KR100329018B1

KR100329018B1 - 알리탐 전구체의 제조방법

Info

Publication number: KR100329018B1
Application number: KR1019990013096A
Authority: KR
Inventors: 신철수; 김철영
Original assignee: 신철수
Priority date: 1999-04-14
Filing date: 1999-04-14
Publication date: 2002-03-18
Also published as: KR20000066182A

Abstract

본 발명은 L-아스파르트산의 유도체와 D-알라닌의 유도체를 혼합하여 공융혼합물을 수득하고, 전기 혼합물의 융점을 최저화하여 최적 온도에서 알리탐 전구체의 효소적 합성이 효율적으로 일어나게 하는 공정을 포함하는, 알리탐 전구체(alitame precursor)의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 두 기질을 혼합하여 공융혼합물을 수득함으로써 융점을 낮추게 되면, 고농도기질의 액체상태에서 최적온도로 효소반응이 가능해지므로, 알리탐 전구체의 생산성을 증진시킬 수 있다. 또한, 본 발명에서 제조된 알리탐 전구체는 효소적 합성법에 의해서 제조되므로, 화학적 합성법에 의한 펩타이드의 제조시 야기되는 제조물의 비특이성, 불안정성 및 유해성등의 단점을 극복할 수 있으므로, 다양한 형태의 식품첨가용 펩티드의 제조에 널리 활용될 수 있다.

Description

알리탐 전구체의 제조방법{Process for Preparing Alitame Precursor}

본 발명은 알리탐 전구체의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 L-아스파르트산의 유도체와 D-알라닌의 유도체를 혼합하여 공융혼합물을 수득하고, 전기 혼합물의 융점을 최저화하여 최적 온도에서 알리탐 전구체의 효소적 합성이 효율적으로 일어나게 하는 공정을 포함하는, 알리탐 전구체(alitame precursor)의 제조방법에 관한 것이다.

알리탐(alitame)은 감미료로 많이 사용되고 있는 펩타이드 물질로서, 식품에 첨가되어 설탕보다 2000배 이상의 단맛을 내는 것으로 알려져 있으며, 여러가지 알리탐 전구체로부터 제조되고 있는 바, 지금까지는 주로 화학적 합성법에 의해서 제조되어 식품첨가용으로 사용되어 왔다.

현재 주로 사용되고 있는 화학적 합성법인 펩타이드 합성법(참조:Bodanszky, M., Peptide Chemistry, Springer-Verlag,179-188, 1988)은 고체 지지체를 이용하여 펩타이드 사슬을 연결하는 방법이다. 식품첨가용으로 사용되는 펩타이드를 화학적 합성법에 의하여 제조할 경우, 펩타이드 제조시의 라세미화(racemization) 문제, 아미노산의 곁사슬(side chain)에 대한 보호, 펩타이드 제조시 다량의 결합제 (coupling agent)및 합성시에 사용되는 다량의 유기용매와 시약의 유해성으로 인해서 식품첨가용으로의 사용이 제한된다는 단점을 내포하고 있었다(참조: Vulfson, E.N., Tren. Food Sci. Technol., 4:209-215, 1993).

이에 따라, 식품첨가용 펩타이드의 제조시 화학적 합성법을 보완하여, 펩타이드 합성이 특이적이고 안정하며, 합성산물이 무해한 효소적 합성법에 관한 연구가 진행되어 왔다. 효소적 합성법은 효소의 특이성에 의해 라세미화 문제가 발생하지 않으며, 효소의 위치특이성(regio-specificity)으로 인해서 기질에 대한 최소한의 보호를 필요로 하고, 합성시에 다량의 유기용매와 시약을 요구하지 않으므로, 식품첨가용 펩타이드의 제조에도 널리 이용될 수 있다. 뿐만 아니라, 비교적 낮은 온도에서 반응을 진행시킬 수 있고, 합성단계를 단축시키며, 고정화한 효소를 사용하게 되면, 반응 후 회수하여 다시 사용할 수 있는 장점이 있다.

