KR20110088519A - 효소적 활성화 및 커플링을 이용한 펩티드 합성 - Google Patents

효소적 활성화 및 커플링을 이용한 펩티드 합성 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (i) N-말단 보호된 아미노산, N-말단 보호된 아미노산 C-말단 에스터, N-말단 보호된 펩티드 또는 N-말단 보호된 펩티드 C-말단 에스터, 및 (ii) 하기 화학식 1로 표시되는 알코올 또는 하기 화학식 2로 표시되는 티올로부터 에스터 또는 티오에스터를 효소적으로 제조하는 단계를 포함하는, 펩티드의 효소적 합성 방법으로서, 상기 에스터 또는 티오에스터의 제조가 반응 매질 중의 액체의 중량을 기준으로 2중량% 이하의 물을 포함하는 반응 매질 중에서 수행되고, 제조된 에스터 또는 티오에스터를 C-말단 보호된 또는 비보호된 아미노산 또는 C-말단 보호된 또는 비보호된 펩티드와 효소적으로 커플링시킴으로써 반응 매질의 총 중량을 기준으로 2중량% 이하의 물을 포함하는 반응 매질에서 펩티드를 합성하는, 펩티드의 효소적 합성 방법에 관한 것이다:
화학식 1
HO-CX2-Z
화학식 2
HS-CX2-Z
상기 식에서,
X는 각각 독립적으로 할로겐 원자 또는 수소 원자를 나타내고;
Z는 sp3-혼성화된 탄소에 직접 부착된 헤테로원자를 포함하는 2개 이상의 치환기를 포함하는 sp3-혼성화된 탄소, 및 sp2-혼성화된 탄소에 직접 부착된 헤테로원자를 포함하는 1 또는 2개의 치환기를 포함하는 sp2-혼성화된 탄소로 구성된 군으로부터 선택된다.

Description

효소적 활성화 및 커플링을 이용한 펩티드 합성{PEPTIDE SYNTHESIS USING ENZYMATIC ACTIVATION AND COUPLING}
본 발명은 펩티드를 효소적으로 합성하는 방법에 관한 것이다.
펩티드, 특히 올리고펩티드는 많은 용도, 예를 들어, 약제, 식품 또는 사료 성분, 농약 또는 화장품 성분으로서 사용된다.
본 발명의 목적상, 펩티드는 2개 이상의 아미노산으로 구성된 임의의 쇄를 의미한다. 본 발명의 목적상, "올리고펩티드"는 2 내지 200개의 아미노산, 특히 2 내지 100개의 아미노산, 보다 특히 2 내지 50개의 아미노산에 의거한 펩티드, 바람직하게는 2 내지 200개의 아미노산으로 구성된 임의의 직쇄, 더 바람직하게는 2 내지 100개 또는 2 내지 50개의 아미노산으로 구성된 임의의 직쇄를 의미한다. 용어 "폴리펩티드"는 올리고펩티드의 경우 특정된 아미노산보다 더 많은 수의 아미노산에 의거한 펩티드를 지칭하는 데 사용된다.
1개 이상의 펩티드 결합이 효소적 커플링 반응에 의해 형성되는 펩티드 합성으로서 본 발명의 목적상 정의되는 화학-효소적 펩티드 합성은 화학적 펩티드 합성에 비해 여러 이점을 갖는다. 예를 들어, 제한된 아미노산 측쇄 보호가 필요하거나 아미노산 측쇄 보호가 필요하지 않는다는 사실로 인해 대규모 생산의 경우 비용-가격이 보다 낮다. 또한, 상기 방법은 보다 더 환경 친화적인 방법이다. 예를 들어, 화학양론적 양의 독성 화학 시약, 예컨대, 다이사이클로헥실 카보다이이미드(DCC), 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 메티오다이드(EDCl)가 요구되지 않는다. 또한, 상기 방법은 보다 적은 유기 용매를 사용하여 수행할 수 있다. 나아가, 효소-촉진된 커플링은 라세미체화를 결여하고 있으므로 생성물이 보다 더 순수하고/하거나 단리가 보다 더 용이하다(예를 들어, 문헌(Sewald and H.-D. Jakubke, in: "Peptides: Chemistry and Biology", 1st reprint, Ed. Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim 2002, p250) 참조).
화학-효소적 커플링 방법의 경우, 펩티드 결합을 생성하는 2가지 방법이 존재한다. 소위 열동력학적(또는 평형-제어된) 방법에서, 카복시 성분, 즉 그의 C-말단 상에서 커플링되는 성분은 자유 카복실산 작용기를 보유하는 반면, 동역학적으로 제어된 방법에서 반응성 카복시 성분, 예컨대, 1차 n-알킬 에스터가 사용된다.
