JP3621271B2 - アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテアーゼを利用してペプチド合成する際に、高濃度基質ペーストを用いたアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの合成法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
プロテアーゼは加水分解酵素として、タンパク質、ポリペプチドの加水分解反応に幅広く利用されている。一方、加水分解反応の逆反応を利用した有用ペプチドの合成に関する研究も増加している。
しかしながら、基質となるアミノ酸の水に対する溶解度は必ずしも高くなく、低濃度基質を用いざるをえない場合も多い。
【0003】
一般に、反応平衡定数Kcは質量保存則に従い、次のように表すことができる。
(S1、S2:基質濃度 P:生産物濃度)
従って、基質濃度を高めることで高い生産物濃度を得ることができる。
【0004】
プロテアーゼを用いたペプチド合成の例として、人工甘味料アスパルテームの前駆体であるN−ベンジルオキシカルボニル−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステル(以下ではZAPMと略記することがある。)が挙げられる。
ところで、上記合成に用いられる基質のN−ベンジルオキシカルボニル−L−アスパラギン酸(以下ではZAと略記することがある。)およびL−フェニルアラニンメチルエステル(以下ではPMと略記することがある。)は、いずれも水に対する溶解度が1〜1.5M程度と低いため、数百mM程度の基質を用いた報告例が多い。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
先に述べたように、高濃度基質を用いることにより高い反応速度、生産物濃度を得ることが期待でき、また、反応器容積の低減も可能である。
しかしながら、基質の水等に対する溶解度が低いために、高濃度基質での反応のメリットが享受できないのが現状である。
従って、本発明の目的は、プロテアーゼを用い、高基質濃度でジペプチド(アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステル)を合成することができる方法を提供することである。
本発明者らは、上記目的を達成すべく種々検討した結果、ZAの粉末とフェニルアラニン低級アルキルエステル(以下ではPheORと略記することがある。)塩酸塩の粉末及び極少量のアルカリ性水溶液を混合してペースト状としたものに酵素を加えて反応を行わせたところ、高収率で目的物質ZAPMが得られることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【0006】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は以下の本発明によって達成される。即ち、本発明は、N−置換アスパラギン酸(A)とフェニルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩(B)とをプロテアーゼの存在下に反応させてペプチド合成するに際し、酵素反応基質として、基質Aと基質B及びこれらの基質の濃度がそれぞれの水に対する溶解度以上の濃度となる量のアルカリ性水溶液とからなるペーストを用いることを特徴とするアスパルチルフェニルアルキルエステルの製造方法である。
【0007】
【発明の実施の形態】
次に好ましい実施の形態を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
本発明のプロテアーゼを用いるアスパルチルフェニルアルキルエステルの製造方法は、反応の基質であるN−置換アスパラギン酸とフェニルアラニン低級アルキルエステル(PheOR)塩酸塩を、これら基質およびアルカリ性水溶液とからなるペーストに高濃度で含むものを使用することが特徴である。
以下では、N−置換アスパラギン酸をN−ベンジルオキシカルボニル−L−アスパラギン酸(ZA)で代表させて、又、フェニルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩をL−フェニルアラニンメチルエステル(PM)塩酸塩で代表させて説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【0008】
本発明においては上記のペーストを調製する方法は、両基質とアルカリ水溶液とが混合されてペースト状となる方法であれば、どのような方法でもよく、特に制限されない。
ペーストを調製する際のZAとPMの混合比は特に限定されないが、ZA/PMが0.1〜1.5(モル比)程度が好ましい。
また、アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの一般的なアルカリの水溶液が用いられる。
アルカリ水溶液の使用量は、ZAとPMの濃度が、これらの水に対する溶解度以上の濃度となる量であり、ペプチドの収量を高めるうえから出来るだけ高濃度となる量が望ましい。アルカリ水溶液の濃度は、特に限定されないが、通常、15N〜飽和溶液が好ましい。
【0009】
また、上記のペーストに更に有機溶媒を含有させることもできる。有機溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジエチレングリコール、グリセロール、エタノール、メタノール、アセトニトリルなどが挙げられる。有機溶媒の添加量は特に限定されないが、両基質濃度がそれぞれの水に対する溶解度以上の濃度となる量が望ましい。
【0010】
本発明で使用するプロテアーゼとしては、例えば、サーモライシン、サーモアーゼなどのバチルス属起源の金属プロテアーゼが好ましく、ストレプトマイセス属起源または緑濃菌起源の金属プロテーアーゼなども使用することができる。酵素濃度は、反応が進行する濃度であれば特に限定されない。
また、本発明における反応温度は40〜60℃が好ましく、これ以外の温度でもペプチド合成は行われるが、実用的な速度は得られ難い。
【0011】
本発明で使用するZA以外のN−置換アスパラギン酸としては、例えば、t−ブトキシカルボニルアスパラギン酸、アセチルアスパラギン酸などが、また、PM塩酸塩以外のフェニルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩としては、例えば、フェニルアラニンエチルエステル、フェニルアラニンブチルエステル、フェニルアラニンプロピルエステルなどの塩酸塩が挙げられる。
【0012】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。文中の%は特に断らない限り重量基準である。
【0013】
実施例1
PM粉末215mg(1.0mmol) およびZA粉末265mg(1.0mmol)に20N水酸化ナトリウム水溶液90μlを加え、よく混合してペースト状とした。ペースト中の各物質の濃度は、PM、ZAともに11.1Mである。上記ペーストにサモアーゼ(大和化成株式会社製)50mgを加えて混合し、50℃で反応を行った。反応液組成はHPLC(高速液体クロマトグラフィー)によって分析した。反応8時間後に4.7mgのZAPMを得た。
【0014】
実施例2〜4
実施例1と同様に、表1に示す濃度条件で反応を行った。反応8時間後に得られたZAPMの量を同表に示す。
表1
【0015】
実施例5
実施例1でペーストにジエチレングリコール100μlを加えて、実施例1と同様に反応させた。基質濃度はPM、ZAとも5Mである。反応8時間後に164.9mgのZAPMを得た。
【0016】
実施例6
PMの代わりにフェニルアラニンエチルエステルを用いる以外は実施例2と同様にして反応させた。反応8時間後に208.7mgのペプチドを得た。
【0017】
【発明の効果】
以上の本発明によれば、ペースト状基質を用いることにより、基質の溶解度に関わらず高濃度の基質を用いてペプチド合成が可能となった。その結果、反応器容積の縮小化が可能となり、例えば、5M濃度の基質を用いた場合では100mM濃度の基質を用いた場合の50分の1の反応器容積で製造を行うことが可能となり、単位反応器容積あたりのペプチド合成量を著しく向上させることができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテアーゼを利用してペプチド合成する際に、高濃度基質ペーストを用いたアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの合成法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
プロテアーゼは加水分解酵素として、タンパク質、ポリペプチドの加水分解反応に幅広く利用されている。一方、加水分解反応の逆反応を利用した有用ペプチドの合成に関する研究も増加している。
しかしながら、基質となるアミノ酸の水に対する溶解度は必ずしも高くなく、低濃度基質を用いざるをえない場合も多い。
【0003】
一般に、反応平衡定数Kcは質量保存則に従い、次のように表すことができる。
(S1、S2:基質濃度 P:生産物濃度)
従って、基質濃度を高めることで高い生産物濃度を得ることができる。
【0004】
プロテアーゼを用いたペプチド合成の例として、人工甘味料アスパルテームの前駆体であるN−ベンジルオキシカルボニル−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステル(以下ではZAPMと略記することがある。)が挙げられる。
ところで、上記合成に用いられる基質のN−ベンジルオキシカルボニル−L−アスパラギン酸(以下ではZAと略記することがある。)およびL−フェニルアラニンメチルエステル(以下ではPMと略記することがある。)は、いずれも水に対する溶解度が1〜1.5M程度と低いため、数百mM程度の基質を用いた報告例が多い。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
先に述べたように、高濃度基質を用いることにより高い反応速度、生産物濃度を得ることが期待でき、また、反応器容積の低減も可能である。
しかしながら、基質の水等に対する溶解度が低いために、高濃度基質での反応のメリットが享受できないのが現状である。
従って、本発明の目的は、プロテアーゼを用い、高基質濃度でジペプチド(アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステル)を合成することができる方法を提供することである。
本発明者らは、上記目的を達成すべく種々検討した結果、ZAの粉末とフェニルアラニン低級アルキルエステル(以下ではPheORと略記することがある。)塩酸塩の粉末及び極少量のアルカリ性水溶液を混合してペースト状としたものに酵素を加えて反応を行わせたところ、高収率で目的物質ZAPMが得られることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【0006】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は以下の本発明によって達成される。即ち、本発明は、N−置換アスパラギン酸(A)とフェニルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩(B)とをプロテアーゼの存在下に反応させてペプチド合成するに際し、酵素反応基質として、基質Aと基質B及びこれらの基質の濃度がそれぞれの水に対する溶解度以上の濃度となる量のアルカリ性水溶液とからなるペーストを用いることを特徴とするアスパルチルフェニルアルキルエステルの製造方法である。
【0007】
【発明の実施の形態】
次に好ましい実施の形態を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
本発明のプロテアーゼを用いるアスパルチルフェニルアルキルエステルの製造方法は、反応の基質であるN−置換アスパラギン酸とフェニルアラニン低級アルキルエステル(PheOR)塩酸塩を、これら基質およびアルカリ性水溶液とからなるペーストに高濃度で含むものを使用することが特徴である。
以下では、N−置換アスパラギン酸をN−ベンジルオキシカルボニル−L−アスパラギン酸(ZA)で代表させて、又、フェニルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩をL−フェニルアラニンメチルエステル(PM)塩酸塩で代表させて説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【0008】
本発明においては上記のペーストを調製する方法は、両基質とアルカリ水溶液とが混合されてペースト状となる方法であれば、どのような方法でもよく、特に制限されない。
ペーストを調製する際のZAとPMの混合比は特に限定されないが、ZA/PMが0.1〜1.5(モル比)程度が好ましい。