또한, 단백질 가수분해효소를 이용하여 펩타이드를 합성할 때에는 가수분해보다 펩타이드 합성에 의해서 반응평형이 결정되기 때문에, 주로 유기용매에서의 반응(참조: Jones, J.B., Tetrahedron, 42:3351-3403, 1986) 또는 물과 유기용매를 함께 이용한 유기-액 이상계(organic-aqueous two phase system)에서의 반응(참조:Reslow M. et al., Eur. J. Biochem., 717:313-318, 1988)이 많이 이루어져 왔다. 특히, 유기용매에서의 반응은 유기용매에 의해 효소의 구조가 변성되고, 유기용매에 대한 기질의 용해도가 낮기 때문에, 펩타이드의 생산성이 낮은 문제점이 제기되었다. 이에 따라, 효소의 구조를 변성시키지 않으면서, 기질의 용해도를 증가시킬 수 있는 새로운 용매계를 개발하려는 노력이 계속되어 왔고, 그 중 하나로 공융혼합물(eutectic mixture, 참조: Moor, W. et al., Basic Physical Chemistry,Prentice-Hall, 173-197, 1983)을 이용하는 방법이 제안되었다. 공융혼합물은 무용매계(solvent-free system, 참조: Kuhl, P. et al., Biotechnol. Bioeng., 45:276-278, 1995)의 하나로, 두 개이상의 물질로 이루어지는 혼합물로서, 개개의 순수 물질이 갖는 융점에 비해 매우 낮은 융점을 가져서 그 상태가 액상이 되는 혼합물을 의미한다. 그 원인으로는 원소간의 혼합시에 생기는 자유 에너지(free energy) 변화와 깁스(Gibbs)의 상평형 원리등이 관련된 것으로 알려져 있는데, 공융혼합물이 형성되면 상대적으로 낮은 온도에서도 액상이 유지되므로 저온에서의 효소반응이 가능해진다.

이에 따라, 공융혼합물을 형성시켜서 적정온도에서의 효소반응을 가능하게 하고, 이러한 공용혼합물을 이용하여 효소적 합성법으로 펩타이드를 제조할 수 있는, 즉, 보다 효율적으로 펩타이드의 생산성을 높이기 위한 노력이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 공용혼합물을 이용한 효소적 합성법에 의하여 식품첨가용 펩타이드인 알리탐의 전구체를 효과적으로 제조하기 위하여 예의 연구노력한 결과, L-아스파르트산(aspartic acid)의 유도체와 D-알라닌(alanine)의 유도체를 혼합하고, 보조제(adjuvant)를 첨가할 때 공융혼합물이 수득되며, 이렇게 해서 융점을 낮춘 공융혼합물에 단백질 가수분해효소를 처리함으로써, 알리탐 전구체를 효율적으로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 L-아스파르트산의 유도체와 D-알라닌의 유도체에 보조제를 첨가하여 공융혼합물을 수득하고, 이 공융혼합물에 단백질 가수분해효소를 처리하여 알리탐 전구체를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 각각 다른 D-AlaNH₂의 몰분율(mole fraction)을 갖는 시료의 용융점을 나타낸 그래프이다.

본 발명의 알리탐 전구체의 제조방법은, L-아스파르트산의 유도체와 D-알라닌의 유도체는를 혼합하고 보조제를 첨가하여 공융혼합물을 수득한 다음, 여기에 단백질 분해효소를 첨가하여 효소적으로 합성하는 공정을 포함한다.

이때, L-아스파르트산의 유도체와 D-알라닌의 유도체는 D-알라닌의 유도체의 몰분율을 L-아스파르트산을 기준으로 0.2 내지 0.8로 하여 혼합하며, L-아스파르트산의 유도체로는 N-CBZ-L-Asp(OEt)OEt, N-CBZ-L-AspOH, N-CBZ-L-AspOMe, N-CBZ-L-AspOEt, 또는 N-CBZ-L-AspOtBu을 사용하고, D-알라닌의 유도체로는 D-AlaNH₂, D-AlaOMe, D-AlaOEt, 또는 D-AlaOBu을 사용한다.

