JPH01501118A - 酵素的方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ジペプチド甘味料の製造に有用な新規な酵素的方法に関する。詳細に は、本発明はし一アスパラギン酸−α−し一フェニルアラニンーメチルエステル およびその誘導体の製造方法における酵素的工程に関する。

発明の背景 ジペプチド系甘味料は、食糧、醸造および薬産業の多くの方面に広く用いられて いる。本発明は大規模に操作し得るジペプチドの簡便経済的に成長の可能性のあ る製造方法を提供する。本発明の方法はし−アスパラギン酸−α−Ｌ−フェニル アラニン−メチルエステル（１−ＡＳＤ−ａ−Ｌ−ＰｈｅＯＭｅ、アスパルテー ム）とその類似体や、欧州特許出願第ＥＰ１０７５９７号明ｍ書に記載されてい るようなアスバル　−ム様化合物の置換Ｎ−フェニルカルバモイル誘導体の製造 に特に有用である。

アスパルテームの一般的な製造法には、酵素的および／または有機化学的方法が ある。ペプチド化学による方法は、一般的にはＮがブロックされたし一無水アス パラギン酸とし一フェニルアラニンメチルエステルとをカップリングして、アス バルタームの２種類の異性形、Ｌ−Ａｓｐ−α−Ｌ−ＰｈｅＯＭｅおよびＬ−Ａ Ｓｐ−β−Ｌ−ＰｈｅＯＭｅを生成させる方法がある。アスパラギン酸は、天然 のアミノ酸に共通のα−カルボキシル基に加えて側鎖のβ−カルボキシル基を有 するために、これらの２種類の異性体が形成される。反応が最適条件下で行われ るときには、異性体の比率は８０％のα：２０％βの程度である。β−異性体は 苦味を有するので、混合物から除く必要がある。

α−異性体だけを形成させることによって、この精製工程の出費を避けることが 望ましい。β−異性体を形成することなく出発物質を所望な生成物へ変換するこ とによっても、原料が節約される。これは、高価な出発物質であるフェニルアラ ニンメチルエステルに関して特に重要である。

β−カルボキシル基を化学的にブロックし、ペプチド結合形成を助けるカップリ ング化合物を用いることによって、この問題を克服する試みが為されてきた。し かしながら、この方法は費用が掛かり、側鎖の保護工程で収量が苔しく低下する 。

酵素的および有機化学的工程を含む別の方法が、トーヨー・ソーダ株式会社［イ ソワ（ＩＳＯＷａ）ら、Ｔｅｔｒａ−ｈｅｄｒｏｎ　１ｅｔｔｅｒｓ　（１９７ ９）　２旦、２６１１ｒ２６１２および米国特許第４４３６９２５号明細！１： ］によって開発された。この方法では、Ｎがブロックされたし一アスパラギン酸 とＬ−ＰｈｅＭｅとを、メタロプロテイナーゼであるサーモリシンによって触媒 されるペプチド結合の加水分解の熱力学的反転によってカップリングする。

しかしながら、多数の関連した欠点がある。ペプチド結合の加水分解が熱力学的 に極めて有利であり、それ故高収量を得るために、反応では！Ｓ質と酵素とを高 １１度にして反応を「反転」方向へ進行させる必要がある。この工程に関する反 応ｍｓは長く掛かるので、生産性に恩彰賢を及ぼす、この方法を高収率で運転す るためには、例えば生成物がより溶解しやすい非相溶性の共溶媒の存装置いて反 応を行うことによって生成物を取り除く必要があることがある。

方法を経済的により成熟したものとするために、他の研究者らはサーモリシンを 不溶性マトリックス上に固定して、反応カラム中に充填した［小山と氷原、Ｃｈ ｅｌｔｅＣｈ２月（１９８４）１００〜１０５；小山ら、（１９８１）Ｊ、　Ｏ ｒｇ、Ｃｈｅｗ、　、４工β１．５２４１−５２４２：中凸ら、（’ｌ　９８５ 　）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　、　３．４５９〜４６４］。

しかしながら、この方法は、Ｎがブロックされたアスバルタームがマトリックス の細孔中に沈澱して、カラムの活性を低下させるので、大規模に運転するには効 率的な方法とは思われない、更に、酵素活性に必須であるカルシウムが浸出する ので、サーモリシンの活性が損失する。

