JP3117157B2

JP3117157B2 - 固定化酵素によるアルコールのアシル化方法

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Publication number: JP3117157B2
Application number: JP03340796A
Authority: JP
Inventors: マンフレート・シユドク; ゲルト・フユリング; ゲールハルト・クレツチユマル
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1990-12-24
Filing date: 1991-12-24
Publication date: 2000-12-11
Anticipated expiration: 2015-12-11
Also published as: EP0492497A2; US5387514A; CA2058185A1; ATE141950T1; DE59108123D1; EP0492497B1; DK0492497T3; JPH04287689A; EP0492497A3

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】光学活性なアルコールは、生物活性物質、
たとえば医薬、天然物質、穀類有害生物殺滅剤のまたそ
のほか液晶成分の重要なキラル前駆体であることが多
い。

【０００２】したがって、酵素的なラセミ体分割すなわ
ち光学活性なアルコールの製造を保証する経済的な製造
方法は、きわめて重要である。同じことが、プロキラル
化合物の酵素による立体的識別、たとえば２−置換１,
３−プロパンジオールの鏡像異性ヒドロキシ基のエステ
ル化についてもいえる。さらに、酵素触媒によるアシル
化は、化学的アシル化と異なり、ある種の一級および二
級アルコールのようなとくに感受性の高い基質の場合、
重要である。

【０００３】本発明の方法によって、その製造が容易に
なり、さらに経済的になる薬剤には、ＮＳＡＩＤ（非ス
テロイド性抗炎症剤）、β−遮断剤、気管支弛緩薬、抗
真菌剤、ピレスロイド、テトラミゾール、テトラハイド
ロゾリン、(Ｒ)−(−)−トモキセチン、および(Ｓ)−
(＋)−フルオキセチン、ならびにプロスタグランジン、
および炭水化物のような製品がある。プロテアーゼ、た
とえばレニンの、インヒビターの合成のための合成用ブ
ロックは、酵素過程の使用によりかなり簡単に得られる
ようになる。

【０００４】ビニルエステルが、溶媒たとえばテトラヒ
ドロフランの存在下にアルコールを添加すると、酵素触
媒でエステル交換できることは既に知られている（M. D
egueil-Castaing et al, Tetrahedron Lett., ２８
（９）：９５３−９５４，１９８７）。酵素としては、
ブタ膵臓リパーゼが使用された。しかしながら、立体選
択性は認められなかった。

【０００５】ビニルエステルとの溶媒なしでの選択的酵
素触媒エステル交換反応に基づく、ラセミアルコールの
酵素的分離も知られている。使用された酵素は、ブタ肝
臓および膵臓、ならびにシュードモナス（Pseudomona
s）、カンジダ（Candida）、ムーコル（Mucor）、クモ
ノスカビ（Rhizopus）およびペニシリウム（Penicilliu
m）からのリパーゼである（ＥＰ０３２１９１８）。

【０００６】さらに、エステル交換のためにカルボン酸
エステル（G. Carpani, F. Orsina,M. Sisti & L. Vero
tta, Gazz. Chim. Ital., １１９：４６３−４６５，１
９８９）およびアシル化のために環状カルボン酸無水物
（Y. Terao et al, Chem.Pharm. Bull., ３７：１６５
３−１６５５，１９８９）が使用できることも知られて
いる。

【０００７】欧州特許出願ＥＰ０２５４２４３で
は、キラル化合物がプロキラルジオールから、ヒドロラ
ーゼの存在下に酢酸ビニルとの反応で光学的に純粋に製
造されている。これは２個の鏡像異性一級ＯＨ基の一方
のみの選択的エステル化によって達成される。

【０００８】固定化リパーゼが脂肪、油脂および類似化
合物の加水分解およびエステル交換に使用できることも
知られている（M. Mittelbach,J. Am. Oil Chem. So
c.，６７：１６８−１７０，１９９０）。

【０００９】Hsu et al（Tetrahedron Lett., ３１（４
４）：６４０３−６４０６，１９９０）は、ＸＡＤ−８
に固定化されたシュードモナスからのリパーゼを用いる
二級アルコールの反応を記載していて、基質の反応速度
の増大を見出している。しかしながら、この文献には、
活性の喪失を無視できる固定化酵素の有用な寿命（安定
性）または熱安定性については全く記述がない。

