CN102216324B - 使用酶促反应和偶联反应的肽合成 - Google Patents

使用酶促反应和偶联反应的肽合成 Download PDF

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Abstract

本发明提供了酶促合成肽的方法，所述方法包括由以下(i)和(ii)酶促制备酯或硫酯：(i)N-端受保护的氨基酸、N-端受保护的氨基酸C-端酯、N-端受保护的肽、或N-端受保护的肽C-端酯，和(ii)式HO-CX2-Z所表示的醇或式HS-CX2-Z所表示的硫醇，每个X独立地表示卤素原子或氢原子；且Z选自下组：包含至少两个取代基的sp3-杂化的碳，所述取代基包含和sp3-杂化的碳直接连接的杂原子，以及包含一个或两个取代基的sp2-杂化的碳，所述取代基包含和sp2-杂化的碳直接连接的杂原子，酯或硫酯的制备在以反应介质中液体重量为基础包含2重量％或更少的水的反应介质中进行；和将制备得到的酯或硫酯与(任选地C-端受保护的)氨基酸或与(任选地C-端受保护的)肽酶促偶联，从而在以反应介质总重为基础包含2重量％或更少的水的反应介质中合成肽。

Description

使用酶促反应和偶联反应的肽合成
本发明涉及用于酶促合成肽的方法。
肽(尤其是寡肽)具有许多应用，例如用作药物、食物或饲料成分、农用化学品或化妆品成分。
就本发明的目的而言，肽表示两个或更多个氨基酸的任何链。就本发明的目的而言，“寡肽”表示基于2-200个氨基酸、尤其基于2-100个氨基酸、更尤其基于2-50个氨基酸的肽，优选地为2-200个氨基酸、更优选地为2-100或2-50个氨基酸的任何线性链。术语“多肽”用于表示与针对寡肽所规定的数量相比基于更大数量的氨基酸的肽。
化学-酶促肽合成就本发明的目的而言被定义为其中一个或多个肽键通过酶促偶联反应形成的肽合成，其具有优于化学肽合成的若干优点。例如，由于不需要或仅需要有限的氨基酸侧链保护，在大规模生产情况下的成本价格更低。另外，该方法对环境更加友好。例如，不需要化学计量用量的毒性化学试剂如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺甲碘化物(EDCI)。另外，这类方法可以使用更少的有机溶剂进行。另外，酶催化的偶联没有外消旋化(见例如Sewald和H.-D.Jakubke，“Peptides：Chemistryand Biology”，第1次重印，Ed.Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim 2002，第250页)，导致更纯的产物和/或更容易的分离。
对化学-酶促偶联方法而言，有两种产生肽键的途径。在所谓的热力学(或平衡控制的)途径中，羧基组件(即要在其C-端偶联的组件)带有游离的羧酸官能度，而在动力学控制的途径中使用活性羧基组件，例如主要的n-烷基酯。
热力学途径具有三种主要的缺点：i)平衡通常位于肽键切割一侧，从而偶联产率较低；ii)通常需要大量酶；iii)反应速率通常非常低。在动力学控制的途径中，需要烷基酯作为起始材料，但是需要少得多的酶，反应时间显著更短，并且最重要的是，可获得的最大产率通常显著更高。因此对工业应用而言，基于动力学途径(即使用活化的羧基组件)的酶促肽合成概念是最有吸引力的(见例如N.Sewald and H.-D.Jakubke，in：“Peptides：Chemistry and Biology”，第1次重印，Ed.Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim 2002，第4.6.2节)。
化学-酶促肽合成可以以C→N端方向或者以N→C端方向进行，但是也可以包括下述片段的酶促偶联，所述片段单独地使用化学合成被合成，或者通过化学和化学-酶促偶联步骤的组合被合成。Chen et al.描述了在“低水性”(low aqueous)有机溶剂中使用在所述有机溶剂中有活性并且稳定的蛋白酶的偶联(J.Org.Chem.1992，57，6960-65，Biomed.Biochim.Acta 1991，50，181，Bioorg.Med.Chem.Lett.1991，1，445)。在这些出版物中描述的方法的缺点是在低水性条件下几乎没有一种酶是有活性且稳定的，并且酶具有有限的底物范围。因此，通常需要长的反应时间和大幅过量的氨基酸或肽亲核体。有时在肽中的其他位置上仍然存在一些水解，并且通常转酰氨基反应发生在片段之一中现存的肽键上(即现存肽键之一上氨基酸或肽亲核体的酶催化的亲核攻击)。因此，产率有时较低。另外，产物的纯化通常是困难的。
另一种途径是所谓的“底物模拟物”，如F.Bordusa et al在CurrentProtein and Peptide Science 2002，3，159-180中综述。在这种途径中，C-活化的氨基酸或肽具有酯片段，所述酯片段与特定氨基酸相似至下述程度：对所述特定氨基酸选择性的酶迅速地与带有该酯片段的任何氨基酸反应。一个良好的例子是使用如Bordusa et al.所发现的4-胍基苯基(Gp)，所述Gp与Arg相似至下述程度：在水解特性方面对Arg-X序列(X代表任何蛋白原性氨基酸(proteinogenic amino acid))特异性的胰蛋白酶能够将几乎任何(带有Gp酯的)C-末端与多种氨基酸和肽亲核体偶联。例如，M.Thormann et al在Biochem.1999，38，6056证明N-受保护的D-Ala-OGp能够偶联至多种氨基酸和肽亲核体。因此，D-氨基酸和非蛋白原性氨基酸也能够被高效并入，并且片段中不发生肽键水解，除非存在偶联酶对其特异性的肽键(例如对胰蛋白酶而言Arg-X键)。底物模拟物途径的缺点是底物模拟物(例如Gp酯)需要费力的多步骤化学合成，这是难以规模化进行的，并且通常发生氨基酸的外消旋化；底物模拟物也是不稳定的，因此难以大规模操作，并且有时它们在水性溶液中的溶解度较低。
在“Organic Letters，2001，Vol 3，No.26，p4157-4159”中，Liu和Tam报道了一种方法，其中枯草杆菌蛋白酶Carlsberg被用于在1，3-丙二醇中和包含1-2.5％水的1，4-丁二醇中催化某些N-端Boc-保护的氨基酸和未受保护的肽的C-端3-羟丙基酯或4-羟丁基酯的形成。另外描述了氨基酸(亮氨酸)或肽与获得的酯在反应介质(不同于发生酯形成的介质)中的酶促偶联。其中发生偶联的反应介质包含大量的水。