열동력학적 방법은 하기 3가지 주요 단점을 갖는다: i) 통상적으로 평형이 펩티드 결합 절단 쪽으로 일어나므로 커플링 수율이 낮다는 점, ii) 통상적으로 대량의 효소가 요구된다는 점, 및 iii) 통상적으로 반응 속도가 매우 낮다는 점. 동역학적으로 제어된 방법에서, 알킬 에스터가 출발 물질로서 요구되지만 훨씬 더 적은 효소가 요구되고, 반응 시간이 유의하게 더 짧고, 특히 최대 달성가능한 수율이 통상적으로 상당히 더 높다. 따라서, 산업 용도의 경우, 동역학적 방법에 의거한, 즉 활성화된 카복시 성분을 사용하는 효소적 펩티드 합성이 가장 흥미를 끈다(예를 들어, 문헌(N. Sewald and H.-D. Jakubke, in: "Peptides: Chemistry and Biology", 1st reprint, Ed. Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim 2002, section 4.6.2) 참조).
화학-효소적 펩티드 합성은 C→N 말단 방향 또는 N→C 말단 방향으로 단계적으로 수행되지만 화학적 합성을 사용하여 개별적으로 합성되거나 화학적 및 화학-효소적 커플링 단계의 병용에 의해 개별적으로 합성된 단편의 효소적 커플링을 수반할 수도 있다. 첸 등(Chen et al.)은 그의 문헌(J. Org. Chem. 1992, 57, 6960-65, Biomed. Biochim. Acta 1991, 50, 181, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1991, 1, 445)에서 유기 용매 중에서 활성 및 안정성을 나타내는 프로테아제를 사용하는 "낮은 수성" 유기 용매 중에서의 커플링을 기술하였다. 상기 문헌에 기재된 방법의 단점은 낮은 수성 조건 하에서 활성 및 안정성을 나타내는 효소가 극소수에 불과하고 상기 효소가 상기 문헌에 기재된 방법에서 제한된 기질 범위를 나타낸다는 점이다. 따라서, 통상적으로 보다 긴 반응 시간 및 과량의 아미노산 또는 펩티드 친핵체(nucleophile)가 요구된다. 종종 펩티드의 다른 위치에서 일부 가수분해가 일어나고, 종종 단편들 중 하나에서 기존 펩티드 결합에 대해 트랜스아미드화(transamidation)(=기존 펩티드 결합 중 하나에 대한 아미노산 또는 펩티드 친핵체의 효소-촉진된 친핵 공격)가 일어난다. 따라서, 수율이 종종 낮다. 또한, 생성물의 정제가 종종 어렵다.
또 다른 방법은 문헌(F. Bordusa et al., Current Protein and Peptide Science 2002, 3, 159-180)에 논의된 소위 "기질 모사체(mimetics)"의 사용이다. 이 방법에서, C-활성화된 아미노산 또는 펩티드는 특정 아미노산에 대해 선별성을 나타내는 효소가 에스터 잔기를 보유하는 임의의 아미노산과 신속히 반응하는 정도로 상기 특정 아미노산과 유사한 에스터 잔기를 가진다. 이의 선례로는 Arg-X 서열(이때, X는 임의의 단백질생성 아미노산을 표시함)에 대해 특이적인 그의 가수분해성 나타내는 트립신이 (4-구아니디노페닐(Gp) 에스터를 보유하는) 거의 임의의 C-말단을 다양한 아미노산 및 펩티드 친핵체에 커플링시킬 수 있을 정도로 Arg와 유사한 것으로 보르두사 등(Bordusa et al.)에 의해 발견된 Gp 에스터의 사용이다. 예를 들어, N-보호된 D-Ala-OGp는 문헌(M. Thormann et al., Biochem. 1999, 38, 6056)에 의해 입증된 바와 같이 다양한 아미노산 및 펩티드 친핵체에 커플링될 수 있다. 따라서, D-아미노산 및 비-단백질생성 아미노산도 높은 효율로 효소에 의해 도입될 수 있고, 커플링 효소가 특이성을 나타내는 펩티드 결합(예를 들어, 트립신의 경우 Arg-X 결합)이 존재하는 경우를 제외하고 단편에서 펩티드 결합의 가수분해가 일어나지 않는다. 기질 모사체 사용 방법의 단점은 기질 모사체(예컨대, Gp 에스터)가 규모를 증가시키기에는 어려운 많은 다단계 화학적 합성을 필요로 하고 이러한 합성에 의해 종종 아미노산의 라세미체화가 일어나고, 기질 모사체가 불안정하기 때문에 대규모로 다루기 어렵고 종종 수용액 중에서의 기질 모사체의 가용성이 낮다는 점이다.
문헌(Organic Letters, 2001, Vol 3, No. 26, p4157-4159)에서 리우(Liu) 및 탐(Tam)은 서브틸리신 칼스버그(subtilisin Carlsberg)가 1 내지 2.5%의 물을 포함하는 1,3-프로판다이올 및 1,4-부탄다이올 중에서 일부 N-말단 Boc-보호된 아미노산 및 비보호된 펩티드의 C-말단 3-하이드록시프로필 또는 4-하이드록시부틸 에스터의 형성을 촉진하는 데 사용되는 방법을 보고한다. 또한, 반응 매질(에스터 형성이 일어나는 매질과 상이한 매질)에서 아미노산(류신) 또는 펩티드와 수득된 에스터의 효소적 커플링이 기재된다. 상기 커플링이 일어나는 반응 매질은 상당량의 물을 포함한다.