また、アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの一般的なアルカリの水溶液が用いられる。
アルカリ水溶液の使用量は、ZAとPMの濃度が、これらの水に対する溶解度以上の濃度となる量であり、ペプチドの収量を高めるうえから出来るだけ高濃度となる量が望ましい。アルカリ水溶液の濃度は、特に限定されないが、通常、15N〜飽和溶液が好ましい。
【0009】
また、上記のペーストに更に有機溶媒を含有させることもできる。有機溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジエチレングリコール、グリセロール、エタノール、メタノール、アセトニトリルなどが挙げられる。有機溶媒の添加量は特に限定されないが、両基質濃度がそれぞれの水に対する溶解度以上の濃度となる量が望ましい。
【0010】
本発明で使用するプロテアーゼとしては、例えば、サーモライシン、サーモアーゼなどのバチルス属起源の金属プロテアーゼが好ましく、ストレプトマイセス属起源または緑濃菌起源の金属プロテーアーゼなども使用することができる。酵素濃度は、反応が進行する濃度であれば特に限定されない。
また、本発明における反応温度は40〜60℃が好ましく、これ以外の温度でもペプチド合成は行われるが、実用的な速度は得られ難い。
【0011】
本発明で使用するZA以外のN−置換アスパラギン酸としては、例えば、t−ブトキシカルボニルアスパラギン酸、アセチルアスパラギン酸などが、また、PM塩酸塩以外のフェニルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩としては、例えば、フェニルアラニンエチルエステル、フェニルアラニンブチルエステル、フェニルアラニンプロピルエステルなどの塩酸塩が挙げられる。
【0012】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。文中の%は特に断らない限り重量基準である。
【0013】
実施例1
PM粉末215mg(1.0mmol) およびZA粉末265mg(1.0mmol)に20N水酸化ナトリウム水溶液90μlを加え、よく混合してペースト状とした。ペースト中の各物質の濃度は、PM、ZAともに11.1Mである。上記ペーストにサモアーゼ(大和化成株式会社製)50mgを加えて混合し、50℃で反応を行った。反応液組成はHPLC(高速液体クロマトグラフィー)によって分析した。反応8時間後に4.7mgのZAPMを得た。
【0014】
実施例2〜4
実施例1と同様に、表1に示す濃度条件で反応を行った。反応8時間後に得られたZAPMの量を同表に示す。
表1
【0015】
実施例5
実施例1でペーストにジエチレングリコール100μlを加えて、実施例1と同様に反応させた。基質濃度はPM、ZAとも5Mである。反応8時間後に164.9mgのZAPMを得た。
【0016】
実施例6
PMの代わりにフェニルアラニンエチルエステルを用いる以外は実施例2と同様にして反応させた。反応8時間後に208.7mgのペプチドを得た。
【0017】
【発明の効果】
以上の本発明によれば、ペースト状基質を用いることにより、基質の溶解度に関わらず高濃度の基質を用いてペプチド合成が可能となった。その結果、反応器容積の縮小化が可能となり、例えば、5M濃度の基質を用いた場合では100mM濃度の基質を用いた場合の50分の1の反応器容積で製造を行うことが可能となり、単位反応器容積あたりのペプチド合成量を著しく向上させることができる。
Claims (2)
- N−置換アスパラギン酸(A)とフェニルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩(B)とをプロテアーゼの存在下に反応させてペプチド合成するに際し、酵素反応基質として、基質Aと基質Bおよびこれらの基質の濃度がそれぞれの水に対する溶解度以上の濃度となる量のアルカリ性水溶液からなるペーストを用いることを特徴とするアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法。
- 該ペーストは、更に有機溶媒を基質Aおよび基質Bの濃度が上記の濃度となる量含まれている請求項1に記載のアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25088898A JP3621271B2 (ja) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25088898A JP3621271B2 (ja) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000078997A JP2000078997A (ja) | 2000-03-21 |
JP3621271B2 true JP3621271B2 (ja) | 2005-02-16 |
Family
ID=17214523
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP25088898A Expired - Fee Related JP3621271B2 (ja) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JP3621271B2 (ja) |
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---|---|---|---|---|
KR20020015742A (ko) * | 2000-08-23 | 2002-03-02 | 신철수 | 단백질 가수분해효소를 이용한 아스파탐 전구체의 제조방법 |
WO2002085840A1 (fr) * | 2001-04-20 | 2002-10-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production d'acide n-formylamino et utilisation dudit acide |
-
1998
- 1998-09-04 JP JP25088898A patent/JP3621271B2/ja not_active Expired - Fee Related
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---|---|
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