在“Biotechnology and Bioengineering，1997，vol.54，no.3，p287-290”中，Mitin et al.报道了一种方法，其中木瓜蛋白酶被用于在含有至少10wt％水的甘油中催化N-端Boc和N-端Cbz保护的氨基酸和肽的C-端甘油酯的形成，以最大70％的产率得到酯。由于木瓜蛋白酶的变性，使用含有少于10wt％水的溶液导致低得多的酯产率。
另一种途径是使用“经活化的”酯如氨基甲酰基甲基(Cam)酯(例如T.Miyazawa et al.J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，2002，390-395所述)或2，2，2-三氟乙基酯(如A.Yan et al.Tetrahedron，61，2005，5933-5941所述)。与“真实的”底物模拟物相比，这些酯通常更容易制备并且更稳定，但是仍然需要昂贵和对环境不友好的化学步骤。另外，这些酯的制备通常导致氨基酸的一些外消旋化。例如，可以通过用2-氯乙酰胺处理酰基供体的Cs盐来制备Cam酯，并可以使用碳二亚胺化学法制备Tfe酯。通常使用便宜和容易获得的蛋白酶如木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶将Cam和Tfe酯与氨基酸或肽亲核体偶联。因此，也可以将D-氨基酸并入肽中(尚未并入Pro)。
通常仍然需要用于肽合成和/或用于制备可用于肽合成的中间产物化合物的替代性方法。这类方法可例如提供另外的策略，所述策略提高肽合成中的灵活性和/或允许合成使用已知的策略不能或者难以获得的特定肽。例如，在可接受的时间内以良好的产率酶促偶联多种氨基酸仍然是一种挑战。因此，仍然需要下述经改进的策略，所述策略用于将蛋白原性以及非蛋白原性氨基酸(例如D-α-氨基酸、β-氨基酸、苯基甘氨酸、DOPA、α-烷基化的氨基酸)或肽(其N-端氨基酸残基是任何这些氨基酸的残基)通过它们的N-端氨基官能团与另一氨基酸或肽的C-端羧酸官能团偶联。另外，仍然需要下述经改进的技术，所述技术用于将蛋白原性以及非蛋白原性氨基酸(例如D-α-氨基酸、β-氨基酸、苯基甘氨酸、DOPA、α-烷基化的氨基酸)或肽(其C-端氨基酸残基是任何这些氨基酸的残基)通过C-端羧基官能团与另一氨基酸或肽的N-端胺官能团偶联。
另外，尤其需要下述经改进的技术，所述技术涉及通过N-端胺官能团使任何氨基酸或肽与空间受阻的氨基酸(例如缬氨酸或异亮氨酸)或C-端氨基酸残基是空间受阻的氨基酸(例如缬氨酸或异亮氨酸)的肽酶促偶联。
另外，仍然需要对环境相对友好的、新的相对简单的方法。
目前发现，通过以特定方式组合氨基酸或肽的经活化的C-端酯或经活化的C-端硫酯的酶促制备，以及所述经活化的酯或经活化的硫酯与另一氨基酸或肽的酶促偶联，可以提供此类方法。
因此，本发明涉及用于酶促合成肽的方法，所述方法包括：
由以下(i)和(ii)酶促制备酯或硫酯：(i)N-端受保护的氨基酸、N-端受保护的氨基酸C-端酯、N-端受保护的肽、或N-端受保护的肽C-端酯，和(ii)式HO-CX2-Z所表示的醇或式HS-CX2-Z所表示的硫醇，
每个X独立地表示卤素原子或氢原子；且
Z选自下组：包含至少两个取代基的sp3-杂化的碳，所述取代基包含和sp3-杂化的碳直接连接的杂原子，和包含一个或两个取代基的sp2-杂化的碳，所述取代基包含和sp2-杂化的碳直接连接的杂原子，
酯或硫酯的制备在以反应介质中液体重量为基础包含2重量％或更少的水的反应介质中进行；和
将制备得到的酯或硫酯与(任选地C-端受保护的)氨基酸或与(任选地C-端受保护的)肽酶促偶联，从而在以反应介质总重为基础包含2重量％或更少水的反应介质中合成肽。
术语“C-端受保护的”在本文中被用于表示对C-端羧基提供保护基，一般基本上保护羧基免于同另一分子的氨基偶联。C-端保护基尤其可以是C-端酯，其中C-端羧基至少基本上被保护从而免于在使用的肽合成条件下同胺偶联。t-烷基通常被用作保护基。
术语“N-端受保护的”在本文中被用于表示对N-端氨基提供保护基，一般至少基本上保护N-端氨基免于参与C-端羧基与N-端氨基的偶联。
在本发明方法中制备的酯或硫酯可分别被称作“经活化的酯”或“经活化的硫酯”，因为此类酯能够参与偶联反应。相反，可被用于制备经活化的酯的酯或游离的C-端羧酸不能够参与偶联，或至少在偶联反应中具有显著更低的反应性，例如少于在本发明方法中酶促制备的经活化的酯的反应性的一半，少于其反应性的十分之一，或少于其反应性的百分之一。尤其对通常难以偶联(具有低偶联率)的氨基酸、C-端氨基酸残基或N-端氨基酸残基而言，由于氨基酸或C-端氨基酸残基的活化，可以通过本发明的方法实现偶联速率的大幅提高。偶联氨基酸或氨基酸残基的困难的典型例子是D-氨基酸或其氨基酸残基和其他非蛋白原性氨基酸或其氨基酸残基。其他例子包括空间受阻的氨基酸，例如缬氨酸和异亮氨酸，或其氨基酸残基。
酯或硫酯的酶促制备在下文中可分别称作酯化或硫酯化。所述术语包括下述情况，其中(硫)酯的制备涉及N-端受保护的氨基酸或肽C-端酯与(硫)醇的反应。更具体地，此类反应已知为(硫)酯交换反应。
在一个实施方案中，本发明的方法具有以下优点：其提供了使用本发明方法偶联多种氨基酸或多种肽的可能性，所述氨基酸或肽中参与偶联反应的末端氨基酸残基有所差异，包括脯氨酸和非蛋白原性氨基酸或含有参与偶联的脯氨酸或非蛋白原性末端氨基酸残基的肽。
在一个实施方案中，本发明的方法具有以下优点：经活化的(硫)酯以环境友好的方式(即不生产化学计量数量的废弃化合物)以高产率合成，而无外消旋化或其他副反应。
在一个实施方案中，本发明的方法具有以下优点：其提供了在所述方法中使用的一种或多种酶的高稳定性和/或活性。
在一个实施方案中，本发明的方法具有以下优点：经酶促制备的酯的水解程度较小(在实现(硫)酯制备和偶联的典型时间段内)，至少在若干实施方案中未观察到可检出的酯水解。
在一个实施方案中，本发明的方法具有以下优点：经酶促制备的肽的水解程度较低，至少在若干实施方案中未观察到可检出的经酶促制备的肽的水解。