문헌(Mitin et al., Biotechnology and Bioengineering, 1997, vol. 54, no. 3, p287-290)에는 파파인이 최대 70% 수율로 에스터를 제공하는 10중량% 이상의 물을 함유하는 글리세롤 중에서 N-말단 Boc 및 N-말단 Cbz-보호된 아미노산 및 펩티드의 C-말단 글리세릴 에스터의 형성을 촉진하는 데 사용되는 방법이 기재되어 있다. 10중량% 미만의 물을 함유하는 용액의 사용은 파파인의 변성으로 인해 훨씬 더 낮은 에스터 수율을 초래한다.
또 다른 방법은 "활성화된" 에스터, 예컨대, 카바모일메틸(Cam) 에스터(예를 들어, 문헌(T. Miyazawa et al. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2002, 390-395)에 기재되어 있음) 또는 2,2,2-트라이플루오로에틸 에스터(문헌(A. Yan et al. Tetrahedron, 61, 2005, 5933-5941)에 기재되어 있음)의 사용이다. 이 에스터들은 통상적으로 "실제" 기질 모사체보다 더 용이하게 제조되고 더 안정하지만 비용이 많이 소요되고 환경 친화적이지 않은 화학적 단계를 필요로 한다. 또한, 이 에스터들의 제조는 종종 아미노산의 일부 라세미체화를 야기한다. 예를 들어, Cam 에스터는 아실 공여체의 Cs 염을 2-클로로아세트아미드로 처리하여 제조할 수 있고, Tfe 에스터는 카보다이이미드 화학합성을 이용하여 제조할 수 있다. Cam 에스터 및 Tfe 에스터는 통상적으로 저렴하고 용이하게 입수할 수 있는 프로테아제, 예컨대, 파파인 및 서브틸리신을 사용하여 아미노산 또는 펩티드 친핵체에 커플링시킨다. 따라서, D-아미노산도 펩티드 내로 도입될 수 있다(Pro는 아직 도입된 바 없음).
펩티드 합성 및/또는 일반적으로 펩티드 합성에 사용될 수 있는 중간체 화합물의 제조를 위한 대안적인 방법이 필요하다. 이러한 방법은 예를 들어, 펩티드 합성에서 유연성을 증가시키고/시키거나 공지된 방법으로 수득되지 않거나 비교적 수득되기 어려운 특정 펩티드의 합성을 허용하는 추가 방법을 제공할 수 있다. 예를 들어, 허용가능한 시간 이내에 우수한 수율로 다양한 아미노산을 효소적으로 커플링하는 것은 여전히 과제이다. 따라서, 단백질생성 아미노산뿐만 아니라 비-단백질생성 아미노산, 예컨대, D-알파-아미노산, 베타-아미노산, 페닐글리신, DOPA, 알파-알킬화된 아미노산, 또는 N-말단 아미노산 잔기가 상기 아미노산들 중 임의의 아미노산의 잔기인 펩티드를 N-말단 아민 작용기를 통해 또 다른 아미노산 또는 펩티드의 C-말단 카복실산 작용기에 커플링시키는 개선된 방법이 여전히 필요하다. 또한, 단백질생성 아미노산뿐만 아니라 비-단백질생성 아미노산, 예컨대, D-알파-아미노산, 베타-아미노산, 페닐글리신, DOPA, 알파-알킬화된 아미노산, 또는 C-말단 아미노산 잔기가 상기 아미노산들 중 임의의 아미노산의 잔기인 펩티드를 이들의 C-말단 카복실산 작용기를 통해 또 다른 아미노산 또는 펩티드의 N-말단 아민 작용기에 커플링시키는 개선된 방법도 여전히 필요하다.
또한, 임의의 아미노산 또는 펩티드를 그의 N-말단 아민 작용기를 통해 입체장애(sterically hindered) 아미노산, 예컨대, 발린 또는 이소류신의 C-말단 카복실산 작용기 또는 C-말단 아미노산 잔기가 입체장애 아미노산, 예컨대, 발린 또는 이소류신인 펩티드의 C-말단 카복실산 작용기에 효소적으로 커플링시키는 것에 대해 개선된 기술이 특히 필요하다.
추가로, 비교적 환경 친화적인 비교적 단순한 신규 방법이 필요하다.
본 발명자들은, 아미노산 또는 펩티드의 활성화된 C-말단 에스터 또는 활성화된 C-말단 티오에스터를 효소적으로 제조하는 것과, 이 활성화된 에스터 또는 활성화된 티오에스터를 특정한 방식으로 또 다른 아미노산 또는 펩티드와 효소적으로 커플링시키는 것을 병행함으로써 이러한 방법을 제공할 수 있음을 발견하였다.
본 발명은 (i) N-말단 보호된 아미노산, N-말단 보호된 아미노산 C-말단 에스터, N-말단 보호된 펩티드 또는 N-말단 보호된 펩티드 C-말단 에스터, 및 (ii) 하기 화학식 1로 표시되는 알코올 또는 하기 화학식 2로 표시되는 티올로부터 에스터 또는 티오에스터를 효소적으로 제조하는 단계를 포함하는 펩티드의 효소적으로 합성 방법에 관한 것으로서, 상기 에스터 또는 티오에스터의 제조는 반응 매질 중의 액체의 중량을 기준으로 2중량% 이하의 물을 포함하는 반응 매질 중에서 수행되고, 제조된 에스터 또는 티오에스터를 C-말단 보호된 또는 비보호된 아미노산 또는 C-말단 보호된 또는 비보호된 펩티드와 효소적으로 커플링시킴으로써 반응 매질의 총 중량을 기준으로 2중량% 이하의 물을 포함하는 반응 매질에서 펩티드를 합성한다.
