JP3638445B2 - アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 - Google Patents
アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3638445B2 JP3638445B2 JP25088798A JP25088798A JP3638445B2 JP 3638445 B2 JP3638445 B2 JP 3638445B2 JP 25088798 A JP25088798 A JP 25088798A JP 25088798 A JP25088798 A JP 25088798A JP 3638445 B2 JP3638445 B2 JP 3638445B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- substrate
- concentration
- alkyl ester
- lower alkyl
- aspartylphenylalanine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Seasonings (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテアーゼを利用してペプチド合成を行う際に、有機溶媒抽出および濃縮を利用して調製した高濃度基質溶液を用いるペプチド合成法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
プロテアーゼは加水分解酵素として、タンパク質、ポリペプチドの加水分解反応に利用されている。一方、加水分解反応の逆反応を利用した有用ペプチドの合成に関する研究も増加している(例えば、福井三郎編、酵素の新機能開発、75〜129頁(森原和之)(講談社サイエンティフィック社刊、1987年)参照)。
プロテアーゼを用いたペプチド合成の代表例として、アスパルテーム前駆体、即ち、N−ベンジルオキシカルボニル−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステル(以下ではZAPMと略記する。)があげられる。本物質は人工甘味料として有用なアスパルテームの誘導体である。
【0003】
加水分解酵素を用いてペプチドを合成する場合、一般に基質濃度が高い方が反応平衡上有利である。また、高濃度基質を用いることは、反応時間の短縮、反応容器容積の低減などの効果も期待でき、製造コスト削減に対する大きな効果が見込まれる。
しかしながら、ZAPM合成反応系における基質N−ベンジルオキシカルボニル−L−アスパラギン酸(以下ではZAと略記する。)およびL−フェニルアラニンメチルエステル(以下ではPMと略記する。)の水に対する溶解度は低いため、反応には数十〜数百mM程度の基質溶液が用いられることが多かった。例えば、基質濃度25〜200mM:Nagayasuら、Biotechnol. Bioeng., 43 巻, 1108〜1117(1994);基質濃度9〜73mM:Oyama ら、J. Chem. Soc. Perkin II, 356 〜360 (1981);基質濃度100mM:Hirataら、J. Ferment. Technol., 84巻, 246 〜267 (1997)などの報告がある。例示された論文、またはそれ以外の報告例において、有機溶媒を反応系に共存させている場合があるが、ZAおよびPMの溶解度の向上は小さく、用いられている基質濃度も水系の場合とほとんど変わりはない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、加水分解酵素(プロテアーゼ)を用い、高基質濃度でジペプチド(アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステル)を合成する方法を提供することである。
本発明者等は上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、フェニルアラニン低級アルキルエステル(以下ではPheORと略記する)水溶液よりPheORを有機溶媒中に抽出後、これを濃縮することで高濃度PheOR溶液が得られることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【0005】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は以下の本発明によって達成される。即ち、本発明は、プロテアーゼ存在下にN−置換アスパラギン酸(A)とフェニルアラニン低級アルキルエステル(B)とを縮合させ、酵素的にジペプチドを製造するに際し、基質Bとして、基質Bを水相から有機溶媒相に抽出し、当該有機溶媒相を濃縮して基質Bの濃度をそれの水に対する溶解度以上の濃度とした溶液を用い、これに基質Bのモル濃度の0.1〜2倍の基質Aを加えた高濃度基質溶液を用いることを特徴とするアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法である。
【0006】
【発明の実施の形態】
次に発明の好ましい実施の形態を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
本発明の特徴は、上記の酵素を用いるアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの合成において、一方の基質であるフェニルアラニン低級アルキルエステル(PheOR)を、水相から有機溶媒相に抽出し、抽出液を濃縮して高濃度のPheOR溶液として使用することである。
【0007】
PheORの濃縮溶液を得るためには、先ずPheORを水または緩衝液に溶解する。次に、この水溶液のpHを4〜8、望ましくは6〜7に調整する。これを有機溶媒に接触させ、常法により溶媒抽出を行う。
本発明に用いる溶媒は、水と二相を形成する有機溶媒であれば特に制限されず、例えば、酢酸アルキルエステル、炭素数3以上のアルコール、クロロホルム、エーテルなどが好ましいものとして挙げられる。
【0008】
抽出操作後、有機溶媒相を取り出し、常法により脱水操作を行った後に、減圧濃縮等のPheORの分解が少ない方法により濃縮を行う。濃縮方法は特に制限されない。
例えば、PheORとしてL−フェニルアラニンメチルエステル(PM)を用いた場合、PMの0.1M水溶液(pH=7)およびクロロホルムを用いて、上記抽出操作を行った場合、水溶液中のPMの約99重量%はクロロホルム相に抽出される。このPM抽出液を減圧濃縮装置を用いて20〜40倍に濃縮してもPMの析出は見られず、得られた濃縮液は、PMの濃度が2〜4Mとなる。ここで、PM析出が発生しない原因は明確ではないが、本濃縮液が安定した過飽和状態となっているのではないかと推察される。