在一个实施方案中，本发明的方法具有以下优点：其提供了高的总体反应率，即从N-受保护的氨基酸或肽起始化合物到经合成的肽的高转化率，导致用相对短的反应时间实现特定产率。
本发明的方法尤其允许氨基酸或肽与另一氨基酸或肽偶联，而不需要偶联配偶体之一大幅过量，从而在相对较短的时间内以可接受的基于另一偶联配偶体的产率获得合成的肽。用于制备(经活化的)(硫)酯的N-端受保护的氨基酸、N-端受保护的氨基酸C-端酯、N-端受保护的肽或N-端受保护的肽C-端酯与任选地C-端受保护的氨基酸或肽的摩尔比在2∶1到1∶3的范围内，尤其是1∶1到1∶2的范围内，优选地1∶1到1∶1.5的范围内选择。在一个特定地优选的方法中，所述摩尔比在1∶1到1∶1.1的范围内。
本发明的方法尤其具有以下优点：已发现有可能酶促制备N-端受保护的氨基酸或N-端受保护的肽的经活化的C-端酯或硫酯，尤其是N-端受保护的氨基酸或N-端受保护的肽的C-端氨基甲酰基甲基(Cam)酯或C-端2，2，2-三氟乙基(Tfe)酯，作为化学-酶促肽合成的一部分。尤其出人意料地发现，可以使用蛋白酶或脂肪酶以高产率酶促制备Cam和Tfe酯，甚至更好的是，使用蛋白酶或脂肪酶的活化步骤可以与使用蛋白酶的肽键形成步骤同时进行，以多于90％的产率得到缩合产物(要合成的肽)，而无可观的副反应，甚至使用等摩尔量的待偶联的氨基酸或肽时也是如此，即不需要过量的氨基酸或肽发挥亲核体的作用。
还发现有可能合成肽而无可观的外消旋化，在“困难的”氨基酸如脯氨酸或非蛋白原性氨基酸例如D-氨基酸存在于待装配的肽键一侧或两侧的情况下也是如此。
根据本发明的方法尤其提供了一种相对简单的方法，因为可能在所谓的“一锅法”中进行(硫)酯化。在一锅法中发生(硫)酯化和偶联，这些反应之间不进行(所制备的酯或硫酯的)分离步骤。甚至可能通过从反应开始时将所有物质(例如待偶联的氨基酸或其酯和/或肽或其酯，醇/硫醇，溶剂和酶)包括在内来进行本发明的方法，这在以高产率在相对短时间内获得要合成的肽方面可以是特别有益的。因此，在本发明的一种尤其合适的一锅法中，酯或硫酯的制备在存在任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽时进行，所述氨基酸或肽要与所制备的酯或硫酯偶联。
在本发明的又一个一锅法中，(硫)酯化和偶联可相继发生，即制备酯或硫酯后添加任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽。
在本发明的又一个一锅法中，首先使用脂肪酶或酯酶进行(硫)酯的制备，之后添加酶(通常为蛋白酶)用于催化偶联反应。在催化偶联的酶对(硫)酯的制备有害的情况下可尤其遵循此类途径，所述情况例如因为所述酶对催化(硫)酯制备的酶的活性或稳定性具有不良影响。
还可能使用这些一锅法的中间产物形式，例如初始时仅包括本发明方法中使用的一种或多种物质的部分，并且将剩余部分之后添加。尤其可以逐渐或逐步添加要与所制备的酯或硫酯偶联的任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽的部分。
原则上，催化(硫)酯化的酶和催化偶联的酶可以相同，尤其是相同的脂肪酶、酯酶或蛋白酶。例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg或南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B可以被用于此类实施方案。
已发现，对在相对短时间内获得所合成的肽而言尤其有利的是使用至少两种酶，即至少一种选自脂肪酶和酯酶组的酶，和至少一种蛋白酶。我们认为在本发明的一锅法中，脂肪酶或酯酶(主要)催化(硫)酯化且蛋白酶(主要)催化偶联反应。
要被(硫)酯化的N-端受保护的氨基酸或N-端受保护的肽原则上可以是任何(蛋白原性或非蛋白原性的)氨基酸或以蛋白原性和/或非蛋白原性氨基酸为基础的任何肽。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中对酯或硫酯的酶促制备而言，(i)N-端受保护的氨基酸或N-端受保护的肽与(ii)式HO-CX2-Z所表示的醇或式HS-CX2-Z所表示的硫醇反应。
N-端受保护的氨基酸或肽尤其可以由式I的化合物表示。
Figure BPA00001373138200081
此处P代表N-端保护基。合适的N-端保护基是可用于合成(寡)肽的N-保护基。这类基团是本领域技术人员已知的。合适的N-保护基的例子包括羰基型保护基，例如‘Cbz’(即苄氧羰基)、‘Boc’(即叔丁氧羰基)、‘For’(即甲酰基)、Fmoc(即9-芴基甲氧羰基)和‘PhAc’(即苯乙酰基)。可以分别使用酶Peptide Deformylase或PenG酰基酶将基团For或PhAc酶促引入和切割。化学切割方法是本领域中公知的。
本文中n是至少为1的整数。n尤其可以至少为2、至少为3、至少为4、至少为5、至少为6、至少为8、至少为9或至少为10。n尤其可以是100或更小、75或更小、50或更小、25或更小、20或更小、15或更小或10或更小，例如5或更小。
每个RA和每个RB独立地表示H或有机片段，优选地为氨基酸侧链。因此，不要求RA在所有n个氨基酸单元中均相同。类似地，不要求RB在所有n个氨基酸单元中均相同。
在本发明的上下文中，“氨基酸侧链”表示任何蛋白原性(proteinogenic)或非蛋白原性的氨基酸侧链。氨基酸侧链中的反应性基团可以通过氨基酸侧链保护基保护，或者可以被脱保护。氨基酸侧链的合适保护基是本领域技术人员已知的。需要时尤其可以对酸性或碱性侧基的所有或部分提供保护基，从而改进氨基酸或肽的溶解度。
蛋白原性氨基酸是由遗传密码子编码的氨基酸。蛋白原性氨基酸包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、色氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸。
非蛋白质原氨基酸可尤其选自D-氨基酸、苯基甘氨酸、DOPA(3，4-二羟基-L-苯丙氨酸)、β-氨基酸、4-氟-苯丙氨酸或α-烷基化的氨基酸。
在一个特定的实施方案中，用于制备参与偶联反应的酯或硫酯的N-端受保护的氨基酸或肽是与要制备的(硫)酯不同的C-端酯，例如叔烷基酯或另一酯，其在肽合成的酶促偶联反应中一般不显示显著活性，或者显示至少比要制备的(硫)酯更低的活性。在此种情况下，(硫)酯的制备可以被称作(硫)酯交换。