[화학식 1]
HO-CX2-Z
[화학식 2]
HS-CX2-Z
상기 식에서,
X는 각각 독립적으로 할로겐 원자 또는 수소 원자를 나타내고;
Z는 sp3-혼성화된 탄소에 직접 부착된 헤테로원자를 포함하는 2개 이상의 치환기를 포함하는 sp3-혼성화된 탄소, 및 sp2-혼성화된 탄소에 직접 부착된 헤테로원자를 포함하는 1 또는 2개의 치환기를 포함하는 sp2-혼성화된 탄소로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에서 사용된 용어 "C-말단 보호된"은 C-말단 카복실 기가 또 다른 분자의 아민 기에 커플링되는 것으로부터 상기 카복실 기를 일반적으로 및 실질적으로 보호하는 보호기를 가짐을 의미한다. 구체적으로, C-말단 보호기는 C-말단 카복실 기가 이용된 펩티드 합성 조건 하에 아민에 커플링되는 것으로부터 적어도 실질적으로 보호되게 하는 C-말단 에스터일 수 있다. t-알킬 기가 통상적으로 사용되는 보호기이다.
본원에서 사용되는 용어 "N-말단 보호된"은 N-말단 아민 기가 C-말단 카복실 기와 N-말단 아민 기의 커플링에 참여하는 것으로부터 N-말단 아민 기를 일반적으로 및 적어도 실질적으로 보호하는 보호기를 가짐을 의미한다.
본 발명의 방법에서 제조되는 에스터 또는 티오에스터는 커플링 반응에 참여할 수 있기 때문에 각각 "활성화된 에스터" 또는 "활성화된 티오에스터"로 지칭될 수 있다. 대조적으로, 활성화된 에스터의 제조에 사용될 수 있는 자유 C-말단 카복실산 또는 에스터는 상기 커플링에 참여할 수 없거나 상기 커플링 반응에서 적어도 상당히 낮은 반응성, 예를 들어, 본 발명의 방법에서 효소적으로 제조된 활성화된 에스터의 반응성의 절반 미만, 10분의 1 미만 또는 100분의 1 미만의 반응성을 나타낸다. 특히, 보편적으로 커플링시키기 어려운(낮은 커플링 속도를 나타내는) 아미노산, C-말단 아미노산 잔기 또는 N-말단 아미노산 잔기의 경우, 커플링 속도의 큰 증가가 아미노산 또는 C-말단 아미노산 잔기의 활성화로 인해 본 발명의 방법에 의해 달성될 수 있다. 커플링시키기 어려운 아미노산 또는 아미노산 잔기의 전형적인 예는 D-아미노산 또는 이의 아미노산 잔기 및 다른 비-단백질생성 아미노산 또는 이의 아미노산 잔기이다. 추가 예로는 입체장애 아미노산, 예를 들어, 발린 및 이소류신, 또는 이의 아미노산 잔기가 있다.
에스터 또는 티오에스터의 효소적 제조는 이하에서 각각 에스터화 또는 티오에스터화로 지칭될 수 있다. 이 용어는 (티오)에스터의 제조가 N-말단 보호된 아미노산 또는 펩티드 C-말단 에스터와 (티오)알코올의 반응을 수반하는 경우를 포함한다. 보다 구체적으로, 이러한 반응은 트랜스(티오)에스터화로서 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 방법을 이용하여 커플링 반응에 참여하는 말단 아미노산 잔기에서 상이한 다양한 아미노산 또는 다양한 펩티드(커플링에 참여하는 프롤린 또는 비-단백질생성 말단 아미노산 잔기를 함유하는 프롤린 및 비-단백질생성 아미노산을 포함함)를 커플링할 수 있는 가능성을 제공한다는 점에서 유리하다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 라세미체화 또는 다른 부반응을 수반하지 않으면서, 즉 불필요한 화합물을 화학양론적 양으로 생성하지 않으면서 활성화된 (티오)에스터를 환경 친화적인 방식으로 고수율로 합성한다는 점에서 유리하다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 이 방법에서 사용되는 효소 또는 효소들의 높은 안정성 및/또는 활성을 제공한다는 점에서 유리하다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 효소적으로 제조된 에스터의 가수분해도가 ((티오)에스터의 제조 및 커플링을 달성하기 위한 전형적인 시간 이내에) 낮다는 점에서 유리한데, 적어도 여러 실시양태에서 에스터의 검출가능한 가수분해는 관찰되지 않았다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 효소적으로 제조된 펩티드의 가수분해도가 낮다는 점에서 유리한데, 적어도 여러 실시양태에서 효소적으로 제조된 펩티드의 검출가능한 가수분해는 관찰되지 않았다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 높은 총 반응 속도, 즉 N-보호된 아미노산 또는 펩티드 출발 화합물로부터 합성된 펩티드로의 높은 전환 속도를 제공하여 특정 수율을 달성하는 데 있어서 비교적 짧은 반응 시간이 요구된다는 점에서 유리하다.
특히, 본 발명의 방법은 커플링 파트너 중 하나를 과량으로 요구하지 않으면서 아미노산 또는 펩티드가 또 다른 아미노산 또는 펩티드에 커플링되게 함으로써 비교적 짧은 시간 이내에 다른 커플링 파트너에 의거한 허용가능한 수율로 합성된 펩티드를 수득할 수 있게 한다. N-말단 보호된 아미노산, N-말단 보호된 아미노산 C-말단 에스터, N-말단 보호된 펩티드, 또는 N-말단 보호된 펩티드 C-말단 에스터(이 에스터의 활성화된 (티오)에스터는 C-말단 보호된 또는 비보호된 아미노산 또는 펩티드에 대해 제조됨)의 몰비는 통상적으로 2:1 내지 1:3, 특히 1:1 내지 1:2, 바람직하게는 1:1 내지 1:1.5이다. 구체적으로 바람직한 실시양태에서, 상기 몰비는 1:1 내지 1:1.1이다.
본 발명의 방법은 N-말단 보호된 아미노산 또는 N-말단 보호된 펩티드의 활성화된 C-말단 에스터 또는 티오에스터, 특히 N-말단 보호된 아미노산 또는 N-말단 보호된 펩티드의 C-말단 Cam 에스터 또는 C-말단 Tfe 에스터를 화학-효소적 펩티드 합성의 일부로서 효소적으로 제조할 수 있다는 점에서 특히 유리하다. 특히, 놀랍게도 프로테아제 또는 리파아제(lipase)를 사용하여 Cam 에스터 및 Tfe 에스터를 고수율로 효소적으로 제조할 수 있다는 점, 및 심지어 커플링되는 아미노산 또는 펩티드를 등몰량으로 사용하는 경우조차도, 즉 친핵체로서 작용하는 아미노산 또는 펩티드를 과량으로 요구하지 않으면서 프로테아제 또는 리파아제를 사용하는 활성화 단계를 프로테아제를 사용하는 펩티드 결합 형성 단계와 동시에 수행하여 인지가능한 부반응을 수반하지 않으면서 90% 초과의 수율로 축합 생성물(합성되는 펩티드)을 제공할 수 있다는 점을 발견하였다.
또한, "어려운" 아미노산, 예컨대, 프롤린, 또는 비-단백질생성 아미노산, 예컨대, D-아미노산이 조립되는 펩티드 결합의 어느 한 쪽 또는 양쪽에 존재하는 경우에도 인지가능한 라세미체화를 수반하지 않으면서 펩티드를 합성할 수 있다는 것을 발견하였다.
특히, 본 발명에 따른 방법은 소위 "1-용기(one-pot)" 공정으로 (티오)에스터화를 수행할 수 있기 때문에 비교적 단순한 방법을 제공한다. 1-용기 공정에서 (티오)에스터화 및 커플링은 이 반응들 사이에 (제조된 에스터 또는 티오에스터)의 단리 단계를 수행하지 않으면서 일어날 수 있다. 심지어, 반응의 개시 시점부터 모든 물질(예컨대, 커플링될 아미노산 또는 이의 에스터 및/또는 펩티드 또는 이의 에스터, 알코올/티올, 용매 및 효소)를 포함함으로써 본 발명에 따른 방법을 수행할 수 있는데, 이러한 점은 합성될 펩티드를 비교적 짧은 시간 이내에 고수율로 수득할 수 있다는 면에서 특히 유리할 수 있다. 따라서, 본 발명의 특히 적합한 1-용기 방법에서, 에스터 또는 티오에스터의 제조는 제조될 에스터 또는 티오에스터와 커플링되는 C-말단 보호된 또는 비보호된 아미노산 또는 C-말단 보호된 또는 비보호된 펩티드의 존재 하에서 수행된다.
본 발명의 추가 1-용기 방법에서, (티오)에스터화 및 커플링은 순차적으로 일어난다. 즉, C-말단 보호된 또는 비보호된 아미노산 또는 C-말단 보호된 또는 비보호된 펩티드를 에스터 또는 티오에스터의 제조 후에 첨가한다.
본 발명의 추가 1-용기 방법에서, 리파아제 또는 에스터라제(esterase)를 사용하여 (티오)에스터의 제조를 먼저 수행한 후 커플링 반응을 촉진하기 위해 효소(통상적으로 프로테아제)를 첨가한다. 특히, 이러한 방법은 커플링을 촉진하는 효소가 예를 들어, (티오)에스터의 제조를 촉진하는 효소의 활성 또는 안정성에 불리한 효과를 미치기 때문에 (티오)에스터의 제조에 유해한 경우 이용될 수 있다.
이 1-용기 방법의 중간체 형태, 예컨대, 본 발명의 방법에서 사용된 1종 이상의 물질들의 일부만을 먼저 포함시키고 나중에 나머지 물질을 포함시키는 방법도 이용가능하다. 특히, 제조되는 에스터 또는 티오에스터와 커플링되는 C-말단 보호된 또는 비보호된 아미노산 또는 C-말단 보호된 또는 비보호된 펩티드의 일부를 점진적으로 또는 단계적으로 첨가할 수 있다.
원칙적으로, (티오)에스터화를 촉진하는 효소 및 커플링을 촉진하는 효소가 동일한 효소, 특히 동일한 리파아제, 에스터라제 또는 프로테아제일 수 있다. 예를 들어, 이러한 실시양태를 위해 서브틸리신 칼스버그 또는 칸디다 안타크티카(Candida antarctica) 리파아제 B가 사용될 수 있다.
비교적 짧은 시간 이내에 합성된 펩티드를 수득하는 면에서 2종 이상의 효소, 즉 리파아제 및 에스터라제로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소 및 1종 이상의 프로테아제를 사용하는 것이 특히 유리하다는 것을 발견하였다. 본 발명의 1-용기 방법에서 리파아제 또는 에스터라제는 (주로) (티오)에스터화를 촉진하고, 프로테아제는 (주로) 커플링 반응을 촉진하는 것으로 생각된다.
(티오)에스터화되는 N-말단 보호된 아미노산 또는 N-말단 보호된 펩티드는 원칙적으로 임의의 단백질생성 또는 비-단백질생성 아미노산일 수 있거나 단백질생성 아미노산 및/또는 비-단백질생성 아미노산에 의거한 임의의 펩티드일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 에스터 또는 티오에스터의 효소적 제조를 위해 (i) N-말단 보호된 아미노산 또는 N-말단 보호된 펩티드를 (ii) 하기 화학식 1로 표시되는 알코올 또는 하기 화학식 2로 표시되는 티올과 반응시키는 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다:
화학식 1
HO-CX2-Z
화학식 2
HS-CX2-Z
구체적으로, N-말단 보호된 아미노산 또는 펩티드는 하기 화학식 I로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 식에서,
P는 N-말단 보호기를 나타내고, 적절한 N-말단 보호기는 (올리고)펩티드의 합성에 사용될 수 있는 N-보호기이고, 이러한 기는 당업자에게 공지되어 있고, 적절한 N-보호기의 예로는 카보닐 타입의 보호기, 예컨대, "Cbz"(즉, 벤질옥시카보닐), "Boc"(즉, t-부틸옥시카보닐), "For"(즉, 포르밀), "Fmoc"(즉, 9-플루오레닐메톡시카보닐) 및 "PhAc"(즉, 페닐아세틸)가 있고, For 또는 PhAc 기가 도입될 수 있고 각각 펩티드 데포르밀라제(Deformylase) 또는 PenG 아실라제(acylase) 효소에 의해 효소적으로 절단될 수 있고, 화학적 절단 방법은 당분야에 잘 공지되어 있고;
n은 1 이상의 정수, 특히 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 8 이상, 9 이상 또는 10 이상일 수 있고, n은 특히 100 이하, 75 이하, 50 이하, 25 이하, 20 이하, 15 이하 또는 10 이하, 예를 들어, 5 이하일 수 있고;
RA 및 RB는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 유기 잔기, 바람직하게는 아미노산 측쇄를 나타내고, RA가 모든 n개의 아미노산 유니트에서 동일할 필요는 없고, 유사하게 RB가 모든 n개의 아미노산 유니트에서 동일할 필요는 없다.
본 발명의 내용에서 "아미노산 측쇄"는 임의의 단백질생성 또는 비-단백질생성 아미노산 측쇄를 의미한다. 아미노산 측쇄의 반응성 기는 아미노산 측쇄 보호기에 의해 보호될 수 있거나 비-보호될 수 있다. 아미노산 측쇄에 적합한 보호기는 당업자에게 공지되어 있다. 특히, 산성 또는 알칼리성 측쇄 기의 전부 또는 일부는 필요에 따라 아미노산 또는 펩티드의 가용성을 개선하기 위해 보호기를 가질 수 있다.
단백질생성 아미노산은 유전 코드에 의해 코딩되는 아미노산이다. 단백질생성 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 트립토판, 글리신, 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘, 라이신, 아르기닌, 프롤린 및 페닐알라닌을 포함한다.
비-단백질생성 아미노산은 특히 D-아미노산, 페닐글리신, DOPA(3,4-다이하이드록시-L-페닐알라닌), 베타-아미노산, 4-플루오로-페닐알라닌 및 알파-알킬화된 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 커플링 반응에 참여하는 에스터 또는 티오에스터의 제조에 사용되는 N-보호된 아미노산 또는 펩티드는 제조될 (티오)에스터와는 상이한 C-말단 에스터, 예를 들어, 펩티드의 합성을 위한 효소적 커플링 반응에서 일반적으로 실질적인 활성을 보이지 않거나 제조되는 (티오)에스터보다 낮은 활성을 보이는 t-알킬 에스터 또는 또 다른 에스터이다. 이러한 경우, (티오)에스터의 제조는 트랜스(티오)에스터화로서 지칭될 수 있다.
제조되는 알코올 또는 티올과 반응하는 화합물이 에스터인 실시양태에서, 상기 에스터는 전형적으로 전술한 바와 같은 아미노산 또는 펩티드의 에스터이다.
따라서, 에스터는 하기 화학식 II로 표시될 수 있다:
[화학식 II]
Figure pct00002
이 에스터는 전형적으로 본 발명의 방법에서 효소적으로 제조되는 에스터 또는 티오에스터보다 더 낮은 반응성을 커플링 반응에서 나타낸다. 일반적으로, 이것은 RC 기가 전자 끌기(withdrawing) 기가 아니거나 에스터 또는 티오에스터의 제조에 사용되는 알코올 또는 티올의 CX2-Z 기보다 더 낮은 전자 끌기를 보임을 의미한다. RC는 통상적으로 탄화수소 기이거나, 에스터 잔기를 기준으로 감마 위치에 존재하거나 에스터 잔기로부터 더 멀리 떨어져 존재하는 탄소에서 치환기를 포함하는 탄화수소 기이다. 구체적으로, RC는 알킬 기, 특히 C1-C6 알킬 기, 보다 특히 메틸 기, 에틸 기, 1차 프로필 기, 2차 프로필 기, 1차 부틸 기, 2차 부틸 기 또는 3차 부틸 기일 수 있다.
상기 식에서, P, RA, RB 및 n은 상기 정의된 바와 같다.
(티오)에스터의 제조에서 사용되는 화학식 HO-X2-Z의 알코올 또는 화학식 HS-X2-Z의 티올은 활성화 알코올 또는 티올이다. 활성화 알코올 또는 티올은 (티오)에스터화 후 활성화된 C-말단 카복시 (티오)에스터 기, 즉 커플링 반응에 참여할 수 있는 카복시 (티오)에스터 기를 제공하는 알코올 또는 티올이다. 전술한 바와 같이, 알코올은 화학식 HO-X2-Z로 표시되고, 티올은 화학식 HS-X2-Z로 표시된다.
상기 식에서, X는 각각 독립적으로 할로겐 원자(F, Cl, Br 또는 I) 또는 수소 원자를 나타낸다. X가 할로겐 원자인 경우, X는 바람직하게는 F이다. 2개의 X가 모두 수소 원자인 본 발명의 방법에서 우수한 결과가 수득되었다.
통상적으로, Z는 전자 끌기 기를 나타낸다. 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, Z가 전자 끌기 기인 것이 커플링 반응 속도 면에서 유리하다고 생각된다.
Z는 헤테로원자를 포함하는 1개 이상의 치환기를 포함하는 sp2- 또는 sp3-혼성화된 탄소 원자를 나타낸다. N-말단 보호된 아미노산 또는 N-말단 보호된 펩티드의 C-말단 (티오)에스터 및 상기 알코올 또는 티올을 화학적으로 제조하는 것은 일반적으로 어렵거나 적어도 많은 노력을 필요로 한다. 따라서, 본 발명은 이러한 에스터의 제조를 위한 비교적 간단한 방법을 제공한다는 점에서 특히 유리하다.
특정 실시양태에서, Z는 헤테로원자를 포함하는 1개의 치환기를 포함하는 sp3-혼성화된 탄소로 구성된 군으로부터 선택되고, 이때 상기 헤테로원자는 sp3-혼성화된 탄소에 직접 결합된다.
바람직한 실시양태에서, Z는 헤테로원자를 포함하는 2 또는 3개의 치환기를 포함하는 sp3-혼성화된 탄소로 구성된 군으로부터 선택되고, 이때 상기 치환기 각각의 상기 헤테로원자는 sp3-혼성화된 탄소에 직접 결합되고, 상기 치환기가 특히 2 또는 3개의 할로겐 치환기, 바람직하게는 F 및 Cl로 구성된 군으로부터 선택된 2 또는 3개의 할로겐 치환기인 경우, 예를 들어, Z는 트라이플루오로메틸 기 또는 트라이클로로메틸 기를 나타낼 수 있다. 특히, 리파아제 및 프로테아제 둘다를 사용하는 방법에서 예를 들어, 2,2,2-트라이플루오로에틸 알코올(X=H, Z=CF3)을 사용한 경우 우수한 결과가 수득되었다. N-말단 보호된 아미노산 트라이플루오로에틸에스터 또는 N-말단 보호된 펩티드 C-말단 2,2,2-트라이플루오로에틸에스터를 N-말단 보호된 아미노산 또는 펩티드로부터 효소적으로 제조한 후 효소적 커플링 방법에서 사용할 수 있다는 점이 특히 놀랍고, 이것을 1-용기 공정에서 우수한 수율로 달성할 수 있다는 점이 훨씬 더 놀랍다.
