JPH0125560B2

JPH0125560B2 -

Info

Publication number: JPH0125560B2
Application number: JP55040315A
Authority: JP
Inventors: Saburo Fukui; Atsuo Tanaka; Tomio Kimura; Tetsuo Komata
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 1980-03-31
Filing date: 1980-03-31
Publication date: 1989-05-18
Also published as: JPS56137891A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、微生物の生産するエステラーゼを利
用し、dl−メントールまたはこれを含有するdl−
メントール異性体の混合物より、ｌ−メントール
を生化学的に分離する方法に関するものである。メントールには、その化学構造上４個の立体異
性体（メントール、イソメントール、ネオメント
ール、ネオイソメントール）が存在し、その各立
体異性体にそれぞれｄ体（右旋性）およびｌ体
（左旋性）の光学異性体が存在する。この８種の
メントール異性体中、ｌ−メントールは天然薄荷
油成分であり、他の７種の異性体に比べて清涼感
が最も強く、香料および医薬品として極めて重要
な物質である。従来、ｌ−メントールは天然薄荷油から抽出す
るか、あるいは天然の光学活性体を原料とし合成
されているが、これら天然原料は資源として限界
があり、安価な工業薬品を原料とするｌ−メント
ールの合成法につき研究が進められている。しかし、一般に光学的に不活性な原料からメン
トールを合成すると、光学的に不活性なdl−メン
トール異性体類の混合物として得られる。例え
ば、周知のようにチモールの水素添加により生成
するメントールは、上記８種の異性体全てを含
み、これを熱異性化すると、ある一定の組成比
（例えばdl−メントール：約70％、dl−イソメン
トール：約20％、dl−ネオメントール：約10％、
dl−ネオメントール：微量）の平衡混合物とな
る。このように、光学的に不活性な原料からメン
トールを合成する方法においては、ｌ−メントー
ル以外の異性体の副生は避けられず、これら混合
物からｌ−メントールだけを分離することが重要
な課題となる。従来、これらメントール類の混合物からｌ−メ
ントールを分離する方法として、メントール類の
有機カルボン酸エステルを基質とし、これを微生
物の生産するエステラーゼを利用し、ｌ−メント
ールの有機カルボン酸エステルのみを加水分解す
る生化学的分離法につき、多くの研究、報告がな
されている。またこの分離法において、他の酵素
反応と同様、その操作を簡便化し、連続的にオー
トメーシヨン化するために、微生物またはその処
理物を適当な担体に固定化することも提案されて
いる。ところで、従来の常識として、微生物又はその
処理物は大部分の有機溶媒と接触すると、該微生
物又はその処理物がもつている酵素活性が急激に
低下し、実質的に失活してしまうという一般的見
解が存在しており、そのため、微生物又はその処
理物を利用する酵素反応は水性媒体中で行うのが
普通である。この理由から、従来公知のｌ−メントールの生
化学的分離法は、いずれも水中で行なわれてい
る。しかし、基質のメントール類の有機カルボン
酸エステルおよび生成物のｌ−メントールは、い
ずれも水に不溶性であるため、従来公知の方法
は、 (1) 反応系が不均一となり、基質濃度を高くする
ことができず、また界面活性剤などの使用も必
要とする。 (2) 基質の固定化物への透過性が悪く、反応速度
が遅い。 (3) 生成したｌ−メントールが固定化物に付着
し、その取得率が低くなる。など工業的に重大な問題点を有している。本発明者らは、この実情に鑑み、ｌ−メントー
ルの生化学的分離を有機溶媒中で行なえれば、上
記公知法の諸欠点が改善できるとの観点から、広
範囲の微生物につき、有機溶媒に対する耐性を検
索した。その結果、トリコデルマ属をはじめとす
る特定の一群の微生物またはその処理物中のエス
テラーゼが、メントール類の有機カルボン酸エス
テルに対する有機溶媒に耐性があり、該有機溶媒
に接しても失活することがないことを知見し、ｌ
−メントールの生化学的分離を従来考えられなか
つた有機溶媒中で行なうという、画期的方法の開
発に成功した。すなわち本発明は、dl−メントールの有機カル
ボン酸エステルまたはこれを含有するdl−メント
ール異性体の有機カルボン酸エステルの混合物
を、トリコデルマ属、ロドトルラ属、ノカルデイ
ア属、ミコバクテリウム属、バシルス属、リゾプ
ス属、キヤンデイダ属、ハンセンヌラ属、ストレ
プトミセス属、アエロバクター属、アルスロバク
ター属、シユードーモナス属、ジベレラ属および
トルロプシス属からなる群から選ばれる属に属す
るエステラーゼ生産能を有する微生物またはその
処理物の固定化物に、含水有機溶媒中で接触させ
ることにより、ｌ−メントールを生化学的に分離
する方法を提供するものである。本発明は、光学的に不活性な原料からメントー
ルを合成する際、得られるメントール類からｌ−
メントールを生化学的に分離するに当り、エステ
ラーゼを産する微生物の種類を特定することによ
り、その分離を有機溶媒中で行なうことを可能に
したもので、従来公知の方法に比較し、次のよう
な利点を有している。 (1) 反応系が均一であるため、基質濃度を高める
ことができ、大量生産に適する。 (2) 基質の固定化物への透過性が良く、反応速度
が速い。 (3) 生成したｌ−メントールも使用される有機溶
媒に可溶であるため、ｌ−メントールが固定化
物に付着することがなくその単離が容易であ
る。本発明において、メントール類の有機カルボン
酸エステルの製造に使用されるカルボン酸として
は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、
カプロン酸、ヘプタン酸、アクリル酸、クロトン
酸などの炭素数１〜７の脂肪族飽和（または不飽
和）モノカルボン酸、あるいはシユウ酸、マロン
酸、コハク酸、グルタール酸、アジピン酸、ピメ
リン酸、マレイン酸、フマル酸などの炭素数２〜
７の脂肪族飽和（または不飽和）ジカルボン酸が
有効である。これらのカルボン酸は、アルキル基
またはハロゲン原子で置換されていてもよく、ま
たこれらのカルボン酸とメントール類のエステル
は、アンモニア、アミン類、アルカリ金属あるい
はアルカリ土類金属などの塩として使用に供すこ
ともできる。本発明で使用されるエステラーゼを生産する微
生物としては、下記の属に属するものが挙げら
れ、下記において各属に属する代表的な種名をも
併せて記載するが、本発明の微生物はこれらの例
示の種に限定されるものではなく、またその分類
上の位置に問わずいずれも有用である。なお、下記例示の微生物はいずれも公知のもの
であり、日本微生物株保存機関連盟（JFCC）の
保存機関である財団法人醗酵研究所（IFO）を通
じて容易に入手することができる。 (1) トリコデルマ属トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）
IFO4847 (2) ロドトルラ属ロドトルラ・テクセンシス・バール・ミヌータ
（Rhodotorula texensis Var.minuta）
IFO0412 (3) ノカルデイア属ノカルデイア・アステロイデス（Nocardia
asteroides） IFO3424 (4) ミコバクテリウム属ミコバクテリウム・フレイ（Mycobacterium
phlei） IFO3158 (5) バシルス属バシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）
IFO3026 (6) リゾプス属リゾプス・チネンシス（Rhizopus chinensis）
IFO4868 (7) キヤンデイダ属キヤンデイダ・ウテイリス（Candida utilis）
IFO0396 (8) ハンセヌラ属ハンセヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）
IFO0117 (9) ストレプトミセス属ストレプトミセス・グリセウス
（Streptomyces griseus） IFO3356 (10) アエロバクター属アエロバクター・アエロゲネス（Aerobacter
aerogenes） IFO3320 (11) アルスロバクター属アルスロバクター・シンプレツクス
（Arthrobacter simplex） IFO3530 (12) シユードモナス属シユードモナス・フルロレセンス
（Pseudomonas fluorescens） IFO3081 (13) ジベレラ属ジベレラ・フジクロイ（Gibberella fujkuroi）
IFO5268 (14) トルロプシス属トルロプシス・キヤンデイダ（Torulopsis
candida） IFO0768 これらの微生物のうち、ロドドルラ属、ノカル
デイア属、バシルス属、リゾプス属、ストレプト
ミセス属およびアルスロバクター属に属する微生
物が、使用に供される有機溶媒に対する耐性が強
く、これらの微生物を用いた場合、一層高収率で
ｌ−メントールを取得できる。本発明において、これら微生物をメントール類
のカルボン酸エステルに作用させる方法として
は、液体培地に菌株を培養した培養物、培養液か
ら分離した菌体、あるいは各種酵素分離法に基づ
いて菌体または培養物から分離した粗製エステラ
ーゼ、精製エステラーゼ、およびエステラーゼ含
有抽出液または濃縮液などの処理物、などの形態
で担体に固定化した状態で行なわれる。使用に供される担体としては、アルギン酸、カ
ラギーナン、コラーゲン、セルロース、アセチル
セルロース、寒天、セロフアン、コロジオンなど
の天然物、あるいはポリアクリルアマイド、ポリ
スチレン、ポリエチレングリコール、ポリプロピ
レングリコール、ポリウレタン、ポリブタジエン
などの高分子物質が挙げられる。固定化は、エス
テラーゼ活性を損うことのない緩和な条件下、常
法に従つて行なう。微生物またはその処理物の担体への固定化量
は、菌体の漏出および酵素活性とを考慮し、菌体
１ｇ（湿潤基準）が、担体0.2〜20ｇ、好ましく
は0.5〜10ｇに固定化されるように用いるのがよ
い。本発明におけるｌ−メントールの生化学的分離
に用いられる有機溶媒は、基質であるメントール
類の有機カルボン酸エステルを充分溶解させるも
のであれば、いずれも有用である。その例として
はｎ(i)−ブタン、ｎ(i)−ヘプタン、ｎ(i)−ヘキサ
ン、ｎ(i)−ペンタン、ｎ(i)−オクタンなどの脂肪
族炭化水素、シクロペンタン、シクロヘキサン、
シクロヘプタンなどの脂肪族環式炭化水素、ベン
ゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水
素、メタノール、エタノール、ｎ(i)−プロパノー
ル、ｎ(i)−ブタノールなどのアルコール類、アセ
トン、メチルイソプロピルケトンなどのケトン
類、テトラヒドロフラン、ジメチルエーテル、ジ
エチルエーテルなどのエーテル類、酢酸メチル、
酢酸エチルなどのエステル類、四塩化炭素、クロ
ロホルム、塩化メチレン、塩化メタンなどのハロ
ゲン化炭化水素、あるいはジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。これらの有機溶媒中には、ｌ−メントールの有
機カルボン酸エステルを加水分解させるに必要な
量の水を存在させるが、これら有機溶媒の中で水
の溶解度が低いものでも、その飽和水量程度存在
させれば十分であるので、反応系は不均一相にな
ることはない。基質であるメントール類の有機カルボン酸エス
テルの使用濃度は、有機溶媒を用いるため自由に
調製でき、通常30〜70重量％と高濃度で行なえ
る。また基質と微生物またはその処理物の使用割
合は、菌体１重量部（凍結乾燥基準）に対し、基
質を0.1〜2.5重量部用いるのが好ましい。本発明における接触温度は20〜45℃が適当であ
るが、酵素活性の低下を少くするために通常25〜
35℃で行うのが経済的に有利である。接触時間
は、５〜80時間が適当であるが、接触温度を高め
たりあるいは酵素量を増加させるなどによつて、
接触時間を短縮することも可能である。本発明の方法は、回分式の反応器あるいは連続
流通式の反応器のいずれでも行なうことができ、
後者で行なう場合には液空間速度0.01〜10hr^-1、
好ましくは0.1〜5hr^-1の範囲で行なうのがよい。次に本発明の実施例と比較例を挙げる。なお、
各例においてｌ−メントールの収率は次の式によ
つて算出したものである。ｌ−メントールの収率(%)＝生成ｌ−メントール
のモル数／仕込み基質中のｌ−メントールエステルのモ
ル数×100 実施例１〜14および比較例１〜３トルエンジイソシアネート２モルと、平均分子
量約2000〜3000のポリエチレンオキシド１モルを
混合し、80℃で約３時間反応させ、両端に各１つ
のイソシアネート基を有し主鎖にポリエチレンオ
キシドを有する、平均分子量約2500〜3500のポリ
マーを調製した。このポリマー１ｇに、各種湿潤菌体１ｇを２ml
のリン酸カリウム緩衝液に充分懸濁させた液を混
合し、菌体をゲル内に固定した後、４℃で約１時
間放置しゲルを充分硬化させ、得た固定化物を３
×３×３mmの立方体に切断した。 dl−メントールのコハク酸モノエステル100mg
を、水で飽和したｎ−ヘプタン10mlに溶解させた
後、上記固定化物の切断物を加え、30℃で23時間
振とう（180回／min）した。その結果を第１表に示す。なお表中、半減期は
固定化物を、同様の操作で繰り返し使用し、その
活性が初期活性の半分に低下した時間である。

【表】実施例 15〜24 各種dl−メントールの有機カルボン酸エステル
を基質とし、また水で飽和したｎ−ヘプタンの代
りに水で飽和した各種有機溶媒10mlを用いた他
は、実施例１と同様の操作で実験を行なつた。その結果を第２表に示す。

【表】実施例 25 アクリルアミド7.23ｇとＮ，N′−メチレンビス
アクリルアミド0.37ｇを、リン酸カリウム緩衝液
23mlに溶解した後、ロードトルラ・テキセンシ
ス・バール・ミヌータ（IFO 0412）を２mlのリ
ン酸カリウム緩衝液に懸濁させた液を加えた。次
いでこの液に、NNN′N′−テトラメチレンジア
ミン0.1ｇ／mlの水溶液１mlおよび過硫酸アンモ
ニウム0.05ｇ／mlの水溶液１mlを加えた後、窒素
ガス雰囲気下で０℃に５分間、さらに室温下に１
時間放置し、菌体の固定化物を得た。この固定化物の切断物（２×２×２mmの立方
体）を用いた他は、実施例１と同様の操作でｌ−
メントールの生化学的分離を行なつた。その結果、旋光度〔α〕²⁰ _D−50.0゜のｌ−メント
ールが35％の収率で得られた。実施例 26 ロードトルラ・テキセンシス・バール・ミヌー
タ（IFO 0412）を２mlのリン酸カリウム緩衝液
に懸濁させた液を、アルギン酸ナトリウム0.01
ｇ／mlの水溶液９mlに混合した。この混合液を、
50ｍmolの塩化カルシウム液200mlに添加し、約
１時間放置し菌体の固定化物を得た。この固定化物の切断物（３×３×３mmの立方
体）を用いた他は、実施例１と同様の操作でｌ−
メントールの生化学的分離を行なつた。その結果、旋光度〔α〕²⁰ _D−50.0゜のｌ−メント
ールが50％の収率で得られた。実施例 27 Ｋ−カラギーナン５ｇを生理食塩水95mmに50℃
で溶解した後、この溶液３mlと、ロードトルラ・
テキセンシス・バール・ミヌータ（IFO 0412）
を２mlのリン酸カリウム緩衝液に懸濁させた液を
混合した。この混合液を10℃で30分間放置後、
0.3molの塩化カリウム水溶液に浸し５〜10℃で
一夜放置し、菌体の固定化物を得た。この固定化物の切断物（５×５×５mmの立方
体）を用いた他は、実施例１と同様の操作でｌ−
メントールの生化学的分離を行なつた。その結果、旋光度〔α〕²⁰ _D−50.0゜のｌ−メント
ールが30％の収率で得られた。

Claims

【特許請求の範囲】

１ dl−メントールの有機カルボン酸エステルま
たはこれを含有するdl−メントール異性体の有機
カルボン酸エステルの混合物を、トリコデルマ
属、ロドトルラ属、ノカルデイア属、ミコバクテ
リウム属、バシルス属、リゾプス属、キヤンデイ
ダ属、ハンセンヌラ属、ストレプトミセス属、ア
エロバクター属、アルスロバクター属、シユード
ーモナス属、ジベレラ属およびトルロプシス属か
らなる群から選ばれる属に属するエステラーゼ生
産能を有する微生物またはその処理物の固定化物
に、含水有機溶媒中で接触させることを特徴とす
る、ｌ−メントールの生化学的分離法。