在要与待制备的醇或硫醇反应的化合物是酯的一个实施方案中，典型地其为上文所述氨基酸或肽的酯。
因此，该酯可由式II表示：
在偶联反应中，所述酯典型地比在本发明方法中酶促制备的酯或硫酯反应性更低。这一般表示RC基团不是吸电子基团，或者比酯或硫酯制备中使用的醇或硫醇的CX2-Z基吸电子性更弱。RC通常是烃基，或是在相对于酯的γ位或离酯片段更远处碳上包含取代基的烃基。Rc尤其可以是烷基，尤其是C1-C6烷基，更尤其是甲基、乙基、伯丙基、仲丙基、伯丁基、仲丁基或叔丁基。
P、RA、RB和n如上文定义。
(硫)酯制备中使用的醇HO-X2-Z或硫醇HS-X2-Z是活化醇或活化硫醇。活化醇或活化硫醇是在(硫)酯化后提供经活化的C-端羧基(硫)酯基的醇或硫醇，所述经活化的C-端羧基(硫)酯基就是能够参与偶联反应的羧基(硫)酯基。如上文所述，醇由式HO-CX2-Z表示，或硫醇由式HS-CX2-Z表示。
在本文中，每个X独立的表示卤素原子(F、Cl、Br、I)或氢原子。在X是卤素原子的情况下，其优选地为F。在其中两个X均为氢的本发明方法中获得了良好的结果。
通常，Z表示吸电子基团。不受任何理论束缚，相信这对偶联反应速率是有利的。
Z表示sp2或sp3杂化的碳原子，所述碳原子包含一个或多个包含杂原子的取代基。化学制备N-端受保护的氨基酸或N-端受保护的肽和此类醇或硫醇的C-端(硫)酯一般是困难的或至少是费力的。因此，本发明在提供制备此类酯的相对简单方法方面也尤其是有利的。
在一个特定的实施方案中，Z选自sp3-杂化的碳的组，所述碳包含含有杂原子的一个取代基，所述杂原子和sp3-杂化的碳原子直接连接。
在一个优选的实施方案中，Z选自sp3-杂化的碳的组，所述碳包含含有杂原子的两个或三个取代基，其中每个取代基的所述杂原子和sp3-杂化的碳直接连接，尤其包含两个或三个卤素取代基，优选地包含选自F和Cl组的两个或三个卤素取代基，例如Z可以表示三氟甲基或三氯甲基。例如使用2，2，2-三氟乙醇(X＝H，Z＝CF3)获得了良好的结果，特别是在利用脂肪酶以及蛋白酶的方法中。尤其令人惊讶的是，可以由N-端受保护的氨基酸或肽酶促制备N-端受保护的氨基酸三氟乙酯或N-端受保护的肽C-端2，2，2-三氟乙酯，并随后用于酶促偶联方法中，另外还可能在一锅法中以良好产率完成所述反应。
在又一个优选的实施方案中，Z选自sp2-杂化的碳的组，所述碳包含至少一个含有杂原子的取代基，所述杂原子和sp2-杂化的碳直接连接。此类Z尤其可以是-(C＝O)R1或-(C＝S)R1。R1可尤其选自氨基，例如-NH2，NHCH3或N(CH3)2，(任选地)C-端受保护的α-氨基酸或(任选地)C-端受保护的肽，优选-NH2；-OH或其盐，例如碱盐或铵盐；烷基或芳基；经取代的烷基或经取代的芳基，尤其是包含一个或多个卤素取代基的经取代的烷基或经取代的芳基；-OR2；-SR2。R2基团通常是烃或经取代的烃，尤其是烷基、经取代的烷基(例如包含一个或多个卤素取代基的烷基)、未经取代的芳基或经取代的芳基(例如包含一个或多个卤素取代基的芳基)。R1或R2中的烷基或经取代的烷基可尤其包含1-6个碳原子；未经取代或经取代的芳基可在一个或多个环中尤其包含5-18个碳原子，更尤其包含6-12个碳原子。
例如使用氨基甲酰基甲醇(Z＝-(C＝O)NH2，氨基甲酰基)获得了良好的结果，特别是在利用脂肪酶以及蛋白酶的方法中。尤其令人惊讶的是可以由N-端受保护的氨基酸或N-端受保护的肽酶促制备N-端受保护的氨基酸C-端氨基甲酰基甲酯或N-端受保护的肽C-端氨基甲酰基甲酯，并随后在酶促偶联方法中使用，甚至还可能在一锅法中以良好产率完成所述反应。
要与(硫)酯偶联的任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽原则上可以是任何(蛋白原性或非蛋白原性的)氨基酸，或以蛋白原性和/或非蛋白原性氨基酸为基础的任何肽。
任选地C-端受保护的氨基酸或肽可尤其由式III的化合物表示：
Figure BPA00001373138200111
这里n、每个RA和每个RB如上文定义。
这里Q表示氨基或OR片段(见下文)。
在Q表示氨基的情况下，氨基可以由式NR1R2表示，其中R1和R2可各自表示任何(经取代的)烷基或(经取代的)芳基。特别低，R1和R2之一是H原子，另一是(经取代的)烷基。优选地，R1和R2均为H。
在Q表示OR片段的情况下，R可表示C-端保护基或阳离子，例如单价阳离子，例如三取代或四取代的铵离子或碱金属阳离子或H。在R是C-端保护基的情况下，其可尤其是任选地经取代的烷基。优选地其为叔烷基，尽管原则上其也可以是本领域技术人员已知的任何其他保护性酯。原则上叔烷基可以是任何保护性叔烷基。优选地，叔烷基选自叔丁基(2-甲基-2-丙基)、叔戊基(2-甲基-2-丁基)和叔己基(2，3-二甲基-2-丁基)。尤其用叔丁基尤其取得了良好的结果。通常，为了避免不想要的副反应，优选Q表示氨基或OR片段，其中R是保护基。然而，至少在一些实施方案中，以其他方式充分地避免了此类副反应。
如上文所指出的，在本发明的方法中，氨基酸或肽的(硫)酯化由酶催化，就像得到的(硫)酯与另一肽或氨基酸的偶联那样。原则上可以使用本领域已知能够催化一个或两个这些反应的任何酶。涉及来自具体来源的酶时，来源于第一生物但实际上在(经遗传修饰的)第二生物中生产的重组酶被认为被包括在来自第一生物的酶范围内。
可作为本发明方法中使用的酶来源的生物的例子包括Trichoderma物种，如Trichoderma reesei；Rhizopus物种，例如Rhizopus oryzae；Bacillus物种，例如Bacillus licheniformis、Bacillus  subtilis  Bacillusamyloliquefaciens、Bacillus clausii、Bacillus lentus、Bacillus alkalophilus、Bacillus halodurans；Aspergillus物种，例如Aspergillus oryzae或Aspergillus niger；Streptomyces物种，例如Streptomyces caespitosus或Streptomyces griseus；Candida物种；真菌；Humicola物种；Rhizoctonia物种；Cytophagia；Mucor物种；和动物组织，尤其是胰腺，例如猪胰腺、牛胰腺或绵羊胰腺。
本领域普通技术人员应当明白，在根据本发明的方法中也可以利用天然存在的(野生型)酶的突变体。可以例如通过使用本领域技术人员已知的诱变技术(随机诱变、定点诱变、定向进化、基因改组等)修饰编码野生型酶的DNA，使得所述DNA编码与野生型酶至少有一个氨基酸不同的酶或者编码与野生型相比更短的酶，或者通过影响藉此修饰的DNA在合适的(宿主)细胞中的表达，来制造野生型酶的突变体。酶的突变体可具有例如关于一个或多个以下方面的经改进的特性：底物范围、活性、稳定性、有机溶剂抗性、温度谱、合成/水解比例和副反应谱。
在一个优选的方法中，使用脂肪酶和/或蛋白酶催化至少一种所述反应。
一种合适的脂肪酶或酯酶选自可归类为EC 3.1的酶。尤其可以使用羧酸酯水解酶(E.C.3.1.1)或硫酯水解酶(E.C.3.1.2)。在一种优选的方法中，使用选自来自Candida(假丝酵母)的脂肪酶组的脂肪酶。使用Candidaantarctica(南极假丝酵母)脂肪酶，尤其是使用Candida antarctica脂肪酶B实现了良好的结果，尤其是关于催化(硫)酯化的良好结果。
一种合适的蛋白酶选自可归类为EC 3.4的酶。蛋白酶可以被进一步分为两个亚类：仅作用于接近肽末端的外肽酶，和在肽内部作用的内肽酶。
在本发明的一个实施方案中，酯或硫酯的酶促制备由脂肪酶或酯酶催化；酶促偶联由蛋白酶催化。
在肽N-端作用的外肽酶释放单个氨基酸(氨肽酶E.C.3.4.11)或二肽(二肽酶，E.C.3.4.13)或二肽和三肽(二肽基肽酶或三肽基肽酶，E.C.3.4.14)。在肽C-端作用的肽酶被称作羧肽酶，并且释放单个氨基酸(羧肽酶，E.C.3.4.16-18)或二肽(肽酰基-二肽酶，E.C.3.4.15)。羧肽酶根据它们的催化机制分类，例如丝氨酸型羧肽酶(E.C.3.4.16)、金属羧肽酶(E.C.3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(E.C.3.4.18)，或者切割被取代、环化、或具有异构肽键(涉及侧链的肽键)的末端氨基酸(ω-肽酶，E.C.3.4.19)。
尤其可以使用内肽酶，特别是选自下组的内肽酶：丝氨酸内肽酶(E.C.3.4.21)、半胱氨酸内肽酶(E.C.3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(E.C.3.4.23)和金属内肽酶(E.C.3.4.24)。
尤其合适的是选自枯草杆菌蛋白酶组的丝氨酸内肽酶。此类酶已发现尤其适用于催化偶联。
多种枯草杆菌蛋白酶是本领域已知的，见例如US 5,316,935和其中引用的参考文献。
枯草杆菌蛋白酶A是来自Novozymes的可商业获得的枯草杆菌蛋白酶。
尤其优选的是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，该枯草杆菌蛋白酶与脂肪酶(例如Candida antarctica脂肪酶)组合使用时被发现在相对短时间内以良好产率合成肽的方面尤其有利。
Figure BPA00001373138200131
是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的一种合适来源。该产品可从Novozymes(Bagsvaerd，丹麦)获得。
Figure BPA00001373138200132
是Bacillus licheniformis生产的廉价并且可以工业获得的蛋白水解酶混合物(含有枯草杆菌蛋白酶Carlsberg作为主要的酶成分)。
可商业获得的酶(例如
Figure BPA00001373138200133
)可以由供应商作为液体提供，尤其是作为水性液体提供。在这样的情况下，优选地首先将酶从不想要的液体(例如过量的水，或引起不想要的副反应的醇)中分离出来。这可适当地通过沉淀(通常之后将固体从液体中分离出来)和/或干燥来完成。沉淀可使用醇完成，所述醇例如为叔丁醇或本发明的方法中使用的醇或硫醇。在使用另一醇或硫醇的情况下，应当注意这类醇或硫醇对(硫)酯化反应或偶联反应无不利影响。
在一个优选的实施方案中，所述酶中至少一种被固定在固体支持物上。至少在一些实施方案中，这可导致在相对短的反应时间后所合成的肽产率提高，尤其是在一锅法中，所述一锅法中用于催化(硫)酯化的酶和用于催化偶联的不同酶二者均被使用。在本文中尤其优选使用至少一种经固定的酶用于催化(硫)酯化，尤其是在使用脂肪酶(例如Candidaantarctica脂肪酶)和蛋白酶例如枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的情况下。用Alcalase交联的酶聚集物(Alcalase-CLEAs)获得了尤其良好的结果，其中已通过与戊二醛的缩合将所述Alcalase固定。
在一个特定的实施方案中，使用至少两种不同的酶，至少一种酶催化(硫)酯的制备，至少另一种催化偶联，其中所述不同的酶被固定在相同的支持物上。
可能在下述混合物中进行反应，所述混合物包含用于(硫)酯化的醇并任选地包含惰性有机溶剂，例如乙腈，烃(例如甲苯)或醚，例如甲基叔丁基醚(MTBE)。
本发明的一个优点是用于制备(硫)酯的硫醇或醇相对于要被酯化的氨基酸或肽而言不必大幅过量存在。例如，所述硫醇或醇与所述氨基酸或肽的摩尔比例可以是50∶1或更少，优选地是25∶1或更少，尤其是20∶1或更少，更尤其是10∶1或更少。通常，所述比例至少为1∶1。优选地，所述摩尔比至少为3∶1，尤其是至少为5∶1，从而允许(硫)酯化以有利的速率进行。
本发明的一种方法在基本无水的条件下进行。技术人员应当理解，取决于酶可能期望有小量的水使酶正确地发挥想要的催化活性。为了得到良好的催化活性，可能期望存在痕量的水，例如以液相为基础至少0.005重量％的水。水浓度尤其至少为0.01重量％或至少0.03重量％。
期望的水浓度上限取决于特定的酶、使用的醇或硫醇、要合成的肽的性质(例如大小、作为肽基础的氨基酸)、期望的最终转化率和期望的反应速率。
至少在活化或酯化(酯交换)开始时，反应介质通常含有以反应介质中液体重量为基础少于2.0重量％的水。反应介质可分散于第二液相中，或者可以将另一液相分散于反应介质中。在两相或多相体系中，特定的水含量以酯化(酯交换)或活化反应(至少主要地)进行的相中液体的重量为基础。
水浓度尤其可以少于1.0重量％或更少，至少在(硫)酯化开始时如此。有利地，所述方法可以在(至少在反应开始时)含有0.52重量％或更少的水、尤其是0.2重量％或更少的水、更尤其0.1重量％或更少的水的介质中发生，同时仍然保持主要的期望的酶活性，和低的、或甚至不可检出的、不期望的水解。事实上，至少在一些实施方案中，特别是在使用Candida antarctica脂肪酶和/或枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的实施方案中，在具有非常低水含量的反应介质中，尤其是在具有少于0.5重量％或少于0.1重量％水含量的反应介质中，观察到与在包含1-2.5％水的反应介质中进行的方法相比经改进的肽合成。
在一个有利的方法中，可以连续或间断地去除形成的水，尤其是在(硫)酯化期间形成的水。原则上去除可以用本领域已知的方式进行。使用分子筛取得了尤其良好的结果。还非常适用于去除的是蒸发，例如使用真空或蒸馏手段的共沸去除。
原则上可以在宽范围内选择使用的pH(如果所选择的反应介质中存在pH)，只要选择使酶显示足够活性的pH即可。这样的pH对于要使用的酶而言通常是已知的，可以其在水性溶液中已知的水解活性为基础，或可以利用已知反应条件下酶的已知底物来常规测定。pH尤其可以被选择为约为中性。需要时可以根据酶而使用碱性或酸性条件。需要时可使用酸和/或碱调节pH，或用酸和碱的合适组合缓冲pH。合适的酸和碱尤其是在反应介质中可溶的酸和碱，例如来自氨和可溶于醇的酸，所述酸例如为乙酸和甲酸。
原则上使用的温度不是关键的，只要选择使使用的酶显示足够活性和稳定性的温度即可。这样的温度针对要使用的酶而言通常是已知的，或者可以在已知的反应条件下利用酶的已知底物来常规测定。通常，温度可以至少为0℃，尤其至少为15℃或至少25℃。具体地，如果使用来源于嗜热生物的酶，则温度优选地至少为40℃。期望的最高温度取决于酶。通常这类最高温度是本领域已知的，例如在可商业获得的酶的情况下在产品数据表中标明，或者可以基于公知常识和本文公开的信息来常规地确定。温度通常为70℃或更少，尤其是60℃或更少，或45℃或更少。然而，具体地如果使用来自嗜热生物的一种或多种酶时，可以选择更高的温度，例如高达90℃的温度。
基于公知常识和本文公开的信息，本领域技术人员通过常规实验可以容易地鉴定特定酶的最适温度条件。例如对枯草杆菌蛋白酶、尤其是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(例如
Figure BPA00001373138200161
中)而言，温度可有利地在25-60℃的范围内。在使用
Figure BPA00001373138200162
和Cal-B的组合的情况下，温度可有利地在30-55℃的范围内。
本发明还涉及如本文所述根据本发明方法的不同实施方案和/或优选的特征的所有可能的组合。
本发明接着将通过以下实施例阐述。
实施例
除非另有说明，化学品从商业来源获得并且直接使用而不经进一步的纯化。在Bruker Avance 300MHz NMR(300.1MHz)光谱仪上记录1H NMR谱；除非另有说明，以ppm(δ)为单位给出相对于CDCl3(7.26ppm)的化学位移。
在预涂覆的硅胶60F254平板(Merck)上进行薄层色谱(TLC)；使用UV光或茚三酮使斑点显影。
在减压下200℃下活化
Figure BPA00001373138200163
分子筛(8到12目，Acros)，并将叔丁醇(tBuOH)储存在这些分子筛上。使用前将tBuOH预热成为液体(45℃)。
使用硅胶(Merck级别)进行柱色谱。在40℃下使用反相柱(Inertsil ODS-3，C18，5μm，150×4.6mm内径)，在HP1090 LiquidChromatograph上进行分析性HPLC。使用UV-VIS 204Linear光谱仪在220nm下进行UV检测。梯度程序为：0-25分钟线性梯度从5％的洗脱液B变化到98％的洗脱液B，从25.1-30分钟达到5％洗脱液B(洗脱液A：H2O中0.5mL/L甲磺酸(MSA)，洗脱液B：乙腈中0.5mL/L MSA)。0-25.1分钟流速为1mL/分钟，25.2-29.8分钟流速为2mL/分钟，然后变回为1mL/分钟并在30分钟时停止。注射体积为20μL。
Alcalase-CLEA购自CLEA-Technologies并含有3.5wt％水；其活性为每克650AGE单位(在40℃和pH 7.5下，1个AGE单位催化由N-乙酰基-甘氨酸乙基酯形成1μmol N-乙酰基-甘氨酸)。使用前如下处理所述Alcalase-CLEA：将1g Alcalase-CLEA悬浮于20mL tBuOH中并用铲勺压碎。过滤后用20mL MTBE重复该过程。
使用不经任何预处理的Cal-B(Novozymes，来自Candida Antarctica的脂肪酶Novozym-435，批次n.LC200204)。
如下化学合成二肽参照化合物：将1.0mmol氨基酸HCl盐或氨基酸tBu-酯HCl盐溶于10mL CHCl3和30mL EtOAc的混合物中，所述混合物含有355μL二异丙基乙胺(DIPEA，2.1mmol，2.1当量)。将所述溶液添加至1mmol N-Cbz-保护的氨基酸(1当量)、207mg N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺.HCl(EDCI.HCl，1.1mmol，1.1当量)和150mg 7-氮杂-N-羟基苯并三氮唑(HOAt，1.2mmol，1.2当量)在20mL CHCl3中的溶液(0℃)中。将混合物在室温下搅拌16小时。将溶液真空浓缩，残余物再溶解于25mL EtOAc中，用20mL水性HCl(pH＝3，3x)、20mL盐水、20mL饱和的NaHCO3水溶液(3x)、20mL盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。需要时使用EtOAc/正庚烷混合物进行额外的柱色谱，得到纯净的二肽。