【００１０】今回驚くべきことに、固定化シュードモナ
スリパーゼを用いるアルコールのＯ−アシル化が、酵素
をポリスチレンベースの吸着性樹脂のような疎水性担体
に結合させることにより固定化すると、とくに効率的に
実施できることが見出されたのである。

【００１１】したがって、本発明は式Ｉ

【化３】〔式中、Ｒ¹はハロゲンで置換されていてもよいＣ₁〜Ｃ
₁₈−アルキル、またはフェニルもしくは(Ｃ₁〜Ｃ₃)−ア
ルコキシ−(Ｃ₁〜Ｃ₄)−アルキルであり、Ｒ²は水素も
しくはメチルである〕で示されるビニルエステル、もし
くは式II

【化４】（Ｒ¹は上述の意味であり、Ｒ⁷はすべてが同一である場
合にはフッ素、塩素もしくは水素であり、２個のＲ⁷が
水素である場合にはＲ⁷はフッ素、塩素、臭素もしくは
シアノおよび水素であり、Ｒ⁷の１個のみが水素であり
他の２個が同一の場合にはＲ⁷はフッ素もしくは塩素お
よび水素である）で示されるカルボン酸エステル、また
はコハク酸無水物およびグルタール酸無水物から選択さ
れる環状カルボン酸無水物を、固定化シュードモナスリ
パーゼの存在下にアルコールと反応させるアルコールの
アシル化方法において、担体材料として細孔容積２５〜
７５％、表面積１００〜１０００m²／ｇ、細孔径２５〜
１２００Åのポリスチレンベースの吸着性樹脂に固定化
されたシュードモナスリパーゼを使用することを特徴と
する方法に関する。

【００１２】本発明は、以下に詳細に、とくにその好ま
しい実施態様について説明する。本発明は、さらに、特
許請求の範囲によって定義される。

【００１３】本発明の方法によれば、ビニルもしくはメ
チルビニルエステル、または式IIのカルボン酸エステル
もしくは環状カルボン酸無水物を、それ自体を溶媒とし
ても作用させまたは他の有機溶媒に溶解させて、ケト
ン、アルデヒドまたはアルコールおよびアシルラジカル
に切断させると、後者が、添加されたアルコール（基
質）を酵素的にアシル化する。

【００１４】適当な担体材料はポリスチレンベースの吸
着性樹脂である。すべての担体は市販品を入手できる。

【００１５】本発明で使用されるポリスチレンベースの
担体材料は、細孔容積２５〜７５％、好ましくは３５〜
５５％、表面積１００〜１０００m²／ｇ、好ましくは２
００〜７５０m²／ｇ、細孔径２５〜１３００Å好ましく
は５０〜２５０Åである。

【００１６】酵素としてはシュードモナスリパーゼ〔Ps
eudomonascapaciaからのリパーゼＰ（ＦＰまたはＰＳと
も呼ばれる）Amano Pharmaceuticals, Nagoya, Japan〕
が使用される。

【００１７】酵素を固定化するためには、担体１０mlあ
たり０.０１〜２ｇ好ましくは０.１〜１.５ｇの酵素
を、pH５〜９好ましくはpH６〜８の０.００５〜１Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液中、１〜２０時間撹拌する。この反
応時間ののち、ガラス濾斗を通して緩衝液を濾過し、酵
素／担体混合物を大量の水、アセトンおよび酢酸ビニル
で洗浄する。担体はこの状態でそのまま使用できるし乾
燥状態で保存もできる。

【００１８】酵素とともに負荷する担体の量は、そのバ
ッチの規模、アルコールの反応性、期待される反応時
間、および変換の所望のレベルに依存して、自由に選択
される。これは予備的な試験によって容易に決定するこ
とができる。

【００１９】購入できない式Ｉのビニルおよびメチルビ
ニルエステルは、簡単な方法で、たとえば酢酸ビニル
の、適当なカルボン酸との貴金属触媒エステル交換によ
って製造できる。このエステル交換の好ましい触媒は、
Ｐｄ⁺である。

【００２０】ビニルエステルはまた、アセチレンのＨｇ
２＋触媒付加によっても合成できる。

【００２１】式IIのカルボン酸エステルは、環状カルボ
ン酸無水物（コハク酸およびグルタール酸無水物）も同
様に、購入できるか、または標準的な方法で製造でき
る。

【００２２】購入できないアルコールは、たとえば大部
分購入できる相当するケトンから、または相当するケト
ンのα−ハロゲン化ついでアルコールへの還元によって
得られる。購入できない他のアルコールまたはケトン
は、文献公知の方法で簡単に、たとえばグリニャール反
応または他の慣用の付加反応で製造できる。

【００２３】アルコールの語は、式III

【化５】〔式中、Ｒ³はＣ₁〜Ｃ₁₈−アルキルまたはＣ₃〜Ｃ₁₀−
シクロアルキルであり（これらの基はハロゲンで置換さ
れていてもよい）、Ｒ⁴はエポキシ−Ｃ₁〜Ｃ₅−アルキ
ル（エポキシ基は式IIの基におけるＯＨ基に対してβ−
位にある）であるか、またはＲ⁴はＣ₁〜Ｃ₁₀−アルキ
ル、Ｃ₂〜Ｃ₁₀−アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₁₀−アルキニル、
Ｃ₃〜Ｃ₈−シクロアルケニル（この場合、アルキル、ア
ルケニル、アルキニルおよびシクロアルケニル基は、Ｃ
ＯＯＨ、ハロゲン、ＮＯ₂、ＣＮ、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキ
シカルボニルまたはフェニルで置換されていてもよく、
一方フェニル基はハロゲン、ＮＯ₂、ＣＮ、Ｃ₁〜Ｃ₄−
アルコキシで置換されていてもよい）であるか、または
Ｒ⁴はアリールもしくはヘテロアリール（この場合アリ
ールもしくはヘテロアリール基はＣ₁〜Ｃ₄−アルキル、
Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ハロゲン、ＮＯ₂、ＣＮまたは
Ｎ−ＰＧで置換されていてもよく、ＰＧはアミノ保護基
である）であるか、あるいは、Ｒ³およびＲ⁴は両者で、
式IVａ、ｂ

【００２４】

【化６】（式中、ｎは１、２または３であり、Ｒ⁵およびＲ⁶は互
いに同種または異種であって、水素、Ｃ₂〜Ｃ₄−アルケ
ニルまたはＣ₁〜Ｃ₄−アルキルであるか、Ｒ⁵およびＲ⁶
は両者でフェニルまたはナフチルに融合していることを
示し、この場合フェニルまたはナフチル基はＣ₁〜Ｃ₄−
アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ＮＯ ₂、ＣＮまたは
ハロゲンで置換されていてもよく、またアルキレン鎖の
メチレン単位はカルボニル基で置換されていてもよい）
である〕で示されるアルコール、または式Ｖ

【００２５】

【化７】（式中、Ｒ⁸はハロゲンまたはアルキル基であり、Ｒ⁹は
アルキル、アラールキル、アリール、ベンジルまたはナ
フチルメチル基である）のアルコールを意味する。

【００２６】基質として、すべての多価アルコールを使
用することもできる。

【００２７】式IIIのアルコール中のハロゲンの語は、
フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素、とくに塩素および
臭素を意味する。「アリール」の語は、たとえば、フェ
ニル、ナフチル、フェナンスリル、アンスリルおよびフ
ルオレニル、とくにフェニル、ナフチルおよびフェナン
スリルを意味する。「ヘテロアリール」の語は、たとえ
ば、フリル、チエニル、ピロリル、ピリジル、ピリミジ
ル、ピラジニル、ピリダジニル、ピラゾリル、イソキサ
ゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリルおよ
びインドリル、とくにフリル、チエニル、ピロリルおよ
びピリジルを意味する。アミノ保護基、「ＰＧ」は、ペ
プチド化学において慣用されているアミノ保護基、たと
えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ベンゾイル、ベ
ンジル、ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フル
オレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンズヒド
リル、アリルオキシカルボニル（Ａｌｏｃ）、トシル、
メトキシメチル（ＭＯＭ）、テトラヒドロピラニル（Ｔ
ＨＰ）、アセチルを意味するが、さらにはアルキルまた
はシクロアルキル基たとえば、Ｎ−メチル、Ｎ,Ｎ−ジ
メチルも包含される。「フェニルに融合」または「ナフ
チルに融合」の語は、式IIIの基のＣ−Ｃ結合がフェニ
ルまたはナフチル基の一部であるフェニルまたはナフチ
ル基を意味する。任意の置換基、Ｒ¹、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵お
よびＲ⁶は好ましくはモノ置換される。