本発明においては、PheORの濃縮液の濃度は、PheORの水に対する溶解度以上の濃度であり、濃度が高ければ高いほど目的物質(アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステル)の合成量が増加するので好ましい。
【0009】
上記濃縮液にN−置換アスパラギン酸として、例えば、N−ベンジルオキシカルボニル−L−アスパラギン酸(ZA)およびプロテアーゼを加えることで速やかなペプチド合成が行われる。
本発明においては、PheORに対するN−置換アスパラギン酸の添加濃度は特に限定されないが、PheORのモル濃度に対し、0.1〜2倍程度が好ましい。
【0010】
また、本発明に用いるプロテアーゼとしては、サーモライシン、サーモアーゼなどのバチルス属起源の金属プロテアーゼが好ましく、ストレプトマイセス属起源または緑濃菌起源の金属プロテアーゼなども使用することができる。酵素濃度は、合成反応が促進される濃度であれば特に限定されない。
本発明における反応温度は40〜60℃が好ましく、これ以外の温度でもペプチド合成は行われるが、実用的な速度は得られ難い。また、基質濃度が上記の濃度を下回らない量の水、グリセロール、エステル等の有機溶媒の添加は酵素活性を向上させる場合がある。
【0011】
本発明でアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの合成に使用されるN−置換アスパラギン酸としては、例えば、N−ベンジルオキシカルボニル−L−アスパラギン酸、t−ブトキシカルボニルアスパラギン酸、アセチルアスパラギン酸などが、また、フェニルアラニン低級アルキルエステルとしては、例えば、フェニルアラニンメチルエステル、フェニルアラニンエチルエステル、フェニルアラニンブチルエステル、フェニルアラニンプロピルエステルなどが挙げられる。
【0012】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。文中の%は特に断らない限り重量基準である。
【0013】
実施例1
PM0.1M水溶液(pH7.0)300mlおよびクロロホルム300mlを分液ロートに入れ、充分に振とうを行った。静置後、クロロホルム相を取り出した。ここで、99%のPMはクロロホルム相に抽出されていた。これを減圧濃縮装置により35倍に濃縮した。濃縮溶液中のPM濃度は3.5Mとなった。この濃縮溶液1.0ml(PM分753mg)にZA200mg、サモアーゼ(大和化成株式会社製)100mgを加え、50℃で反応を行った。反応8時間後127mgのZAPMを得た。
【0014】
実施例2
実施例1で用いた反応液に水100μlを加え、実施例1と同様の操作を行った。反応8時間後473mgのZAPMを得た。
【0015】
実施例3
実施例1で用いたクロロホルムの代わりにジエチルエーテルを用いる以外は実施例2と同様にしてZAPMの合成を行った。反応8時間後363mgのZAPMを得た。
【0016】
実施例4
実施例1で用いたPMの代わりにフェニルアラニンエチルエステルを用いて、実施例2と同様の操作を行った。反応8時間後441mgのペプチド(N−ベンジルオキシカルボニル−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンエチルエステル)を得た。
【0017】
実施例5
ZA添加量を600mgとし、実施例2と同様の操作を行った。反応8時間後983mgのZAPMを得た。
【0018】
【発明の効果】
以上の本発明により、基質の溶解度を越えた高濃度基質を用いたペプチド合成が可能となる。また、反応器容積の縮小化が可能となり、例えば、5M濃度の基質を用いた場合では100mM濃度の基質を用いた場合の50分の1の反応器容積で製造を行うことが可能となるから、単位反応器容積あたりのペプチド合成量を向上させることも可能である。
Claims (3)
- プロテアーゼ存在下にN−置換アスパラギン酸(A)とフェニルアラニン低級アルキルエステル(B)とを縮合させて酵素的にジペプチドを製造するに際し、基質Bとして、基質Bを水相から有機溶媒相に抽出し、当該有機溶媒相を濃縮して基質Bの濃度をそれの水に対する溶解度以上の濃度とした溶液を用い、これに基質Bのモル濃度の0.1〜2倍の基質Aを加えた高濃度基質溶液を用いることを特徴とするアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法。
- 抽出用有機溶媒が、酢酸アルキルエステル、炭素数3以上のアルコール、クロロホルム又はエーテルである請求項1に記載のアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法。
- 該高濃度基質溶液に水又は有機溶媒を添加して酵素を活性化する請求項1又は2に記載のアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25088798A JP3638445B2 (ja) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25088798A JP3638445B2 (ja) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000086695A JP2000086695A (ja) | 2000-03-28 |
JP3638445B2 true JP3638445B2 (ja) | 2005-04-13 |
Family
ID=17214507
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP25088798A Expired - Fee Related JP3638445B2 (ja) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3638445B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20020015742A (ko) * | 2000-08-23 | 2002-03-02 | 신철수 | 단백질 가수분해효소를 이용한 아스파탐 전구체의 제조방법 |
-
1998