如下合成N-Cbz-保护的氨基酸甲基酯：用在丙酮中的干冰浴将100mL MeOH冷却至-80℃，之后逐滴添加4mL SOCl2(5.5mmol，3.7当量)。随后添加1.5mmol Cbz-保护的氨基酸，去除干冰浴后，将混合物在室温下搅拌5小时。真空蒸发挥发物，将残余物的剩余挥发物与MeOH(3x)共蒸发。将得到的残余物在室温下真空干燥过夜，得到纯净的N-Cbz-保护的氨基酸甲基酯。
如下进行N-Cbz-保护的氨基酸氨基甲酰基甲基(Cam)酯或三氟乙基(Tfe)酯的化学合成：将1mmol N-Cbz-保护的氨基酸溶于30mL EtOAc和5mmol氨基甲酰基甲醇(CamOH)或2，2，2-三氟乙醇(TfeOH)(5当量)的混合物中。随后添加207mg EDCI.HCl(1.1mmol，1.1当量)、150mg
HOAt(1.2mmol，1.2当量)、292μL三乙胺(TEA，1.1mmol，1.1当量)。将反应混合物在室温下搅拌20小时。随后添加20mL EtOAc，并用50mL HCl水溶液(pH＝3，2x)、50mL去离子水(2x)、50mL盐水洗涤有机混合物，干燥(Na2SO4)，真空浓缩并与10mL甲苯(2x)共蒸发。需要时使用EtOAc/正庚烷混合物进行额外的柱色谱，得到纯净的酯。
化学合成的起始材料和参照化合物的 1 H NMR和HPLC数据
Figure BPA00001373138200191
Figure BPA00001373138200211
Figure BPA00001373138200221
Figure BPA00001373138200231
实施例1
使用Alcalase-CLEA从Me、Cam和Tfe酯开始酶促合成二肽
Figure BPA00001373138200241
R1和R2＝氨基酸侧链
X＝CH3、CH2C(O)NH2或CH2CF3
y＝OtBu或NH2
向3mL MTBE和200mg
Figure BPA00001373138200242
分子筛的混合物中添加300mg Alcalase-CLEA。随后添加100mg N-Cbz-保护的氨基酸酯和1.0当量C-端受保护的氨基酸。将混合物在50℃下以150rpm摇动16小时。过滤后用10mLEtOAc(3x)洗涤固体。用25mL饱和的NaHCO3水溶液(3x)、25mL HCl水溶液(pH＝3，3x)、25mL盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，真空浓缩并与20mL甲苯(2x)和20mL CHCl3(2x)共蒸发。需要时使用EtOAc/正庚烷混合物进行额外的柱色谱，得到纯净的二肽。所有获得的二肽的HPLC停留时间和1H NMR谱完全对应于参照化合物。获得的产率在下表中给出。
Figure BPA00001373138200243
Figure BPA00001373138200251
实施例2
Cam和Tfe酯的酶促合成
Figure BPA00001373138200252
R1＝氨基酸侧链
X＝CH2C(O)NH2或CH2CF3
使用下文所示方案1、2或3之一合成若干Cam和Tfe酯。
方案1：使用Alcalase-CLEA合成Cam或Tfe酯
将300mg Alcalase-CLEA添加至3mL MTBE、200mg
Figure BPA00001373138200253
分子筛、200mg氨基甲酰基甲醇或2，2，2-三氟乙醇和50mg N-Cbz-保护的氨基酸的混合物中。将混合物在50℃下以150rpm摇动72小时。过滤后用10mLEtOAc(3x)洗涤固体。用25mL去离子水(3x)、25mL HCl水溶液(pH＝3，3x)、25mL盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，真空浓缩并与20mL甲苯(2x)和20mL CHCl3(2x)共蒸发。
方案2：使用Cal-B合成Cam或Tfe酯
将100mg Cal-B添加至3mL乙腈、100mg分子筛、200mg氨基甲酰基甲醇或2，2，2-三氟乙醇和50mg N-Cbz-保护的氨基酸的混合物中。将混合物在50℃下以150rpm摇动16小时。过滤后用10mL EtOAc(3x)洗涤固体。用25mL去离子水(3x)、25mL HCl水溶液(pH＝3，3x)、25mL盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，真空浓缩并与20mL甲苯(2x)和20mL CHCl3(2x)共蒸发。需要时使用EtOAc/正庚烷混合物进行额外的柱色谱，得到纯净的酯。
Figure BPA00001373138200262
方案3：使用Cal-B合成Tfe酯
将100mg Cal-B添加至3mL MBTE、100mg
Figure BPA00001373138200263
分子筛、200mg2，2，2-三氟乙醇和50mg N-Cbz-保护的氨基酸的混合物中。将混合物在50℃下以150rpm摇动54小时。通过HPLC分析测定原料向相应Tfe酯的转化。
Figure BPA00001373138200264
实施例3
使用Cam或Tfe作为添加剂的二肽酶促合成
Figure BPA00001373138200271
R1和R2＝氨基酸侧链
X＝CH2C(O)NH2或CH2CF3
使用下文所示的方案1-3之一合成若干二肽。
方案1：使用Cam或Tfe醇作为添加剂，用Alcalase-CLEA合成二 肽。
将300mg Alcalase-CLEA添加至3mL MTBE、200mg
Figure BPA00001373138200272
分子筛和200mg适当醇的混合物中。随后添加50mg N-Cbz-保护的氨基酸和1当量的氨基酸酰胺。将混合物在50℃下以150rpm摇动16小时。
方案2：使用Cam或Tfe作为添加剂，用Cal-B合成二肽。
将100mg Cal-B添加至3mL乙腈、200mg
Figure BPA00001373138200273
分子筛和200mg适当醇的混合物中。随后添加50mg N-Cbz-保护的氨基酸和1当量的氨基酸酰胺。将混合物在50℃下以150rpm摇动16小时。