【００２８】炭素原子３個もしくはそれ以上を有するア
ルキルおよびアルケニル基ならびに炭素原子４個もしく
はそれ以上を有するアルキニル基は、直鎖状でも分岐状
でもよい。

【００２９】アシル化されるアルコールは、ビニルエス
テルの容量に基づいて、濃度０.０５〜２００％、好ま
しくは０.５〜１０％で使用される。

【００３０】アルコールのアシル化には、少なくとも
０.５モル当量のビニル基を使用しなければならない。

【００３１】アルコールの反応は、回分式または連続法
で行われる。

【００３２】アルコールのラセミ分割は、本発明の方法
においては、慣用の方法に比べて、活性が少なくとも９
０％増大して実施することができる。

【００３３】担体上に固定化された酵素は、連続過程に
おける数か月もの使用後にさえも、活性の喪失はほとん
ど示さず、固定化酵素を使用しない場合と反応進行およ
び反応相には変化はない。これは、反応を加熱下に行う
場合でも同様である。

【００３４】固定化シュードモナスリパーゼを用いる回
分式反応の場合には、式Ｉのビニルエステルもしくは式
IIのカルボン酸エステルまたは環状カルボン酸無水物、
好ましくは酢酸ビニルまたはビニルエステルの溶液を
（非極性）有機溶媒に導入し、反応させるアルコールを
添加する。適当かつ好ましい溶媒は、エーテルであり、
とくに対称および非対称、分岐状および直鎖状ジアルキ
ルエーテルが使用できる。同じく、適当かつ好ましい溶
媒は炭化水素であり、とくに直鎖状、分岐状または脂環
式のＣ₄〜Ｃ₈の炭化水素が使用できる。担体上に固定化
されたシュードモナスリパーゼを懸濁液に加え、一定の
温度で撹拌または振盪する。反応の完了はＴＬＣ、ＧＣ
またはＨＰＬＣによってチェックされる。固定化酵素を
ついで濾過し、溶媒（上述）または酢酸ビニルで完全に
洗浄し、溶液を真空中で濃縮する。ラセミ体分割の場合
には、残留物として得られるアルコール／エステル混合
物を、シリカゲル上クロマトグラフィーまたは抽出、結
晶化もしくは蒸留によって分離する。他のアシル化生成
物の場合は、多くの場合、十分な純度で得られ、したが
って、精製は不要である。

【００３５】反応を連続法で実施する場合には、担体上
に固定化されたシュードモナスリパーゼＰ／ＥＰ／Ｐ
Ｓをガラスカラムに充填し、反応を行う溶媒、すなわち
酢酸ビニル、他のビニルエステルまたは他の有機溶媒で
洗浄する。

【００３６】ついで基質溶液を、一定の速度、一定の温
度で通過させる。

【００３７】担体（ml）と固定化リパーゼ（ｇ）と酢酸
ビニル（ml）と基質（容量％）の比は、酢酸ビニルを用
いる場合（すなわち、さらに溶媒を添加しない場合）、
５〜１００：１：５〜１０,０００：０.５〜２００の範
囲である。

【００３８】反応をビニルエステル中で実施する場合に
は、アシル化するアルコールは０.０５〜２００容量％
の濃度で使用される。

【００３９】変換のレベルは、事実上、所望により、滴
下速度を調節することによって、制御することが可能
で、これは予備試験によって容易に決定される。

【００４０】空間−時間収率は上述のパラメーターに直
接依存するが、とくにカラムディメンションすなわちカ
ラム内の担体に固定化された酵素の量に依存する。

【００４１】カラムディメンションは自由に選択できる
が、実験室規模では、１０〜５００mlのオーダーとする
ことが好ましい。担体に固定化された酵素５０mlの好ま
しいカラム充填で、基質溶液の濃度は１％、流速１０
滴／分で、約０.５〜３００ｇ／リットル／ｈの空間−
時間収率が達成される。

【００４２】処理時の反応温度は−１０〜＋１００℃、
好ましくは０〜６０℃である。

【００４３】反応時間は、反応させるアルコールの性
質、その濃度および担体上に固定された酵素の量に依存
し、１ｈ〜４週の間で変動する。３ｈ〜３日であること
が好ましい。

【００４４】本発明の方法で生じたアセトアルデヒドま
たはアセトン生成物、およびアシル化のために遊離した
アルコール、ならびに選択的アシル化の場合に生成した
鏡像異性アルコール（基質）すなわちカルボン酸エステ
ルおよび非反応アルコールは、すべての慣用方法を用い
て既知の方法で、ただし各場合について予備試験をし
て、好ましくはシリカゲル上クロマトグラフィーまたは
他の上述の方法の１種によって分離することができる。

【００４５】

【実施例】一般的方法酵素を固定化するには、担体材料は、酵素の固定化後、
ａ）非処理で、またはｂ）ついでグルタールアルデヒド
で架橋して用いられる（表１）。

【００４６】ａ）の場合、担体にリパーゼを固定化する
には、担体５０mlをリン酸カリウム緩衝液pH７.０、１
００mlに懸濁し、リパーゼＰ５００mgを加える。混合
物を室温で３時間撹拌し、濾過し、水で完全に洗浄す
る。

【００４７】ｂ）のついで架橋する場合、処理はａ）に
記載したと同様に実施し、指示した固定化時間ののち、
４mlのグルタールアルデヒド溶液（濃度２５％）で架橋
を行う。１時間後に、担体上に固定化された酵素を濾過
し、水洗する。

【００４８】好ましい担体としては次のような特徴を有
する担体を挙げることができる。

【００４９】 ^RＸＡＤ−２ ^RＸＡＤ−４細孔容積（％）４２５１密度１.０２１.０２表面積（m²／ｇ）３３０７５０細孔径（Å）９０５０

【００５０】担体は水中に、または乾燥状態で保存する
ことができる。

【００５１】反応させるアルコール５００mgを酢酸ビニ
ル２０mlに懸濁する。これに固定化リパーゼを加え、混
合物を一定の温度で撹拌する。

【００５２】反応完了後、固定化酵素を濾過して除く。
残った溶液を真空中で完全に蒸発させる。

【００５３】残留物中に存在するアシル化生成物は、標
準的方法、たとえばシリカゲルクロマトグラフィーによ
って分離することができる。

【００５４】出発原料および得られた生成物、変動可能
な工程パラメーター（酵素の量、担体の量、アルコール
の量、ビニルエステルの量、反応温度、反応時間）なら
びに生成物の特性および化学的収率を表２〜５に掲げ
る。

【００５５】活性の正確な決定には、担体に結合した酵
素の量を正確に測定する必要がある。

【００５６】本発明の方法に関して本明細書に記載した
試験における基本的な前提は、シュードモナスリパーゼ
が塩含量３７％または蛋白質６３％（重量％）の単一な
蛋白質であるということである。この塩含量は透析によ
って測定される。

【００５７】固定化収率の測定には、２０mlのＸＡＤ−
２担体および２ｇのシュードモナスリパーゼを用いて既
述の試験を実施する。固定化および洗浄溶液を集めて合
し、凍結乾燥する。酵素と緩衝塩からなる残留物１.７
７ｇがこのプールから得られる。純粋な緩衝液の凍結乾
燥後に得られる重量から、使用された緩衝液の量の中の
塩の量は０.３８ｇであることがわかっている。

【００５８】したがって、残留物の１.７７ｇから、ひ
とつには緩衝塩の０.３８ｇと、次に酵素の塩０.７４ｇ
（＝３７％、上記参照）を差し引く必要がある。

【００５９】残った量０.６５ｇが固定化されなかった
酵素の量に相当する筈である。

【００６０】残留物をついで透析すると、少量の塩がま
だ存在し、したがって残っている酵素の量は、理論量の
０.６５ｇではなく、０.５８ｇである。すなわち、固定
化された酵素の量は０.６１〜０.６８ｇである。これは
固定化収率が５１％であることを意味する。

【００６１】この計算を、例示のためにもう一度、表２
〜５に掲げた実施例１の場合（フェニルエタノール）に
ついて行う。

【００６２】５０mgのリパーゼＰ（市販品を入手） ×０.６３実際のリパーゼＰ酵素含量 ×０.５１固定化収率 →１６mg 担体上に固定化されたリパーゼ５０mgの遊離リパーゼ ×０.６３実際のリパーゼＰ酵素含量 →３１.５mg 実際のリパーゼＰ酵素量１６mgの固定化酵素は３３.４％の変換率を与え、遊離
の酵素３１.５mgは２０.７％の変換率を与える： →活性：３２０％

【００６３】酵素的なラセミ体の分割は、上述のように
酢酸ビニルの存在下のみでなく、他のビニルエステル、
たとえばクロロ酢酸、ラウリン酸およびフェニル酢酸の
ビニルエステルの存在下にも実施できる。このために
は、担体に固定化したリパーゼＰをガラスカラムに充填
し、以後の反応で溶媒として用いられるｔ−ブチルメチ
ルエーテル１５０mlで洗浄する。

【００６４】次にカラムに、それぞれ２５０mlのｔ−ブ
チルメチルエーテル２５０mlに溶解した基質およびビニ
ルエステルの溶液を負荷する。この溶液をカラムを徐々
に通過させ、溶液が完全に通過したのちの組成をガスク
ロマトグラフィーで測定する。

【００６５】使用された量、通過および反応時間、なら
びに結果は表６に示す。

【００６６】酢酸エチルによるエステル交換：酢酸エチ
ル０.５mlを、ｔ−ブチルメチルエーテル（１０ml）中
２.５％濃度のフェニルエタノールおよび５mlのＸＡＤ
−２上固定化酵素（酵素の理論量：５０mg）と室温で撹
拌する。この反応は５日後にフェニルエタノールの５０
％変換を示した。

【００６７】非固定化酵素による対照実験では７日後に
も明らかに低い変換率を示した。

【００６８】変換はＴＬＣで測定した。

【００６９】一級ＯＨ基のエステル化例：ゲラニオール
を酢酸ビニル１０ml中２.５％の濃度に溶解し、ＸＡＤ
−２上固定化酵素５ml（酵素の理論量５０mg）を加えて
室温で撹拌する。わずか１時間後に固定化酵素では定量
的なアシル化が達成されたが、遊離酵素ではさらに５０
％の時間を要した。

【００７０】ｄｌ−パントラクトンのアセチル化例−連
続法における高温での長期安定性の試験：４００mlのＸ
ＡＤ−２上固定化リパーゼＰを、熱制御可能なジャケッ
ト付きガラスカラムに充填する。０.１％濃度のｄｌ−
パントラクトン溶液（酢酸ビニル／ｔ−ブチルメチルエ
ーテル１：９中；総容量２リットル）を、流速０.１１
ml／分、５０℃においてカラムを通過させる。カラム容
量はその後の同速度でのｔ−ブチルメチルエーテルによ
る洗浄で補整する。反応溶液のＧＣ分析で、第１回目の
試行ではパントラクトンアセテートへの変換率は７１.
６％を示す。洗浄したカラムは乾燥状態で室温において
保存し、新たな試行の開始に際してはその都度５時間前
に温度を平衡化させた。以後の５カ月間にさらに１１回
の連続反応を同様の様式で行う。５カ月後に行った１２
回目の試行におけるパントラクトンアセテートへの変換
率は７０.７％を示している。

【００７１】

【表１】

【００７２】

【表２】

【００７３】

【表３】

【００７４】

【表４】

【００７５】

【表５】

【００７６】

【表６】

【００７７】本発明の方法は、アルコールのラセミ体の
分割のための慣用方法に比較して以下の利点を有する。Ａ）酵素活性の増大により、空間−時間収率が著しく
上昇する。Ｂ）固定化酵素のきわめて長い有用寿命は、とくに生
物触媒の経済的な利用を可能にする。Ｃ）酵素活性の耐容性が高い（表１，下記(ａ)参
照）。Ｄ）固定化酵素の高い熱安定性。

【００７８】トルエン中０.５％濃度のフェニルエタノ
ール溶液１０mlを遊離リパーゼ１００mgまたは固定化酵
素１mlと混合し、ついで各場合０.１mlのフェニル酢酸
ビニルエステルを加える。遊離のリパーゼは室温で５時
間撹拌後３.２％の変換率を示し、同じ時間１１０℃で
還流したのちには最早活性を示さないのに対し、固定化
リパーゼは１１０℃でなお１〜２％の変換率を示す。変
換率はＧＣ試験（^RChromsorb 上 Reoplex）。

【００７９】（ａ) ラセミ体フェニルエタノール２５
０mgを酢酸ビニル２０ml中、固定化リパーゼ２mlと５０
℃で６時間振盪する。ついで変換率をＧＣで測定し、固
定化酵素を濾過して除き、酢酸ビニルで完全に洗浄す
る。次の日に同一条件で新たな反応を実施する。（ｂ）この方法を０.２ｇの遊離酵素を用いて同様に
行う。

【００８０】(ａ) 最初の試行では６時間後に４８.７
％の変換がみられる。第１０回目の試行では６時間後に
２１.２％の変換がみられる。

【００８１】(ｂ) 最初の試行では６時間後に４６.１
％の変換がみられる。７回目以後の試行では生成物は最
早認められない。

【００８２】酵素の活性は長期にわたって確認される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ゲールハルト・クレツチユマルドイツ連邦共和国デー−6236エシユボルン２．ウルメンヴエーク10 (56)参考文献特開平１−202296（ＪＰ，Ａ) 特開平２−167098（ＪＰ，Ａ) Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．, Ｖｏｌ．37，Ｎｏ．６（1989）ｐ．1653 −1655 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 7/62 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式Ｉ【化１】〔式中、Ｒ¹はハロゲンで置換されていてもよいＣ₁〜Ｃ
₁₈−アルキル、またはフェニルもしくは(Ｃ₁〜Ｃ₃)−ア
ルコキシ−(Ｃ₁〜Ｃ₄)−アルキルであり、Ｒ²は水素も
しくはメチルである〕で示されるビニルエステル、もし
くは式II 【化２】（Ｒ¹は上述の意味であり、Ｒ⁷がすべて同一であらねば
ならない場合にはフッ素、塩素もしくは水素であり、２
個のＲ⁷が水素であらねばならない場合にはＲ⁷はフッ
素、塩素、臭素もしくはシアノおよび水素であり、Ｒ⁷
の１個のみが水素であり他の２個が同一の場合にはＲ⁷
はフッ素もしくは塩素および水素である）で示されるカ
ルボン酸エステル、またはコハク酸無水物およびグルタ
ール酸無水物から選択される環状カルボン酸無水物を、
固定化シュードモナスリパーゼの存在下にアルコールと
反応させるアルコールのアシル化方法において、担体材
料として細孔容積２５〜７５％、表面積１００〜１００
０m²／ｇ、細孔径２５〜１２００Åのポリスチレンベー
スの吸着性樹脂に固定化されたシュードモナスリパーゼ
を使用する方法。
【請求項２】反応は回分式で行われる請求項１記載の
方法。
【請求項３】反応は連続法で行われる請求項１記載の
方法。
【請求項４】担体は、その上に酵素をカップリングし
たのち、ａ）固定化のための処置をせず、またはｂ）つ
いでグルタールアルデヒドで架橋する、いずれかの形で
使用することができる請求項１〜３のいずれかに記載の
方法。
【請求項５】反応温度は−１０〜＋１００℃とする請
求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】反応温度は０〜＋６０℃とする請求項１
〜５のいずれかに記載の方法。