JPH08196292A - 酵素によるＮ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】原料の使用量が少なく、循環流も少なく、有機
溶媒やアミンも必要なく、高い転化率で濾過し得る生成
物が得られるＮ−ベンジルカルボキシル−α−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造
方法を提供する。 【構成】Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＮ−ベ
ンジルオキシカルボニル−アスパラギン酸との酵素によ
るカップリング反応によるＮ−ベンジルカルボキシル−
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエ
ステルの製造方法において、等モル又は実質的に等モル
のＬ−フェニルアラニンメチルエステルとＮ−ベンジル
オキシカルボニル−アスパラギン酸を使用し中性プロテ
アーゼの作用下で、当初のｐＨが４．５〜６．０で、３
〜２５重量％のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又
はアンモニウム塩の存在下でカップリング反応を実施す
ることを特徴とするＮ−ベンジルカルボキシル−α−Ｌ
−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の利用分野】本発明は酵素によるＬ−フェニルア
ラニンメチルエステルとＮ−ベンジルオキシカルボニル
−Ｌ−アスパラギン酸とのカップリング反応により、水
性溶媒中で沈殿物として、高い転化率でＮ−ベンジルオ
キシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニル
アラニンメチルエステルを製造する方法に関するもので
ある。

【０００２】Ｎ−保護−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
ェニルアラニンメチルエステル、例えば特にＮ−ベンジ
ルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェ
ニルアラニンメチルエステルは、蔗糖の約２００倍の甘
味があり、サッカリンやチクロの様な強力甘味料の様な
苦味の後味もない強力甘味料“アスパルテーム”の重要
な前駆体である。甘味料アスパルテームはソフトドリン
ク、お菓子、卓上甘味料、薬品等の様な製品に広い範囲
で使用される。

【０００３】

【従来の技術】アスパルテームの製造法としては、種々
の方法が知られている。化学的製造方法に加えて、酵素
による製造方法もあり、それは酵素が構造的選択的およ
び位置選択的に起こるという特異性によるものである。
Ｎ−保護−アスパラギン酸、特にＮ−ベンジルオキシカ
ルボニル−アスパラギン酸（以後、Ｚ−Ａｓｐと略記す
る。）とＬ−（又はＤＬ−）フェニルアラニンメチルエ
ステル又はそれから誘導される例えば塩酸塩の様な酸塩
（以後、ＰＭとして略記する。）との酵素によるＬ，Ｌ
カップリング反応は、Ｎ−保護のアスパルテーム前駆体
の合成法として、これまで、十分に研究され、記述され
てきた。このアスパルテーム製造法の総説が、“キラリ
ティ− イン ケミストリー”（発行所：Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ＆ ＳｏｎｓＬｔｄ， １１章、ｐ．２３７〜
２４７（１９９２）に掲載された。

【０００４】原則として、６〜７．５のｐＨで、中性プ
ロテアーゼ、特に、サーモリシンの様な金属プロテアー
ゼの存在下で実施される当酵素によるカップリング反応
は、平衡が支配的な反応である。その様な酵素によるカ
ップリング反応の高い転化率を達成するため、先行文献
によれば特別な方法が必要である。例えば、ＵＳ−４１
６５３１１には、反応混合物中に、Ｎ−保護アスパルテ
ーム、特にＮ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以
後、Ｚ−ＡＰＭと略記する。）を、Ｄ又はＬ−フェニル
アラニンメチルエステルとの付加化合物として晶析させ
て、カップリング平衡反応を右にシフトすることを利用
している。そのようなアスパルテームの前駆体の付加化
合物も、以後、Ｚ−ＡＰＭ・Ｄ−ＰＭ又はＺ−ＡＰＭ・
Ｌ−ＰＭと各々略記する。その先行文献によれば、望ま
しいその付加化合物を製造するためには、高い転化率す
なわちＺ−Ａｓｐに対して６０％以上、好ましくは８０
％以上を得るために、Ｚ−ＡｓｐとＬ−ＰＭのカップリ
ング反応において、Ｚ−Ａｓｐに対して少なくとも２倍
モルのＬ−ＰＭ、又は、少なくともＤ−ＰＭの１当量の
存在下でカップリング反応を実施することが好ましい。
実際、この酵素によるカップリング反応は通常Ｚ−Ａｓ
ｐに対するＰＭのモル比で、例えば、２．０〜２．５：
１で表現される。従って、その様な場合、望ましい化合
物が高い転化率で確かに得られるのであるが、それらの
方法には、多数の欠点を有する。

【０００５】例えば、（ａ）その付加化合物は濾過する
のが比較的困難であり、最終的に求められるアスパルテ
ーム（以後、ＡＰＭと略記する。）を得るための沈殿の
処理及び品質改良には、徹底的に洗浄しなければならな
いために、ほんの少量の不純物を含有するＡＰＭを得る
のは、幾分困難である。

【０００６】（ｂ）過剰に存在する成分と、カップリン
グ生成物から遊離する非ＡＰＭ組成物の回収及び／又は
再利用が必要である。；カップリング反応がＤＬ−ＰＭ
を用いて行われた場合、一般に、残存したＤ−ＰＭは再
利用するために、ＤＬ−フェニルアラニンを経てラセミ
化しなければならない。従って、これらの方法は、工業
規模への適用が好ましくない。

【０００７】ＷＯ−９２／０２６１７（出願番号：ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９１／０５４１５）は、水性溶媒中で、酢酸存
在下、ｐＨ＝７で、Ｚ−ＡｓｐとＬ−ＰＭ・ＨＣｌとが
実質上等量（モル比はおおよそ１．２：１）で酵素によ
るカップリング反応を記載していることに注目すべきで
ある。この場合、架橋法で固定化したプロテアーゼ酵素
結晶を使用しているが、転化率は高々約２０％にしかす
ぎない。ＥＰ−Ａ−０１４９５９４には水溶液中で、Ｌ
−ＰＭに対するホルミル保護アスパラギン酸（Ｆ−Ａｓ
ｐ）のモル比が１：１での酵素によるカップリング反応
に対して、Ｆ−Ａｓｐの使用が記載されている。しかし
ながら、Ｆ−ＡＰＭ・Ｌ−ＰＭの付加化合物の生成のた
め、Ｆ−Ａｓｐの転化率は、５０％以下であり、反応後
の収率は非常に低い（Ｆ−ＡＰＭを得るための精製後で
約１２％である。）。

