JPH0634751B2 - Ｄ−フエニルアラニンの分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、光学的に純度の高いＤ−フェニルアラニンの
分離方法に関する。 Ｄ−フェニルアラニンは鎮痛作用を有し、鎮痛剤のほ
か、抗生物質の合成原料などとしても最近注目を集めて
いる医薬，医薬原料として有用なアミノ酸である。 従来の技術及び発明が解決しようとしている問題点 Ｄ−フェニルアラニンの製造及び分離方法に関しては、
ベンジルヒダントインをある種の微生物が生産する酵素
ヒダントイナーゼを作用させて酵素的にＤ−フェニルア
ラニンを得る方法や、（発酵と工業Vol 138 No.10 P937
外）また、優先晶出法、ジアステレオマー法などの物理
化学的な手法による光学分割法による方法が多数知られ
ている。 前者においては原料ベンジルヒダントインの工業的な入
手に難があり、後者は完全な光学分割はできず、かなり
の量の異性体（Ｌ−体）が混入される。 Ｄ−フェニルアラニンは用途によっては光学異性体の混
入は厳しく制限されており、含有量によってはその商品
価値を低下させる。したがってＤ−フェニルアラニンの
製造においては、極力Ｌ−フェニルアラニンの含有量を
減少させる必要があるが、化学的方法によるＤ−フェニ
ルアラニンの製造においては、得られたＤ−体及びＬ−
体のラセミ体から高純度のＤ−体のみを得る分離に大変
困難をきたす。 例えばＮ−アセチルグリシンとベンズアルデヒドの縮合
などの化学的方法で得られたラセミ体反応液から、通常
のアミノ酸の光学分割法として知られているＮ−アセチ
ル−ＤＬ−アミノ酸のＬ体のみ加水分解するアシラーゼ
酵素を用いたアシラーゼ反応後、反応液を固液分離に付
した場合、加水分解により生成したＬ−フェニルアラニ
ンの溶解度分がＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンの
結晶に付着される。 またアシラーゼ酵素による選択的加水分解反応において
は、効率のよい分離法を考慮するのは勿論だが、Ｌ−フ
ェニルアラニンの生成物濃度が高くなると、反応を阻害
する。したがってＮ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニ
ンのアシラーゼ反応による光学分割においては１回のア
シラーゼ反応のみでは、限度があり、たとえ酵素を多用
してもＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを充分に反
応せしめることはできず、得られるＮ−アセチル−Ｄ−
フェニルアラニン中にかなりの未反応Ｌ−体が混入さ
れ、最終的に加水分解して得られるＤ−フェニルアラニ
ンの高光学純度を得るには問題があることもわかった。 問題点を解決するための手段 本発明者らはこのような問題点を踏まえ、化学的方法に
より得られたＮ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニンの
ラセミ体反応液からＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニ
ンのみを効率よく分離し、高光学的純度を有するＤ−フ
ェニルアラニンを得る方法を鋭意検討し、本発明方法に
達したものである。 すなわち、本発明方法は、１）Ｎ−アセチル−ＤＬ−ア
ミノ酸のＬ体のみ加水分解するアシラーゼ酵素を用い
て、Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニンを処理し、
Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンのみ加水分解し、
得られたアシラーゼ反応液を、２）濃縮後冷却してでき
るだけ多くのＬ−フェニルアラニンを結晶として晶出分
離するか、または反応液に無機酸を添加してpHを１以下
にすることにより、Ｌ−フェニルアラニンのみを完全に
溶解してろ液として分離するかのいずれかの方法で、Ｌ
−フェニルアラニンを分離後、３）主にＮ−アセチル−
Ｄ−フェニルアラニン及び未反応のＮ−アセチル−Ｌ−
フェニルアラニンよりなるろ液または結晶を、再度上記
のアシラーゼ酵素により処理して、４）得られた反応終
了液のpHを１以下にして、生成残存するＬ−フェニルア
ラニンを溶解させて、固液分離し、５）得られたＮ−ア
セチル−Ｄ−フェニルアラニン結晶を加水分解に付する
ことよりなる、光学的に高純度のＤ−フェニルアラニン
を得る方法である。 本発明は以下の様にして実施する。 Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニンのアシラーゼ酵
素によるアシラーゼ加水分解反応は、Ｎ−アセチル−Ｄ
Ｌ−フェニルアラニンの５〜４０％水溶液を苛性ソーダ
で中性付近もしくは弱アルカリ付近まで中和した水性媒
体中で、温度３０〜６０℃、反応時間１０〜７０Hrで実
施するのが好ましく、またアシラーゼの安定化のために
通常行なわれている様にCoCl₂・6H₂Oを添加し系内のコバ
ルトイオン濃度が１０^-6Ｍ〜１０^-2Ｍの濃度となるよう
にして実施するのが望ましい。 上記の様な方法で得られたアシラーゼ反応終了液中に
は、加水分解により生成したＬ−フェニルアラニンの溶
解度が２％前後であるため、溶解度分以外のＬ−フェニ
ルアラニンの結晶が析出しており、未反応のＮ−アセチ
ル−Ｌ−フェニルアラニンとＮ−アセチル−Ｄ−フェニ
ルアラニン及び溶解度分のＬ−フェニルアラニンは溶液
となっている。この反応水溶液からなるべく多くのＬ−
フェニルアラニンを系外へ除去するために、アシラーゼ
反応マスを濃縮した後、冷却を行ない固液分離によりＬ
−フェニルアラニンを系外へ除去する。その際、好まし
くはＬ−フェニルアラニンの濃度が２０％程度となるま
で濃縮を行ない、０〜１０℃まで冷却してＬ−フェニル
アラニンの結晶を固液分離するのがよい。 また本発明においては、上記の濃縮、冷却による方法以
外に、Ｌ−フェニルアラニンを分離する方法としてアシ
ラーゼ反応終了後、直ちにPHを塩酸などで１以下にし
て、生成しているＬ−フェニルアラニンを完全に溶解さ
せ、ろ液として分離することもできる。その場合はＮ−
アセチル−Ｄ−フェニルアラニン及び未反応のＮ−アセ
チル−Ｌ−フェニルアラニンは結晶として析出するので
これを分離する。その際、水でよく洗浄して付着してい
るＬ−フェニルアラニンを十分除去するのがよい。 このようにしてＬ−フェニルアラニンを固液分離して得
られた、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン及び未反
応のＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン及び若干のＬ
−フェニルアラニンを含むろ液または結晶は、Ｌ−フェ
ニルアラニン濃度が0.5％以内となる様に水で希釈さ
れ、この水溶液中に新たにＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ
酸のＬ体のみ加水分解するアシラーゼ酵素を添加して再
度反応を行なわせる。 これにより、アシラーゼ酵素反応阻害もなく、未反応の
Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンは再度加水分解さ
せることができて極力減らすことができる。 二回目のアシラーゼ反応が終了したら、溶液のPHを塩酸
などで１以下とすることにより、生成しているＬ−フェ
ニルアラニンを溶解させ、未反応物のほとんど含まれな
いＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンを析出させ固液
分離により単離する。その際好ましくはアシラーゼ反応
終了液は濃縮などによりＮ−アセチル−Ｄ−フェニルア
ラニンの濃度を高くしておく方がよい。 かくして光学純度の高い、すなわちＤ−体含量９９％以
上のＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンを得ることが
できる。 本発明のアシラーゼ反応において使用するアシラーゼ酵
素は、選択的にＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸のＬ−体
のみを加水分解するものであればいかなる菌体より取得
されたものでもよいが、アシラーゼ反応は通常中性付近
もしくは弱アルカリ付近で行なわれており、従って本発
明においても至適PHが６〜９付近のアシラーゼを使用す
るのが好ましい。例えば、アスペルギルス属、ペニシリ
ウム属の菌など公知の糸状菌、シュードモナス属菌など
公知細菌、ストレプトミセス属などの公知の放線菌など
から得られたものが使用できる。 本発明方法により得られたＮ−アセチル−Ｄ−フェニル
アラニンの加水分解は、常法に従い実施できる。即ち塩
酸使用量がＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンの1.25
倍モル程度、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンの濃
度が１０〜３０％の塩酸水溶液中で、加熱還流を数時間
行ない冷却、中和して析出した結晶を固液分離すること
により高収量で光学純度の高い（光学純度９９％以上）
Ｄ−フェニルアラニンを得ることができる。 また副生したＬ−フェニルアラニンは、単離してＬ−フ
ェニルアラニン製品としても良いし、あるいはラセミ
化、アセチル化によりＮ−アセチル−ＤＬ−フェニルア
ラニンとして再使用することもできる。 以下実施例を示す。 実施例１ Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニン１００ｇをイオ
ン交換水及び２０％苛性ソーダ水溶液にて溶解し、PH7.
5に合わせる。CoCl₂・6H₂Oを反応系内のCo²⁺濃度が５×
１０^-4Ｍとなる様に添加した。反応液の全重量が550gと
なる様にして、天野製薬（株）製アシラーゼ酵素1.4g(1
8,000U/g）を添加して４０℃／40Hrで反応を行った。反
応開始後10Hr付近より結晶が析出し始めた。 反応終了後、反応液を減圧下（約100mm/Hg）で濃縮し、
水留去を行ない濃縮液180g（Ｌ−フェニルアラニン２０
％濃縮液）を得た。 反応終了マスのＨＬＣ分析の結果、Ｎ−アセチル−Ｌ−
フェニルアラニンよりＬ−フェニルアラニンへの転換率
は８８％であった。 次に濃縮液を冷却して、10℃／２Ｈｒ晶出後、ヌッチェ
により真空ろ過を行ない、Ｌ−フェニルアラニンの粗結
晶を約４０ｇ（Dry換算33.0g）とろ液１４１ｇを得た。
ろ液中のＬ−フェニルアラニン濃度は1.5％であった。 得られたろ液を水で希釈して全体を４５０ｇとし、さら
に２０％苛性ソーダ水溶液にてPHを7.5に合わせた。つ
いで天野製薬（株）製アシラーゼ酵素0.7ｇを添加して4
0℃／40Hrで２回目の反応を行なった。２回目アシラー
ゼ反応終了後の反応液中のＬ−フェニルアラニン濃度は
0.47％より1.4％まで上昇し、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェ
ニルアラニンの大部分がＬ−フェニルアラニンへ転換し
ていることを示す。 得られた反応終了液を約300ｇまで減圧下に濃縮し、室
温にて濃塩酸を加えてPH１とした。引続き10℃／２Hr晶
出を行ない、ヌッチェで真空ろ過後水洗，乾燥を行な
い、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンの結晶42.8ｇ
を得た。 この結晶は純度99.6％、旋光度▲〔α〕²⁰ _D▼＝−40.2
°（Ｃ＝２，CH₃OH）であり、光学的にほぼ純品のＮ−
アセチル−Ｄ−フェニルアラニンであることが確認され
た。 上記により得られたＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニ
ン25ｇを、濃塩酸及び水に溶解して、全容量が１００
ｇ、塩酸濃度を７％として、加熱還流を８Hr行ない、冷
却後３２％苛性ソーダ水溶液にてPHを5.0とし、10℃／
２Hr晶析を行なった。 ヌッチェによる真空ろ過し、水にて洗浄後、結晶を乾燥
して白色のＤ−フェニルアラニン精結晶15.2ｇを得た。 本品は純度100.1％、▲〔α〕²⁰ _D▼＝＋３４６°（Ｃ＝
２、水）であり、光学異性体分離用カラム（ダイセル社
製キラルパック）で分析した結果、Ｌ−体は0.3％の混
入であった。 比較例 実施例１と同様に行なった。ただしアシラーゼ酵素使用
量は倍量の2.8ｇとし、２回目のアシラーゼ反応はカッ
トした。得られたＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン
の旋光度▲〔α〕²⁰ _D▼＝−36.2°（Ｃ＝２、CH₃OH）と
低く、さらにこれより得られたＤ−フェニルアラニンの
▲〔α〕²⁰ _D▼＝＋29.4°と低かった。この場合Ｌ−体
の８％が混入していた。 実施例２ 実施例１と同様にして一回目の光学分割反応を行ない、
濃縮液を得た。濃縮液に室温にて濃塩酸８６ｇを加えて
PHを1.0とし、５℃に冷却、２Hr晶出を行なった。析出
している未反応のＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン
を含むＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンの結晶をろ
別し、乾燥後４６ｇを得た。 この結晶は、純度98.7％、旋光度〔α〕²⁰ _D＝−32.4°
（Ｃ＝２、CH₃OH）。光学純度は約９０％であった。 得られた結晶４０ｇを用いて水及び２０％苛性ソーダ水
溶液にてPHを7.5、全容量を220ｇとなる様にし、天野製
薬（株）製アシラーゼ酵素0.7ｇを添加して40℃／40Hr
で２回目の反応を行なった。反応液中には新たにＬ−フ
ェニルアラニンが重量で2.9ｇ生成しており、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−フェニルアラニンの大部分はＬ−フェニルア
ラニンへ転換していることを示す。 上記により得られた反応終了液を室温にて濃塩酸を加え
PH1.0とし、さらに10℃／２Hr晶出後ヌッチェで真空ろ
過、水洗、乾燥を行ない、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニル
アラニンの結晶３２ｇを得た。 この結晶は純度99.8％。〔α〕²⁰ _D＝−40.3°（Ｃ＝
２、CH₃OH）であり、ほぼ純品のＮ−アセチル−Ｄ−フ
ェニルアラニンであることが確認された。 上記により得られたＮーアセチル−Ｄ−フェニルアラニ
ン２５ｇを用いて実施例１と同様に加水分解を行ない、
Ｄ−フェニルアラニン精結晶14.8ｇを得た。本品は純度
99.8％、〔α〕²⁰ _D＝＋34.8°（Ｃ＝２、水）であり光
学異性体分離用カラム（ダイセル社製、キラルパック）
で分析した結果、Ｌ−体は0.2％の混入であった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】１）Ｎ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸のＬ体
   のみを選択的に加水分解するアシラーゼ酵素を用いて、
   Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニンを処理し、Ｎ−
   アセチル−Ｌ−フェニルアラニンのみ加水分解してＬ−
   フェニルアラニンとし、得られたアシラーゼ反応液を、 ２）濃縮、冷却して反応液中のＬ−フェニルアラニンを
   結晶として固液分離した後、 ３）主にＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン及び未反
   応のＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンよりなるろ液
   を、再度上記のアシラーゼ酵素で処理して、Ｎ−アセチ
   ル−Ｌ−フェニルアラニンのみ加水分解してＬ−フェニ
   ルアラニンとし、 ４）得られた反応終了液のｐＨを１以下にして生成した
   Ｌ−フェニルアラニンを溶解させ、 ５）固液分離して得られたＮ−アセチル−Ｄ−フェニル
   アラニンの結晶を加水分解に付すことよりなる、光学的
   に純度の高いＤ−フェニルアラニンの分離方法。
2. 【請求項２】１）Ｎ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸のＬ体
   のみを選択的に加水分解するアシラーゼ酵素を用いて、
   Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニンを処理し、Ｎ−
   アセチル−Ｌ−フェニルアラニンのみ加水分解してＬ−
   フェニルアラニンとし、得られたアシラーゼ反応液を、 ２）ｐＨを１以下にして、反応液中に生成したＬ−フェ
   ニルアラニンをろ液として固液分離した後、 ３）主に、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン及び未
   反応のＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンよりなる結
   晶を、再度上記のアシラーゼ酵素で処理して、Ｎ−アセ
   チル−Ｌ−フェニルアラニンのみ加水分解してＬ−フェ
   ニルアラニンとし、 ４）得られた反応終了液のｐＨを１以下にして、生成し
   たＬ−フェニルアラニンを溶解させ、 ５）固液分離して得られたＮ−アセチル−Ｄ−フェニル
   アラニンの結晶を加水分解に付すことよりなる、光学的
   に純度の高いＤ−フェニルアラニンの分離方法。