JPS6296096A - オリゴペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、特定の蛋白分解酵素を用いてＮ−置換グリシ
ル−グリシンとフェニルアラニル−ロイシルアルキルエ
ステルとを縮合反応させてオリゴペプチドを製造する方
法に関する。

従　　来　　の　　技　　術 オリゴペプチド、グリシル−グリシル−フェニルアラニ
ル−ロイシン、即ちＧ　ＩＶ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｐ　１）ｅ
−１ｅｕは、デス−Ｔｙｒ’　−エンケファリ：／　（
ｄｅｓ　−Ｔ　ｙｒ’　−ｅｎｋｅｐｈａｌ　ｉｎ）と
呼ばれ、エンケファリン分解酵素（エンケファリナーゼ
）の阻害剤とじて知られている。

しかして、エンケファリン（ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎｌＬ
　−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｅｕ
）は、ブタを初めとする数種の哺乳動物の脳から単離さ
れたモルヒネ様鎮痛ペプチドであり、生体成分の鎮痛剤
として関心が持たれている。一方、生体内に投与された
エンケファリンは、極めて速やかに脳細胞の酵素により
分解されてその生理活性を失う。

従ってエンケファリンを分解する酵素であるエンケファ
リナーゼの活性を抑制すれば、生体内におけるエンケフ
ァリンの相対的濃度上昇をもたらし、鎮痛作用の増強及
びその持続時間の延長が期待できる。このエンケファリ
ナーゼ阻害活性を有する物質としてデス−Ｔｙｒ’　−
エンケファリンが知られているが、現在該化合物は、専
ら化学的合成法により製造されている。

近年、蛋白分解酵素の逆反応を利用して有用ペプチドを
合成しようとする試みが活発になってきており、かかる
蛋白分解酵素を利用してペプチドを合成する方法（酵素
的合成法）は、化学的合成法と比較して、アミノ酸の側
鎖官能基を必ずしも保護しておく必要がないこと、反応
が立体選択的に進行するので安価なラセミ体原料を使用
できること、反応中ラセミ化が起らないこと、常温常圧
で反応が進行すること等の非常に優れた特徴を有してい
る。

反面、酵素的合成法は酵素の基質特異性のために原料と
するアミノ酸の種類に応じて利用できる酵素が決定され
、あるひとつの酵素が如何なるペプチド合成にも利用で
きるというものではなく、目的とするペプチド合成反応
を触媒することのできる酵素を選択すること自体非常に
困難であること、更に確立された酵素的ペプチド合成法
といえども、一般に反応の平衡は基質の方に大きく片寄
っており、収率、反応速度等がかなり低い等の問題点が
ある。殊に、三つ以上の異なるアミノ酸が結合したオリ
ゴペプチドを酵素的に合成する場合には、通常予め二つ
のアミノ酸を結合反応させた後、これに更にアミノ酸を
順次結合反応させていく所謂ステップワイズ法が採用さ
れるが、この方法では第２段階以降の反応に原料基質と
してジペプチド、トリペプチド等を用いる必要があり、
これら原料基質は、合成反応系内で用いられる酵素。

により加水分解されて切断されたり、該切断により生じ
るアミノ酸等が更に合成反応に関与したりすることが多
い。２等副反応が生起する場合、目的物が得られなかっ
たり、多役の副生物が生成して目的物の分離が困難とな
ったり、目的物純度を大巾に低下させる。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、酵素的合成法を駆使して、デスーＴｙ
ｒ’−エンケファリンを製造する新しい方法を提供する
ことにある。特に本発明は、上記オリゴペプチドを、簡
単な操作及び工程で、効率よくしかも高収率、高純度を
もって製造できる実用的技術を提供することを目的とす
る。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、水−酢酸エチル二相系で、バチルス属
金属プロテアーゼを用いてＮ−置換グリクルーグリシン
とフェニルアラニル−ロイシルアルキルエステルとを縮
合反応させることを特徴とするオリゴペプチドの製造法
が提供される。