【０００８】カップリング反応系に存在するそのエステ
ルは、ついでながら、化学的加水分解に対して比較的鋭
敏であることも注目すべきである。このように、ＰＭは
加水分解によりフェニルアラニン（以後、Ｐｈｅと略記
する。）を生成する；Ｚ−ＡＰＭは加水分解し、Ｚ−保
護−アスパルチルフェニルアラニン（時々、Ｚ−ＡＰと
略記する。）となる。この好ましくない副反応はｐＨ≧
６又はｐＨ≦４で特に起こり、そのｐＨ値よりはずれれ
ばはずれる程、反応条件下でＺ−ＡＰＭの残留時間が長
くなればなるほど、その副反応が強くなる。

【０００９】対応する量のＤ−ＰＭの存在なしに、また
はカップリング平衡反応のずれをシフトする他の方法を
用いることなしに、Ｚ−ＡｓｐとＬ−ＰＭが当量又は事
実上当量から出発する場合、Ｚ−ＡｓｐとＬ−ＰＭの酵
素によるカップリング反応において、Ｚ−Ａｓｐに対す
る計算値の５０％以上の転化率は達成できないことが、
現在迄推定されてきた。水性溶媒中での酵素によるカッ
プリングに関しては、Ｚｈｏｕ ｅｎ Ｈｕａｎｇ（Ｉ
ｎｄｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，３２Ｂ，ｐ．３５〜３９
（１９９３））が最近、固定化プロテアーゼを使用した
反応の最適条件でさえ、Ｚ−Ａｓｐ：ＰＭの比が１：４
であることを述べている。この中で、固定化酵素を使用
した場合（例えば、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ，
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．３，ｐ．４５
９〜４６４（１９８５）），多量の目的物が固定化に使
用した樹脂に吸着し、分離抽出により取り除かなければ
ならないことが記載されている。Ｚ−ＡｓｐとＬ−ＰＭ
の１：１の比でのＮａｋａｎｉｓｈｉ等により得られた
結果は、比較的低濃度（８０ｍＭ）でせいぜい５８％の
収率であり、従って工業的実施は不適当である。

【００１０】カップリング平衡反応をシフトさせる別の
反応は、特に、（ｉ）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．
４６，ｐ．５２４１（１９８１）や、同様に特公昭６０
−３３８４０：固定化プロテアーゼと水と混和しない有
機溶媒を使用することが記載されているが、１：１のモ
ル比の場合、約２０〜３０％の転化率しか得られていな
い。又、（ｉｉ）固定化プロテアーゼと水に混和する有
機溶媒を使用する（ＧＢ−Ａ−２２５００２３）及びア
セトニトリルを使用する（ＥＰ−Ａ−０２７２５６４）
場合、Ｎ−保護−ＡｓｐとＬ−ＰＭの比が１０：１〜
１：１０にすることが記載されているが、実施例では、
かなり過剰のＬ−ＰＭのみしか示されておらず、理論比
または実質的に理論比である場合、低い転化率及び低い
収率しか得られないことが示されている。ＧＢ−Ａ−２
２５００２３の実施例から、Ｎ−保護Ａｓｐに対するＬ
−ＰＭの比を高くすると高い収率が得られる（２：１で
約８５％、１：１でたった約５０％）ことが同様に理解
できる。その様な方法では、平衡反応のシフトは、沈殿
が生成することによっては達成することができず、カッ
プリング反応生成物が有機相に移行することにより達成
される。有機溶媒を使用すると、しばしば不可避の有機
溶媒ロスによるコスト上昇の面とは別に、この様な方法
のもう一つの欠点としては、アスパルテーム製造の高度
精製を行う間に、カップリング反応に使用する有機溶媒
を取り除くために特別の方法がとられなければならない
ことがある。例えば、アセトニトリル、ジメチルホルム
アミドの様な有機溶媒又はジ及びトリグリム（ＥＰ−Ａ
−０２７８１９０参照）の様な物質を添加する場合（場
合に応じて、その中で反応を行うか、又はその存在中で
実施するか）、Ｚ−Ａｓｐに対して高モル比のＬ−ＰＭ
（・ＨＣＬ）を用いないと、一般的に低いＺ−ＡＰＭま
たは同様なものの収率しか得られない。

【００１１】さらに、化学カップリング反応（Ｎ−保護
−無水アスパラギン酸、例えば、Ｎ−ホルミル誘導体、
及びＬ−Ｐｈｅ又はＬ−ＰＭを原料とする。）におい
て、反応が化学量論的な又は実質化学量論的な比で起こ
ることは珍しくないことも注目すべきであるが、これら
の方法は水中での出発物質としてＺ−Ａｓｐを使用す
る、酵素によるカップリング反応に関しては何にも開示
していない。

【００１２】しかしながら、ＤＥ−Ａ−３５１７３６１
が、酵素法カップリング反応において、反応原料Ｚ−Ａ
ｓｐとＬ−ＰＭが実質的に等モル比でよいことを開示し
ており、注目されるが、付加物形成のために、（上記公
知文献によるＬ−ＰＭ又はＤ−ＰＭが少なくとも等モル
が過剰にあることが必要な代わりに）少なくとも一個の
Ｃ₆炭化水素基が存在する有機アミノ化合物が少なくと
も等モル必要である。実際には、この様な方法は、ＡＰ
Ｍの製造に適さない。何故ならば、一方で生成した付加
化合物は酸分解により開裂し、アミンを遊離しなければ
ならず、他方、「プロセスにとって異物である」有機化
合物が導入されるが、このものは、プロセス中の循環液
及び濾液に存在し、ＡＰＭの合成のために用いられた出
発原料と分離することが困難であるからである。

【００１３】従って、単純で、効率的であり、好ましく
は化学量論的であり、高い転化率及び原料の使用量が少
なく、循環流が少なく、少なくとも当量のＤ−ＰＭ（又
はＬ−ＰＭの追加当量）の必要もなく、カップリング反
応中に有機溶媒もアミンも必要のない、酵素によるＺ−
ＡｓｐとＬ−ＰＭとのカップリング方法が望まれてい
る。

【００１４】

【本発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上
記欠点を回避し、化学量論の又は実質的に化学量論の反
応原料を使用し、容易に濾過し得る生成物を得、高転化
率でのＺ−Ａｓｐ及びＬ−ＰＭの酵素によるカップリン
グ反応の単純なプロセスを提供することにある。驚くべ
きことに、この目的は、等モル、又は実質等モルのＺ−
ＡｓｐとＬ−ＰＭを使用し、酵素として、中性プロテア
ーゼの存在下で、初期のｐＨを４．５〜６．０にし、全
反応物質の３〜２５重量％のアルカリ金属塩、アルカリ
土類金属塩又はアンモニウム塩の存在下でこの反応を行
うことにより達成される。反応速度と好ましくない加水
分解抑制と関係して、初期のｐＨを４．７〜５．５とし
て反応を行なうことが好ましい。

【００１５】更に驚くべきことに、本発明に従って実施
する場合には、非常に都合のよいことに、出発物質（原
料）の濃度が相当高くてもカップリング反応を実施でき
ることも判った。従来の方法では、この様な高濃度で
ば、反応が進むにつれて、反応系の粘度が過度の状態に
まで上昇するため、製造プロセスとしては不可能である
ことが判っている。

【００１６】特別な説明を加えなくても、本発明の有利
な結果は、異なるｐＨ値及び塩濃度において、Ｚ−ＡＰ
Ｍ及びＺ−ＡＰＭ・ＰＭの溶解度が異なることに起因す
ることが推察される。

【００１７】本発明による方法では、アルカリ金属塩、
アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩を全反応液基準
で３〜２５重量％含み、初期のｐＨ＝４．５〜６．０１
である水性溶媒を用いて、化学量論比又は実質的に化学
量論比のＺ−保護アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニ
ンメチルエステルとを中性プロテアーゼにより酵素カッ
プリング反応を実施し、沈殿物が生成する。

【００１８】本発明において、水性溶媒とは、例えば、
メタノールやアセトニトリルの様な有機溶媒を少量（約
３０％まで）含有しても良い、均一な極性水溶液系の溶
媒をも意味する。

【００１９】種々のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属
塩又はアンモニウム塩を本発明の方法に使用できる。特
に、カリウム、ナトリウム、リチウム、カルシウム、マ
グネシウム及びアンンモニウムのハロゲン化物又は硫酸
塩、又はそれらの混合物が好ましい。ここで言うアンモ
ニウムとは、一つ又はそれ以上がＣ_1〜3アルキル基と置
換しているアンモニウム化合物も含む。その様なアンモ
ニウム塩としては、例えば、トリエチル（又はメチル）
アミン塩化物やジエチル（又はメチル）アミン塩化物等
が挙げられる。本発明においては、３〜２５重量％であ
るその含有量に関して、その塩の使用は、各々の溶解度
によっても決定される。アルカリ金属塩やアンモニウム
塩は一般に溶解度が大きく、好ましい。特に、塩化リチ
ウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウ
ム、硫酸カリウム、塩化アンモニウム及び／又は硫酸ア
ンモニウムが好ましい。

【００２０】反応系の塩の含有量が大きければ大きい
程、収率に著しく影響を及ぼすことなく、反応がより速
くなる。しかしながら、その塩の含有量が大きいと、す
ぐに系の粘度値が著しく上昇し、そして／または１つ又
はそれ以上の出発物質及び／又は塩自体の溶解限界を超
えてしまい、得られた沈殿が当該塩により不必要に汚染
され、反応の収率が低くなる。塩の含有量が２５％を超
えると、系の粘度により、反応の実施が実質上不可能と
なる。反応系の塩の含量を低くすればする程、必要な反
応時間が長くなり、加水分解、特に、Ｌ−ＰＭの加水分
解が増大する。塩の含有量が３％より低くなると、塩の
存在は全く反応に効果が無くなる。低い塩濃度では、カ
ップリング生成物の溶解度に好ましくない影響もある。
付加生成物（Ｚ−ＡＰＭ・Ｌ−ＰＭ）が早く沈殿する場
合、当の特別な条件下での反応進行中、平衡は、その生
成物の全部又は一部がＺ−ＡＰＭ沈殿物へ自動的にシフ
トするために、この沈殿は本発明の反応の妨げにならな
い。ａ）系の粘度、ｂ）出発物質の溶解度と最終目的物
の沈殿生成及びｃ）反応時間の点から最も好ましい条件
から、塩の好ましい含有量は、１０〜１８％である。こ
のことは、下文で、その系に必要な力学的条件に関する
議論の中でより詳細に議論する。

【００２１】一般に酵素によるカップリング反応は、原
則として１０〜６０℃の範囲で実施される。温度が低く
なると、カップリング反応もＬ−ＰＭおよびＺ−ＡＰＭ
の加水分解の様な副反応も遅くなる。温度が高くなる
と、酵素の失活が速くなる。従って、当業者は、Ｚ−Ａ
ＰＭの転化率及び酵素の寿命から、最良の結果を得るた
めに、温度を何度にすべきかを容易に決定することが出
来る。

【００２２】本発明の酵素によるカップリング反応は、
中性プロテアーゼを用いて実施される。この中性プロテ
アーゼは、Ｚ−ＡｓｐとＬ−ＰＭからＺ−ＡＰＭを合成
するのに用いることのできる蛋白質加水分解活性をもつ
酵素を意味し、同様に同等もしくは増強された活性をも
つ変異体も意味する。例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔ
ｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓから製造される
サーモリシンの様な金属プロテアーゼや他のプロテアー
ゼ、特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑ
ｕｅｆａｃｉｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓの
ような他のＢａｃｉｌｌｕｓ属やコラゲナーゼの様が含
まれる。一般的に、これらの酵素は、ｐＨ＝６〜８の範
囲で酵素活性が最大となるが、本発明のカップリング反
応においては、初期のｐＨが４．５〜６．０の範囲、特
に、４．７〜５．５の範囲において、過度の酵素を追加
しなくても良い結果が得られる。一般に、少量のＣａ²⁺
イオンの存在は酵素の安定化及び作用に有利な効果があ
ることも注目すべきである。

【００２３】本発明で良い結果を与える、（初期のｐＨ
値として表現される）ｐＨの範囲は酵素によるカップリ
ング反応の開始での水溶液反応系でのｐＨ値として、理
解すべきであり、本発明のカップリング反応中、原則と
して、最初にｐＨの値が少し低下し、その後、反応の進
行とともにｐＨ値が大きくなる。その低下及び増加の
間、その結果に不利な効果なしに前述のｐＨの限度を超
える。しかしながら、カップリング反応の間は、特にこ
のような反応の後半では、ｐＨ値は６．２未満、特に
５．７未満にするのが好ましい。

【００２４】初期のｐＨ値が４．５以下になると、酵素
活性が低くなり、転化率および収率が減少する。初期の
ｐＨ値が６．０を超えると、もはやこの条件ではＺ−Ａ
ＰＭに変換されず、Ｚ−ＡＰＭ・Ｌ−ＰＭの生成と同様
に好ましくないエステルの加水分解の増加のため、転化
率及び収率もまた低下する。ついでに言えば、これらの
ｐＨの限界値は使用する酵素により少し変化する。例え
ば、低いｐＨで活性である変異酵素を使用すれば、例え
ば３．５〜４．０の様なｐＨ値も可能となる。反応の終
了時、即ち、最終転化率が得られる時点では、酵素の活
性は、原則として、殆ど変化しないかほとんど変わら
ず、酵素の再使用が可能である。結果として、−特に溶
解した酵素を使用する場合−、沈殿物の分離後、その酵
素を酵素のカップリング反応に再使用することを勧め
る。そうする場合、水性溶媒の組成を、反応の初期組成
になるまで微調整することが必要となる。このようにし
て、同じ酵素量で数回繰り返して使用することが可能で
あり、酵素の初期活性が若干低下すれば、必要であれ
ば、新しい酵素を添加し、好ましい転化率が、目的に合
致する時間内に達成される。

【００２５】本発明での“Ｚ−”とは、例えば、ベンジ
ル基の環を一つまたはそれ以上のアルキル基、アルコキ
シ基、アシル基またはハロゲン基で置換したベンジルオ
キシカルボニル化合物の様な極性を有するいかなる保護
基をも意味する。また、本発明のＬ−フェニルアラニン
メチルエステル（Ｌ−ＰＭ）とは、例えば、その塩酸塩
（Ｌ−ＰＭ／ＨＣｌ）の様なその酸塩をも意味する。本
発明のベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸（Ｚ−
Ａｓｐ）とは、例えば、二ナトリウム塩（Ｚ−Ａｓｐ・
２Ｎａ）の様なその塩も意味すると理解すべきである。
明らかにＬ−ＰＭの代わりにその塩を及び／又はＺ−Ａ
ｓｐの代わりにその塩を使用する場合、そのｐＨを調整
するために、化学薬品の量を調節する必要がある。

【００２６】本発明での化学量論比又は実質化学量論比
は、Ｚ−Ａｓｐ：Ｌ−ＰＭの比が１：０．７〜０．７：
１の範囲の比を意味する。特に、１：０．８〜１：１の
範囲のモル比を使用するのが好ましい。Ｚ−Ａｓｐを若
干過剰にすれば、転化率及び収率が良くなる。１：１条
件では、一方または両方の未反応の原料の必要な循環が
最小となる。

【００２７】本発明の方法によれば、その沈殿は先行技
術で得られるＺ−ＡＰＭ・（Ｄ／Ｌ）−ＰＭ付加化合物
とは化学組成と結晶の性質及び濾過性の両方の面から異
なる。得られる結晶はより大きく、濾過速度は従って大
きく、結果として不純物が少ししか付着しないか、又は
残存する水分に少ししか残存しないため、その生成物の
精製が容易となる。

【００２８】本発明者は、そのカップリング反応を実施
する際に、系を流動させるための装置又は方法におい
て、望むならば多くの形態が可能であることを見出だし
た。そのカップリング反応は、その反応を妨げないガラ
ス製、ステンレス製等で作られたいかなる種類の容器や
カラムにおいて実施することが可能である。カラムは、
特に支持酵素などの固定化酵素を使用する場合に好適で
ある。その装置の寸法は、広範囲に変えることが出来
る。その反応は、例えば試験管、ビーカーから１０ｍ³
のスケールの範囲で実施出来る。

【００２９】また、バッチ方式反応から連続式反応まで
選択することも可能である。本発明の方法を（半）連続
操作で実施する場合、最初の反応液の転化率が、少なく
とも約６０％に達した時点から、沈殿物の連続分離を開
始することが好ましく、それ以後、沈殿物の分離に見合
った量の限度において、さらに原料を実質的に化学量論
比で添加することも容易にできる。

【００３０】本発明の転化は、反応系に付加される何等
の力学的作用のない状態、いわゆる静置状態で良好に進
行する。従って、その時選択された反応器は撹拌機又は
反応液を撹拌以外で流動化させる手段を備える必要がな
い。反応系を例えば機械的撹拌や反応容器の振動によ
り、連続的に、又は間欠的に流動させれば、素晴らしい
結果が達成される。撹拌や振動という用語には、当業者
にとって思い当たるすべての具体例が含まれる。

【００３１】この様にして、撹拌の目的にいかなるタイ
プの撹拌機も使用される。しかしながら、撹拌速度を最
適にし、粘度の変化に調節されるように、可変速式撹拌
機の使用が好ましい。しかしながら、時として撹拌速度
の影響が小さいこともある。反応容器中の内容物を外部
ポンプで循環することも、撹拌の一種と見なされる。ポ
ンプの速度と反応容器の寸法により、反応系の混合度が
決定される。振動を使用する場合は、反応が比較的小規
模、１０００リットル迄の規模で実施される場合に好ま
しいことは自明である。本発明の実施例においては、
“振動法”を使用すれば非常に高い転化率が達成され
る。非常に好ましい方法として、転化率が２０〜６０
％、特に好ましくは３０〜５０％になる迄は静置状態で
反応を実施し、その後は、所望の転化率が達成される
迄、撹拌条件下で反応を実施する方法がある。これらの
力学的方法の全ての可能な組み合わせも本発明の範疇に
入る。

【００３２】カップリング反応に使用される酵素の量は
それほど重要ではないが、高い転換率（６０％以上、好
ましくは８０％以上）に達する迄の反応時間が１５０時
間を超えない程度の量の酵素が通常使用される。一般
に、全反応混合液の重量割合で０．０８〜１．５％、特
に好ましくは０．１５〜０．７５％の当該酵素量（酵素
活性を有する蛋白質、いわゆる活性蛋白質として理解さ
れる）は、もしその全酵素量を購入した（乾燥）粗酵
素、即ち、活性蛋白及び塩の様な他の補助剤として同様
な他の蛋白の総量で換算した場合、ここで言うパーセン
トとは、原則として約０．５〜１０％であり、好ましく
は１〜５％に相当する。その酵素はしばしば粗酵素とし
て使用され、それ自体商業的にも入手できる。通常、そ
の粗酵素に含まれる活性蛋白は、粗酵素の約１５％であ
る。

【００３３】本発明の方法において、酵素はこの目的に
適したいかなる形態、即ち、溶解した状態及び固定化酵
素の状態で使用が可能である。特にその酵素自体の再使
用と同様に、得られる沈殿物の分離や、その沈殿物のそ
の後の精製時に利点を有するので、（反応溶媒に粗酵素
を溶解して得られた）溶解酵素を使用するのが好まし
い。既述の様に、変異導入酵素の使用も可能である。酵
素量として上文に記した割合は、変異導入酵素を使用す
る場合、使用する酵素の活性により変化する。

【００３４】原料であるＺ−Ａｓｐ及びＬ−ＰＭの濃度
は同様に広い範囲で変えられ、特に、初期の反応混合液
中でのそれらの物質の溶解度により決定される。しかし
ながら、少量の未溶解原料があったとしても、反応中に
溶液に溶解するので、反応の妨げにならない。従来の反
応法では、反応中に過剰の原料に起因する生成反応の停
止及び粘度の上昇により、約２００〜７００ｍＭの原料
モル濃度以上で反応を実施することが不可能である；本
発明は、実際に１２００ｍＭ迄の高濃度の原料モル濃度
でさえ良い転化率を達成できる方法を供し、従って、高
カップリング生成物濃度もまた供される。反応容積当た
りの生成量が大きくすることが可能となるため、本発明
は別の利点を有する。

【００３５】本発明を以下の実施例及び比較例により、
具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何等
限定されるものでない。

【００３６】最初に、実施例で与えられる反応混合物の
組成（初期状態での、モル濃度及び重量％）は、正確に
求められる使用量と調製された反応混合物の重量及び容
積を基に計算されたものである。転化率（と同時に反応
終了時で起こっているＬ−ＰＭの加水分解に関しての結
果）は、いわゆる逆相高速液体クロマトグラフィー（逆
相ＨＰＬＣ）により、２５７ｎｍの紫外線分光検知器を
用いて、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８を充填したカラム
で、ｐＨ＝３の多重勾配溶出システム（水／アセトニト
リル／トリエチルアミン燐酸塩）を使用して定量した。
反応混合物から取り出したサンプルは、酵素反応を停止
するために、そのたびごとに直ちにエタノール溶液に溶
解し、（溶離液の連続的液流に自動的注入により）分析
する前に、低温で保存した。以下の実施例に記載された
酵素の濃度や酵素の初期活性は、各々使用した酵素を基
にしてそのたびごとに計算された。明記したＬ−ＰＭの
加水分解値は反応終了時に測定し、最初に存在したＬ−
ＰＭの総量に対して、１時間当たりの平均的加水分解パ
ーセントで表現されている。

【００３７】実施例１ Ｌ−ＰＭ・ＨＣｌ（４．０１ｇ；１８．６ｍｍｏｌ）
を、水（２０．５７ｇ）にＺ−Ａｓｐ・二ナトリウム塩
（７．２８ｇ；２３．４ｍｍｏｌ）を加えた溶液と撹拌
機付１００ｍｌのビーカーで室温において混合した。そ
の後、その混合液を２．５９ｇの塩化ナトリウム及び
０．１７ｇのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏと撹拌しながら混合
し、３Ｎの塩酸を添加して、ｐＨを５．０に設定した。
残存している清浄な溶液を、２．９８ｇのサーモライシ
ン（大和化成社製粉末；約１５％のサーモリシン蛋白質
及び７０％の塩化ナトリウムを含有する。）と混合し
た。この様にして、以下に示す構成からなる反応混合液
が得られた。

【００３８】全重量：３９．７ｇ 全容量：３３．１ｍｌ ［Ｚ−Ａｓｐ］₀ ：７０７ｍＭ（Ｌ−ＰＭに対して２６
％過剰） ［Ｌ−ＰＭ］₀ ：５６２ｍＭ ［ＮａＣｌ］ ：１４．５％ ［ｅｎｚｙｍｅ］：７．５％（粗酵素） ｐＨ ：５．０ 反応混合液の約２．０ｍｌを、各々１５本の試験管に直
ちに移し、その後、振動機（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃ
ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｇｙｒａｔｏｒｙ水浴
振動機、Ｇ７６Ｄ型）に連結されたホルダーに浮かせ
て、４０℃のウォターバスに同時に設置した。その振動
機は１分間に２００回転するようにセットされた。ある
時間経過した後、反応の進行度を決定するために、一本
の試験管をウォターバスから取り出した。最後に、反応
を停止するために約１５ｍｌのメタノールを添加した
後、その試験管を約５℃に冷却し、その組成を逆相ＨＰ
ＬＣで分析した。酵素の初期活性値は、３２ｎｍｏｌ・
ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1−粗酵素であった。加えて、約３０分間
後に最初の沈殿が存在し、最終転化率が２．５時間の反
応後には、Ｌ−ＰＭを基準にして８７％に達することが
確認された。それ以降、反応を続けても転化率は全く増
加しなかった。２．５時間の反応後、Ｌ−Ｐｈｅの生成
は全く確認できなかった。従って、この条件下では、Ｌ
−ＰＭの加水分解は起こらない。

【００３９】実施例２ Ｌ−ＰＭ・ＨＣｌ（３．３４ｇ；１５．５ｍｍｏｌ）
と、水（１４．９ｇ）にＺ−Ａｓｐ（４．９６ｇ；１
８．６ｍｍｏｌ）を加えた溶液に２２％の水酸化ナトリ
ウム（６．７２ｇ：３７．０ｍｍｏｌのＮａＯＨ）を撹
拌機付１００ｍｌのビーカーで室温において混合し、ｐ
Ｈ＝５．０である透明な溶液が得られた。その後、その
混合液を、３．２６ｇの塩化ナトリウム、０．１２ｇの
ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ及び１．４ｇのサーモライシン（天
野製薬社製粉末；約１５％のサーモリシン蛋白質及び３
４％の塩化ナトリウムを含有する。）と混合した。この
様にして、以下に示す構成からなる反応混合液が得られ
た。

【００４０】全重量：３４．７ｇ 全容量：２９．３ｍｌ ［Ｚ−Ａｓｐ］₀ ：６３４ｍＭ（Ｌ−ＰＭに対して２０
％過剰） ［Ｌ−ＰＭ］₀ ：５２９ｍＭ ［ＮａＣｌ］ ：１３．５％ ［ｅｎｚｙｍｅ］：４．０％ ｐＨ ：５．０ 反応混合液を直ちに試験管に分けて、さらに実施例１と
同様の方法で処理した。酵素の初期活性値は、２７ｎｍ
ｏｌ・ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1−粗酵素であった。約１２０分間
後に最初の沈殿を確認することができ、最終転化率が９
時間の反応後にはＬ−ＰＭ基準で８０％に達した。それ
以降、反応を続けても転化率は全く増加しなかった。９
時間の反応後、１時間当り０．１６％のＬ−ＰＭの加水
分解に相当する少量のＬ−Ｐｈｅ（０．２１ｍｍｏｌ）
が生成していた。

【００４１】実施例３ 原料の量を以下の様にする以外は、実施例２と同様な実
施例を繰り返した。

【００４２】（Ｌ−ＰＭ・ＨＣｌ（４．７０ｇ；２１．
８ｍｍｏｌ）；Ｚ−Ａｓｐ（５．２８ｇ；１９．８ｍｍ
ｏｌ）；水（１３．６８ｇ）；２２％ＮａＯＨ（６．３
６ｇ；３５．０ｍｍｏｌ ＮａＯＨ）；ＮａＣｌ（２．
９５ｇ）；ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ（０．１３ｇ）；サーモ
リシン（実施例２と同様の天野製薬社製粉末、１．５０
ｇ）。

【００４３】この様にして、以下に示す構成からなる反
応混合液が得られた。

【００４４】全重量：３４．６ｇ 全容量：２９．０ｍｌ ［Ｚ−Ａｓｐ］₀ ：６８３ｍＭ ［Ｌ−ＰＭ］₀ ：７５２ｍＭ（Ｚ−Ａｓｐに対して１
０％過剰） ［ＮａＣｌ］ ：１３．７％ ［ｅｎｚｙｍｅ］：４．３％ ｐＨ ：５．０ 反応混合液を直ちに試験管に分けて、実施例１と同様の
方法で処理した。酵素の初期活性値は、３２ｎｍｏｌ・
ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1−粗酵素であった。約６０分間後に最初
の沈殿が確認できた。最終転化率が１３．５時間の反応
後にはＬ−ＰＭ基準で５７％に達した。それ以降、反応
を続けると、転化率はさらにいくらか増加した。１３．
５時間の反応後は、１時間当り０．１％のＬ−ＰＭの加
水分解に相当する少量のＬ−Ｐｈｅ（０．２１ｍｍｏ
ｌ）が確認された。

【００４５】実施例４ 原料の量を以下の様にする以外は、実施例２と同様な実
施例を繰り返した。

【００４６】（Ｌ−ＰＭ・ＨＣｌ（４．３１ｇ；２０．
０ｍｍｏｌ）；Ｚ−Ａｓｐ（５．８７ｇ；２２．０ｍｍ
ｏｌ）；水（１４．５３ｇ）；２２％ＮａＯＨ（６．８
９ｇ；３７．９ｍｍｏｌ ＮａＯＨ）；ＮａＣｌ（３．
２０ｇ）；ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ（０．１２ｇ）；サーモ
リシン（実施例２と同様の天野製薬社製粉末、１．４２
ｇ）。

【００４７】この様にして、以下に示す構成からなる反
応混合液が得られた。

【００４８】全重量：３６．３ｇ 全容量：３０．８ｍｌ ［Ｚ−Ａｓｐ］₀ ：７１４ｍＭ（Ｌ−ＰＭに対して１０
％過剰） ［Ｌ−ＰＭ］₀ ：６４９ｍＭ ［ＮａＣｌ］ ：１３．４％ ［ｅｎｚｙｍｅ］：３．９％ ｐＨ ：５．０ 反応混合液を直ちに試験管に分けて、さらに実施例１と
同様の方法で処理した。酵素の初期活性値は、２７．９
ｎｍｏｌ・ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1−粗酵素であった。最終転化
率が１５時間の反応後にはＬ−ＰＭ基準で８３％に達し
た。それ以降、反応を続けても転化率は全く増加しなか
った。１５時間の反応後は、１時間当り０．２％のＬ−
ＰＭの加水分解に相当する少量のＬ−Ｐｈｅが確認され
た。

【００４９】実施例５ 水（１３．５８ｇ），２２％ＮａＯＨ（７．３０ｇ；４
０．１ｍｍｏｌ）；ＮａＣｌ（４．６０ｇ）を使用する
以外は、実施例４と同様な実施例を繰り返した。この様
にして、以下に示す構成からなる反応混合液が得られ
た。

【００５０】全重量：３７．２ｇ 全容量：３１．２ｍｌ ［Ｚ−Ａｓｐ］₀ ：７０６ｍＭ（Ｌ−ＰＭに対して１０
％過剰） ［Ｌ−ＰＭ］₀ ：６４１ｍＭ ［ＮａＣｌ］ ：１７．２％ ［ｅｎｚｙｍｅ］：３．８％ ｐＨ ：５．０ 反応混合液を直ちに試験管に分けて、さらに実施例１と
同様の方法で処理した。酵素の初期活性値は、４２．０
ｎｍｏｌ・ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1−粗酵素であった。最終転化
率は、４時間の反応後にはＬ−ＰＭ基準で７７％に達し
た。それ以降、反応を続けても転化率は全く増加しなか
った。４時間の反応後は、１時間当り０．１６％のＬ−
ＰＭの加水分解に相当する少量のＬ−Ｐｈｅ（０．２３
ｍｍｏｌ）が確認された。

【００５１】実施例６ 水（１５．７８ｇ），２２％ＮａＯＨ（６．８２ｇ；３
７．５ｍｍｏｌ）；ＮａＣｌ（２．００ｇ）を使用する
以外は、実施例４と同様な実施例を繰り返した。

【００５２】この様にして、以下に示す構成からなる反
応混合液が得られた。

【００５３】全重量：３６．３ｇ 全容量：３０．８ｍｌ ［Ｚ−Ａｓｐ］₀ ：７１４ｍＭ（Ｌ−ＰＭに対して１０
％過剰） ［Ｌ−ＰＭ］₀ ：６４９ｍＭ ［ＮａＣｌ］ ：１０．０％ ［ｅｎｚｙｍｅ］：３．９％ ｐＨ ：５．０ 反応混合液を直ちに試験管に分けて、さらに実施例１と
同様の方法で処理した。酵素の初期活性値は、１８．０
ｎｍｏｌ・ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1−粗酵素であった。最終転化
率が１６時間の反応後にはＬ−ＰＭ基準で８４％に達し
た。それ以降、反応を続けても転化率は全く増加しなか
った。１６時間の反応後は、１時間当り０．３％のＬ−
ＰＭの加水分解に相当する少量のＬ−Ｐｈｅ（１．１ｍ
ｍｏｌ）の生成が確認された。

【００５４】実施例７ 原料の量を以下の様にする以外は、実施例２と同様な実
施例を繰り返し、流動の効果を明確にするため、種々の
振動速度、及び静置条件下で実験を実施した。（Ｌ−Ｐ
Ｍ・ＨＣｌ（１２．９３ｇ；６０．０ｍｍｏｌ）；Ｚ−
Ａｓｐ（１８．３３ｇ；６８．６ｍｍｏｌ）；水（４
３．８６ｇ）；２２％ＮａＯＨ（１９．９９ｇ；１０
９．９ｍｍｏｌ ＮａＯＨ）；ＮａＣｌ（９．７５
ｇ）；ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ（０．４２ｇ）；サーモリシ
ン（実施例２と同様の天野製薬社製粉末、４．２６
ｇ）。

【００５５】この様にして、以下に示す構成からなる反
応混合物が得られた。

【００５６】全重量：１０９．５ｇ 全容量：９１．２ｍｌ ［Ｚ−Ａｓｐ］₀ ：７５２ｍＭ（Ｌ−ＰＭに対して１４
％過剰） ［Ｌ−ＰＭ］₀ ：６５８ｍＭ ［ＮａＣｌ］ ：１３．４％ ［ｅｎｚｙｍｅ］：３．９％ ｐＨ ：５．０ 得られた反応混合液の内の１５ｍｌを、４０℃のウォタ
ーバス中に設置し、振動機に連結されたホルダーに浮か
せた３．３ｃｍの直径を有するガラス製反応器に移し
た。振動機の回転速度を１分間に１５０回転にセットし
た。

【００５７】同時に、別の１５ｍｌの反応混合液を、回
転速度を１分間に２５０回転にセットした別の振動機で
同様に処理した。更に、別の１０ｍｌの反応混合物を、
４０℃での静置状態で貯蔵した。

【００５８】ある時間が経過した後、反応の進行度を決
定するため容器からサンプルを取り出した。沈殿がない
か、または非常に少量の沈殿が存在している最初のサン
プルはピペットで取り出した。沈殿生成により反応混合
液の粘度が上がっているその後のサンプルは、スパチュ
ラにより取り出した。最後のサンプルは約１５ｍｌのメ
タノールで希釈して取り出し、すべてのサンプルは約５
℃に冷却してから、逆相ＨＰＬＣでそれらの組成を分析
した。酵素の初期活性値は、１５０回転の場合、３７．
８ｎｍｏｌ・ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1−粗酵素であり、２５０回
転の場合、３０．０ｎｍｏｌ・ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1−粗酵素
であり、静置条件下では、２１．０ｎｍｏｌ・ｍｉｎ^-1
ｍｇ^-1−粗酵素であった。その３つの条件下で、１５０
回転の場合、８時間以内、他の場合、１２時間以内に、
転化率はＬ−ＰＭ基準で約８９％となり、それ以降、反
応を続けても転化率は全く増加しなかった。これらの３
つの条件下において、Ｌ−ＰＭの加水分解は１時間当り
０．２％の量であった。振動を行った状態で４時間後に
存在する沈殿の化学組成を測定し、少なくとも９８％が
Ｚ−ＡＰＭであることを確認した。

【００５９】実施例８ 実施例７で準備した初期の反応混合物の別の５０ｍｌ
を、４０℃に保温してあり、撹拌羽根が底の僅か上部と
液面の僅か下部に位置している可変撹拌機が付いた直径
約５ｃｍのガラス製反応容器に移した。撹拌機の回転速
度は６０回転／分に設定した。ある時間が経過後に、実
施例７と同様に、各々ピペットまたはスパチュラでサン
プルを取り出し、分析した。酵素の初期活性値は、２
０．１ｎｍｏｌ・ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1−粗酵素であった。２
５時間反応が経過した後、転化率はＬ−ＰＭ基準で６７
％に達し、それ以降、反応を続けると転化率は依然とし
てさらに増加した。２５時間後、１時間当り０．０７％
のＬ−ＰＭの加水分解に相当する少量のＬ−Ｐｈｅ
（０．５５ｍｍｏｌ）の生成が確認された。４時間後お
よび２０時間後に存在する沈殿の化学組成を測定した。
４時間後では、９８％がＺ−ＡＰＭ・Ｌ−ＰＭであり、
２％がＺ−ＡＰＭであったが、２０時間後では、これら
の割合は、６７％がＺ−ＡＰＭ・Ｌ−ＰＭであり、３３
％がＺ−ＡＰＭに変化した。

【００６０】実施例９ 主にＫＣｌ又はＮａ₂ＳＯ₄を使用して、１３．４％の塩
含量を達成した溶液を調製し、他の組成が同じである実
施例７及び実施例８と同様な原料を準備した。混合液Ａ
には１２．１％のＫＣｌと１．３％のＮａＣｌが含まれ
ている。混合液Ｂには、８．９％のＮａ₂ＳＯ₄と４．５
％ＮａＣｌが含まれてる。カップリング反応を実施した
ところ、実施例７及び実施例８の結果と同様の結果が確
認された。

【００６１】実施例１０ 実施例７と同様の方法で、新たに反応混合液を準備し
た。その反応混合液の５０ｍｌを４０℃に保温した実施
例８と同様のガラス製反応容器に直ちに移した。しかし
ながら、５時間後まで静置条件下にしておき、その後撹
拌を開始し、回転速度を６０回転／分にセットした。

【００６２】ある時間が経過後に、実施例７と同様にサ
ンプルを取り出し、分析した。酵素の初期活性値は、２
０．６ｎｍｏｌ・ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1−粗酵素であった。５
時間経過後、転化率はＬ−ＰＭ基準で４３％であった。
反応時間が２０時間経過した後、転化率はＬ−ＰＭ基準
で８６％に達し、それ以降、反応を続けると転化率は依
然として増加した。２５時間後、１時間当り０．１７％
のＬ−ＰＭの加水分解に相当する少量のＬ−Ｐｈｅ
（１．１ｍｍｏｌ）が確認された。

【００６３】実施例１１ 以下の組成を有する反応混合液（全重量：３３９．９６
ｇ；全容積：２７５．６ｍｌ）を調製した。

【００６４】［Ｚ−Ａｓｐ］₀ ：７４５ｍＭ（Ｌ−ＰＭ
に対して１４％過剰） ［Ｌ−ＰＭ］₀ ：６５３ｍＭ ［ＮａＣｌ］ ：１３．０％ ［ｅｎｚｙｍｅ］：３．８％（粗酵素：天野製薬製サー
モリシン） ｐＨ ：５．３ 反応混合液を、実施例８と同様の方法で、９０ｍｌの３
つの溶液（Ａ，Ｂ，Ｃ）に分割した。溶液ＡのｐＨはカ
ップリング反応の間に調製しなかった。溶液ＢのｐＨは
（ｐＨが低下する場合、）ＮａＯＨを添加し、（ｐＨが
増大する場合、）ＨＣｌを添加して、ｐＨを約５．３に
保った。溶液Ｃの場合、（ｐＨが５．３を越える場
合、）ＨＣｌを添加してｐＨを約５．３に保つようにし
た。

【００６５】溶液Ａ及び溶液Ｂのカップリング反応にお
いては、３０分後に、すでに結晶が生じていた、溶液Ｃ
の場合は、約１時間かかった。溶液Ａ（酵素の初期活性
が３３．０ｎｍｏｌ・ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1−粗酵素）におい
て、転化率は２４時間後に約７０％となり、それ以降は
反応を続けてもこの転化率は増加しなかった。最終のｐ
Ｈが６．１６であり、ＰＭの加水分解は、１時間当り約
０．１％であった。溶液Ｂおよび溶液Ｃ（同じ酵素の初
期活性を有する。）においては、溶液Ｂでは６０時間後
には、転化率は９５％であり、溶液Ｃでは４５時間後に
は、転化率は９６％であり、ＰＭの加水分解は１時間当
り０．０７％であった。

【００６６】比較例１ 原料の量を以下の様にし、ｐＨを６．０にする以外は、
実施例２と同様な実施例を繰り返した。：（Ｌ−ＰＭ・
ＨＣｌ（４．０４ｇ；１８．８ｍｍｏｌ）；Ｚ−Ａｓｐ
（５．３４ｇ；２０．０ｍｍｏｌ）；水（４４．３５
ｇ）；２２％ＮａＯＨ（７．５６ｇ；４１．６ｍｍｏｌ
ＮａＯＨ）；ＮａＣｌ（８．０８ｇ）；ＣａＣｌ₂・
２Ｈ₂Ｏ（０．１２ｇ）；サーモリシン（実施例２と同
様の天野製薬社製粉末、１．４２ｇ）。

【００６７】この様にして、以下に示す構成からなる透
明な反応混合液が得られた。

【００６８】全重量：７０．１ｇ 全容量：６１．７ｍｌ ［Ｚ−Ａｓｐ］₀ ：３２４ｍＭ（Ｌ−ＰＭに対して６％
過剰） ［Ｌ−ＰＭ］₀ ：３０５ｍＭ ［ＮａＣｌ］ ：１３．４％ ［ｅｎｚｙｍｅ］：１．０％ ｐＨ ：６．０ 反応混合液を試験管に分けて、さらに実施例１と同様の
方法で処理した。酵素の初期活性値は、６１ｎｍｏｌ・
ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1−粗酵素であった。最終転化率が３時間
の反応後にはＬ−ＰＭ基準で４６％に達した。それ以
降、反応を続けても転化率は全く増加しなかった。３時
間反応後、初期の１８ｍｍｏｌを基にして、１時間当り
約１．１５％のＬ−ＰＭの加水分解に相当する０．６５
ｍｍｏｌのＬ−Ｐｈｅが生成したことを確認した。

【００６９】

【発明の効果】本発明のＮ−ベンジルカルボキシル−α
−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエス
テルの製造方法によれば、化学量論的又は実質的に化学
量論的反応原料の反応物を採用することにより、原料の
使用量が少なく、循環流も少なく、有機溶媒やアミンも
必要なく、高い転化率で濾過し得る生成物が得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピーター ヤン レオナルド クオデフリ ーグ オランダ国 ゲーレン ジェー ケー 6162、 スロートマーカーショフ ８

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＮ
   −ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸との
   酵素法によるカップリング反応により、水性溶媒中で沈
   殿物として、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−
   アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを
   製造する方法において、等モル又は実質等モルのＬ−フ
   ェニルアラニンメチルエステルとＮ−ベンジルオキシカ
   ルボニル−Ｌ−アスパラギン酸を使用して、酵素として
   中性プロテアーゼの作用下で、当初のｐＨが４．５〜
   ６．０の範囲で、全反応物質基準で３〜２５重量％のア
   ルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩
   の存在下でカップリング反応を実施することを特徴とす
   る高い転化率での酵素によるＮ−ベンジルオキシカルボ
   ニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメ
   チルエステルの製造方法。
2. 【請求項２】請求項１に記載の製造方法において、当初
   のｐＨが４．７〜５．５の範囲であることを特徴とする
   Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル
   −Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造方法。
3. 【請求項３】請求項１又は請求項２に記載の製造方法に
   おいて、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアン
   モニウム塩が、全反応物質の１０〜１８重量％存在する
   ことを特徴とするＮ−ベンジルオキシカルボニル−α−
   Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
   ルの製造方法。
4. 【請求項４】請求項１〜３のいずれかの請求項に記載の
   製造方法において、アルカリ金属塩又はアンモニウム塩
   が、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫
   酸ナトリウム、硫酸カリウム、塩化アンモニウム、及び
   ／又は硫酸アンモニウムであることを特徴とするＮ−ベ
   ンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−
   フェニルアラニンメチルエステルの製造方法。
5. 【請求項５】請求項１〜４のいずれかの請求項に記載の
   製造方法において、全反応物質の０．０８〜１．５重量
   ％、特に０．１５〜０．７５重量％の酵素の存在下で、
   カップリング反応を実施することを特徴とするＮ−ベン
   ジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
   ェニルアラニンメチルエステルの製造方法。
6. 【請求項６】請求項１〜５のいずれかの請求項に記載の
   製造方法において、溶解した酵素を使用することを特徴
   とするＮ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパ
   ルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造方
   法。
7. 【請求項７】請求項１〜６のいずれかの請求項に記載の
   製造方法において、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
   −アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニンメチルエステ
   ルとのモル比が１：０．７〜０．７：１の範囲であるこ
   とを特徴とするＮ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ
   −アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
   の製造方法。
8. 【請求項８】請求項７に記載の製造方法において、Ｎ−
   ベンジルオキシカルボニル−アスパラギン酸とＬ−フェ
   ニルアラニンメチルエステルとのモル比が１：０．８〜
   １：１の範囲であることを特徴とするＮ−ベンジルオキ
   シカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
   ラニンメチルエステルの製造方法。
9. 【請求項９】請求項１〜８のいずれかの請求項に記載の
   製造方法において、カップリング反応の水性反応系のｐ
   Ｈを、６．２以下、好ましくは５．７以下に維持するこ
   とを特徴とするＮ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ
   −アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
   の製造方法。
10. 【請求項１０】請求項１〜９のいずれかの請求項に記載
    の製造方法において、少なくともカップリング反応時で
    は、反応混合液を流動させる条件下でカップリング反応
    を行うことを特徴とするＮ−ベンジルオキシカルボニル
    −α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチル
    エステルの製造方法。
11. 【請求項１１】請求項１〜１０のいずれかの請求項に記
    載の製造方法において、少なくともカップリング反応時
    では、反応混合液を振動により流動させることを特徴と
    するＮ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパル
    チル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造方
    法。
12. 【請求項１２】請求項１〜１１のいずれかの請求項に記
    載の製造方法において、当初の反応混合物の少なくとも
    ６０％転化した時点で反応生成物である沈殿を連続的に
    抜き出しながら、その実質的に同じ比率で反応原料を更
    に添加することにより、カップリング反応を半連続的に
    実施することを特徴とするＮ−ベンジルオキシカルボニ
    ル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチ
    ルエステルの製造方法。
13. 【請求項１３】請求項１〜１２のいずれかの請求項に記
    載の製造方法において、反応初期の転化率が約２０〜６
    ０％に達するまでは、カップリング反応を静置条件下で
    実施し、それ以降のカップリング反応の間、少なくとも
    時には、反応混合液を流動下に保って、反応を実施する
    ことを特徴とするＮ−ベンジルオキシカルボニル−α−
    Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
    ルの製造方法。
14. 【請求項１４】明細書及び実施例に実質的に記載された
    Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル
    −Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造方法。
15. 【請求項１５】請求項１〜１４のいずれかのＮ−ベンジ
    ルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェ
    ニルアラニンメチルエステルの製造方法により得られる
    Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル
    −Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル。