JPH052317B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はジペプチドエステルとアミノ酸エステ
ルとの付加化合物の製造方法に関する。更に詳し
くはアスパラギン酸及び塩化ベンジルオキシカル
ボニル並びにフエニルアラニン及びメタノールか
ら酵素反応を利用してＮ−ベンジルオキシカルボ
ニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラ
ニンメチルエステルとフエニルアラニンメチルエ
ステルとの付加化合物を製造する方法に関するも
のである。

アミノ基を保護したモノアミノジカルボン酸と
カルボキシル基を低級アルコキシ基等で保護して
エステルとしたモノアミノモノカルボン酸とを蛋
白分解酵素の存在下で反応させ更に反応生成物
と、このカルボキシル基をエステル化したモノア
ミノモノカルボン酸との付加化合物を形成させ
て、ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの
付加化合物を製造することは公知である（特開昭
53−92729号）。

こうして得られる付加化合物は食品、医薬品等
の中間体として重要なものであるが、そのうちで
もＮ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル
とフエニルアラニンメチルエステルとの付加化合
物（以下ZAPM・PMと略記する）は容易に低カ
ロリー甘味剤であるアスパルテームに誘導できる
ことから特に重要である。

上述した公知の方法では、ZAPM・PMはいず
れもＮ−ベンジルオキシカルボニルアスパラギン
酸（以下ZAと略記する）又はその塩及びフエニ
ルアラニンメチルエステル（以下PMと略記す
る）又はその塩を出発原料として製造されてい
る。その場合これらの出発原料はいずれも純度の
高い状態に単離（結晶化）したものを用いてい
る。酵素を用いる反応では反応系に夾雑成分があ
ると場合によつては酵素の阻害、失活が起る恐れ
があるので、これらの共存を避けて反応を行うの
が一般的である。

結晶ZAは通常アスパラギン酸と塩化ベンジル
オキシカルボニルを塩基の存在下水溶液中で反応
させたのち、酸を加えて反応液のPHを酸性側にし
てZAを結晶化させ、単離、乾燥させることによ
り得られる。一方の原料であるPM（塩酸塩）は
フエニルアラニンを塩化水素の存在下メタノール
中でメタノールと反応させたのち、メタノールを
留去し生成したPMの塩酸塩の結晶を単離し、乾
燥させることにより得られる。

本発明者らはこれらの原料の製造工程と酵素反
応とを有機的に結合させることによつて、用いる
酵素を失活させることなしに製造工程数と用いる
副原料の使用量を減少させることを目的として研
究を行つて本発明に到達した。

即ち本発明はアスパラギン酸と塩化ベンジルオ
キシカルボニルを水溶液中、塩基の存在下で反応
させてZAを含む水溶液を調製し、別にフエニル
アラニンを酸の存在下でメタノールと反応させて
PMを生成させ、過剰のメタノールを水で置換し
てPMの水溶液とし、先に調製したZAを含む水
溶液と混合し、これに蛋白分解酵素をその実質的
に起きない条件下で添加し、蛋白分解酵素が酵素
活性を示す条件下でZAとPMとを反応させて
ZAPM・PMを析出させこれを回収することを特
徴とするジペプチドエステルとアミノ酸エステル
との付加化合物の製造方法を提供するものであ
る。

本発明で用いるアスパラギン酸及びフエニルア
ラニンはそれぞれのＬ−体又はＬ体とＤ−体の混
合物を用いる。

本発明の第一段の工程の一方の反応であるZA
の水溶液の調製反応はアミノ酸のアミノ基の保護
基であるＮ−ベンジルオキシカルボニル基導入の
一般的な方法（シヨツテン−バウマン法）に従つ
て行うことができる。即ち約５ないし約50％のア
スパラギン酸とアスパラギン酸に対してモル比で
１ないし約３倍量の塩基を含む水溶液中にアスパ
ラギン酸に対してモル比で１ないし約２倍量の塩
化ベンジルオキシカルボニルを加えさらに同じく
約１ないし約３倍量の塩基を反応液の温度が０な
いし30℃の間で添加する。アスパラギン酸（及び
塩基の一部）に代えてアスパラギン酸の塩を用い
てもよい。ここで使用する塩基性物質はアンモニ
ア、１級および２級アミン以外のものであれば有
機および無機のいずれの塩基も使用することがで
きる。これらのうちでも水酸化ナトリウムや水酸
化カリウムのような水酸化アルカリ金属類、およ
び炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナト
リウム、炭酸水素カリウムのようなアルカリ金属
類の炭酸塩を工業的見地から特に好適な例として
挙げることができる。このようにして製造した
ZA水溶液はそのまま次工程へまわすことができ
るがベンジルアルコール、未反応の塩化ベンジル
オキシカルボニル等を含んでいるので、トルエ
ン、エチレンジクロリド、石油エーテル、メチル
イソブチルケトン等の水と二相を形成することの
できる有機溶媒で洗浄した後使用することが望ま
しい。またこれらの溶媒の存在下でＮ−ベンジル
オキシカルボニル化反応を行い反応後二相を分離
してZAを含む水溶液を調製してもよい。