水明ｐＡｍにおいて、アミノ酸、ペプチド、保護基等の
記載は、当該分野における慣用記号に従うものとする。

本発明者らは、プロテアーゼによるペプチド類の合成に
つき鋭意研究を重ねる過程において、先にジペプチドＰ
ｈｅ−ｐｈｅ及びＡｓｐ−Ｐｈｅの酵素合成法を確立し
た（特開昭６０−４５５９６号公報参照）。引続く研究
において本発明者らは、エンケファリンの合成を最終目
標として、その第一段階としてエンケファリナーゼの阻
害剤であるデス−Ｔｙｒｌ−エンケファリンの酵素によ
る合成（縮合）反応につき研究を重ねた。その結果、上
記縮合反応がサーモライシン即ちバチルス属金属プロテ
アーゼにより触媒され、しかもこの反応が水−酢酸エチ
ル二相系で効率よ〈実施されるという新しい知見を得た
。本発明は、この知見に基づいて完成されたものである
。

本発明方法において一方の基質とするＮ−置換Ｇ　ｌｙ
−Ｇ　Ｉｙ　（以下「酸成分」という）におけるＮ−置
換基は、ペプチド合成反応に慣用されるアミノ基保護基
である。その代表例としてはベンジルオキシカルボニル
基（Ｚ）を例示でき、催に例えばｐ−メトキシベンジル
オキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基（ＢＯ
Ｃ）　、２−クロルベンジルオキシカルボニル基等も包
含される。他方の基質とするＰ　ｈｅ　−Ｌ　ｅｕ−ア
ルキルエステル（以下「塩基成分」という）におけるア
ルキル基も亦慣用されるアミノ酸のカルボキシル保護基
である。

その具体例としては炭素数１〜４のアルキル基、例えば
メチル、エチル、プロピル、ブチル基を例示でき、他に
ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−クロロベンジル基
等もよく知られている。２等原料基質のうちで酸成分と
するＧ　＋ｙ−Ｇ　ＩＶは、Ｇｌｙが光学異性体を有し
ていないため、化学合成法で簡単に合成でき、また市販
されてもいる。塩基成分であるｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｅｕの
各アミノ酸としては、通常いずれもし一体を利用するの
が普通であり、該塩基成分の合成は化学合成法によって
もよいが、本発明に従うＦｆ素内的合成法同様にしてサ
ーモライシンにより合成するのが好ましい。

本発明では、酵素反応を水−酢酸エチル二相系で行なう
ことが重要である。ここで水−酢酸エチル二相系とは、
別個に調製した水相と酢酸エチル相とを用いることを意
味し、実際の反応に当っては両相は撹拌等によりエマル
ジョン状態で均一に混合される。

上記水相としては適当な緩衝液を用いるのがよく、例え
ば（２−ジアミノモルホリノ）エタンスルホン酸（ＹＥ
Ｓ）の水溶液が好ましく用いられる。また該水相には、
そのａｔ−＋を約４〜５程度１−調節するために例えば
水酸化ナトリウム等を加えることができ、更に用いる酵
素の安定化因子として知られている例えば塩化カルシウ
ム等を溶解させることもできる。

本発明方法では、まず上記水相に酸成分を溶解し、酢酸
エチル相に塩基成分を溶解して、両基質の溶液を調製す
る。上記各基質溶液における基質濃度は、適宜に決定さ
れ、反応速度の面からはできるだけ高濃度とするのが好
ましいが、通常いずれも約５〜６０ｍＭ程度の範囲とす
るのがよく、特に塩基成分に対する酸成分の濃度比を、
約０．２〜３の範囲、通常約０．４〜３とするのが好適
であり、この範囲では酸成分濃度が低い程目的とするオ
リゴペプチドの収率は向上する傾向にあり、逆に酸成分
濃度を高くすると目的物収率は若干低下するが、副反応
生成物の生成が抑制される傾向がある。また上記各基質
溶液の使用割合（体積比）は、酢酸エチル相に対して水
相を少なくとも等量とすることにより、目的とする合成
反応が進行し、高収率で目的物が収得される。通常上記
体積比率は、水相に対して酢酸エチル相を約１〜１０倍
量となる範囲で選択するのがよく、この範囲で酢酸エチ
ル相を多量に用いる程目的物純度及び収率は向上する傾
向にある。