セリンおよびシスティンペプチダーゼを用いるＮがブロックされたジペプチドエ ステルの製造が報告されている［日本化学会秋期大会（１９７６）、４８２〜４ ８６頁、米国特許第４２５８３６＠明１１１１゜含まれる反応は、上記のサーモ リシンによって触媒される反応と類似の熱力学的反転法であり、したがって同様 な制限および欠点を有する。カルボキシペプチダーゼは、タンパクおよびペプチ ドのＣ−末端を開裂するエキソペプチダーゼである。セリンおよびシスティンカ ルボキシペプチダーゼは、ペプチド結合の開裂に加えて、Ｃ−末端エステルおよ びアミド結合も開裂することができる。セリンおよびシスティンプロテアーゼは 、共有結合性ａｍ−ｇ素中間素中形体して、これは続いて親核的攻撃を受ける。

通常は、水は、攻撃によって真の加水分解を生じるが、より強力な親核性基はこ の反応を完結させて新たな化学結合を形成することができる。この型の反応は、 アミツリシスとして知られている。

欧州特許出願第ＥＰＩ　７４８５Ａ号明ｍｓには、カルボキシペプチダーゼ酵素 を用いて、Ｎ−末端がブロックされたアミノ酸エステルとＮがブロックされたア ミノ酸エステルとを反応させることによるＮがブロックされたジペプチドエステ ルの製造法が開示されている。カルボキシペプチダーゼＹのような広範囲の特異 性を有するセリンカルボキシペプチダーゼを用いて、Ｍ’Ｒと親核性基との両方 と、したがってアミツリシス反応のジペプチド生成物がとエステルであるアミツ リシス反応を行うことは、ジペプチドエステル甘味料の形成にとって２つの主要 な欠点を有する。第一に、アミツリシス反応の生成物と親核性基とは、カルボキ シペプチダーゼの基質であるので、親核性基がジペプチダーゼ生成物のカルボキ シル末端へ重合してトリペプチドやより大きなポリベブグドを形成する。第二に 、ジペプチド甘味量の本質的部分であるＣ−末端エステル基は酵素によって加水 分解され、所望な甘味が破壊される。それ故、上記の方法を用いるジペプチドエ ステル甘味料の製造は、実際的ではない。

幾つかの出版物には、プロテアーゼを用いるペプチド結合の形成が開示されてい る（例えば、ウィドマー（ｌＪｉｄｍａｒ）ら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　１９８４　 （１９８４）ニーーラグナルソン（１１，Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ）監修、１９３ 〜２００頁：シエレンベルガ−（Ｓｃｈｅｌ　Ｉｅｎｂｅｒｇｅｒ）ら、Ｐｅｐ ｔｉｄｅｓ　１９８４（１９８４）ニー・ラグナルソン（ｕ、　Ｒａｇｎａｒｓ ｓｏｎ）監修、２０１〜２０４頁：およびヤクブケ（Ｊａｋｕｂｋｅ）ら、（１ ９８５）Ａｎ　ｅｗ、Ｃｈｅｗ、Ｉｎｔ、Ｅｄ、Ｅｎｏｌ、２４　（２）８５〜 ９３頁を参照されたい）。特に、マウスの上皮成長因子の７ラグメントの酵素的 合成の研究において、ウィドマー（１４ｉｄ■ｅｒ）らはＣＰＤＹ、　トリプシ ン、キモトリプシンおよびｖ８プロテアーゼからなる多くの酵素を用いてアミツ リシス反応機構によりペプチド結合形成を触媒した。しかしながら、形成された ペプチド結合はペプチドフラグメントの間にあり、この文献ではジペプチドエス テル甘味料の製造は開示されていない。

ヤクブケ（Ｊａｋｕｂｋｅ）ら（上記文献）も、タンパク分解酵素を用いるペプ チド結合の形成について報告している。

しかしながら、この文献には、エンドペプチドを用いるジペプチド甘味料の合成 は開示されていない。

スタフィロコッカス性ｖ８プロテアーゼは、以前は加水分解の熱力学的反転にお いて２つのポリペブチダーゼの間にペプチド結合を形成するための触媒として用 いられティた（　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｉ、　５ｕｐｐ１．９Ｂ（１ ９８５）１２７）。このスタフィロコッカス性Ｖ８ブＯテアーゼを用いる文献で は、ジペプチドエステルの製造またはアミツリシス反応機構の開発については開 示されていない。

本発明は、ジペプチドエステル、詳細にはジペプチドエステル甘味料を形成する ための改良法を提供する。

発明の要約 本発明によれば、式（Ｉ） Ｒ１−Ｒ２−α−０Ｒ３（Ｉ　） （式中、Ｒ４は酸性アミノ酸またはＮ−末端がブロックされた形状の酸性アミノ 酸であり、Ｒ２はアミノ酸残基であり、Ｒ３はアルキル基、好ましくは０１〜４ アルキル基、最も好ましくはメチル、エチルまたはプロピル基、置換アルキル基 、例えばトリフルオロメチル基、アリール基、例えばベンジル基、または置換ア リール基である）を有するジペプチドエステルのＦｉｉｔ法であって、Ｒ１のエ ステルと式（ＩＩ） Ｒ２−α−０Ｒ３（１） （式中、Ｒ２とＲ３とは上記定義の通りである）を有する化合物とを、セリンま たはシスティンエンドペプチダーゼの存在で、アミツリシスが行われるｐＨで反 応させる工程からなる方法が提供される。

本発明の方法は、セリンとシスティンプロテアーゼは、メタロプロテアーゼによ って用いられる機構とは根本的に異なる類似の反応ｖａＩＩを用いるという事実 を利用している。セリンまたはシスティンプロテアーゼによって共有結合性の基 質−酵素中間体が形成され、これは次に通常は水によって攻撃され、真の加水分 解を生じるが、例えばｌ−−ｐｈｅＯＭｅの７ミノ基のようなより強力な親核性 基はこの反応を完結させてアミツリシスを生じ、新規な化学結合を形成すること ができる。アルカリ性１）Ｈでは、セリンおよびシスティンプロテアーゼは一層 効率的にペプチド結合よりもエステル結合を開裂する。これは、適当な条件下で は限定された特異性を有するセリンまたはシスティンプロテアーゼを用いること によって、Ｎがブロックされたアミノ酸エステルとＮがブロックされていないア ミノ酸エステルとを結合させてＮがブロックされたジペプチドエステルを形成し 、これを連続的に取り出す必要なしに蓄積されることを意味する。

ここで用いられるアミノ酸という用市は、天然に存在するまたは天然には存在し ないアミノ酸を表わす。

アミノ敗残ＷＲ１およびＲ２は、Ｒ１のαカルボン酸基とＲ２のαアミノ酸との 間がペプチド結合によって結合されている。

ここで用いられるαという記号は、結合が７ミノＩＩＦＪ基のα炭素に対するも のであることを表わしている。

基Ｒ１は、如何なる酸性アミノ酸またはその塩でもよく、例えばグルタミン酸ま たはアミノマロン酸、好ましくはアスパラギン酸である。

基Ｒ２は、如何なるアミノ酸残基またはその塩でもよく、例えばメチオニンまた はチロシン、好ましくはフェニルアラニンである。

Ｒ１エステルはアルキルエステル、好ましくはＣアルキルエステル、最も好まし くはメチル、工１〜４ チルまたはプロピルエステル、置換アルキルエステル、例えばトリフルオロメチ ルエステル、アリールエステル、例えばベンジルエステルまたはｌｉ挽ノアリー ルエステルもよい。Ｒ１エステルはα−エステル基またはα−および側鎖エステ ルの混合物であることができる。α−エステルのみが反応に関与するので、未反 応の側鎖エステルは容易に回収し、処理して、リサイクルすることができる。

ＲおよびＲ２は、好ましくはＬ−異性体の形である。

ジペプチドエステル甘味料を製造するためには、墨ＲおよびＲ２を、例えＬ？７ ジノ（ＦｕｊｉｎＯ）ら（１９７６）（Ｃｈｅｗ、　Ｐｈａｒｇ＋、　Ｂｕｌｌ 、２４．２１１２〜２１１７）の当業界の教示にしたがって選択サベきである。

ＩＲｌはＮ−末端を好適なブロッキング基でブロックして、所望ならばジペプチ ドの形成後に、分子の他の部分に影響を与えることなく当業界に周知の物理化学 的方法（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓ　ｎｔｈｅｓ＋ｓ　、ボダンズキイ（Ｂｏ ｄａｎｓｚｋｙ）とオンデツテイ（Ｏｎｄｅｔｔｉ）　Ｕ修（１９６６）インタ ーサイエンス・パブリツシャーズ（ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅ ｒｓ）を参照されたい）を用いて、外すことができる。あるいは、Ｎ−末端ブロ ッキング基を、英国特許出願第ＧＢ２１６０８７０号明細書に記載の酵素的方法 によって容易に外すこともできる。

好適なＮ−末端ブロッキング基には、例えばアリール−低級アルキル基、例えば ジフェニルメチルまたはトリフェニルメチル基であって任意にハロゲン、ニトロ 、低級アルキルまたは低級アルコキシ基によって置換されていてもよい基ニアロ イル基例えばベンゾイル基；アシル基例えばホルミル、アセチル、アセトアセチ ル、トリフルオロアセチルおよびベンゼンスルフェニル基：カルボン酸またはチ オカルボン酸から誘導され、ハロゲン原子、ニドＯＪＩまたは低級アルキル、低 級アルコキシまたは低級カルボアルコキシ基によって芳香族基で任意に置換され ているもの、例えばカルボベンゾキシ、ｐ−メトキシカルボベンゾキシおよびｐ −クロロカルボベンゾキシ：ベンジルオキシカルボニル基；脂肪族オキシカルボ ニル基、例えばｔ−ブトキシカルボニルのようなアルコキシカルボニル基：例え ばハロゲン原子によって［換された脂肪族オキシカルボニル基、例えば１，１． １−トリクＯロエチルオキシカルポニル基またはフルオレニルメトキシカルボニ ル基；カルバモイル、フェニルチオカルバモイルまたはフェニルカルバモイル基 であって例えばアシル基、チオアシル基またはシアン基によって置換されていて もよいものがある。特に好ましいブロッキング基はカルボベンゾキシ、フェニル チオカルバモイルおよびフェニルカルバモイル基であって、所望ならば例えばフ ッ素原子のようなハロゲン原子によって置換されていてもよいもの：アルキルカ ルボニル基、例えばメチルカルボニル基；アルコキシカルボニル基、例えばメト キシまたはエトキシカルボニルミニジアノ基；ニトロ基；またはスルホニルオキ シ基がある。

特に好ましいセリンまたはシスティンエンドペプチダーゼは、スタフィロコッカ ス性■８プロテアーゼ（ＥＣ。

３．４．２１．１９）、ズブチリシン（ＥＣ，３，４゜２１．１４）科の一員、 ククミシン（ＥＣ，３，４，２１，２５）およびパパイン（ＥＣ，３，４，２２ ，２）、およびスタフィロコッカス性■８プロテアーゼ（ＥＣ。

３．４．２１．１９）に類似の基質特異性を有するセリンまたはシスティンエン ドペプチダーゼである。

システィンまたはせリンエンドペプチダーゼは、例えば遺伝学的または化学的に 改質することかできるが、スタフィロコッカス性■８プＯテアーゼ（ＥＣ，３， ４゜２１．１９）に類似の基質特異性を有するものでなければならない。

本発明の方法は、セリンまたはシスティンエンドペプチダーゼが７ミノリシス反 応を行うｐＨで行われる。このｐＨは一般的には、アルカリ性であり、例えばｐ Ｈ７〜１２であり、８〜１０の範囲が好ましい。

セリンまたはシスティンエンドペプチダーゼは、可溶性形で用いることができる 。あるいは、不溶形もしくは固定形で用いて、酵素の安定性を増し且つこの方法 の操作を促進することもできる。

本発明の方法に用いられる酵素の濃度は、モルからナノモルの範囲にあることが できるが、ナノモルから７４９０モルの温度が好ましい。エステル化されたＲ１ アミノ酸の濃度は、好ましくは７４９０モルからミリモルの範囲であり、式（Ｉ ｆ）の化合物の深度は、好ましくはモルからミリモルの範囲にある。本発明の方 法の収率は、一般的には式（Ｉ）の化合物の濃度に比例するので、この化合物を 実施可能な限り高い深度で用いるのが有利である。

本発明の方法で用いられるセリンまたはシスティンエンドペプチダーゼは、自然 にまたは当業界に周知の技法を用いて遺伝子操作を行った後、所望な酵素を産生 ずることができる微生物の株の培養物によって好都合に製造することができる。

システィンまたはセリンエンドペプチダーゼは、当業界に周知の方法を用いてｍ 胞または培養液から部分的または完全にＩｆ製することができる。

反応の工程は、システィンまたはぜリンエンドペプチダーゼが最大活性および安 定性を示す温度、例えば３０℃〜４０℃で行われる。

反応は、好ましくは水性環境中で行われるが、所望ならば水混和性溶媒の存在、 または水混和性／水不混和性溶ｔＪＸ混合物中または不混和性溶媒の存在で水性 環境中で行うことができる。溶媒は、反応収率を増加する効果を有することがあ る。溶媒という用詔は、ｆｆｌ臨界流体をも包含する。

本発明の方法によれば、ジペプチドの所望なα−異性体のみを形成するので、好 ましくない側鎖エステルの不経済な生産および除去を行わないで済む。

本発明の方法によれば、熱力学的に有利な酵素反応を用いることができる。これ によって、反応Ｒ門が速やかになり、酵素の濃度が比較的低くて済む。これは、 本発明の方法を用いるジペプチドニスデル甘味料の製造に含まれる経費に有利な 効果を有する。更に、不混和性共溶媒を必要としないので、反応の工程に用いら れる酵素の安定性と酵素コファクター条件の不在により、本発明の方法が、回分 式または連続方式で大規枝に操作するのに好都合になる。

更に、本発明の方法は、Ｌ−異性体と＾い特異性でカップリングするので、出発 物質のＤ／Ｌ混合物を用いることが可能である。

式１の化合物を塩の形で製造することが所望な場合には、これを当業界に周知の 方法で達成することができる。

所望ならば、Ｒ２が酸性の側鎖を有するときには、Ｒ１とＲ２との両方または一 方を当業界に周知の方法を用いて同じまたは異なる生理学的に受容可能な塩形に 転換することができる。ＲとＲ２とが遊離のアミノ酸を有するときには、これは 当業界に周知の方法を用いて同じまたは異なる生理学的に受容可能な酸付加塩に 転換することができる。例えば、米国特許第４０２９７０１号、３７１４１３９ 号、４４１１９２５号、４０３１２５８号および４０２９７０１号明ｔａ占およ び欧州特許出願第ＥＰ９５７７２号明１［＋徳を参照されたい。

Ｒ１のエステルは当業界に知られており、対応する無水物を、式（■） Ｒ４−ＯＨ（Ｉｌｌ） （式中、Ｒ４は、例えばアルキル基、例えばメチルまたはエチル塁：置換アルキ ルＭニアリール基、例えばベンジル；または置換アリール基である）を有する第 一級アルコールと反応させることによって好都合に製造することができる。反応 は、α−および側鎖のエステル形を両方形成する。これらは、α−興性体のみが 本発明の方法によって酵素によって色倍されるアミツリシスを行うので分離する 必要がない。未反応の側鎖エステルは、本発明の方法によって製造されたジペプ チドエステルから容易に分離し、例えば高１）Ｈ溶液で処理して、エステルを外 し、Ｒ１出発物質を再生させることができる。

式ｉ）の化合物は、当業界に周知の方法を用いて製造することができ、瀝たは商 業的に入手することができる。

本発明を、下記の非制限的実施例と、下記の表の詳細な説明によって更に説明す る。

表−１は、基質として、Ｎ−ベンゾイル（ＢＺ）Ｌ−アスパラギン酸−α−ＯＭ ｅ！、すなわちＮ−ＢＺ−Ｌ−ＡＳｐ−ＯＨおよびＮ−ＢＺ−７スパルタームを 用いる酵素依存性加水分解およびアミツリシス生成物の収率を示す。

表−２は、！！質としてＮがカルボベンゾキシ（ＣＢｚ）でブロックされたし一 アスパラギン酸エステル、すなわちＮ−ＣＢｚ−Ｌ−Ａｓｐ−ＯＨおよびＮ−Ｃ ＢＺ−７スパルタームを用いる酵素依存性加水分解およびアミツリシス生成物の 収率を示す。

表−３は、基質としてＣＢｚ−Ａｓｐ−ＯＭｅおヨヒＣＢＺ−ＡＳＤ−ＯＢＺを 用いるｖ８プロテアーゼによって触媒される反応の反応パラメーターとサーモリ シンによって触媒される反応の反応パラメーターとの皮革を示す。

表−４は、逆相ＨＰＬＣ分析の条件と基質および生成物の保持時間を示す。

態様の詳細な説明 実施例１ 基質としてのα−Ｎ−ベンゾイル−し−アスパラギン酸−α−メチルエステル ５０ミリモルのα−Ｎ−ベンゾイル−し−アスパラギン酸−αメチルエステル（ １，４−ジオキサンの５０％（Ｖ／Ｖ）　）を、１００ミリモルのホウ酸ナトリ ウムＩＩ液（ｐＨ９，０）または１００ミリモルの炭酸ナトリウムン炭酸水素ナ トリウム緩衝液（ＤＨ９，０）で１０分の１に希釈した。固形のし一フェニルア ラニンメチルエステルを加えて、２５０ミリモルのとして、ｐＨを潜水酸化ナト リウムで９．０に再調整した１反応は、溶液を３７℃に加熱し、スタフィロコッ カス性■８プＯテアーゼ（ＥＣ。

３．４．２１．１９＞を添加して最終醇素謬度を１０マイクロモルとすることに よって開始した。各種のインキュベーションＷ＃間の後、一部分を取り出し、５ 分の１容の１％（ｖ／ｖ）　トリフルオロ酢酸／アセトニトリルを添加すること によって反応を停止した。これらの部分をＣ１８カラム（ライニン・マイクロソ ルブ（ＲａｉｎｉｎＨｉｃｒｏｓｏｒｂ）、１５ａｇＸ４．６ａｓ＋内径）を用 いて、逆相ＨＰＬＣによって分析し、溶出液の２６０ｎ−での吸収を観察した。

表−４に、分析条件と、各種ｍｖｔおよび生成物の保持時間を示す。

基質およびその加水分解生成物よりも疎水性である新規なピークが観察された。

このピークと基質加水分解生成物のピークとの収率を、ピークの面積として表わ して表−１に示す、このピークの同定は、下記のようにして分析した。このピー クを含む溶出液を集めて、真空で乾燥し、次いで６Ｍ塩酸中で１０５℃で１６時 間加水分解した。加水分解生成物を真空で乾燥し、ディ・シー・ターネル（Ｄ、 　Ｃ，Ｔｕｒｎｅｌｌ）とジエイ・ディ・エイチ・クーパー（Ｊ、Ｄ、Ｈ，Ｃｏ ｏｐｅｒ）　（Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、（１９８２）　２一旦、５２７〜５３１ 頁）に記載の方法で０−７タルアルデヒドを用いるプレカラム誘専体化で、逆相 ＨＰＬＣ上でアミノ酸分析を行うことによって分析した。この分析では、約等量 のアスパラギン酸とフェニルアラニンとが示された。これは、α−Ｎ−ベンゾイ ル−し−アスパラギン酸−α−−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのピーク と一致する。

実施例２ 基質としてのα−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−アスパラギン酸−α−メチルエス テル １０ミリモルのα−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−アスパラギン酸−α−メチルエ ステルと、３５０ミリモルのし一フェニルアラニンーメチルエステルとを、３０ ℃で緩衝液中またはｐＨ８，５または９．０の水および５％（Ｖハ）の１．４− ジオキサンの存在で１０マイクロモルのスタフィロコッカス性ｖ８ブＯテアーゼ （ＥＣ，３゜４．２１．１９）とインキュベーションした。緩衝液は５０ミリモ ルのビストリスプロパンまたはビシンであった。一部分を経時的に取り出し、５ 分の１容の１％（ｖ／ｖ）　トリフルオロ酢Ｆｌｌ／アセトニトリルを添加する ことによって反応を停止した。これらの部分をＣＩ８カラムを用いて、逆相ＨＰ ＬＣによって分析し、溶出液の２６０ｎ−での吸収をｔｌ！察した。表−４に、 分析条件と、各！！基質および生成物の保持時間を示す。α−Ｎ−カルボベンゾ キシ−し−アスパラギン駁−α−し一フェニルアラニンーメチルエステルに予測 したのと同じ保持時間を有する新規な生成物のピークが観察された。表−２に、 α−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−アスパラギン酸−α−し一フェニルアラニンメ チルエステルと基質の加水分解生成物であるα−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−ア スパラギン酸との収率で表わした結果を示す。α−Ｎ−カルボベンゾキシ−し− アスパラギン酸とα−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−アスパラギン酸−α−し一ア スパラギン酸メチルエステルとの濃度を、既知の濃度の１準と比較することによ ってピーク面積から計算する。これはα−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−アスパラ ギン酸−α−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの標準が入手できなかったの で、行うことができなかった。したがって、この化合物のピーク面積を近似の濃 度に転換するために、面積を、１ミリモルのα−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−ア スパラギンＰ！標準について得た面積で２回割った（すなわち、α−Ｎ−カルボ ベンゾキシ−し−アスパラギン酸とフェニルアラニンメチルエステルとの吸光計 数がほぼ等しいと仮定する）。