또한, 보조제로는 물, 다이메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, 이하 DMSO), 2-메톡시에틸아세테이트(methoxyethylacetate, 이하 MEA), 포름아마이드 (formamide), 에탄올(ethanol), 에틸아세테이트(ethylacetate), 트리에틸아민 (triethylamine), 옥탄올(octanol) 및/또는 핵산(hexane)을 두 유도체의 반응혼합물 중량의 30 내지 50%(w/w)가 되도록 첨가하며, 단백질 분해효소는 α-키모트립신 (chymotrypsin), 섭틸리신칼스버그(subtilisin carlsberg), 써모리신(thermolysin fromBacillus thermoproteolyticus rokko), 펑걸프로테아제 (fungal protease), 파파인(papain), 프로티나제(proteinase) K 또는 프로나아제(pronase) E를 공용혼합물의 10 내지 20%(w/w)가 되도록 첨가한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 두가지 기질의 공융혼합물 수득

알리탐 전구체를 효율적으로 제조할 수 있는 중간산물인 두 기질의 공융혼합물을 수득하기 위하여, 기질인 N-CBZ-L-Asp(OEt)OEt와 D-AlaNH₂를 각각 다른 D-AlaNH₂의 몰분율(X_AlaNH2)로 준비하고 보조제를 첨가한 다음, 온도를 20℃ 내지 200℃에서 분당 10℃씩 증가시키면서 시차주사 열량계(differential scanning calorimeter, DSC)로 각 시료의 융점을 측정하였다. 이때, N-CBZ-L-Asp(OEt)OEt와 D-AlaNH₂의 융점은 각각 64℃, 174℃였는데, 두 기질에 보조제를 첨가하여 공융혼합물을 수득했을 때, 융점이 각 기질 본래의 융점보다 훨씬 낮아졌다(참조: 도 1). 도 1에서, (▲)는 보조제를 첨가하지 않았을 때 혼합물의 융점; (■)는 기질 중량의 5%(w/w)에 해당하는 물을 첨가하였을 때 혼합물의 융점; 및, (●)는 기질 중량의 12%(w/w)에 해당하는 물, 9%(w/w)에 해당하는 DMSO, 18%(w/w)에 해당하는 MEA를 혼합하여 보조제로 첨가했을 때 혼합물의 융점을 나타낸다.

도 1에서 보듯이, 보조제로서 물, DMSO 및 MEA가 각각 기질 중량의 12%(w/w), 9%(w/w) 및 18%(w/w)가 되도록 혼합하여 첨가된 경우, 보조제를 첨가하지 않은 경우와 물만 5%(w/w) 첨가한 경우에 비해 가장 낮은 융점을 나타냈으며, N-CBZ-L-Asp(OEt)OEt와 D-AlaNH₂의혼합물은 D-AlaNH₂의 몰분율(X_AlaNH2)이 0.4일때 가장 낮은 융해점인 27℃가 얻어졌다. 결과적으로, 각각 다른 융점을 나타내는 두 기질의 혼합물에 보조제가 첨가되면, 기질혼합물의 물리적 특성을 변화시켜 융점을 낮추는 등 공융혼합물의 수득이 용이해지며, 공융혼합물을 수득하는 정도와 그 효과는 첨가되는 보조제의 종류에 따라 다른 것으로 나타났다.

실시예 2: α-키모트립신을 이용한 알리탐 전구체의 합성

알리탐 전구체를 제조하기 위하여, N-CBZ-L-Asp(OEt)OEt와 D-AlaNH₂의 두 기질을 각각 0.5mmol이 되도록 바닥이 둥근 10ml의 바이얼(vial)에 넣고 혼합하고, 60℃ 수조(water bath)에서 10분간 중탕한 다음, 여기에 보조제로서 기질 중량의 12%(w/w)에 해당하는 물, 9%(w/w)에 해당하는 DMSO와 18%(w/w)에 해당하는 MEA를 혼합하여 첨가하므로써 공융혼합물을 수득하였다.

이와 같이 제조한 공융혼합물의 온도를 37℃로 조절한 다음, α-키모트립신을 기질의 15%(w/w)가 되게 첨가하여 37℃, 160rpm의 진탕수조(shaking water bath)에서 배양하였다. 8시간 후에 5%(v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) 0.4ml와 아세토나이트릴(acetonitrile) 10ml를 가하여 반응을 멈추게 하고, N-CBZ-L-Asp(OEt)OEt, N-CBZ-L-Asp(OEt)-D-AlaNH₂및 N-CBZ-L-Asp(OEt)-OH를 HPLC로 정량분석 하였다. HPLC는 워터스사(Waters, U.S.A.) 제품의 μ-본더팩(Bondapack) C₁₈컬럼을 사용하였고, 이동상으로는 물과 아세토나이트릴을 각각 7.5와 2.5의 비율(v/v)로 혼합하여 1min/㎖의 유속으로 용출시켰다. 결과적으로, 보조제로서 반응혼합물 중량의 12%(w/w)에 해당하는 물, 9%(w/w)에 해당하는 DMSO와 18%(w/w)에 해당하는 MEA를 혼합하여 첨가하고, 단백질 분해효소로 공융혼합물 중량의 15%(w/w)에 해당하는 α-키모트립신을 첨가하여 반응시킬 때, 알리탐 전구체에 대한 최대 전환수율이 70%(mol/mol)로 높게 나타났으며, 이때 제조된 알리탐 전구체의 구조는 N-CBZ-L-Asp(OEt)-D-AlaNH₂이었다.

실시예 3: 보조제의 종류에 따른 공융혼합물 수득과 펩타이드의 제조

보조제로 기질 중량의 12%(w/w)에 해당하는 물과, 유기용매로서 기질 중량의 15%(w/w)에 해당하는 DMSO, MEA를 혼합하여 첨가하고 실시예 2와 유사한 방법으로 알리탐 전구체를 제조하였을 때, 알리탐 전구체인 N-CBZ-L-Asp(OEt)-D-AlaNH₂에 대해 60%에 이르는 전환수율을 나타내었고, 소수성(hydrophobic) 용매인 옥탄올, 핵산을 동일한 비율로 첨가하였을 때에는 40 내지 50%(mol/mol)의 전환수율을 나타내었다. 결과적으로, 보조제를 첨가하였을 때 공융혼합물의 수득을 통한 알리탐 전구체의 제조가 용이해짐을 확인할 수 있었고, 특히 보조제로 물, DMSO, MEA를 첨가하였을 때 가장 효과적으로 알리탐 전구체를 제조할 수 있었다.

실시예 4: 기질의 종류에 따른 펩타이드 제조

L-아스파르트산의 유도체로 N-CBZ-L-Asp(OEt)OEt 대신에 N-CBZ-L-AspOH, N-CBZ-L-AspOMe(methyl ester), N-CBZ-L-AspOEt(ethyl ester) 또는 N-CBZ-L-AspOtBu(t-butyl ester)를 첨가하고, D-알라닌의 유도체로 D-AlaNH₂대신에 D-AlaOMe(methyl ester), D-AlaOEt(ethyl ester) 또는 D-AlaOBu(butyl ester)를 첨가하여 실시예 2와 유사한 방법으로 알리탐 전구체를 제조하였을 때, 5 내지50%(mol/mol)의 전환수율로 여러가지 구조의 알리탐 전구체를 수득할 수 있었다. 이로서, L-아스파르트산의 유도체로 N-CBZ-L-Asp(OEt)OEt를 사용하고, L-알라닌의 유도체로 D-AlaNH₂를 사용했을 때보다는 낮을 수율이었으나, 상기의 여러 기질로부터 알리탐 전구체의 제조가 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 효소의 종류에 따른 펩타이드 제조

보조제로 기질 중량의 12%(w/w)에 해당하는 물, 9%(w/w)에 해당하는 DMSO와 18%(w/w)에 해당하는 MEA를 혼합하여 첨가하고, 단백질 가수분해효소로 α-키모트립신 외에 섭틸리신 칼스버그, 써몰리신, 펑걸프로테아제, 파파인을 각각 공융혼합물의 15%(w/w)가 되도록 첨가하여 알리탐 전구체를 합성하였을 때, 섭틸리신 칼스버그가 54%, 써모리신이 65%, 펑걸프로테아제가 52%, 파파인이 38%(mol/mol)의 전환수율을 나타내었는 바, 이는 α-키모트립신을 첨가했을때보다는 낮은 값이었지만, 비교적 높은 전환수율이었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 기질인 L-아스파르트산의 유도체와 L-알라닌의 유도체에 보조제를 첨가하여 공융혼합물을 수득하고, 이에 단백질 분해효소를 처리하여 여러가지 알리탐 전구체를 효율적으로 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 두 기질을 혼합하여 공융혼합물을 수득함으로써 융점을 낮추게 되면, 고농도기질의 액체상태에서 최적온도로 효소반응이 가능해지므로, 알리탐 전구체의 생산성을 증진시킬 수 있다. 또한, 본 발명에서 제조된 알리탐 전구체는 효소적 합성법에 의해서 제조되므로, 화학적 합성법에 의한 펩타이드의 제조시 야기되는 제조물의 비특이성, 불안정성 및 유해성등의 단점을 극복할 수 있으므로, 다양한 형태의 식품첨가용 펩타이드의 제조에 널리 활용될 수 있다.

Claims

L-아스파르트산의 유도체와 D-알라닌의 유도체를 혼합하고, 보조제를 첨가하여 공융혼합물을 수득한 다음, 단백질 분해효소를 첨가하여 효소적으로 합성하는 공정을 포함하는 알리탐(alitame) 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

L-아스파르트산의 유도체와 D-알라닌의 유도체는 D-알라닌의 유도체의 몰분율을 L-아스파르트산을 기준으로 0.2 내지 0.8로 하여 혼합하는 것을 특징으로 하는

알리탐 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

L-아스파르트산의 유도체는 N-CBZ-L-Asp(OEt)OEt, N-CBZ-L-AspOH, N-CBZ-L-AspOMe, N-CBZ-L-AspOEt 또는 N-CBZ-L-AspOtBu인 것을 특징으로 하는

알리탐 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

D-알라닌의 유도체는 D-AlaNH₂, D-AlaOMe, D-AlaOEt 또는 D-AlaOBu인 것을 특징으로 하는

알리탐 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

보조제는 물, 포름아마이드, 다이메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO), 2-메톡시에틸아세테이트(methoxyethylacetate, MEA), 에탄올, 에틸아세테이트, 트리에틸아민, 옥탄올 및 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는

알리탐 전구체의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

보조제는 L-아스파르트산의 유도체와 D-알라닌의 유도체의 반응혼합물 중량의 30 내지 50%(w/w)가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는

알리탐 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

단백질 분해효소는 α-키모트립신, 섭틸리신칼스버그(subtilisin carlsberg), 써모리신(thermolisin fromBacillus thermoproteolyticus rokko), 펑걸프로테아제(fungal protease), 파파인, 프로티나제 K 또는 프로나아제 E인 것을 특징으로 하는

알리탐 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

단백질 분해효소는 공융혼합물의 10 내지 20%(w/w)가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는

알리탐 전구체의 제조방법.