本発明方法においては、バチルス屈金厘プロテアーゼを
、上記水相側基質溶液に添加して用いる。

上記酵素剤としては例えば代表的にはサーモライシン（
大和化成株式会社製）が市販されているが、本発明では
特にこの市販品を用いる必要はなく、別途にバチルス属
細菌より￥ＸＡ製される粗酵素液やその精製品等を用い
ることもでき、また他の同様の酵素の性質を有するバチ
ルス属金屈プロテアーゼを用いることもできる。その使
用但は、用いる酵素の力価、反応条件等により異なるが
、通常ナーモライシンの場合は本発明に用いる前記水相
の全容積の約０．２Ｗ／Ｖ％以上、好ましくは約１〜２
Ｗ　／Ｖ％程度とするのがよい。勿論この範囲以上の高
濃度で用いることもできるが、高濃度で用いても目的物
収母等が向上するわけではなく、むしろ経済的に好まし
くない。

本発明の縮合反応は、上記塩基成分を含む酢酸エチル相
と酸成分及び酵素を含有させた水相とを添加混合するか
、上記酢酸エチル相と酵素とを同時に、酸成分を含む水
相に添加混合するか、又は塩基成分と酸成分とを含む酢
酸エチル相と酵素を含む水相とを混合して、混合物（エ
マルジョン）を所定温度で撹拌することにより実施され
る。上記反応時の温度は通常約２０〜５０℃とされるの
がよく、該温度が高い程反応時間は短縮されるが、通常
約４０℃付近とするのが適当である。反応時の水相のｐ
Ｈは、通常約４．５〜６．５の範囲とするのが好ましく
、反応の進行に伴って変化するおそれのある該水相のｐ
Ｈを、上記範囲に維持するために、反応系内には塩酸等
の酸を逐次添加することもできる。また上記撹拌は反応
系が均一状態を保持するように、通常比較的ゆるやかな
条件で行なうか又はｉｎしながら行なうことができる。

更に上記撹拌は反応中宮に連続して行なう必要はなく、
断続的に行なうこともできる。

上記縮合反応によって、目的とするオリゴペプチドが有
機溶媒溶液として得られる。これは、常法に従い有機相
を分取し、ａ縮晶析させるか又は抽出等の操作を行なう
ことにより容易に分離することができ、更に通常の単離
精製手段により精製することもできる。

かくして得られるオリゴペプチドは、そのカルボキシル
基及びアミノ基保護塞を、常法に従い脱離することによ
って、デス−Ｔｙｒ１−エンケファＰネｅ リン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｅｒ−Ｌ−１，ｅｕ）と
することができる。これはエンケファリナーゼ阻害剤と
して有用であり、また更にエンケファリンの合成中間体
としても有用である。

実　　施　　例 以下本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。

実施例　１ （１）　　Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−ＬｅｕＯＥｔの調製０．２
５Ｍトリス塩酸緩衝液（５，ｉＭＣａＣＱ２を含む）と
、等容積の酢酸エチルとを分液漏斗を用いて平衡化＜４
０’Ｃ）させ、酢酸エチルで飽和されたトリス塩酸緩衝
液と、同トリス塩酸緩衝液で飽和された酢酸エチル溶液
とを調製した。

上記で得た酢酸エチル飽和のトリス塩酸緩衝液１０戒に
Ｌ−ＬｅｕＯＥｔ　−ＨＣＱ塩３１３ｍｃ＋（１６０ｍ
Ｍ）を溶かして、ｐ）−１＝７．５の水相側基質溶液を
Ｔ！４製した。