実施例３ α−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−アスパラギン酸α−ベンジルエステル α−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−アスパラギン酸−α−ベンジルエステルをαＮ −カルボベンゾイル−し−アスパラギン酸−α−メチルエステルの代わりに用い たことを除いて、実験条件は実施例２に記載したものと同じである。プロテアー ゼの存在で逆相ＨＰＬＣ分析によって新規生成物ピークが観察され、し−フェニ ルアラニン−メチルエステルの保持時間は、基質としてのα−Ｎ−カルボベンゾ イル−し−アスパラギン酸−α−メチルエステルで観察された新規生成物ピーク の保持時間と同じであった（表−４参照）。結果を、表−２に示す・各種化合物 の面積を、実施例２に記載したように濃度に変換した。

表−３はこの実施例と前期実施例とに記載した条件下で得られた反応パラメータ ーを示し、これらを米国特許第４４３６９２５号明１８日に記載のデーターから サーモリシン法について計算した物と比較する。基質としてα−Ｎ−カルボベン ゾイル−し−アスパラギン酸−α−ベンジルエステルでは一特異的生産性は、サ ーモリシン法で得られたものの少なくとも５０倍以上であった。部分的転換およ び容積生産速度は、米国特許第４４３６９２５号明細書の実施例７に記載のサー モリシン法に就いてのものよりも、両方共基質としてα−Ｎ−カルボベンゾイル −し−アスパラギン酸−α−ベンジルエステルを用いるｖ８ブＯテアーゼによっ て触媒される反応の方が大きかった。４個の総ての反応パラメーターは、より高 濃度のフェニルアラニンメチルエステルを用いまたは水活性が有機溶媒の存在に よって低下する場合には、■８プロテアーゼによって触媒される反応に就いて改 良されることが期待された。更に、α−Ｎ−カルボベンゾイル−し−アスパラギ ン酸−α−ベンジルエステルの濃度を更に高くすると、総ての４個の反応パラメ ーターを改善することが期待された（この実施例で用いられる濃度は１０ミリモ ルであり、米国特許第４４３６９２５号明細書の実施例７および１９で用いられ た濃度は、１．２５モルおよび０．２９モルであった）。

実施例４ 迅速原子１ｆｉ９！マススペクトル法によるα−Ｎ−カルボベンゾイル−し−ア スパラギンＭ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとしての新規なピークの同 定実験条件は、実施例３に記載した通りであった。表−４に、ＨＰＬＣ分析の分 析条件とピークの保持時間を示す。新規なピークに対応するＨＰＬＣカラムから の溶出液の部分を数回のＨＰＬＣ実験から集めた。集めた部分を真空で乾燥し、 ５％（Ｖ／Ｖ）酢酸に再溶解した。この一部を、ＶＧ７ナリテイカル（Ａｎａｌ ｙｔｉｃａｌ）　ＺＡＧハイ・フィールド・マス・スペクトロメーターのターゲ ットに付した。迅速原子！ｌｉ撃を陽イオンモードで行い、ｍ７ｚ右付与の（Ｍ ＋Ｈ）＋分子イオンを観察した。予期したα−Ｎ−カルボベンゾイル−し−アス パラギンｌ１ｌ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの分子量は４２８である 。したがって、これらの結果は、新規なピークが上記化合物に対応することを証 明している。

実施例５ 基質としてのα−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−グルタミン酸α−ベンジルエステ ル １０ミリモルのα−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−グルタミン酸−α−ベンジルエ ステルと４００ミリモルのフェニルアラニンメチルエステルを、３０”Ｃで４０ ミリモルのビストリスプロパン緩衝液ｐＨ９，０，１０％（Ｖ／Ｖ）の１．４− ジオキサン中で１マイクロモルスタフィロコッカス性Ｖ８プロテアーゼ＜ＥＣ， ３，４，２１，１９＞の不在または存在においてインキュベーションした。１５ および６０分後に一部分を取り出し、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸を それぞれ２０％および０．２％加えてそれ以上の反応を停止させた。これらの部 分を逆相ＨＰＬＣによって分析した。分析に用いた条件は、ピークの保持時間と 共に、表−４に示した。酵素の存在では、α−Ｎ−カルボベンゾイル−Ｌ−グル タミン酸に対応しない新規なピークが観察された。このピークの保持時間はα− Ｎ−カルボベンゾキシ−し−アスパラギン酸α−ベンジルエステルとα−Ｎ−カ ルボベンゾキシ−し−グルタミン酸α−ベンジルエステルとの保持時間の差に等 しい伍だけα−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−アスパラギンＭ−Ｌ−フェニルアラ ニンメチルエステルの保持時間と異なっていた。したがって、このピークはα− Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−あるふ−フェニルアラニンメチルエ ステルに対応するものと思われる。加水分解生成物のあるものである、α−Ｎ− カルボベンゾキシ−し−グルタミン酸も観察された。

実施例６ 親核性基としてのＬ−フェニルアラニンエチルエステル １０ミリモルのα−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−アスパラギン酸α−ベンジルエ ステルと４００ミリモルのし一フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ−フェ ニルアラニンメチルエステルを３０℃で４０ミリモルのビストリスプロパン緩衝 液ｐＨ９，０，１０％（ｖ／ｖ）の１．４−ジオキサン中で１マイクロモルスタ フィロコッカス性Ｖ８プロテアーゼと共にインキュベーションした。３０分後に 、反応混合物に、アセトニトリルおよびフェニルメチルスルホニルフルオリドを それぞれ２０％および５ミリモルになるように添加した後、逆相ＨＰＬＣによっ て、分析した。分析条件とピークの保持時間を、表−４に示す、酵素とし一フェ ニルアラニンエチルエステルの存在では、し−フェニルアラニンメチルエステル で観察されたピークの保持時間よりも大きな保持時間を有する新規なピークが観 察された。この新炭なピークはα−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−アスパラギン酸 −α−Ｌ−フェニルアラニンエステルエステルに対応するものと思われる。

実施例７ 親核性基としてのＤ−フェニルアラニンメチルエステル １０ミリモルのα−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−アスパラギン酸α−ベンジルエ ステルと４００ミリモルのし−フェニルアラニンメチルエステルまたはＬ−フェ ニルアラニンメチルエステルを３０℃で４０ミリモルのビストリスプロパン緩衝 液衝１ｐＨ９，０，１０％（ｖ／ｖ）　（１）１　、４−ジオキサン中で１マイ クロモルスタフイ０コツカス性ｖ８プロテアーゼと共にインキュベーションした 。１５．６０および２４０分３０”Ｃでインキュベーションした後、一部を採取 し、アセトニトリルおよびフェニルメチルスルホニルフルオリドをそれぞれ２０ ％および０．２ミリモルになるように添加して反応を停止した。これらの部分を 、表−４に記載の条件を用いて、逆相ＨＰＬＣによって、分析した。基質と生成 物ピークの保持時間の保持時間を、表−４に示す、Ｄ−またはＬ−異性体のいず れかの存在においては、α−Ｎ−カルボベンゾキシ−アスパラギン酸−α−フェ ニルアラニンメチルエステルに対応する２２．８分の保持時間を有する新規ピー クが観察された。異性体の存在において１５分インキュベーションした後、総て のα−Ｎ−カルボベンゾキシ−アスパラギン酸αベンジルエステルが使用された 。Ｄ−異性体で形成されたα−Ｎ−カルボベンゾキシ−アスパラギン酸−α−フ ェニルアラニンメチルエステルは、し−異性体で形成されたものの１５％であっ た。したがって、Ｄ−フェニルアラニンメチルエステルはアミツリシス反応にお ける親核性基として関与するがし一フェニルアラニンメチルエステルよりも速度 が遅い。

手続補正書（自発） 昭和６３年　２月−７日

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．式 Ｒ１−Ｒ２−α−ＯＲ３（Ｉ） （式中、Ｒ１は酸性アミノ酸またはＮ−末端がブロックされた形の酸性アミノ酸 であり、Ｒ２はアミノ酸残基であり、Ｒ３はアルキル基、置換アルキル基、アリ ール基または置換アリール基である）を有するジペプチドエステルの製造法であ って、Ｒ１のエステルを、式Ｒ２−α−ＯＲ３（ＩＩ） （式中、Ｒ２とＲ３は上記定義の通りである）を有する化合物を、アミノリシス が行なわれるＰＨでセリンおよびシステインエンドペプチダーゼの存在で反応さ せる工程からなる方法。
2. ２．セリンまたはシステインエンドペプチダーゼはスタフイロコッカスのＶ８プ ロテアーゼである、請求項１記載の方法。
3. ３．ＰＨは７〜１２の範囲にある、請求項１記載の方法。
4. ４．Ｒ１はアスパラギン酸であり、Ｒ２はフェニルアラニンであり、Ｒ３はメチ ルである、請求項１記載の方法。
5. ５．Ｒ１とＲ２とがＬ−異性体形である、請求項１記載の方法。
6. ６．反応を３０℃〜４０℃の温度で行なう、請求項１記載の方法。