方案3：使用Cam或Tfe醇作为添加剂，用Alcalase-CLEA和Cal-B 合成二肽。
将300mg Alcalase-CLEA和100mg Cal-B添加至3mL乙腈、200mg
Figure BPA00001373138200274
分子筛和200mg适当醇的混合物中。随后添加50mg N-Cbz-保护的氨基酸和1当量氨基酸酰胺。将混合物在50℃下以150rpm摇动16小时。过滤后用10mL EtOAc(3x)洗涤固体。用25mL去离子水(3x)、25mLHCl水溶液(pH＝3，3x)、25mL盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，真空浓缩并与20mL甲苯(2x)和20mL CHCl3(2x)共蒸发。
实施例4
使用Cal-B酶促合成二肽和三肽的Tfe酯
将100mg Cal-B添加至3mL甲基叔丁基醚、100mg
Figure BPA00001373138200281
分子筛、200mg 2，2，2-三氟乙醇和50mg N-Cbz-保护的二肽或三肽的混合物中。将混合物在50℃和150rpm下摇动。通过HPLC分析监测原料向相应的C-端Tfe酯的转化。在所有情况下，起始化合物都仅被转化成相应的C-端Tfe酯。起始化合物和Tfe酯产物(P)的HPLC停留时间展示于下表中。
Figure BPA00001373138200282
在1天和/或2天和/或3天和/或7天后从反应混合物中采样。通过下式计算Tfe酯产物的％(％P)，如下表所示：
％P＝Tfe酯产物的面积％/(起始化合物的面积％+Tfe酯产物的面积％)。
Figure BPA00001373138200283
[n.d.＝未测定]
如下处理Cbz-Ala-Ala酯化成Cbz-Ala-Ala-OTfe的反应混合物。将7天后获得的反应混合物过滤，并用10mL EtOAc(3x)洗涤固体。用25mL去离子水(3x)、25mL HCl水溶液(pH＝3，3x)、25mL盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过与20mL甲苯(2x)和20mL CHCl3(2x)共蒸发去除得到的残余物中的挥发物。产物的色谱纯化以85％的产率得到纯净的Cbz-Ala-Ala-OTfe。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝1.32(d，J＝7.4Hz，3H，CH3)，1.37(d，J＝7.3Hz，3H，CH3)，4.13-4.24(m，1H，CαH)，4.29-4.40(m，1H，CαH)，4.49-4.61(m，2H，OCH2CF3)，5.05(s，2H，CH2OCO)，5.18(bs，1H，NH)，6.41(bs，1H，NH)，7.28(m，5H，CArH)；
13C NMR(75MHz，CDCl3)δ＝16.7，16.8，46.9，49.4，60.0，66.1，119.8，123.5，127.1，127.3，127.6，138.3，170.2，170.9.
Figure BPA00001373138200291

Claims (12)

1.用于酶促合成肽的方法，所述方法包括由以下(i)和(ii)酶促制备酯或硫酯：(i)N-端受保护的氨基酸、N-端受保护的氨基酸C-端酯、N-端受保护的肽、或N-端受保护的肽C-端酯，和(ii)式HO-CX2-Z所表示的醇、或式HS-CX2-Z所表示的硫醇，
每个X独立地表示卤素原子或氢原子；且Z表示选自下组的吸电子基团：包含至少两个取代基的sp3-杂化的碳，所述取代基包含和sp3-杂化的碳直接连接的杂原子，和包含一个或两个取代基的sp2-杂化的碳，所述取代基包含和sp2-杂化的碳直接连接的杂原子，
酯或硫酯的制备在以反应介质中液体重量为基础包含2重量％或更少水的反应介质中进行；和
将制备得到的酯或硫酯与任选地C-端受保护的氨基酸或与任选地C-端受保护的肽酶促偶联，从而在以反应介质总重为基础包含2重量％或更少水的反应介质中合成肽，
其中所述酯或硫酯的制备由选自枯草杆菌蛋白酶和来自假丝酵母属的脂肪酶的组的至少一种酶催化，并且其中所述偶联由选自枯草杆菌蛋白酶和来自假丝酵母属的脂肪酶的组的至少一种酶催化。
2.根据权利要求1的方法，其中所述偶联在存在用于催化所述酯或硫酯的制备的酶时进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酯或硫酯的制备以及所述偶联均由所述脂肪酶催化。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用来自南极假丝酵母的脂肪酶。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述枯草杆菌蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用至少一种被固定的酶。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酯的制备和所述偶联在下述反应介质中进行，所述反应介质包含1.0重量％或更少水。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中Z是氨基甲酰基、三氟甲基或三氯甲基。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中两个X均表示氢。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酯或硫酯的制备在存在以下物质时进行：要与所制备的酯或硫酯偶联的任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽，和催化所述偶联反应的酶。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中在制备了所述酯或硫酯之后添加所述任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中进行所述偶联时不首先从所述反应介质中分离所述制备得到的酯或硫酯。
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