一方、上記トリス塩酸緩衝液で飽和した酢酸エチル１０
ｍ（ｌに、Ｚ−Ｐｈｅ２３９．５ｍｇ（８０ｍＭ）を溶
かして有機相側基質溶液を調製した。

上記水相側基質溶液にサーモライシン２０ｍｇ（０，２
％）を加え、これを有機相側基質溶液と混合し、４０”
Ｃで撹拌しながら反応させて、Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌ
ｅｕＯＥｔを得た。

収率（Ｚ−Ｐｈｅ基準） ５時間反応後　９３．２％ ２４時間反応後　９９．５％ 上記で得られた保護ジペプチドより、酢酸と２５％Ｈｅ
ｒ−酢酸溶液を用いてＺ基を脱離反応させてし−Ｐｈｅ
　−Ｌ　−ＬｅｕＯＥ　ｔを得た。

（２）　　　Ｚ−１３１ｙ−Ｇｌｌ／−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ
−ＬｅｕＯＥｔの製造 先ずサーモライシンの安定化因子である５ｍＭ−ＣａＣ
Ｑ２を含む０．０５Ｍ−ＹＥＳ　（＜２−ジアミノモル
ホリノ）エタンスルホン酸・モノ水和物、同口化学研究
所製）溶液と、等容積の酢酸エチルとを分液漏斗を用い
て平衡化（４０℃）させ、酢酸エチルで飽和されたＹＥ
Ｓ溶液と、同ＭＥＳ溶液で飽和された酢酸エチル溶液と
を調製した。

上記で得たＹＥＳ溶液飽和の酢酸エチル溶液１０−に、
Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−ＬｅｕＯＥｔ　６１．４ｍａを溶解（
終濃度２０ｍＭ）して有機相側基質溶液を調製した。

一方、上記で得た酢酸エチル飽和のＭＥＳ溶液溶液１０
転Ｑ方の基質であるＺ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　ｌｙ　（シグ
マ社製）５３．３ｍａを溶解（ＩＩ濃度２０ｍＭ）Ｉ、
、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でＩ）Ｈを４．５に調節
して水相側基質溶液を調製した。

上記水相側基質溶液に、サーモライシン（大和化成株式
会社製、バチルス冗金属プロテアーゼ、力価９４７０Ｐ
Ｕ／ｍｏ）　４０１１１（Ｊを溶解させ、コレに前記有
機相側基質溶液を加えて４０℃で撹拌して、エマルジョ
ン状態で反応を行なわせた。尚、反応中１Ｎ塩酸を溶液
に添加して水相側ｐＨを４．５に維持した。経時的に有
機相の少量をサンプリングし、下記に示す条件で高速液
体クロマトグラフィーを行ない、生成物量を定１した。

水相中の生成物量は、有機相中のそれと比較して無視で
きるものであった。

く高速液体クロマトグラフィー〉 ｇｉ　　置：高速流体クロマトグラフ （島津製作所製　ＬＣ−３Ａ型） カラム：内径１０ｍｍｘ長さ３００ｍｍ充填剤：ＴＳＫ
−ＧＥＬ　　ＬＳ−４１０Ｋ（○ＤＳ−シリカ　東洋曹
達社製） 溶　媒ニアセトニトリルー水＜５５：４５、リン酸でｐ
Ｈを２．５に調整） 検　出：紫外吸収（２５４ｎｍ） 結果を第１図に示す。第１図において横軸は反応時間（
時間）を、縦軸は生成物収率（％）を示し、曲線（１）
は、目的生成物であるＺ　−Ｇ　１ｙ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐ
ｈｅ−Ｌ−ＬｅｕＯＥｔを、曲線（２）は、副生成物と
するＺ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ＩＶ　−Ｌ　−Ｐ　ｈｅ　
−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−ＬｅｕＯＥｔをそれぞれ示す。

第１図より、目的生成物（デス−Ｔ　ｙｒ’　−ロイシ
ン　エンケファリンの前駆体、曲線〈１）で示される）
の出発基質に対する収率は、約６０％におよび、一方副
生成物としては、上記曲線（２）で示されるペンタペプ
チドのみが僅か６％程度生成するに過ぎないことが判る
。

上記目的物（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｔ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌ
ｅｕＯＥｔ）を、酢酸エチルで抽出し、エバポレーター
で乾固させ、その４ミリモル当りに、酢酸５ｍＱと２５
％ＨＢｒ−酢酸溶液１０−との混液を加え、空温で１時
間反応させてＺ基を脱離除去した。

反応後、系内にジエチルエーテルを添加してＨ８ｒ　−
Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　−Ｌ
　ｅｕｏ　Ｅ　ｔを沈澱として析出させた。これを等量
の炭酸ナトリウムと共に蒸留水に溶かし、分液漏斗でク
ロロホルムと振盪してＧ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌ　−
Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　−Ｌ　ｅｕ□　Ｅ　ｔを抽出し、クロ
ロホルム相を無水［２マグネシウムにて脱水しロータリ
ーエバポレーターで乾固させた。

得られた化合物に０〜４℃で等量の１Ｎ水酸化ナトリウ
ム水溶液を添加してエステル結合を切断し、更に酢酸で
中和し、ロータリーエバポレーターで約１０倍に′ａ縮
し、得られる沈澱物を少量の蒸留水、次いでエーテルで
各々洗浄し、乾燥してＧｌ’／−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−
Ｌ−Ｌｅｕを得た。

比較例　１ 上記実施例１に示した水−酢酸エチル二相系での本発明
方法に見られる効果を明らかにするため、以下の水相系
での比較方法を実施した。

即ち酢酸エチル飽和の１／２０Ｍ−ＭＥＳ−Ｎａ　ＯＨ
緩衝液（ｐ、Ｈ５，４）に、それぞれ終濃度が２００１
Ｍとなるように各基質（Ｚ　−Ｇ　１ｙ−Ｇｌｙ及びＬ
−Ｌｅｕ−Ｌ−ＰｈｅＯＥｔ　）を添加溶解し、更にこ
の水溶液に実施例１で用いたと同一の酵素（０，１％）
を加え、同一条件下に水溶液中で酵素反応を行なわせた
。

反応液を経時的にサンプリングし、実施例１と同一条件
で高速液体クロマトグラフィーを行ない、生成物量を定
量した結果を、第２図に示す。

第２図より明らかな通り、水溶液中での反応では、目的
物の収率は僅か７．５％（曲線（１）参照）に過ぎず、
一方副生成物としては、ペンタペプチドＺ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｈｅ　−し−Ｌ　ｅｕＯＥ　
ｔが約１５％（図中曲線（２）として示す）及び更に高
分子のペプチドである２−−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈ
ｅ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−１ｅｕ□Ｅｔが約１
０％（図中曲線（３）として示す）も生成することが確
認された。

実施例　２ 実施例１において、Ｚ　−Ｇ　ＩＶ−Ｇ　ｌｙの終濃度
を１５ｍ　Ｍ、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−ＬｅｕＯＥｔの終濃度
を５ｍＭ、有截相容積／水相容積比を１０／１、水相酵
素濃度を２％、水相ｐＨを４．５として、同様にエマル
ジョン状態で反応を行なった。

その結果、約８２％の高収率で目的物が製造された。

このように本発明の水−酢酸エチル二相系での酵素反応
によれば、目的物の収率向上が可能であることが判る。

また反応条件の選択によれば、約９０％前後の高収率で
目的物の合成が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１に示す方法における反応時間と収率の
関係を示すグラフであり、第２図は比較例１に示す方法
における同グラフである。 （以　上） 第１図 り応時藺（時閉） 第２　図 反忘・時開（′ｆＦ間）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）水−酢酸エチル二相系で、バチルス属金属プロテ
   アーゼを用いてＮ−置換グリシル−グリシンとフェニル
   アラニル−ロイシルアルキルエステルとを縮合反応させ
   ることを特徴とするオリゴペプチドの製造法。