本発明の第一段の工程の他方の反応であるPM
水溶液調製の反応は酸の存在下、アミノ酸のメタ
ノール中におけるエステル化の一般的な方法（フ
イツシヤー法等）によりフエニルアラニンとメタ
ノールを反応させたのち、メタノールを水と置換
するものである。

ここで使用される酸の種類としては、無機酸、
有機酸とを問わない。例えば無水の塩化水素、臭
化水素、硫酸、トルエンスルホン酸等を使用でき
るが、工業的見地からは塩化水素、硫酸が特に好
適である。エステル化はフエニルアラニンに対し
て少なくとも当量以上一般的には当量比で約1.5
ないし約20倍量の酸の存在下エタノール中約10℃
から還流温度の範囲内において一般的に行われ
る。しかしながらあまり多量の酸を用いると中和
の際に多量の塩が生成するため塩の析出がその後
の工程で起りやすい。従つて好ましくはフエニル
アラニンに対して約1.5倍ないし約５倍量である。
メタノールは通常フエニルアラニンに対して大過
剰量用いる。

反応液からは反応終了後これに水を加えたのち
又は水を加えながらメタノールを留去する等の方
法によりメタノールを水と置換することができ
る。しかしながら、メタノール留去中に酸による
PMの加水分解が生起しやすいので、過剰の酸を
あらかじめ塩基により中和すると、メタノール留
去中の加水分解を効果的に抑制することができ
る。このようにして得られたPMを含む水溶液は
そのまま又は含有するPMの濃度により、濃縮又
は水で希釈したのち、前述の様にして調製した
ZAの水溶液と混合する。また塩基を加えてPM
を遊離の形としたのち、適当な有機溶媒を用いて
抽出し、さらに分液後有機相を酸性水溶液と混合
接触させ、再びPMを水相側に抽出しPMの水溶
液としてよい。

このようにして得られらZAを含む水溶液と
PMを含む水溶液を混合しZAとPMを含む水溶液
とする。混合割合は混合水溶液中のZAとPMの
量が後述する酵素反応によるZAPM・PMの製造
条件として適当な範囲となる様に行う。この範囲
を多少はずれた割合となる場合でも、他の方法で
得たZAやPMを追加してこの範囲内となる様に
してもよいことは当然である。

本発明はこのようにして調製したZAとPMの
混合水溶液に蛋白分解酵素を添加し、第二段の反
応である酵素反応によるZAPM・PMの生成析出
を行わせるものである。蛋白分解酵素の添加は混
合水溶液の液性がその失活を起さない様な状態で
行う必要があるが、混合前のZA及びPMの水溶
液の液性がそれぞれ塩基性及び酸性であり、混合
によつて中和が起るので中性近傍への液性の調節
は容易である。

本発明の方法で用いる蛋白分解酵素としては、
チオールプロテイナーゼ、セリンプロテイナー
ゼ、酸性プロテイナーゼ等も使用できるが、活性
中心に金属イオンを有する酵素、即ち金属プロテ
イナーゼが最も好ましい。その例としては微生物
起源のもの、例えばタシナーゼＮ等の放線菌起源
のプロテイナーゼ、プロリシン、サーモライシ
ン、PS−プロテアーゼ等の細菌起源のもの、コ
ラゲナーゼ、クロタルスアトロツクスプロテアー
ゼ等を挙げることができる。粗製の酵素例えばサ
ーモアーゼ等も使用できる。粗製の酵素が夾雑す
るエステラーゼ作用等を有する場合には、ポテト
インヒビターなどの阻害剤を併用してもよい。パ
パイン等のチオールプロテイナーゼ又はトリプシ
ン等のセリンプロテイナーゼ類を用いる場合に
は、エステラーゼ作用を伴うのでエステル加水分
解反応による副反応が起きないよう注意して反応
を行う必要がある。

本発明のZAPM生成反応は上述のようにして
調製したZAとPMとの混合溶液中添加した蛋白
分解酵素が酵素活性を示すPH条件のもとで反応さ
せるものである。本発明のZAPMとPMとの付加
化合物形成反応もPH依存性があり、したがつて本
発明の第二段の反応はPH約４乃至約９の範囲内で
行うことができる。しかしながらアルカリ側では
PMの加水分解反応が平行して起こるため、PH８
以下で行うのが最も好ましい。本反応において使
用されるZAおよびPMは前述したようにそれぞ
れＬ−体であつてもよいしＤ−体を含むＬ−体で
あつてもよい。ペプチド結合形成反応にはＬ−体
のみが関与する。ZAのＤ−体は共存しても反応
を妨害しない。PMがＬ−体とＤ−体の混合物の
場合にはペプチド結合形成反応により生成した
ZAPMはＤ−体のPMと優先的にZAPM・PMを
形成し系外に析出してくる。従つてZAPM生成
反応はＬ−体のZAに対してＬ−体PMが少くと
も当モル以上であればよいが、生成したZAPM
はPMと水に難溶性のZAPM・PMを形成するの
で、Ｌ−体のZA1モルに対してPMは少くとも１
モルのＬ体を含み、全体量が２モル以上あること
が必要である。従つてＬ体のZA1モルに対して
PMは少なくとも約１モル乃至約５モルのＬ−体
を含み全量が約２モル乃至５モルあることが望ま
しい。

本発明の方法においてペプチド結合形成反応が
平衡反応であることから、酵素反応液中の基質の
濃度はなるべく高い方が、即ち基質に対する水性
媒体の量はなるべく少ない方が好ましい。しかし
ながら少なすぎると反応終了時の反応液が高度の
粘度を有する懸濁状態となり反応液の後処理が困
難になる。従つて反応液中の水分量はＬ−体の
ZAの１重量部に対して５乃至25重量部が好まし
い。従つて反応に際して反応液中の水分量がこれ
らの下限以下の場合には希釈を、上限以上の場合
には両基質の混合液もしくはそれぞれの製造工程
からの水溶液をこの範囲内に収まるように濃縮す
ることが望ましい。

本発明の方法で使用する酵素の量は限定的でな
い。使用濃度が高ければ反応は単時間で完了する
が濃度が低いとそれだけ反応時間が長くなる。し
かし一般的には両出発物質（基質）１ミリモルに
対して２乃至400mg（５×10_-3乃至１×10^-2ミリ
モル）程度好ましくは５乃至100mg（１×10^-4乃
至３×10^-2ミリモル）程度である。反応時間は反
応温度および触媒である酵素の使用量によつて一
義的に限定することはできないが、通常30分ない
し50時間程度が望ましい。

本発明の第二段の工程の反応は温度約10℃ない
し約90℃、酵素活性を維持する観点から好ましく
は約20℃ないし約50℃で行うものである。

析出したZAPM・PMは過、溶媒抽出等の慣
用の手段で容易に回収することができる。本発明
の方法では第一段の工程の両反応によつて得た
ZA及びPMの水溶液を混合して調製した混合水
溶液はZAとPMとの酵素反応及び引続く
ZAPM・PMの生成反応を阻害せずこれらの反応
は極めて円滑に進行する。

前述したZA製造工程では、通常Ｎ−ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アス
パラギン酸（以下ZAAと略記する）の副生が避
けられない。酵素反応によらない方法でZAAを
含むZAをPMと反応させると、通常無視できな
い量のＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラ
ニンメチルエステル（以下ZAAPMと略記する）
が副生する。ZAAPMはZAMPからの分離が容
易でなく、また後工程へ残るとZAPM同様脱Ｚ
化されてＬ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルとなり、こ
れもまた、目的物であるα−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルとの分離が
困難であるので極めて好ましからざる副生物であ
る。酵素法によるZAとPMとの反応においても
ZAAが共存すればZAAPM又はそのPMとの付加
化合物が副生することが予想される。ところが本
発明の方法では意外にも得られるZAPM・PMに
ZAAPM又はそのPMとの付加化合物による汚染
はほとんどない。本発明の方法ではまたZA及び
PMを単離する必要がないので全体としての工程
数を大きく減らすことができ、それによつてそれ
らの省略された工程での原料、中間体などの損失
を避けることができる。Ｚ化およびエステル化の
反応で、未反応で残つたフエニルアラニン及びア
スパラギン酸は縮合工程で生成したZAPM・PM
を分離した残液から、縮合工程で未反応物として
残つているPM及びZA、さらには副反応でPMが
加水分解されて副生することのあるフエニルアラ
ニンとともに後工程で回収することができるので
原料の損失が少ない。

更にまた第一段の工程の両反応で用いる塩基及
び酸を相互の中和用に有効利用できるので、酸及
びアルカリの使用量も減らすことができる。

以下、本発明を実施例について更に詳細に説明
する。

実施例 １ ZA水溶液の調製 Ｌ−アスパラギン酸319.4ｇ（2.4モル）を水
360mlに懸濁させ、次に10N水酸化ナトリウム水
溶液480ml（4.8モル）を加えて完全に溶解した。
この液に激しく撹拌しながら温度が０〜12℃；PH
が9.5〜12.0の範囲内で塩化ベンジルオキシカル
ボニル480ｇ（純度93％2.62モル）と、10N水酸
化ナトリウム水溶液330ml（3.3モル）を６時間か
けて同時に滴下した。滴下終了後約２時間室温で
撹拌したのち、トルエン１を加えて混合撹拌
し、水相とトルエン相を分離した。水相の全体量
は2185.5ｇであり高速液体クロマトグラフ分析か
らZAが607.0ｇ（収率94.7％）生成していること
を認めた。また22.9ｇのZAAが副生した。

PM水溶液の調製 DL−フエニルアラニン991.5ｇ（６モル）を塩
化水素437.4ｇ（12.0モル）を含むメタノール
332.0ｇ中に加え、３時間油浴中で加熱還流した。
冷却後反応液のホルハルト法による分析から塩素
イオンが9.23モル存在していることを認めた。こ
の溶液に１の蒸留水および48％の水酸化ナトリ
ウム水溶液259.0ｇ（3.22モル）を加えて仕込み
のフエニルアラニンに対する過剰の塩化水素を中
和したのち蒸留水1.5を加えながらロータリー
エパポレータでメタノールを完全に留去した。農
縮液の全体量は2821.0ｇであり、高速液体クロマ
トグラフ分析からDL−フエニルアラニンメチル
エステル（DL−PM）が1007.1ｇ（収率93.7％）
生成していることを認めた。

ZAとPMの反応によるZAPM・PMの製造 こうして調製しZA水溶液192.43ｇ（ZA0.2モル
含有）及びDL−PM水溶液250.98ｇ（DL−
PM0.5モル含有）を混合し、さらに蒸留水265ml
を加えたのち5N−水酸化ナトリウム水溶液によ
りPHを6.3に調製した。この液にサーモアーゼPS
−160（大和化成製、160万PU／ｇ）7.2ｇと酢酸
カルシウム−水塩1.3ｇを加え、40℃で撹拌しな
がら反応を行なつた。８時間後生成した懸濁液を
グラスフイルターで過し結晶を500mlの冷水で
洗浄した。この結晶はＮ−ベンジルオキシカルボ
ニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラ
ニンメチルエステルと主にＤ−体のフエニルアラ
ニンメチルエステルとの付加化合物（Ｚ−
APM・Ｄ−PM）であり、高速液体クロマトグ
ラフ分析から収率は85.6％であつた。この結晶が
Ｚ−APMと主にＤ−体PMの１：１の付加化合
物であることは酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶
媒から再結晶して得たもののNMR及びIRスペク
トル、元素分析値ならびに施光度が特開昭53−
92729号に開示されているデーターと実質的に一
致することから確認した。ZAAPM及びPM付加
化合物は検出されなかつた。

実施例 ２ PM水溶液の調製 実施例１のPM水溶液の調製で得られたDL−
PMを含む水溶液25ｇにメチルイソブチルケトン
50mlを加え、両液を撹拌混合しながら10N−水酸
化ナトリウム水溶液６mlを滴下した。撹拌を停止
したのち形成された二相を分離した。メチルイソ
ブチルケトン相には６ｇの濃塩酸と15mlの水を加
え撹拌混合し、撹拌停止後形成された二相を分離
水相30.0ｇを得た。水相中には高速液体クロマト
グラフ分析からDL−PMが8.3ｇ含まれているこ
とを確認した。

ZAとPMの反応によるZAPM・PMの調製 こうして得たDL−PMの水溶液3.240ｇ（DL−
PM5ミリモル含有）を実施例１のZA水溶液の調
製で得られたZA水溶液1.924ｇ（ZA2ミリモル含
有）、1N水酸化ナトリウム0.6ml及び蒸留水２ml
を混合した（この時のPHは6.2）。この液にサーモ
ライシン50mgと酢酸カルシウム一水塩５mgを加
え、インキユベーター中40℃で８時間反応を行な
つた。反応液を過し、残つた結晶を冷水10mlで
洗浄したのち採取し、ZAMPと主としてＤ−体
のPMとの付加化合物（高速液体クロマトグラフ
イによる収率86.2％）を得た。ZAAPM及びその
PM付加化合物は検出されなかつた。

実施例 ３ PM水溶液の調製 Ｌ−フエニルアラニン198.23ｇ（1.2モル）、塩
化水素87.48ｇ（2.4モル）およびメタノール576
ｇの混合液を３時間加熱還流した。冷却後反応液
のホルハルト法による分析から塩素イオンが
1.893モル存在することを認めた。この溶液に200
mlの蒸留水を加え、さらに48％の水酸化ナトリウ
ム水溶液40.48ｇ（0.693モル）を加えて仕込みフ
エニルアラニンに対して過剰の塩化水素を中和
し、蒸留水300ml加えながらロータリーエバポレ
ーターでメタノールを完全に留去した。濃縮液の
全体量は543.9ｇであり、高速液体クロマトグラ
フイ分析からＬ−フエニルアラニンメチルエステ
ル（Ｌ−PM）が206.6ｇ（収率96.1％）生成して
いることを認めた。

ZAとPMの反応によるZAPM・PMの調製 こうして得たＬ−PMの水溶液179.45ｇ（Ｌ−
PM0.4モル含有）を実施例１のZA水溶液の調製
で得たZA水溶液192.43ｇ（ZA0.2モル含有）と混
合し、さらに蒸留水240mlを加えたのち1N−塩酸
によりPHを5.75に調製した。この液にサーモアー
ゼPS−160 7.2ｇと酢酸カルシウム一水塩1.3ｇを
加え、撹拌しながら反応を行なつた。10時間後反
応を停止し実施例１と同様に後処理および分析を
行なつた。得られた結晶のNMR及びIRスペクト
ル、元素分析値ならびに施光度は特開昭53−
92729号に開示されているＮ−ベンジルオキシカ
ルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニル
アラニンメチルエステルとＬ−フエニルアラニン
メチルエステルとの付加化合物（ZAPM・Ｌ−
PM）のそれらと実質的に一致した。ZAMP・Ｌ
−PMの収率は83.2％であつた。ZAAPM及びそ
のPMとの付加化合物は検出されなかつた。

実施例 ４ ZA水溶液の調製 Ｌ−アスパラギン酸53.24ｇ（0.4モル）と炭酸
ナトリウム70.26ｇ（0.663モル）を水165ｇに懸
濁させた液に激しく撹拌しながら、温度が０〜12
℃の間で塩化ベンジルオキシカルボニル80ｇ（純
度93％、0.436モル）を６時間かけて滴下した。
さらに室温で一夜間撹拌したのち、トルエン200
mlを加えて混合撹拌し、水相とトルエン相を分離
した。水相の全体量は325ｇであり、高速液体ク
ロマトグラフ分析からZAが97.3ｇ（収率91.0％）
生成していることを認めた。またZAA4.6ｇが副
生した。

ZAとPMの反応によるZAPM・PMの調製 こうして調製したZA水溶液178.52ｇ（ZA0.2モ
ル含有）と実施例１のPM水溶液の調製で得た
DL−PM水溶液250.98ｇ（DL−PM0.5モル含有
を混合し、さらに蒸留水280mlを加えたのち、5N
水酸化ナトリウム水溶液によりPHを6.11に調製し
た。この液にサーモアーゼPS−160 7.2ｇと酢酸
カルシウム一水塩1.3ｇを加えて40℃で撹拌しな
がら10時間反応を行なつた。実施例１と同様に後
処理を行ないZAPMと主にＤ−体のPMとの付加
化合物を得た。収率は83.3％であつた。ZAAPM
及びそのPM付加化合物は検出されなかつた。

実施例 ５ ZA水溶液の調製 Ｌ−アスパラギン酸31.94ｇ（0.24モル）を5N
−水酸化カリウム水溶液96ml（0.48モル）に溶解
した液に激しく撹拌しながら温度が０〜12℃、PH
が9.5〜12.0の範囲内で塩化ベンジルオキシカル
ボニル48ｇ（純度93％、0.262モル）と5N−水酸
化カリウム66ml（0.33モル）を６時間かけて同時
に滴下した。滴下終了後約２時間室温で撹拌した
のち、トルエン200mlを加えて混合撹拌し、水相
とトルエン相を分離した。水相の全体量は259ｇ
であり、高速液体クロマトグラフ分析からZAが
58.4ｇ（収率91.0％）生成していることを認め
た。またZAAも3.2ｇ生成していた。

ZAとPMの反応によるZAPM・PMの調製 こうして調製したZA水溶液237.19ｇ（ZA0.2モ
ル含有）と実施例１のPM水溶液の調製により得
たDL−PM水溶液250.98ｇ（DL−PM0.5モル含
有）を混合し、さらに蒸留水350mlを加えたのち、
5N−水酸化カリウム水溶液によりPHを6.3に調製
した。この液にサーモアーゼPS−160 4.8ｇと酢
酸カルシウム一水塩0.8ｇを加えて40℃で撹拌し
ながら18時間反応を行なつた。実施例１と同様に
後処理を行ないZAPMと主にＤ−PMとの付加化
合物を得た。収率は83.5％であつた。ZAAPM及
びそのPM付加化合物は検出されなかつた。

実施例 ６ PM水溶液の調整 DL−フエニルアラニン99.1ｇ（0.6モル）とメ
タノール228ｇの混合液中に濃硫酸115.4ｇを加え
３時間油浴中で加熱還流した。

冷却後、蒸留水100mlおよび48％水酸化ナトリ
ウム水溶液を53.1ml加えたのち、蒸留水を100ml
加えながらロータリーエバポレーターでメタノー
ルを留去した。濃縮後の全体量は411.1ｇであり、
高速液体クロマトグラフ分析からDL−PMが
101.6ｇ（収率94.5％）生成していることを認め
た。

ZAとPMとの反応によるZAPM・PMの製造 こうして得たDL−PM水溶液181.26ｇ（DL−
PM0.25モル含有）を実施例１のZA水溶液の調製
で得たZA水溶液96.68ｇ（ZA0.1モル）と混合し
た。さらに蒸留水を24ml加えたのち5N−水酸化
ナトリウム水溶液によりPHを6.3に調製した。

この液にサーモアーゼPS−160 ３ｇと酢酸カ
ルシウム一水塩0.65ｇを加え、40℃で12時間撹拌
しながら反応を行つた。実施例１と同様に後処理
を行ないZAPMと主にＤ−体のPMとの付加化合
物を得た。収率は84.9％であつた。ZAAPM及び
そのPM付加化合物は検出されなかつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アスパラギン酸と塩化ベンジルオキシカルボ
   ニルを水溶液中、塩基の存在下で反応させてＮ−
   ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸を含む
   水溶液を調製し、別にフエニルアラニンを酸の存
   在下でメタノールと反応させてフエニルアラニン
   メチルエステルを生成させ、過剰のメタノールを
   水で置換してフエニルアラニンメチルエステルの
   水溶液とし、先に調製したＮ−ベンジルオキシカ
   ルボニルアスパラギン酸を含む水溶液と混合し、
   得られた混合液に蛋白分解酵素をその失活が実質
   的に起きない条件下で添加し、蛋白分解酵素が酵
   素活性を示す条件下でＮ−ベンジルオキシカルボ
   ニルアスパラギン酸とフエニルアラニンメチルエ
   ステルとを反応させて、Ｎ−ベンジルオキシカル
   ボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルア
   ラニンメチルエステルとフエニルアラニンメチル
   エステルとの付加化合物を析出させ、これを回収
   することを特徴とするジペプチドエステルとアミ
   ノ酸エステルとの付加化合物の製造方法。 ２ アスパラギン酸及びフエニルアラニンのそれ
   ぞれＬ−体又はＬ−体とＤ−体の混合物を用い、
   Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパ
   ルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルと
   Ｌ−もしくはＤ−フエニルアラニンメチルエステ
   ル又はこの両者の混合型のフエニルアラニンメチ
   ルエステルとの付加化合物を回収する特許請求の
   範囲第１項記載の製造方法。 ３ 酵素反応を行う際のＮ−ベンジルオキシカル
   ボニルアスパラギン酸のＬ−体に対するフエニル
   アラニンメチルエステルの量比が、モル比で前者
   １に対して後者のＬ−体で少なくとも約１であ
   り、Ｌ−体とＤ−体の合量で約２ないし約５であ
   る特許請求の範囲第１項または第２項記載の製造
   方法。 ４ 塩基としてアルカリ金属の水酸化物、炭酸塩
   又は炭酸水素塩を用い、酸として無機の強酸を用
   いる特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずる
   れか１項記載の製造方法。 ５ 蛋白分解酵素として金属プロテイナーゼを用
   いる特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれ
   か１項記載の製造方法。 ６ アスパラギン酸と塩化ベンジルオキシカルボ
   ニルを水溶液中、塩基の存在下で反応させたの
   ち、反応液を水と二相を形成することのできる有
   機溶媒で洗浄してＮ−ベンジルオキシカルボニル
   アスパラギン酸を含む水溶液を調製する特許請求
   の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項記載の
   製造方法。 ７ アスパラギン酸と塩化ベンジルオキシカルボ
   ニルを水溶液中、塩基の存在下で反応させてＮ−
   ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸を含む
   水溶液を調製し、別にフエニルアラニンを酸の存
   在下でメタノールと反応させてフエニルアラニン
   メチルエステルを生成させ、これに塩基を加えて
   フエニルアラニンメチルエステルを遊離させ、水
   と二相を形成することのできる有機溶媒を加えて
   混合接触させてフエニルアラニンメチルエステル
   を有機溶媒相に抽出し、分相して有機溶媒相に酸
   性水溶液を加えて混合接触させてフエニルアラニ
   ンメチルエステルを水相に逆抽出し、分相して水
   相を先に調製したＮ−ベンジルオキシカルボニル
   アスパラギン酸を含む水溶液と混合し、得られた
   混合液に蛋白分解酵素をその失活が実質的に起き
   ない条件下で添加し、蛋白分解酵素が酵素活性を
   示す条件下でＮ−ベンジルオキシカルボニルアス
   パラギン酸とフエニルアラニンメチルエステルと
   を反応させて、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−
   α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメ
   チルエステルとフエニルアラニンメチルエステル
   との付加化合物を析出させ、これを回収すること
   を特徴とするジペプチドエステルとアミノ酸エス
   テルとの付加化合物の製造方法。 ８ アスパラギン酸及びフエニルアラニンのそれ
   ぞれＬ−体又はＬ−体とＤ−体の混合物を用い、
   Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパ
   ルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルと
   Ｌ−もしくはＤ−フエニルアラニンメチルエステ
   ル又はこの両者の混合型のフエニルアラニンメチ
   ルエステルとの付加化合物を回収する特許請求の
   範囲第７項記載の製造方法。 ９ 酵素反応を行う際のＮ−ベンジルオキシカル
   ボニルアスパラギン酸のＬ−体に対するフエニル
   アラニンメチルエステルの量比がモル比で前者１
   に対して後者のＬ−体で少なくとも約１であり、
   Ｌ−体とＤ−体の合量で約２ないし約５である特
   許請求の範囲第７項または第８項のいずれか１項
   記載の製造方法。 １０ 塩基としてアルカリ金属の水酸化物、炭酸
   塩又は炭酸水素塩を用い、酸として無機の強酸を
   用いる特許請求の範囲第７項ないし第９項のいず
   れか１項記載の製造方法。 １１ 蛋白分解酵素として金属プロテイナーゼを
   用いる特許請求の範囲第７項ないし第１０項のい
   ずれか１項記載の製造方法。 １２ アスパラギン酸と塩化ベンジルオキシカル
   ボニルを水溶液中、塩基の存在下で反応させたの
   ち、反応液を水と二相を形成することのできる有
   機溶媒で洗浄してＮ−ベンジルオキシカルボニル
   アスパラギン酸を含む水溶液を調製する特許請求
   の範囲第７項ないし第１１項のいずれか１項記載
   の製造方法。