- 1998-09-04 JP JP25088798A patent/JP3638445B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2000086695A (ja) | 2000-03-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO1990012805A1 (en) | Postostatin and related compound thereof, or their salts | |
Clapés et al. | Enzymatic synthesis of arginine‐based cationic surfactants | |
EP0149594A2 (en) | Enzymatic coupling of n-formyl amino acids and/or peptide residues | |
So et al. | Protease-catalyzed tripeptide (RGD) synthesis | |
JP3638445B2 (ja) | アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 | |
JPS61267600A (ja) | N−保護−α−L−アスパルチル−L−フエニルアラニンメチルエステルの製造法 | |
CA2021180C (en) | Process for the preparation of .alpha.-l-aspartyl-l-phenylalanine methyl ester hydrochloride by use of isolated n-formyl-aspartic anhydride | |
CA1265083A (en) | Process for the preparation of aromatically substituted l-amino acids | |
BE863245A (fr) | Nouveaux composes d'addition d'un derive de dipeptide et d'un derive d'amino-acide, et leur procede de preparation et de decomposition | |
EP0154472B1 (en) | Process for the production of l-aspartyl-l-phenylalanine ester | |
US4426325A (en) | Process for the preparation of compounds containing carboxylic acid amide groups, in particular or peptides | |
JPH05284991A (ja) | N−ベンジルオキシカルボニル−α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステルの製造法 | |
JPH01104192A (ja) | ビブリオリシン結合方法 | |
Ohno et al. | Partial enzymic deprotection in the synthesis of a protected octapeptide bearing a free terminal carboxyl group | |
JPS6344594A (ja) | N−保護−α−L−アスパルチル−L−フエニルアラニンの分離方法 | |
JP2979761B2 (ja) | α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩の製造法 | |
US6784309B2 (en) | Method for the purification of N-[N-(3,3-dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanine 1-methyl ester | |
JP2508803B2 (ja) | α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニン誘導体の製造法 | |
JPH0647600B2 (ja) | β−アスパルチルフエニルアラニン誘導体のα−アスパルチルフエニルアラニン誘導体への変換法 | |
JP3621271B2 (ja) | アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 | |
EP0269390B1 (en) | Enzymatic l-aspartyl-l-phenylalanine alkyl ester production | |
JPS6033840B2 (ja) | ジペプチド類の製造法 | |
Natchev | Organophosphorus analogues and derivatives of the natural L-amino carboxylic acids and peptides. V. Synthesis of analogues of plumbemycin A. | |
JP4196423B2 (ja) | アルキルグリオキサール付加体およびその製造方法 | |
Shields et al. | Synthesis of l‐α‐aminoadipyl‐l‐serinyl‐d‐valine, a naturally occuring tripeptide from the fermentation of Penicillium chrysogenum |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040803 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040930 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20041228 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050111 |
|
R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080121 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090121 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090121 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100121 Year of fee payment: 5 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |