JPH0716097A - ｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸誘導体とフェニルアラニン又はフェニルアラニン低級アルキルエステルの縮合物製造法 - Google Patents
ｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸誘導体とフェニルアラニン又はフェニルアラニン低級アルキルエステルの縮合物製造法Info
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- JPH0716097A JPH0716097A JP3306202A JP30620291A JPH0716097A JP H0716097 A JPH0716097 A JP H0716097A JP 3306202 A JP3306202 A JP 3306202A JP 30620291 A JP30620291 A JP 30620291A JP H0716097 A JPH0716097 A JP H0716097A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】酵素を使用してジペプチドを調製するにあた
り、酵素活性を長く持続させ、ジペプチドの収量を高め
る。 【構成】水可溶性有機溶剤中で、水及び固定化酵素の存
在下で、ｌ−アスパラギン酸及びｌ−アスパラギン酸誘
導体の少なくとも一種と、フェニルアラニン及びフェニ
ルアラニン低級アルキルエステルの少なくとも一種を反
応させることによって、ｌ−アスパラギン酸又はｌ−ア
スパラギン酸誘導体とフェニルアラニン又はフェニルア
ラニン低級アルキルエステルの縮合物を調製する。
り、酵素活性を長く持続させ、ジペプチドの収量を高め
る。 【構成】水可溶性有機溶剤中で、水及び固定化酵素の存
在下で、ｌ−アスパラギン酸及びｌ−アスパラギン酸誘
導体の少なくとも一種と、フェニルアラニン及びフェニ
ルアラニン低級アルキルエステルの少なくとも一種を反
応させることによって、ｌ−アスパラギン酸又はｌ−ア
スパラギン酸誘導体とフェニルアラニン又はフェニルア
ラニン低級アルキルエステルの縮合物を調製する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ジペプチドを調製する
方法に関し、特に水溶性有機溶剤中で水及び固定化酵素
の存在下で、ｌ−アスパラギン酸及びｌ−アスパラギン
酸誘導体の少なくとも一種と、フェニルアラニン及びフ
ェニルアラニン低級アルキルエステルの少なくとも一種
を反応させて、ｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギ
ン酸誘導体とフェニルアラニン又はフェニルアラニン低
級アルキルエステルの縮合物の構造であるジペプチドの
製造法に関する。
方法に関し、特に水溶性有機溶剤中で水及び固定化酵素
の存在下で、ｌ−アスパラギン酸及びｌ−アスパラギン
酸誘導体の少なくとも一種と、フェニルアラニン及びフ
ェニルアラニン低級アルキルエステルの少なくとも一種
を反応させて、ｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギ
ン酸誘導体とフェニルアラニン又はフェニルアラニン低
級アルキルエステルの縮合物の構造であるジペプチドの
製造法に関する。
【０００２】本発明は、基質よりの生成物をより容易に
回収するために溶解性を改善し、生成物の回収及び基質
調製を容易にする水溶性有機溶剤中での反応を含むｌ−
アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸誘導体とフェニ
ルアラニン又はフェニルアラニン低級アルキルエステル
の縮合物の構造であるジペプチドの製造法に関する。
回収するために溶解性を改善し、生成物の回収及び基質
調製を容易にする水溶性有機溶剤中での反応を含むｌ−
アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸誘導体とフェニ
ルアラニン又はフェニルアラニン低級アルキルエステル
の縮合物の構造であるジペプチドの製造法に関する。
【０００３】
【従来の技術】一般にプロテアーゼが蛋白質分解の可逆
反応においてペプチド結合を形成させるために使用され
ることは公知である。ジペプチドの合成のための可逆反
応を円滑にするために多数の公知の方法がある。米国特
許第４,１６５,３１１号はプロテアーゼの存在下で水性
媒体中でジペプチドとアミノ酸エステルを反応させて付
加化合物を調製する方法を開示している。前記特許の方
法を改良し、さらに酵素を固定化することによって、酵
素の安定性の向上を可能とした。米国特許第４，２８
４，７２１号は水不溶性有機溶剤中で水を含む固定化金
属プロテアーゼがペプチド結合形成に有効であることを
開示している。有機化学雑誌（４６巻、５２４１ペー
ジ、１９８１年）は、生成物が水不溶性有機溶剤へ即時
に移行するので、反応率は平衡収量と同様に比較的よい
ことを開示している。
反応においてペプチド結合を形成させるために使用され
ることは公知である。ジペプチドの合成のための可逆反
応を円滑にするために多数の公知の方法がある。米国特
許第４,１６５,３１１号はプロテアーゼの存在下で水性
媒体中でジペプチドとアミノ酸エステルを反応させて付
加化合物を調製する方法を開示している。前記特許の方
法を改良し、さらに酵素を固定化することによって、酵
素の安定性の向上を可能とした。米国特許第４，２８
４，７２１号は水不溶性有機溶剤中で水を含む固定化金
属プロテアーゼがペプチド結合形成に有効であることを
開示している。有機化学雑誌（４６巻、５２４１ペー
ジ、１９８１年）は、生成物が水不溶性有機溶剤へ即時
に移行するので、反応率は平衡収量と同様に比較的よい
ことを開示している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】米国特許第４，１６
５，３１１号の方法では可溶性酵素しか使用することが
できない。概してこのような可溶性酵素はコスト高であ
るばかりでなく、水性媒体中では不安定であり、工業上
きわめて限られた用途にしか使用できない。
５，３１１号の方法では可溶性酵素しか使用することが
できない。概してこのような可溶性酵素はコスト高であ
るばかりでなく、水性媒体中では不安定であり、工業上
きわめて限られた用途にしか使用できない。
【０００５】この特許の改良方法である固定化酵素を使
用しても反応生成物と酵素を分離することが困難である
ので、あらゆる種類の固定化酵素を使用することは実用
上不可能であった。前記有機化学雑誌の方法では、反応
率は平衡収量と同様に比較的よいが、なお水性媒体中に
おけるよりもより低い。米国特許第４，２８４，７２１
号の方法では、有機溶剤中で安定な固定化酵素を使用し
ているけれど、酵素は或程度水を含んでいることが必要
なので、水不溶性有機溶剤は必然的に２相を含むことが
必要であり、このような２相媒体は合成法の連続操作に
制約を加える。特に充填カラム反応装置や撹拌槽型反応
装置の製造法では制約が大きい。また撹拌槽型反応装置
では必然的に酵素の損耗を生じる。なおその上たとえ固
定化酵素といえども充分に安定ではない。
用しても反応生成物と酵素を分離することが困難である
ので、あらゆる種類の固定化酵素を使用することは実用
上不可能であった。前記有機化学雑誌の方法では、反応
率は平衡収量と同様に比較的よいが、なお水性媒体中に
おけるよりもより低い。米国特許第４，２８４，７２１
号の方法では、有機溶剤中で安定な固定化酵素を使用し
ているけれど、酵素は或程度水を含んでいることが必要
なので、水不溶性有機溶剤は必然的に２相を含むことが
必要であり、このような２相媒体は合成法の連続操作に
制約を加える。特に充填カラム反応装置や撹拌槽型反応
装置の製造法では制約が大きい。また撹拌槽型反応装置
では必然的に酵素の損耗を生じる。なおその上たとえ固
定化酵素といえども充分に安定ではない。
【０００６】水不溶性有機溶剤のこれらの不利益を避け
るために水溶性有機溶剤の使用が検討されている。しか
しこのような媒体中で固定化酵素を囲む水と有機溶剤間
でミクロ膜の形成を生じ、フィードバックを抑え反応率
を必然的に減少させる。
るために水溶性有機溶剤の使用が検討されている。しか
しこのような媒体中で固定化酵素を囲む水と有機溶剤間
でミクロ膜の形成を生じ、フィードバックを抑え反応率
を必然的に減少させる。
【０００７】しかし他方では、混合有機溶剤が可逆的ペ
プチド生成反応を合成の方向へ移すということができる
との報告もある。（生化学１７巻、５２２０ページ、１
９７８年）。
プチド生成反応を合成の方向へ移すということができる
との報告もある。（生化学１７巻、５２２０ページ、１
９７８年）。
【０００８】従って本願発明の目的は上記欠点を克服す
るジペプチドを調製する改良方法を提供することであ
る。
るジペプチドを調製する改良方法を提供することであ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に本願請求項１の発明は、ｌ−アスパラギン酸及びｌ−
アスパラギン酸誘導体の少なくとも一種と、フェニルア
ラニン及びフェニルアラニン低級アルキルエステルの少
なくとも一種を、１種又は２種以上の水溶性有機溶剤中
で、水及び固定化酵素の存在下で反応させることを特徴
とするｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸誘導
体とフェニルアラニン又はフェニルアラニン低級アルキ
ルエステルの縮合物製造法を提供することである。
に本願請求項１の発明は、ｌ−アスパラギン酸及びｌ−
アスパラギン酸誘導体の少なくとも一種と、フェニルア
ラニン及びフェニルアラニン低級アルキルエステルの少
なくとも一種を、１種又は２種以上の水溶性有機溶剤中
で、水及び固定化酵素の存在下で反応させることを特徴
とするｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸誘導
体とフェニルアラニン又はフェニルアラニン低級アルキ
ルエステルの縮合物製造法を提供することである。
【００１０】請求項２の発明は、上記縮合物製造法にお
いて、固定化酵素として固定化金属プロテアーゼを使用
するものである。
いて、固定化酵素として固定化金属プロテアーゼを使用
するものである。
【００１１】請求項３の発明は、上記縮合物製造法にお
いて、保護基（Ｘ）がベンゾイル基、ベンゾイルオキシ
カルボニル基、Ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル
基及びｔ−ブトキシカルボニル基よりなる群より選ばれ
たものであるｌ−アスパラギン酸誘導体を使用するもの
である。
いて、保護基（Ｘ）がベンゾイル基、ベンゾイルオキシ
カルボニル基、Ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル
基及びｔ−ブトキシカルボニル基よりなる群より選ばれ
たものであるｌ−アスパラギン酸誘導体を使用するもの
である。
【００１２】請求項４の発明は、上記縮合物製造法にお
いて、低級アルキル基（Ｙ）がメチル基、エチル基、プ
ロピル基及びブチル基よりなる群より選ばれたものであ
るフェニルアラニン低級アルキルエステルを使用するも
のである。
いて、低級アルキル基（Ｙ）がメチル基、エチル基、プ
ロピル基及びブチル基よりなる群より選ばれたものであ
るフェニルアラニン低級アルキルエステルを使用するも
のである。
【００１３】請求項５の発明は、上記縮合物製造法にお
いて、反応媒体中の水溶性有機溶剤として、メタノー
ル、エタノール、アセトニトリル、ジメチルフォルムア
ミド、ジメチルスルフォキシド、テトラヒドロフラン、
エチレングリコール又は分子量２００乃至２０００のポ
リエチレングリコールを使用するものである。
いて、反応媒体中の水溶性有機溶剤として、メタノー
ル、エタノール、アセトニトリル、ジメチルフォルムア
ミド、ジメチルスルフォキシド、テトラヒドロフラン、
エチレングリコール又は分子量２００乃至２０００のポ
リエチレングリコールを使用するものである。
【００１４】請求項６の発明は、上記縮合物製造法にお
いて、反応媒体中の水溶性有機溶剤として、２種以上の
水溶性有機溶剤を使用するものである。
いて、反応媒体中の水溶性有機溶剤として、２種以上の
水溶性有機溶剤を使用するものである。
【００１５】請求項７の発明は、上記縮合物製造法にお
いて、反応媒体１００重量部中、水溶性有機溶剤１０乃
至７０重量部を使用するものである。
いて、反応媒体１００重量部中、水溶性有機溶剤１０乃
至７０重量部を使用するものである。
【００１６】請求項８の発明は、上記縮合物製造法にお
いて、水溶性有機混合溶剤１００重量部中、エチレング
リコール又は分子量２００乃至２０００のポリエチレン
グリコールを５〜４０重量部を使用するものである。
いて、水溶性有機混合溶剤１００重量部中、エチレング
リコール又は分子量２００乃至２０００のポリエチレン
グリコールを５〜４０重量部を使用するものである。
【００１７】請求項９の発明は、上記縮合物製造法にお
いて、金属プロテアーゼとしてサブティリス、ステアロ
セルモフィラスよりなる群から選ばれた桿状菌種の培養
により得られた酵素を使用するものである。
いて、金属プロテアーゼとしてサブティリス、ステアロ
セルモフィラスよりなる群から選ばれた桿状菌種の培養
により得られた酵素を使用するものである。
【００１８】請求項１０の発明は、上記縮合物製造法に
おいて、金属プロテアーゼとしてセルモリシン又はセル
モアーゼを使用するものである。
おいて、金属プロテアーゼとしてセルモリシン又はセル
モアーゼを使用するものである。
【００１９】請求項１１の発明は、上記縮合物製造法に
おいて、ｌ−アスパラギン酸及びｌ−アスパラギン酸誘
導体の少なくとも一種のフェニルアラニン及びフェニル
アラニン低級アルキルエステルの少なくとも一種に対す
るモル比を１：１及至１：５として使用するものであ
る。
おいて、ｌ−アスパラギン酸及びｌ−アスパラギン酸誘
導体の少なくとも一種のフェニルアラニン及びフェニル
アラニン低級アルキルエステルの少なくとも一種に対す
るモル比を１：１及至１：５として使用するものであ
る。
【００２０】
【作用】本発明で使用する出発物質であるｌ−アスパラ
ギン酸、ｌ−アスパラギン酸誘導体、フェニルアラニン
及びフェニルアラニン低級アルキルエステルは水溶性有
機溶剤に高濃度で溶解し、酵素もこれら水溶性有機溶剤
に溶解し安定であるから、出発物質の反応は容易であ
り、かつ酵素の効力が長く持続し、大きい収率で縮合物
を得ることができる。
ギン酸、ｌ−アスパラギン酸誘導体、フェニルアラニン
及びフェニルアラニン低級アルキルエステルは水溶性有
機溶剤に高濃度で溶解し、酵素もこれら水溶性有機溶剤
に溶解し安定であるから、出発物質の反応は容易であ
り、かつ酵素の効力が長く持続し、大きい収率で縮合物
を得ることができる。
【００２１】
【実施例】本発明で使用するｌ−アスパラギン酸、ｌ−
アスパラギン酸誘導体、フェニルアラニン又はフェニル
アラニン低級アルキルエステルは一般公知の方法で提供
される。そしてｌ−アスパラギン酸誘導体の保護基
（Ｘ）はベンゾイル基、ベンゾイルオキシカルボニル
基、Ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基又はｔ−
ブトキシカルボニル基であることが好ましく、フェニル
アラニン低級アルキルエステルのアルキル基はメチル
基、エチル基、プロピル基又はブチル基であることが好
ましい。
アスパラギン酸誘導体、フェニルアラニン又はフェニル
アラニン低級アルキルエステルは一般公知の方法で提供
される。そしてｌ−アスパラギン酸誘導体の保護基
（Ｘ）はベンゾイル基、ベンゾイルオキシカルボニル
基、Ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基又はｔ−
ブトキシカルボニル基であることが好ましく、フェニル
アラニン低級アルキルエステルのアルキル基はメチル
基、エチル基、プロピル基又はブチル基であることが好
ましい。
【００２２】本発明で使用する酵素は、プロテアーゼで
あり、好ましくはサブスティリス、スティアロセルモフ
ィス（ Subtilis，Stearothermophilus ）のような桿状
菌より生成する金属プロテアーゼ（metallo protease）
である。
あり、好ましくはサブスティリス、スティアロセルモフ
ィス（ Subtilis，Stearothermophilus ）のような桿状
菌より生成する金属プロテアーゼ（metallo protease）
である。
【００２３】本発明で酵素を固定化して使用する方法は
公用の技術によるが、物理的吸着法、共有結合法、包含
法、架橋法がある。
公用の技術によるが、物理的吸着法、共有結合法、包含
法、架橋法がある。
【００２４】縮合反応は水溶性有機溶剤を約７０％以上
含む水性媒体中で、或いは数種類の水溶性有機混合溶剤
である水性媒体中で継続させる。好ましい水溶性有機溶
剤は、メタノール、エタノール等のアルコール類、エチ
レングリコール、分子量２００〜２０００のポリエチレ
ングリコール等のグリコール類、ジメチルフォルムアミ
ド、ジメチルスルフォキシド、アセトニトリル、テトラ
ヒドロフランである。
含む水性媒体中で、或いは数種類の水溶性有機混合溶剤
である水性媒体中で継続させる。好ましい水溶性有機溶
剤は、メタノール、エタノール等のアルコール類、エチ
レングリコール、分子量２００〜２０００のポリエチレ
ングリコール等のグリコール類、ジメチルフォルムアミ
ド、ジメチルスルフォキシド、アセトニトリル、テトラ
ヒドロフランである。
【００２５】さらに水溶性有機溶剤を含む水性媒体或い
は水溶性有機混合溶剤は反応出発物質であるｌ−アスパ
ラギン酸、ｌ−アスパラギン酸誘導体、フェニルアラニ
ン及びフェニルアラニン低級アルキルエステルにも、生
成物であるｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸
誘導体とフェニルアラニン又はフェニルアラニン低級ア
ルキルエステルの縮合物にも、高い溶解性を持っている
ことが必要である。好適に選ばれた水性媒体は高い反応
率と高い平衡状態を生じる。酵素安定性は同じ媒体中で
維持されねばならない。
は水溶性有機混合溶剤は反応出発物質であるｌ−アスパ
ラギン酸、ｌ−アスパラギン酸誘導体、フェニルアラニ
ン及びフェニルアラニン低級アルキルエステルにも、生
成物であるｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸
誘導体とフェニルアラニン又はフェニルアラニン低級ア
ルキルエステルの縮合物にも、高い溶解性を持っている
ことが必要である。好適に選ばれた水性媒体は高い反応
率と高い平衡状態を生じる。酵素安定性は同じ媒体中で
維持されねばならない。
【００２６】本発明では各々の出発物質の濃度は高濃度
であることが望しい。その理由は濃度が大きくなればな
るほど反応率はより大きくなるからである。各々の出発
物質の各濃度は出発物質及び生成物質が、媒体中で常に
溶解状態を維持せねばならないので０.２５Ｍ〜１.０Ｍ
の範囲であることが望しい。
であることが望しい。その理由は濃度が大きくなればな
るほど反応率はより大きくなるからである。各々の出発
物質の各濃度は出発物質及び生成物質が、媒体中で常に
溶解状態を維持せねばならないので０.２５Ｍ〜１.０Ｍ
の範囲であることが望しい。
【００２７】本発明においてｌアスパラギン酸及びｌア
スパラギン酸誘導体の少なくとも一種と、フェニルアラ
ニン及びフェニルアラニン低級アルキルエステルの少な
くとも一種の使用量は１：１乃至１：５のモル比の範囲
である。その理由は後者のモル濃度の方が前者のモル濃
度より大きいことが便宜であるからである。
スパラギン酸誘導体の少なくとも一種と、フェニルアラ
ニン及びフェニルアラニン低級アルキルエステルの少な
くとも一種の使用量は１：１乃至１：５のモル比の範囲
である。その理由は後者のモル濃度の方が前者のモル濃
度より大きいことが便宜であるからである。
【００２８】本発明において反応に使用する固定化酵素
の使用量は全く制限されない。その理由は酵素は単に反
応時間に影響するだけだからである。
の使用量は全く制限されない。その理由は酵素は単に反
応時間に影響するだけだからである。
【００２９】その他本発明においては、塩化カルシュウ
ム等の公知の酵素安定剤を適宜添加することが望まし
い。
ム等の公知の酵素安定剤を適宜添加することが望まし
い。
【００３０】反応混合物のPHは選ばれた反応媒体中で酵
素活性が最大となる範囲で維持されねばならない。一般
にPHは約５〜８、好ましくは５.５〜７.０の範囲であ
る。PHは反応を開始させる前に水酸化ナトリウムを加え
て調節する。
素活性が最大となる範囲で維持されねばならない。一般
にPHは約５〜８、好ましくは５.５〜７.０の範囲であ
る。PHは反応を開始させる前に水酸化ナトリウムを加え
て調節する。
【００３１】反応温度は一般に約５℃〜５０℃の範囲で
あり、好ましくは３０℃〜５０℃の範囲である。
あり、好ましくは３０℃〜５０℃の範囲である。
【００３２】反応時間は反応温度、出発物質の濃度、固
定化酵素の量に影響されるが、０.５時間〜１０時間で
充分である。
定化酵素の量に影響されるが、０.５時間〜１０時間で
充分である。
【００３３】本出願の方法は固定化酵素を充填したカラ
ムへ水溶性有機溶剤に出発物質を溶解したものを導入す
る。この方法は反応を連続的に続けることができるので
工業的応用には特に利点がある。その他撹拌槽型反応装
置で実施してもよい。たゞし撹拌槽型反応装置は固定化
酵素を損耗させる可能性がある。
ムへ水溶性有機溶剤に出発物質を溶解したものを導入す
る。この方法は反応を連続的に続けることができるので
工業的応用には特に利点がある。その他撹拌槽型反応装
置で実施してもよい。たゞし撹拌槽型反応装置は固定化
酵素を損耗させる可能性がある。
【００３４】生成した縮合物は、通常生成混合物より固
体として回収する。精製の後処理をしなくても高純度の
縮合物を得る。未反応のｌ−アスパラギン酸、ｌ−アス
パラギン酸誘導体、フェニルアラニン及びフェニルアラ
ニン低級アルキルエステル、未回収の縮合物、固定化酵
素は回収し、再使用することができる。特にカラム中の
酵素は長期間繰返して使用できる。
体として回収する。精製の後処理をしなくても高純度の
縮合物を得る。未反応のｌ−アスパラギン酸、ｌ−アス
パラギン酸誘導体、フェニルアラニン及びフェニルアラ
ニン低級アルキルエステル、未回収の縮合物、固定化酵
素は回収し、再使用することができる。特にカラム中の
酵素は長期間繰返して使用できる。
【００３５】ｌ−アスパラギン酸縮合物の保護基は、パ
ラジウムの接触作用のような、公用の水素添加反応によ
り縮合物分子から容易に除去され、遊離アスパラギン酸
縮合物を得ることができる。
ラジウムの接触作用のような、公用の水素添加反応によ
り縮合物分子から容易に除去され、遊離アスパラギン酸
縮合物を得ることができる。
【００３６】本発明はフェニルアラニン低級アルキルエ
ステルの低級アルキル基がメチル基であるときアスパル
ターム製造法として特に有用である。アスパルタームは
食品材料では甘味剤として有用であり、化学名はｌ−ア
スパラギン酸−ｌ−フェニルアラニンメチルエステルで
ある。
ステルの低級アルキル基がメチル基であるときアスパル
ターム製造法として特に有用である。アスパルタームは
食品材料では甘味剤として有用であり、化学名はｌ−ア
スパラギン酸−ｌ−フェニルアラニンメチルエステルで
ある。
【００３７】次に記す実施例は単に発明を理解するだけ
のものであって、その変更も発明の範囲内である。
のものであって、その変更も発明の範囲内である。
【００３８】実施例 １ 多孔性アクリル樹脂（商品名、ＸＡＤ−７樹脂、ローム
＆ハース社製）を、トリス緩衝液（２０mMの塩化カルシ
ウムを含み、PH７.０）で洗滌し平衝させた。１００ml
の樹脂にセルモアーゼ（Thermoase、大和化成製、１０
０００PU、１ユニットはカゼイン中で３５℃において１
分間にチロシンの１mMを消化し、２８０nmの吸光を示
す。）１２.５ｇを添加し、５時間撹拌した後生成した
ビーズをグルタルアルデヒド１０％溶液で定着させ緩衝
液で洗滌した。
＆ハース社製）を、トリス緩衝液（２０mMの塩化カルシ
ウムを含み、PH７.０）で洗滌し平衝させた。１００ml
の樹脂にセルモアーゼ（Thermoase、大和化成製、１０
０００PU、１ユニットはカゼイン中で３５℃において１
分間にチロシンの１mMを消化し、２８０nmの吸光を示
す。）１２.５ｇを添加し、５時間撹拌した後生成した
ビーズをグルタルアルデヒド１０％溶液で定着させ緩衝
液で洗滌した。
【００３９】１.１９ｇ（５．０mM）のベンゾイル−ｌ
−アスパラギン酸と１.７９ｇ（１０.０mM）のｌ−フェ
ニルアラニンメチルエステルを５mMの塩化カルシウムを
含む水５０重量部に５０重量部のアセトニトリルを加え
たもの５０mlを入れたフラスコ中に添加した。溶液のPH
は１０M水酸化ナトリウム水溶液で６.０に調節した。溶
液には上記の通り調製し吸引濾過した固定化酵素４ｇを
添加した。
−アスパラギン酸と１.７９ｇ（１０.０mM）のｌ−フェ
ニルアラニンメチルエステルを５mMの塩化カルシウムを
含む水５０重量部に５０重量部のアセトニトリルを加え
たもの５０mlを入れたフラスコ中に添加した。溶液のPH
は１０M水酸化ナトリウム水溶液で６.０に調節した。溶
液には上記の通り調製し吸引濾過した固定化酵素４ｇを
添加した。
【００４０】その後撹拌しながら４０℃で４時間反応を
続けた。反応完了後、固定化酵素を濾過して分離した。
瀘液のPHを１０Ｍ塩酸で３.７に調節した。生成したス
ラリーを濾過し、水で洗滌し、ベンゾイル−ｌ−アスパ
ラギン酸−ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを得
た。
続けた。反応完了後、固定化酵素を濾過して分離した。
瀘液のPHを１０Ｍ塩酸で３.７に調節した。生成したス
ラリーを濾過し、水で洗滌し、ベンゾイル−ｌ−アスパ
ラギン酸−ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを得
た。
【００４１】かくして得た結晶は高度の液状クロマトグ
ラフィ分析にかけ、反応において８２.４％の収率であ
ったことが分かった。上記の分析（ＨＰＬＣ）に使用し
た条件は以下の通りである。
ラフィ分析にかけ、反応において８２.４％の収率であ
ったことが分かった。上記の分析（ＨＰＬＣ）に使用し
た条件は以下の通りである。
【００４２】カラム、エコノスフェアＣ１８（商品名、
アルテック社製）、２５０×４.６mm、５ミクロン、 溶 媒、２５％のアセトニトリル、１２％のメタノール
を含む０.１Ｍの燐酸塩緩衝液、 ＰＨ、 ３.５、 流出率（Flow rate）、 １.０mｌ／分、 検出器、２５４nmの紫外線。
アルテック社製）、２５０×４.６mm、５ミクロン、 溶 媒、２５％のアセトニトリル、１２％のメタノール
を含む０.１Ｍの燐酸塩緩衝液、 ＰＨ、 ３.５、 流出率（Flow rate）、 １.０mｌ／分、 検出器、２５４nmの紫外線。
【００４３】実施例 ２ ベンゾイル−ｌ−アスパラギン酸の量が２.３８ｇ（１
０.０mM）であることと、アセトニトリルに代えてジメ
チルスルフォキシドを使用することの他は、実施例１に
準じて、ベンゾイル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステルを５２.１％の収率で得た。
０.０mM）であることと、アセトニトリルに代えてジメ
チルスルフォキシドを使用することの他は、実施例１に
準じて、ベンゾイル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステルを５２.１％の収率で得た。
【００４４】実施例 ３ PHを６.５に調節すること、反応温度が３０℃、及び反
応時間が８時間であることの他は、実施例２に準じてベ
ンゾイル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニン
メチルエステルを４６.７％の収率で得た。
応時間が８時間であることの他は、実施例２に準じてベ
ンゾイル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニン
メチルエステルを４６.７％の収率で得た。
【００４５】実施例 ４ ベンジルオキシカルボニル−ｌ−アスパラギン酸を１.
３４ｇ（５.０mM）使用すること、及び反応時間が３時
間であることの他、実施例１に準じてベンジルオキシカ
ルボニル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニン
メチルエステルを８３.５％の収率で得た。
３４ｇ（５.０mM）使用すること、及び反応時間が３時
間であることの他、実施例１に準じてベンジルオキシカ
ルボニル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニン
メチルエステルを８３.５％の収率で得た。
【００４６】実施例 ５ セルモアーゼの量が５ｇであること、反応時間が１３時
間であることの他は実施例１に準じて、ベンゾイル−ｌ
−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
ルを７８.９％の収率で得た。
間であることの他は実施例１に準じて、ベンゾイル−ｌ
−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
ルを７８.９％の収率で得た。
【００４７】実施例 ６ アセトニトリルに代えて、ジメチルフォルムアミドを使
用すること、及び反応時間が６時間であることの他、実
施例１に準じてベンゾイル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−
フェニルアラニンを６５.７％の収率で得た。
用すること、及び反応時間が６時間であることの他、実
施例１に準じてベンゾイル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−
フェニルアラニンを６５.７％の収率で得た。
【００４８】実施例 ７ アセトニトリル５０％と水５％に代えて、４０％のジメ
チルフォルムアミドと１５％のエチレングリコールを使
用すること、及びPHを５.８に調節すること、反応時間
が６時間であることの他、実施例１に準じて、ベンゾイ
ル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニンメチル
エステルを５７.６％の収率で得た。
チルフォルムアミドと１５％のエチレングリコールを使
用すること、及びPHを５.８に調節すること、反応時間
が６時間であることの他、実施例１に準じて、ベンゾイ
ル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニンメチル
エステルを５７.６％の収率で得た。
【００４９】実施例 ８ アセトニトリル５０％と水１０％に代えて４５％のジメ
チルスルフォキシドと１５％のポリエチレングリコール
４００を使用すること、反応時間が５時間であること、
PHが６.２であることの他、実施例４に準じて、ベンジ
ルオキシカルボニル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステルを８５.１％の収率で得た。
チルスルフォキシドと１５％のポリエチレングリコール
４００を使用すること、反応時間が５時間であること、
PHが６.２であることの他、実施例４に準じて、ベンジ
ルオキシカルボニル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステルを８５.１％の収率で得た。
【００５０】実施例９ アセトニトリル５０％と水５％に代えて、３０％のアセ
トニトリルと２５％のポリエチレングリコール６００を
使用すること、反応時間が６時間であること、及びPHを
６.５に調節することの他、実施例１に準じて、ベンゾ
イル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステルを７８.５％の収率で得た。
トニトリルと２５％のポリエチレングリコール６００を
使用すること、反応時間が６時間であること、及びPHを
６.５に調節することの他、実施例１に準じて、ベンゾ
イル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステルを７８.５％の収率で得た。
【００５１】実施例 １０ ベンゾイル−ｌ−アスパラギン酸の量が２.８５ｇ（１
２mM）、ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの量が
２.６９ｇ（１５mM）を使用すること、ポリエチレング
リコール６００に代えてポリエチレングリコール２００
を使用すること及び反応時間が７時間であることの他
は、実施例９に準じて、ベンゾイル−ｌ−アスパラギン
酸−ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを６４.２％
の収率で得た。
２mM）、ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの量が
２.６９ｇ（１５mM）を使用すること、ポリエチレング
リコール６００に代えてポリエチレングリコール２００
を使用すること及び反応時間が７時間であることの他
は、実施例９に準じて、ベンゾイル−ｌ−アスパラギン
酸−ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを６４.２％
の収率で得た。
【００５２】実施例 １１ アセトニトリルに代えてジメチルフォルムアミドを使用
すること、反応時間が５時間であること、及びPHを６.
２に調節することの他は、実施例１０に準じて、ベンゾ
イル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステルを５２.４％の収率で得た。
すること、反応時間が５時間であること、及びPHを６.
２に調節することの他は、実施例１０に準じて、ベンゾ
イル−ｌ−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステルを５２.４％の収率で得た。
【００５３】実施例 １２ 撹拌することに代えて、実施例１で調製された固定化酵
素を充填したコラムを使用し、実施例１１と同一濃度の
出発溶液を調製し、出発溶液を流入率０.９／時間で連
続的にカラムに投入した。生成溶液中でベンゾイル−ｌ
−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニンの濃度は１１
５mMであった。未反応物質を含む出発溶液を生成物から
実施例１と同一操作で分離し、次の工程へ循環した。
生物反応装置の操作は１ヶ月継続された。
素を充填したコラムを使用し、実施例１１と同一濃度の
出発溶液を調製し、出発溶液を流入率０.９／時間で連
続的にカラムに投入した。生成溶液中でベンゾイル−ｌ
−アスパラギン酸−ｌ−フェニルアラニンの濃度は１１
５mMであった。未反応物質を含む出発溶液を生成物から
実施例１と同一操作で分離し、次の工程へ循環した。
生物反応装置の操作は１ヶ月継続された。
【００５４】実施例 １３ ジメチルフォルムアミド５０％に代えて、ジメチルスル
フォキシド４０％と水１０％を使用すること、流入率が
１.２／時間であること、ベンゾイル−ｌ−アスパラギ
ン酸の濃度が１００mMであること、及びｌ−フェニルア
ラニンメチルエステルの濃度が２００mMであることの
他、実施例１２に準じ処理した。
フォキシド４０％と水１０％を使用すること、流入率が
１.２／時間であること、ベンゾイル−ｌ−アスパラギ
ン酸の濃度が１００mMであること、及びｌ−フェニルア
ラニンメチルエステルの濃度が２００mMであることの
他、実施例１２に準じ処理した。
【００５５】生成溶液中のベンゾイル−ｌ−アスパラギ
ン酸−ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの濃度は７
５mMであり、生物反応装置の操作は２ヶ月継続した。
ン酸−ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの濃度は７
５mMであり、生物反応装置の操作は２ヶ月継続した。
【００５６】上記の発明は、多くの方法で変更が可能で
あることは当然である。このような変更は発明の思想や
範囲から逸脱するものではない。そしてこの技術の分野
における通常の知識を有する人にとって自明であるこの
ような変更は特許請求の範囲内に含まれるべきである。
あることは当然である。このような変更は発明の思想や
範囲から逸脱するものではない。そしてこの技術の分野
における通常の知識を有する人にとって自明であるこの
ような変更は特許請求の範囲内に含まれるべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヒュン・イル 大韓民国 ソウル ユンピョン−ク デジ オードン 87−100 (72)発明者 ハン・ミンス 大韓民国 ソウル ドボン−ク バンハー ドン 624−24 (72)発明者 リム・ブンサム 大韓民国 ソウル ソンパーク ムンジユ ン−ドン フアミリーアパート 223−703
Claims (11)
- 【請求項１】 化２式で示すｌ−アスパラギン酸及びｌ
−アスパラギン酸誘導体の少なくとも一種と、化３式で
示すフェニルアラニン及びフェニルアラニン低級アルキ
ルエステルの少なくとも一種を、１種又は２種以上の水
溶性有機溶剤中で、水及び固定化酵素の存在下で反応さ
せることを特徴とする化１式で示すｌ−アスパラギン酸
又はｌ−アスパラギン酸誘導体とフェニルアラニン又は
フェニルアラニン低級アルキルエステルの縮合物製造
法。 【化１】 【化２】 【化３】 式中、Ｘは水素原子或いは保護基であり、Ｙは水素原子
或いは低級アルキル基である。 - 【請求項２】 ｌ−アスパラギン酸及びｌ−アスパラギ
ン酸誘導体の少なくとも一種と、フェニルアラニン及び
フェニルアラニン低級アルキルエステルの少なくとも一
種を、固定化金属プロテアーゼと接触させ、両成分を反
応させることを特徴とする請求項１のｌ−アスパラギン
酸又はｌ−アスパラギン酸誘導体とフェニルアラニン又
はフェニルアラニン低級アルキルエステルの縮合物製造
法。 - 【請求項３】 保護基（Ｘ）がベンゾイル基、ベンゾイ
ルオキシカルボニル基、Ｐ−メトキシベンジルオキシカ
ルボニル基及びｔ−ブトキシカルボニル基よりなる群よ
り選ばれたものであることを特徴とする請求項１又は２
のｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸誘導体と
フェニルアラニン又はフェニルアラニン低級アルキルエ
ステルの縮合物製造法。 - 【請求項４】 低級アルキル基（Ｙ）がメチル基、エチ
ル基、プロピル基及びブチル基よりなる群より選ばれた
ものであることを特徴とする請求項１又は２のｌ−アス
パラギン酸又はｌ−アスパラギン酸誘導体とフェニルア
ラニン又はフェニルアラニン低級アルキルエステルの縮
合物製造法。 - 【請求項５】 反応媒体中の水溶性有機溶剤が、メタノ
ール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルフォルム
アミド、ジメチルスルフォキシド、テトラヒドロフラ
ン、エチレングリコール及び分子量２００乃至２０００
のポリエチレングリコールよりなる群から選ばれたもの
であることを特徴とする請求項１又は２のｌ−アスパラ
ギン酸又はｌ−アスパラギン酸誘導体とフェニルアラニ
ン又はフェニルアラニン低級アルキルエステルの縮合物
製造法。 - 【請求項６】 反応媒体中の水溶性有機溶剤が２種以上
の水溶性有機混合溶剤であることを特徴とする請求項１
又は２のｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸誘
導体とフェニルアラニン又はフェニルアラニン低級アル
キルエステルの縮合物製造法。 - 【請求項７】 反応媒体中の水溶性有機溶剤が該媒体１
００重量部中、１０及至７０重量部であることを特徴と
する請求項１又は２のｌ−アスパラギン酸又はｌ−アス
パラギン酸誘導体とフェニルアラニン又はフェニルアラ
ニン低級アルキルエステルの縮合物製造法。 - 【請求項８】 水溶性有機混合溶剤１００重量部中、エ
チレングリコール又は分子量２００乃至２０００のポリ
エチレングリコールが５〜４０重量部であることを特徴
とする請求項６のｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラ
ギン酸誘導体とフェニルアラニン又はフェニルアラニン
低級アルキルエステルの縮合物製造法。 - 【請求項９】 金属プロテアーゼがサブティリス、ステ
アロセルモフィラスよりなる群から選ばれた桿状菌種の
培養により得られた酵素であることを特徴とする請求項
１又は２のｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸
誘導体とフェニルアラニン又はフェニルアラニン低級ア
ルキルエステルの縮合物製造法。 - 【請求項１０】 金属プロテアーゼがセルモリシン又は
セルモアーゼであることを特徴とする請求項９のｌ−ア
スパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸誘導体とフェニル
アラニン又はフェニルアラニン低級アルキルエステルの
縮合物製造法。 - 【請求項１１】 ｌ−アスパラギン酸及びｌ−アスパラ
ギン酸誘導体の少なくとも一種のフェニルアラニン及び
フェニルアラニン低級アルキルエステルの少なくとも一
種に対するモル比が１：１及至１：５であることを特徴
とする請求項１又は２のｌ−アスパラギン酸又はｌ−ア
スパラギン酸誘導体とフェニルアラニン又はフェニルア
ラニン低級アルキルエステルの縮合物製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019900019109A KR930002966B1 (ko) | 1990-11-24 | 1990-11-24 | 디펩티드의 제조방법 |
| KR1990-19109 | 1990-11-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0716097A true JPH0716097A (ja) | 1995-01-20 |
Family
ID=19306482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3306202A Pending JPH0716097A (ja) | 1990-11-24 | 1991-11-21 | ｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸誘導体とフェニルアラニン又はフェニルアラニン低級アルキルエステルの縮合物製造法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5418146A (ja) |
| JP (1) | JPH0716097A (ja) |
| KR (1) | KR930002966B1 (ja) |
| AU (1) | AU8809491A (ja) |
| DE (1) | DE4137168A1 (ja) |
| FR (1) | FR2669638A1 (ja) |
| GB (1) | GB2250023A (ja) |
| IT (1) | IT1250347B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| DE69613305T2 (de) * | 1995-10-11 | 2002-05-02 | Holland Sweetener Co | Verbesserte enzymatische Kupplungsreaktion von N-geschützte L-Asparaginsäure und Phenylalaninmethylester |
| WO1997021804A1 (fr) * | 1995-12-11 | 1997-06-19 | Sagami Chemical Research Center | Nouvelle protease analogue a la thermolysine et son utilisation |
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| US8796009B2 (en) | 2010-06-21 | 2014-08-05 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Clearcoat containing thermolysin-like protease from Bacillus stearothermophilus for cleaning of insect body stains |
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| US8394618B2 (en) | 2010-06-21 | 2013-03-12 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Lipase-containing polymeric coatings for the facilitated removal of fingerprints |
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| US10988714B2 (en) | 2010-06-21 | 2021-04-27 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods of facilitating removal of a fingerprint from a substrate or a coating |
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| US4086136A (en) * | 1975-10-23 | 1978-04-25 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center | Process for producing a peptide using a serine or thiol proteinase |
| DE2801238C2 (de) * | 1977-01-27 | 1986-06-05 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center, Tokio/Tokyo | Verfahren zur Herstellung von Salzen aus L,L-Dipeptiden und Phenylalaninestern |
| JPS5411294A (en) * | 1977-05-23 | 1979-01-27 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | Recovery of protease |
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| JPS6339237B2 (ja) * | 1979-04-06 | 1988-08-04 | Karuruberugu Baiotekunorojii Ltd As | |
| JPS5917997A (ja) * | 1982-07-23 | 1984-01-30 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物の製造方法 |
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- 1992-12-15 US US07/993,466 patent/US5418146A/en not_active Expired - Fee Related
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