JPS6078596A - 固定化酵素による光学活性オキサゾリジン誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固定化酵素充填カラムにより生化学的光学分
割と光学活性体の分取を同時に行う光学活性なオキサゾ
リジノン誘導体の製造方法に関する。更に詳しくは、一
般式 Ｃ式中、Ｒ１は炭素原子数１〜４個の低級アルキル基、
Ｒ２はアルキル基）で表わされる３−アルキル置換−５
−アシロキシメチルオキサゾリジン−２−オン　ラセミ
体を不斉的に加水分解する能力を有する微生物由来もし
くは哺乳動物の臓器由来のエステラーゼを疎水性をもっ
担体に固定化した固定化酵素を充填したカラムに［Ｒ，
５）−Ｉ）を負荷し、水又は緩衝液を流すことによって
不斉氷解反応を行うと同時に生成する親水性の一般式（
式中、Ｒ１は前記と同じ）及び未反応の疎水性の一般式 Ｃ式中、Ｒ１，Ｒ２は前記と同じ）で表わされる光学活
性オキサゾリジノン、誘導体とを上記固定化酵素の担体
との親和性の差を利用し、水又は緩衝液によって（ｆＲ
ｌ−ＩＤ　を溶出、採取し、次いでカラム内の固定化酵
素に疎水的相互作用によって吸着、保持されているｌｌ
５）−Ｉｌを低極性有機溶媒を流すことによって溶出、
採取することを特徴とするオキサゾリジノン誘導体Ｃ（
Ｒ，５）−Ｉ：）の生化学的光学分割と光学活性体〔（
Ｒ１７１１］及び［ｆＳｌ−ＩＤの分別、採取を同時に
行う光学活性なオキサゾリジノン誘導体の固定化酵素に
よる製造方法に関するものである。

化合物１ｊｓｌ−Ｉ）をアルカリ加水分解するか、もし
くは化合物［１：（Ｒ１−１１）を反転することによっ
て得られる一般式 （式中、Ｒ１は前記と同じ）で表わされる光学活性Ｃ５
Ｉ　−（＋１−８−アルキル置換−５−ヒドロキシメチ
ルオキサゾリジン−２−オンは光学活性なβ−受容体遮
断薬の重要な合成中間体であり、下記の経路で容易に合
成できることか知られている。

未 ［５）−ＲＩＮＨＣＨｚＣＨＣＨｚＯＡｒＨ 光学活性β授容体遮断薬 従来酵素反応は遊離の酵素を反応器に加え、回分法で反
応が行われ、反応終了後、酵素は使いすてにされていた
が、酵素は一般的に高価であるためコスト的に不利とな
り、また不安定でもあるため工業的利用は限られていた
。さらに回分法では酵素反応終了後、反応生成物を反応
液から分離する方法として １）有機溶媒で抽出分離する方法。

２）反応液を一旦有機溶媒で転溶するか、又はそのまま
反応液をカラムクロマトグラフィー処理で分離する方法
。

３）反応液を一旦有機溶媒で転溶するか、又はそのまま
反応液を分留操作により分離する方法。

などが行われてきたが、操作か繁雑で収率が悪かったり
、時間がかかったり、特別の装置が必要であったりして
コストが高くなるという欠点があった。このため近年酵
素の固定化が研究され、酵素の安定性の向上や繰り返し
使用、さらにはカラムに充填して反応を行うことも可能
となってきた。

しかし、固定化酵素を用いてラセミ体を原料として不斉
氷解と同時に反応生成物を分離し、更に連続的に反応を
行って成功した例はこれまで報告されていない。

本発明者らは先に化合物［（Ｒ，５）−Ｉ）を不斉水解
する活性を有する微生物もしくは該微生物より得られる
酵素又は動物臓器より得られる酵素を化合物［（Ｒ，５
）−Ｉ）に作用させて不斉的に加水分解して光学活性な
化合物［（５１−Ｉ）　及び［ｊＳｌ−Ｈ〕　を製造す
る方法を既に見い出している（特願昭５７−１４１５７
５．特願昭５７−１９（１５８４）。本発明者らは、さ
らに酵素による不斉氷解反応と同時に反応生成物のより
簡便な分離技術を確立すべく鋭意研究した結果、酵素を
疎水性担体に固定化することによって安定化し、且つ繰
り返し使用できることを見い出し、工業的に有用なカラ
ム法による不斉氷解反応の連続化を可能ならしめ、同時
に基質と生成物の性質の差を利用して固定化酵素に反応
生成物の分離機能を持たせることによって本発明を完成
させるに至ったものである。

即ち本発明により、従来の遊離の酵素による反応に比べ
て酵素が安定化され、繰り返し連続して有効に使用でき
るためコストの低減が可能となり、更に使用した酵素等
の不純物の混入もなくなった。

更に、一般の固定化酵素と比べても酵素反応だけでなく
、固定化酵素に反応生成物の分離機能を持たせることに
よって不斉氷解後の抽出分離操作が不用で簡便になり、
収率が向上し高品質の光学活性化合物［ｆＳｌ−Ｉｆ及
び〔（ＲＩ−Ｉｆ）　が安定して得られるようになった
。従って本発明により、光学活性β−受容体遮断薬も高
純度で安価に合成することが可能となった。

本発明において原料基質として使用されるラセミ体化合
物（（Ｒ，５）−Ｉ）の式中の３位のＲ１は炭素原子数
１〜４個の低級アルキル基であり、更に好ましくは［−
ブチル基又はイソプロピル基である。一方、５位のエス
テル部分のＲ２は炭素原子数２〜１７個のアルキル基で
あり、例えばプロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、枯草酸、
カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミ
リスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸
、リレール酸等が挙げられ、更には取り扱１．）の容易
さ、反応生成物の分離、溶出の容易さの観点から炭素数
４〜８個の有機カルボン酸のエステルがより望ましい。

これらのエステルの製造は、既に本発明者らが提案して
いる方法（特願昭５８−５８３１６）によって容易に合
成することができる。

本発明で用いる固定化酵素に供される酵素はラセミ体化
合物［（Ｒ，Ｓ）　−’Ｉ）に対し不斉氷解能を持つ微
生物起源のエステラーゼおよび動物の臓器起源のエステ
ラーゼであり、リノクーゼを含む広義のエステラーゼで
ある。具体的には特願昭５７−１４１５７５及び特願昭
５７−１９０５８４に記載されている酵素、例えばシュ
ードモナス属、エンテロバクタ−属、クレブシェラ属、
ミクロコツカス属、ハンゼヌラ属等の微生物又は牛、馬
、豚等の肝臓もしくは膵臓から得られるエステラーゼか
挙けられる。

本発明における酵素固定化用担体としては、疎水性をも
つ種々の担体が用いられる。本発明で用いられる疎水性
をもつ担体とは、水もしくは緩衝液中では不斉氷解反応
によって生成した親水性化合物［（Ｒ１−ｎ）を吸着せ
ず、未反応のエステル化合物Ｃｆ５ｌ−Ｉ）は疎水的相
互作用によって吸着し、更にこの吸着しているエステル
化合物〔［５ｌ−ｉ）は低極性溶媒中では速かに脱着す
るような性質をもつ担体であることが望ましい。更に具
体的な担体としては、例えば疎水性をもつ合成吸着剤、
疎水クロマトグラフィー用樹脂、疎水性をもつ光架橋性
樹脂、疎水基を化学結合させて導入した高分子物質等が
挙げられる。

かかる担体への酵素の固定化は、公知の種々の方法によ
って行うことができる。例えば物理的吸着法、共有結合
法、イオン結合法、包括法等が挙げられる〔福井・千畑
・鈴木編、酵素工学、１５７−２４３頁、講談社（１９
８１）　；千畑一部機、固定化酵素、講談社（１，９７
５））。

このような固定化酵素の調製法のうち、方法の簡便さ、
担体の物理的強度及び安置さなどにより疎水性をもつ合
成吸着剤に酵素を物理的に吸着させる方法が工業的に望
ましい。酵素の担体への担持量は、担体の酵素担持能に
よって左右されるので必ずしも一義的ではないが、担体
の湿重量１７当り約０．１ｍグないし約１００ｍ９、通
常的１ｍ５１’ないし約１０ｍ５’程度であれはよい。

本固定化酵素を用いて回分法てラセミ体化合物［（Ｒ’
、５）−Ｉ〕の不斉氷解を行い、親水性化合物〔α＜１
＝ＩＪ］を含む水層と未反応の疎水性化合物Ｃ（Ｓｌ−
Ｉ）を吸着している固定化酵素とを濾過もしくはゆるや
かに遠心することによって分離し、さらに低極性溶媒で
固定化酵素を洗浄することによって化合物１：（５１−
Ｉ）を得ることができ、固定ｆヒ酵素は再び反応に用い
ることができる。かかる方法によっても従来の遊離酵素
を用いる回分法に比べて利点はあるが、本発明は、それ
を更に進めて、固定化酵素をカラムに充填し酵素反応と
同時に反応生成物の分離を行い、反応を連続化すること
によって工業上さらに有用としたものである。

本発明における不斉氷解反応は通常１０〜６０℃の範囲
で可能であるが、２０〜４０℃で行うことが好ましい。

この不斉氷解反応はｐ　Ｈ４，５〜１０の範囲で可能で
あるが、反応速度が大であるｐＨ６〜８．５の範囲で行
うことが望ましい。また未反応では不斉氷解の進行に伴
い有機酸を生じｐＨが低下する。そのため基質化合物の
負荷量が多いときには、緩衝液を使用するなどしてｐＨ
を一定の範囲内に制御することが望ましい。この目的に
適する緩衝液としては無機酸塩、有機酸塩いずれの緩衝
液も使用することができる。

本発明では該固定化エステラーゼをカラムに充填し、ま
ず緩衝液を流し、次に基質のエステル化合物［（Ｒ，５
）−Ｉ）を負荷し、負荷し終わったら再び緩衝液を流す
ことによってカラム内で不斉氷解反応を行わせしめ、か
つ生成する親水的な化合物［［１−’ｎ）は緩衝液に溶
かし、カラムから排出させる。この緩衝液画分をガスク
ロマトグラフィー（充填剤、シリコン０Ｖ−１７，８ｍ
ｍφＸ１ｍカラム、カラム温度２２０℃）により分析し
、両分中に化合物［、［Ｒ１−１１）がほとんど認めら
れなくなった時点で緩衝液にかえて低極性溶媒を流し、
カラム内の固定化酵素に吸着している未反応の化合物Ｃ
（Ｓ−Ｉ”：Ｊを溶出する。この溶媒画分もガスクロマ
トグラフィーで分析し、両分中に化合物［１５１−Ｉ）
がほとんど認められなくなれは、低極性溶媒にかえて再
び緩衝液を流すことによってカラム内を緩衝液で置換し
、基質のエステル（ヒ合物［（Ｒ，５）−Ｉ’）を負荷
する。これらの一連の操作を繰り返すことによって化合
物〔（Ｒ９Ｓ）−Ｉ］の不斉氷解と反応生成物の分取を
パルス的に連続して行うことが可能である。

本固定化エステラーゼを充填したカラムに負荷てきる基
質の量としては、固定化した担体によって変わるか、基
質を負荷している途中もしくは緩衝液を流し始めたとき
に未反応の基質がカラムから排出されなければ排出され
る限界量まで可能である。例えば合成吸着剤アンノ１−
ライトＸＡＤ−７を担体とした固定化エステラーゼを充
填した場合、そのカラム容積のｌ／３量までの基質を負
荷することが可能である。

本発明において疎水性の未反応の「ヒ合物［（Ｓｌ−■
〕を溶出するのに用いる低極性溶媒は、担体に吸着して
いる酵素を脱着しない溶媒であって、かつ親水性化合物
〔■１−Ｈ）は殆んど溶解せず、一方、疎水性の化合物
Ｃ（Ｓｌ　−Ｉ　］はよく溶解する溶媒が望ましい。そ
のような溶媒としては、例えばベンゼン、トルエン、キ
シレンのような芳香族炭化水素溶媒；ｎ−ヘキサン、ｎ
−へブタン、ｎ−オクタンのような脂肪族炭化水素溶媒
；シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロへブタンの
ような脂環式炭化水素溶媒又はこれらの混合溶媒が好適
な溶媒として挙げられる。

本発明における遊離及び固定化酵素の加水分解活性は回
分法によって次のようにして反応初期の速度からめた。

基質：ＣＲ，５）−（±）−３−ｔ−ブチル−５−カプ
ロイロキシメチルオキサゾリジン−２−オン 測定法及び活性単位の算出 基質５グを蒸留水４５ｍＪに加え懸濁し、恒温水槽を用
いて３３℃に保つ。ｐＨスタットを接続し、ｐＨを７．
０に調整してから遊離の酵素５〜５０ｍｇ、又は湿潤固
定化酵素（＠引沢過したもの）０．５〜１．．０９を加
えて撹拌下に反応を開始する。

酵素による基質エステルの加水分解によってカプロン酸
が生成するが、ＰＨスタットを用いて５Ｎ水酸化すｌ−
ＩＪウム溶液を加えることによって反応液のｐＨを７．
０に維持した。反応開始後１分から６分までの５分間に
ｐＨを７，０に維持するために消費した水酸化ナトリウ
ム溶液の量から１分間当りの平均消費Ｉをめ、遊離の酵
素１ｇ、当りもしくは固定化酵素１ｇ当りの消費量に換
算する。１分間に１マイクロモルの水酸化ナトリウムを
消費する（即ちカプロン酸を生成する）酵素活性の強さ
を１単位（ｕｌとして各酵素標品１グ当りの比活性を算
出した。

以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本
発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ リポプロティンリパーゼ（起源：シュードモナス属、力
価４５，０００ｕ／ｇ、天野製薬株式会社製）６．０７
をｐ　Ｈ７，０の０．１　Ｍリン酸緩衝液１００ｍｊ？
に加えて混和し、濾過によって不溶物を除いた。

Ｐ液ニローム・アンド・ハース社製メタクリレート糸多
孔質吸着剤アンバーライトＸＡＤ−７をメタノールと水
で洗浄後、湿重量６０７（含水率７１％）加え、室温で
一夜振盪撹拌し、酵素を吸着固定化した。固定化酵素懸
濁液をグラスフィルターを用いて吸引濾過し、さらにｐ
　Ｈ７，０の０．１Ｍ　ＩＪン酸緩衝液１００ｒｒ＋Ｊ
？で３回洗浄後、吸引濾過して湿潤固定化酵素を得た。

水分含量は固定化ｍ１の樹脂の水分陰量とほとんど同じ
であり、本固定化酵素の活性は１ｇ当り５９０ｕであっ
た。こうして得た固定化酵素を内径２．２ｃｍ０カラム
に高さ１５　ｃｍに充填し、３３℃に保温してラセミ休
の３−ｔ−ブチル−５−カプロイロキシメチルオキサゾ
リジン−２−オン　１０ｇを負荷し°、ｐ　Ｈ７，００
０，１Ｍリン酸緩衝液を毎分、１．ＯｍＩ！の流速で流
して反応させた。カラムからの排出液を１０ｍＪずつフ
ラクションコレクターで分取し、ガスクロマトグラフィ
ー（充填剤、シリコン０ｖ−１７．３ｍｍφＸ１ｍカラ
ム、カラム温度２２０℃）により分析した。このリン酸
緩衝液画分１こｌよ、不斉水解され生成した親水的な３
７ｔ−ブチル−５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−
２−オンのみが含まれていた。該リン酸緩衝液の画分１
００ｍｊ？に等里の塩化メチレンを加え、２同核ヒドロ
キシメチル体を抽出し、脱水後、濃縮した。この濃縮液
にヘキサンを徐々に加えて無色の結晶を析出させ、これ
を集めて真空乾燥したところ、比旋光度〔α］　−４４
，７°（ｃｍ１．ｏ、クロロホルム）を有するＣＲ〕−
（−１−３−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシメチルオキサ
ゾリジン−２−オン　２６ｇ　（収率８１．５％）を得
た。リン酸緩衝液を１２０ｍ１流した時点で、リン酸緩
衝液にかえてヘキサンを毎分１．０ｍｊ？の流速で流し
、カラム内の固定化酵素の担体に吸着されていた未反応
の疎水的な３−ｔ−ブチル−５−カプロイロキシメチル
オキサゾリジン−２−オンを溶出した。溶出ヘキサン溶
液を１０ｍ１！ずつフラクションコレクターで分取し、
８−ｔ−ブチル−５−カプロイロキシメチルオキサゾリ
ジン−２−オンを３む画分１００　ｍ’ｌを濃縮し、比
旋光度〔α、：ｌ　＋２７．９°（Ｃ＝１．０．りロロ
ホルム）を有する油状物４．４ｇを得た。

更にこの油状物に水５（１ｍｊ’と水酸化ナトリウム溶
液を加え、ｐＨ１２〜１３に保ち室温で　３時間エステ
ルの加水分解を行った。加水分解液中のヒドロキシメチ
ル体を塩化メチレン６０ｍ１！で２回抽出し、脱水処理
後、濃縮した。この濃縮液にヘキサンを徐々に加えて無
色の結晶を析出させ、０ これを集めて真空乾燥したところ比旋光度〔α〕ゎ−１
−４４，２°（Ｃ＝１．０．クロロホルム）を有するＣ
３〕−１＋１−８−　ｔ−ブチル−５−ヒドロキシメチ
ルオキサゾリジン−２−オン　２．１１ｉ’（収率６５
．８％）を得た。

上記リン酸緩衝液およびヘキサンによる溶出において酵
素の脱着は認められなかった。

実施例２ 実施例１において使用した固定化リポプロティンリパー
ゼ充填カラムにｐＨ７，０の０１Δ４　１Ｊン酸緩衝液
５０ｍＪ？を流してから実施例１と同様にしてラセミ体
の３−ｔ−ブチル−５−カプロイロキシメチルオキサゾ
リジン−２−オン１０ｉｉ’　を負荷し、リン酸緩衝液
による反応およびヒドロキシメチル体の溶出ならびにヘ
キサンによる未反応のエステル体の溶出を行った。更に
この一連の反応、溶出７操作を２０回繰り返し連続して
行し）、毎回リン酸緩衝液画分とヘキサン溶出画分とを
実施例１と同様の操作で処理した。その結果、各リン酸
緩衝液画分から比旋光度〔α）Ｄ−４４，１°　（Ｃ＝
＝１．０　、クロロホルム〕カラｃａ〕Ｄ４４．９’（
Ｃ＝１．０．クロロホルム）を有す・るＣ：Ｒ：Ｉ　−
（−１−３−［−ブチル−５−ヒドロキシメチルオキサ
ゾリジン−２−オンを２．４７〜２．８ｆｌ（収率７５
２〜８７．８％）の範囲で得た。また各ヘキサン溶出画
分から比旋光度〔α）、＋４８．７°〜＋４４８゜（Ｃ
−１，クロロフォルム）を有するＣ３）−（＋ｌ　−５
−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−
２−オンを２．０〜２．４ｇ（収率６２，７〜７５２％
）の範囲で得た。

実施例３〜８ 実施例１と同様にしてアンバーライトＸＡＤ−７に固定
化したリポプロティンリパーゼを内径２、２　ｃｍ　＋
長さ１５　ｃｍＯカラムに充填し、基質のエステル体と
未反応のエステル体の溶出液をかえて実施例１と同様の
操作を行い、表１の結果を／ 実施例９ 実施例１において、メタクリレート系吸着剤アンバーラ
イトＸＡＤ−７のかわりに三菱ｆヒ成工業株式会社製の
同系の多孔質吸着剤ダイヤイオンＨＰ２ＭＧをメタノー
ルと蒸留水で洗浄後、湿重量６０ｙ（含水率６１％）用
い、以下の操作は実施例１に準じて固定化リボプロティ
ンリパーゼを調製した。この湿潤固定化酵素の活性は１
１当り５００ｕであった。該固定化酵素を内径２．２ｃ
ｔｎ、長さ１５　ｃｍＯカラムに充填し、不斉氷解の基
質をラセミ体の３−イソプロピル−５−カプリ１ノロキ
シメチルオキサゾリジン−２−オン　１０ノとして実施
例１と同様の操作で不斉氷解と生成物の分離を行った。

リン酸緩衝液画分を実施例１と同様に処理することによ
って比旋光度〔α：］Ｄ−４８．５゜（Ｃ＝１．０．ク
ロロホルム）を有するＣＲ，：）＋１−３−イソプロピ
ル−５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−２−オン　
２．１ｇ（収率７５．３％）を得た。ヘキサン溶出画分
も実施例１と同様に処理すること＋とよって比旋光度〔
α）　＋４８．１０（Ｃ＝１．０゜クロロホルム）を有
する［Ｓ］−ｊ＋１−８−インプロピル−５−ヒドロキ
シメチルオキサゾリジン−２−オン１．８ｆＩ（収率６
４，６％）を得た。

実施例１Ｏ 実施例９において使用した固定化リポプロティンリパー
ゼ充填カラムにｐ　Ｈ７，０のリン酸緩衝液５０ｍｆｆ
を流してから実施例９と同様にしてラセミ体の３−イソ
プロピル−５−カプリリロキシメチルオキサゾリンン−
２−オン　１０ｇを負荷し、リン酸緩衝液による反応お
よびヒドロキシルメチル体の溶出ならびにヘキサンによ
る未反応のエステル体の溶出を行った。さらにこの一連
の反応、溶出操作を２０回くり返し連続して行い、各回
のリン酸緩衝液画分を−まとめにし、実施例１と同揮に
処理することによって比旋光度〔α、：１Ｄ−４８，：
（。

（Ｃ＝１．０．クロロホルム）を有するＣＲＩ−（−１
−３−イソプロピル−５−ヒドロキシメチルオキサゾリ
ジン−２−オン　４２．８ｇ（収率７６．８％）を得た
。　−−−＝−、 刷４績１制Ｕ０ＩトトトｈＨ鈷トγｄ帆影劃剣場吋匙−
ｔ８７−８−！Ｌ−（−舛」−１泰咲季イ；−６４づ仁
）４１１烙、ヘキサン溶出画分も−まとめにし、実施例
１と同様に処理することによッテ比旋光度Ｃａ）　＋４
８．０°（Ｃ＝１．０．クロロホルム）を有する［３）
−（＋１−３−イソプロピル−５−ヒドロキシメチルオ
キサゾリジン−２−オン　４０．１ｇ（収率７１．９％
）を得た。

実施例】１ リパーゼＰＬ２６６（起源：アルカリ土類金属。

力価６，４００ｕ／ｇ、名糖産業■製品）１０ｇをｐ　
Ｈ７，０の０．１Ｍリン酸緩衝液１００　ｍｌに加えて
混和し、ｐ過によって不溶物を除いた。Ｆ液にファルマ
シア社製オクチルセファロースＣＬ−４Ｂを水と緩衝液
で洗浄、ｒ過後、湿重量６０７（含水率９４％）加え、
室温で一夜振帰撹拌し、酵素を吸着固定化させた。固定
化酵素懸濁液をグラスフィルターを用いて吸引沢過し、
さらに緩衝液１００ｍ１で３回洗浄後、吸引沢過して湿
潤固定化酵素を得た。この湿潤固定化酵素の活性番よ１
７当り３５０ｕてあった。この固定化酵素を内径２．２
ｃｍのカラムに高さ１５　ｃｍに充填し、３３℃に保温
してラセミ体の３−［−ブチル−５−カプロイロキシメ
チルオキサゾリジン−２−オン５ｇを負荷し、ｐ　Ｈ７
，０の０，１Ｍリン酸緩衝液を毎分１．０ｍｊ？の流速
で流して反応させた。カラムからの溶出液を１０＋ｎＪ
？ずつフラクションコレクターで分取し、リン酸緩衝液
画分８０ｍｊ’ｌこ等量の塩化メチレンを加え２回抽出
を行った。

以下実施例１と同様の操作を行し）、リン酸緩衝液両分
から比旋光度〔σ］Ｄ−４４，８°（Ｃ＝１．０゜クロ
ロホルム）を有する［Ｒ）　−’（−１−３−ｔ−）゛
チルー５−ヒドロキシメチルオキサンリジン−２−オン
　１．２７（収率７５．２％）を得た。またヘキサン画
分から、比旋光度〔α〕ゎ＋４３．８°（Ｃ＝１．０．
クロロホルム）を有する〔Ｓ〕−（ト）−３−［−ブチ
ルー５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−２−オン　
１．１１収率６９．０％）を得た。

実施例】２ 実施例１において、メタクリレート系吸着剤アンバーラ
イトＸＡＤ−７のかわりにスチレン・ジヒニルベンゼン
系の吸着剤アンバーライトＸＡＤ−２をメタノールと蒸
留水で洗浄後、湿重量６０ｇ（含水量４３％）用い、　
リポプロティンリパーゼにかえてリパーゼＡＬ（起源ニ
アクロモバクター属、力価８，５００ｕ／グ９名糖産業
（株製品）を１０７用いた他は実施例１と同様の操作に
よって固定化リパーゼＡ’Ｌを調製した。この湿潤固定
化酵素の活性は１７当り６５ｕであった。この固定化酵
素を内ｆ４２．２　ｃｍＯカラムに高さ１５　ｃｍに充
填し、３３°Ｃに保温してラセミ休の３−【−ブチル−
５−ブチリロキシメチルオキサゾリジン−２−オン　１
　（１！ｉ’を負荷し、ｐ　Ｈ７，０のＯ，］、　Ｍリ
ン酸緩衝液を毎分０．３　ｍ１ｇの流速で流して反応さ
せた。カラムからの溶出液を１０ｍ１！ずつフラクショ
ンコレクターで分取し、リン酸緩衝液画分１００　ｍ、
ｇに当量の塩化メチレンを加え２回抽出し、脱水後、濃
縮した。この濃縮液にヘキサンを徐々に加えて無色の結
晶を析出させ、これを集めて真空乾燥したところ比旋光
度〔α〕−３４，７゜（Ｃ＝１．０．クロロホルム）を
有する［Ｒ’：ｌ　−ｊ”）−３−１−フチルー５−ヒ
ドロキシメチルオキサゾリジン−２−オン　２．８９（
収率７８．７％）を得た。リン酸緩衝液を１２０＋ｎＪ
？流した時点で、リン酸緩衝液にかえてトルエンを毎分
１．０　ｍ１ｇの流速で流し、カラム内の固定化酵素に
吸着されていた未反応の３−４−ブチル−５−ブチリル
オキシメチルオキサゾリジン−２−オンを溶出した。溶
出トルエン溶液８０ｍｆを減圧濃縮し、油状物を得た。

以後、実施例１と同様の処理を行い、比、旋光度〔α］
　＋８５．２°（Ｃ＝１．０．クロロホルム）を有する
［５）−（＋１−３−　ｔ−ブチル−５−ヒドロキシメ
チルオキサゾリジン−２−オン　２１９（収率５９，０
％）を得た。

特許出願人　鐘淵化学工業株式会社 代理人　弁理士　浅　野　真　− 手続袖正書（臼４） １、　Ｚｌ１件の表示 昭和５８年　２４　盲１　願第１８７５０９号−ダト 小（１、！：の関係　特許出願人 任　所　大阪市北区中之島三Ｊ’Ｌｉ１２番・↓−壮正
正０礒名称）　（Ｑ（１４）鐘淵１ヒ学］二ｌｊ”二（
ニ）、式会社代表者　高１）敞 ４代理人 （２）発明の詳細な説明の欄 イ、明細書５頁３行 ロ、同５頁６行 「及び未反応の」を［及び基質とならなも）未反応の」
に訂正する。

ハ、同５頁−Ｆから７行目及び同頁下から２行目のＣ（
ｉｔ）　−ＩＩ　）を、ともに〔１１〕にｄ」圧する。

二、同５頁下から５行目及び同頁下から２行目の（（Ｓ
）−１）を、ともに〔１〕に訂正する。

ポ、同５頁８行 ・＼、同６頁３行〜１３行の「化合物（（Ｓ）−１）を
・・・・・合成でさることが知られている。」を削除し
、次の文章を加入する。

［使用するエステラーゼが、（（Ｒ，５）−１）のうち
、 のみを特異的に加水分解する場合には、す および を分別採取することが出来、 使用するエステラーゼが、（（Ｒ，５）−１）ノうち、
のみを特異的に加水分解する場合には、り および を分別採取することができる。

これらの化合物１、（Ｓ）−１Ｊ、（（几）−１〕、（
（ｓ）−Ｉｌｌ（（Ｊも）　−ＩＩ　）のうち、化合物
（（Ｓ）−１ｔ）、〔Ｓ〕−（＋）−３−アルキル置換
−５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−２−オンは、
光学活性なβ−受容体遮断薬の重要な合成中間体であり
、本発明を使用して調製できる。すなわち、化合物（（
Ｓｌ−１〕を特異的に水解するエステラーゼを使用した
場合には、本発明ニヨリ［接Ｃ’（Ｓ）−１１］を採取
することができ、化合物〔（几）−１〕を特異的に水解
するエステラーゼを使用した場合には、採取した化合物
ｒ（ｓ）−１）をアルカリ加水分解するか、もしくは化
合物（０，（）−１）を反転することによって得ること
ができる。

このようにして得た化合物（（Ｓ）−１）から次の経路
で容易にβ−受容体遮断薬を合成することができる。」 １−１同８頁１３〜１４行 ［（特願昭５７−１４１５７５．曲・四〇５８４　）。

」を［（特開昭５９−８１６９２゜同５９７８１６９３
．特願昭５７−１９０５８５）。ｊに訂正する。

チ、同９頁１２行目 １−性化合物〔（Ｓ）刊〕及び〔（ａ）　−１ｌ）ｌを
［性化合物（（Ｓ）−１）　、　（（Ｓ）−ＩＩ　）及
び（（Ｒ）−Ｉ　）　、　ｃ（ｍ）−ｎ　）　Ｊに訂正
する。

す、同９頁１３行目 ［従って本発明により、」を１従って本発明により得た
化合物をもとに、」に訂正する。

ヌ、同１０貫下から６〜５行 ［具体的には・・間特願昭５７−１９０５８４に」をｒ
（（Ｒ）−１〕を特異的に水解する酵素については、特
開昭５９’−８１６９８及び特願昭５７−１９０５８５
に」に訂正する。

ル、同１１頁１行「セが挙げられる。」を「セが挙げら
れる。また（＜５）−１）を特異的に水解する酵素につ
い−Ｃは、特開昭５９−８１６９２に記載している微生
物、例えばプレヒバクテリウム属、コリネバクテリウム
属に由来する酵素が使用できる。酵素の形態は、固定化
できる状態であれば精製された標品である必要はない。

無細胞抽出液や硫安分画などで部分精製された酵素を用
いることもてきるし、場合によっては菌体自体も適用し
うる。」に訂正する。

オ、同１１頁６行目の（（Ｒ）−１１）を〔■１〕に旧
。

正し、同頁７行目及び８行目の〔（Ｓ）−１：］を、と
もに〔１〕に訂正する。

ワ、同１２頁１１行目の（（Ｒ）　−ＩＩ　）を〔１〕
に訂正し、同頁１２２行目び１５５行目〔（Ｓ　）−１
〕を、ともに〔１〕に力正する。

力、同１３頁下から３行目の〔（Ｒ）刊しを〔川〕に訂
正する。

３、同１４頁２行目の（（Ｒ）−１ｆ）を〔１〕に訂正
し、同頁５行目及び７行目の（（Ｓ）−１）を、ともに
〔１〕に訂正する。

夕、同１５頁３〜４行及び７行目ノ〔（ｓ）−１〕を〔
１〕に訂正し、同頁６行目の〔（几）−１〕を〔１１〕
に訂正する。

以北 （別紙） 特許請求の範囲 （１）一般式 （式中、几ｌは炭素原子数１〜４個の低級アルキル基、
Ｒ２はアルキル基）で表わされる３−アルキル置換−５
−アシロキシメチルオキサゾリジン−２−オン　ラセミ
体を不斉的に加水分解する能力を有するエステラーゼを
疎水性をもつ担体に固定化した固定化酵素を充填したカ
ラムに（（Ｒ，Ｓ）　−１）を負荷し、水又は緩衝液を
流すことによって不斉氷解反応を行い、それと同時に生
成する親水性の一般式 （式中、Ｒ，は前記と同じ）で表わされる光学活性３ア
ルキルｆｉｌ換−５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン
−２−オンを上記水又は緩衝液によって溶出、採取し、
次いでカラム内の固定化酵素の担体に吸着、保持されて
いる不斉氷解の基質とならない疎水性の一般式 （式中、Ｒ１，Ｒ２は前記と同じ）で表わされる光学活
性３−アルキル置換−５−アシロキシメチルオキサゾリ
ジン−２−オンを有機溶媒を流すことによって溶出、採
取することを特徴とする、一般式 （式中、Ｒ１は前記と同じ）で表わされる光学活性８−
フルキル置換−５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−
２−オン及び一般式 （式中、几１．Ｒ２は前記と同し）で表わされる光学活
性３−アルキルＩ！換−５−アシロキンメチルオキサゾ
リジン−２−オンの固定化酵素による製造方法。

（２）　エステラーゼが、（（ｕ、ｓ）　−１：）のう
ち、−セであり、〔１〕が、一般式 で表わされる（Ｒ）−（−）−８−アルキル置換−で表
わされる〔几）−（’−）−８−アルキル置換−５−ア
シロキシメチルオキサゾリジン−２−オ（４）化合物（
（Ｒ，５）−１）の式中、几１がｔ−フチル基又はイソ
プロピル基である特許請求の範囲第１項記載の方法。

（５）　配合物〔（几、５）−１Ｊの式中、Ｒ２のアル
キル基が炭素原子数２〜１７個である特許請求の範囲第
１項記載の方法。

（６）　エステラーゼの起源が微生物又は哺乳動物の臓
器である特許請求の範囲第１項記載の方法。

（７）疎水性を持つ酵素固定化用担体が合成吸着剤、疎
水クロマＩ・グラフィー用樹脂、疎水性光架橋性樹脂又
は疎水基を化学結合させて導入した高分子物質である特
許請求の範囲第１項記載の方法っ （８）化合物（（Ｓ）−１）の溶出を行う有機溶媒が低
極性有機溶媒である特許請求の範囲第１項記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （式中、Ｒ１は炭素原子数１〜４個の低級アルキル基、
   Ｒ２はアルキル基）で表わされる３−アルキル置換−５
   −アシロキシメチルオキサゾリジン−２−オン　ラセミ
   体を不斉的に加水分解する能力を有するエステラーゼを
   疎水性をもつ担体に固定化した固定化酵素を充填したカ
   ラムに〔（Ｒ，５）−Ｉ〕を負荷し、水又は緩衝液を流
   すことによって不斉氷解反応を行い、それと同時に生成
   する親水性の−（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表わされ
   るＣＲ）−ｉ−１−３アルキル置換−５−ヒドロキシメ
   チルオキサゾリジン−２−オンを上記水又は緩衝液によ
   って溶出、採取し、次いてカラム内の固定化酵素の担体
   に吸着、保持されてし）る未（式中、Ｒ１，Ｒ２は前記
   と同じ）で表わされる［Ｓ：ｌ−（＋１−３−アルキル
   置換−５−アシロキシメチルオキサゾリジン−２−オン
   を有機溶媒を流すことによって溶出、採取することを特
   徴とする、一般式 （式中、Ｒ１は前記と同じ）で表わされる光学活性ＣＲ
   ］＋１−８−アルキル置換−５−ヒドロキシメチルオキ
   サゾリジン−２−オン及び一般式 ０ （式中、Ｊ　＋Ｒ２は前記と同じ）で表わされる光学活
   性［Ｓ）　−（＋１−３−アルキル置換−５−アシロキ
   シメチルオキサゾリジン−２−オンの固定化酵素による
   製造方法。 （２）化合物Ｃ（Ｒ，ｓ）　−Ｉ）の式中、Ｒ１がｔ−
   ブチル基又はイソプロピル基である特許請求の範囲第１
   項記載の製造方法。 （３）化合物Ｃ（Ｒ，５）−Ｉ）の式中、Ｒ２のアルキ
   ル基が炭素原子数２〜１７個である特許請求の範囲第１
   項記載の製造方法。 （４）　エステラーゼの起源が微生物又は哺乳動物の臓
   器である特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 （５）疎水性を持つ酵素固定化用担体が合成吸着剤、疎
   水クロマトグラフィー用樹脂、疎水性光架橋性樹脂又は
   疎水基を化学結合させて導入した高分子物質である特許
   請求の範囲第１項記載の製造方法。 （６）　化合物Ｃ（Ｓ）−ＩＤの溶出を行う有機溶媒か
   低極性有機溶媒である特許請求の範囲第１項記載の製造
   方法。