추가 바람직한 실시양태에서, Z는 헤테로원자를 포함하는 1개 이상의 치환기를 포함하는 sp2-혼성화된 탄소로 구성된 군으로부터 선택되고, 이때 상기 헤테로원자는 sp2-혼성화된 탄소에 직접 결합된다. 특히, 상기 Z는 -(C=O)R1 또는 -(C=S)R1일 수 있다. R1은 특히, 아민 기, 예컨대, -NH2, NHCH3 또는 N(CH3)2, C-말단 보호된 또는 비보호된 알파-아미노산 또는 C-말단 보호된 또는 비보호된 펩티드, 바람직하게는 -NH2; -OH 또는 이의 염, 예컨대, 알칼리 또는 암모늄 염; 알킬 또는 아릴 기; 치환된 알킬 또는 아릴 기, 특히 1개 이상의 할로겐 치환기를 포함하는 치환된 알킬 또는 아릴 기; -OR2; 및 -SR2로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. R2 기는 통상적으로 탄화수소 또는 치환된 탄화수소, 특히 알킬, 치환된 알킬(예컨대, 1개 이상의 할로겐 치환기를 포함하는 알킬), 비치환된 아릴 기 또는 치환된 아릴 기(예컨대, 1개 이상의 할로겐 치환기를 포함하는 아릴)이다. R1 또는 R2에서 알킬 또는 치환된 알킬은 특히 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있고, 비치환된 또는 치환된 아릴 기는 특히 고리에서 5 내지 18개, 보다 특히 6 내지 12개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
특히, 리파아제 및 프로테아제 둘다를 사용하는 방법에서 예를 들어, 카바모일메틸 알코올(Z=-(C=O)NH2, 카바모일)을 사용한 경우 우수한 결과가 수득되었다. N-말단 보호된 아미노산 C-말단 카바모일메틸 에스터 또는 N-말단 보호된 펩티드 C-말단 카바모일메틸에스터를 N-말단 보호된 아미노산 또는 N-말단 보호된 펩티드로부터 효소적으로 제조한 후 효소적 커플링 방법에서 사용할 수 있다는 점이 특히 놀랍고, 이것을 1-용기 공정에서 우수한 수율로 달성할 수 있다는 점이 훨씬 더 놀랍다.
(티오)에스터와 커플링되는 C-말단 보호된 또는 비보호된 아미노산 또는 C-말단 보호된 또는 비보호된 펩티드는 원칙적으로 임의의 단백질생성 또는 비-단백질생성 아미노산, 또는 단백질생성 아미노산 및/또는 비-단백질생성 아미노산에 의거한 임의의 펩티드일 수 있다.
구체적으로, C-말단 보호된 또는 비보호된 아미노산 또는 펩티드는 하기 화학식 III으로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 III]
Figure pct00003
상기 식에서,
n, 및 RA 및 RB 각각은 상기 정의된 바와 같고;
Q는 아미드 기 또는 OR 잔기(하기 참조)를 나타낸다.
Q가 아미드 기를 나타내는 경우, 상기 아미드 기는 R1 및 R2가 각각 독립적으로 임의의 (치환된) 알킬 또는 (치환된) 아릴 기를 나타낼 수 있는 화학식 NR1R2로 표시될 수 있다. 구체적으로, R1 및 R2 중 하나는 수소 원자이고 나머지 하나는 (치환된) 알킬 기이다. 바람직하게는, R1 및 R2 둘다 수소 원자이다.
Q가 OR 잔기를 나타내는 경우, R은 C-말단 보호기 또는 양이온, 예를 들어, 1가 양이온, 예컨대, 삼치환된 또는 사치환된 암모늄 이온, 알킬리성 금속 양이온 또는 수소 원자를 나타낼 수 있다. R이 C-말단 보호기인 경우, R은 특히 치환된 또는 비치환된 알킬 기일 수 있다. R은 원칙적으로 당업자에게 공지된 임의의 다른 보호 에스터일 수도 있지만 바람직하게는 t-알킬 기일 수 있다. t-알킬 기는 원칙적으로 임의의 보호성 3차 알킬 기일 수 있다. 바람직하게는, t-알킬은 t-부틸 (2-메틸-2-프로필), t-펜틸 (2-메틸-2-부틸) 및 t-헥실 (2,3-다이메틸-2-부틸)로 구성된 군으로부터 선택된다. 특히, t-부틸을 사용한 경우 우수한 결과가 수득되었다. 통상적으로, 원치않는 부반응을 피하기 위해, Q는 아미드 기, 또는 R이 보호기인 OR 잔기를 나타내는 것이 바람직하다. 그러나, 적어도 일부 실시양태에서 상기 부반응은 달리 적절하게 피해질 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법에서 아미노산 또는 펩티드의 (티오)에스터화는 생성된 (티오)에스터와 또 다른 펩티드 또는 아미노산의 커플링과 마찬가지로 효소에 의해 촉진된다. 원칙적으로, 이 반응들 중 하나 또는 둘다를 촉진할 수 있는 효소로서 당분야에 공지되어 있는 임의의 효소가 사용될 수 있다. 특정 공급원으로부터 유래된 효소를 지칭하는 경우, 제1 유기체로부터 유래되되 사실상 (유전적으로 변경된) 제2 유기체에서 제조된 재조합 효소는 특히 상기 제1 유기체로부터 유래된 효소로서 포함되는 것을 의미한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 효소의 기원이 되는 유기체의 예로는 트라이코데르마(Trichoderma) 종, 예컨대, 트라이코데르마 리이세이(Trichoderma reesei); 리조퍼스(Rhizopus) 종, 예컨대, 리조퍼스 오리자(Rhizopus oryzae); 바실러스(Bacillus) 종, 예컨대, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실러스 렌터스(Bacillus lentus), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alkalophilus) 또는 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans); 아스퍼길러스(Aspergillus) 종, 예컨대, 아스퍼길러스 오리자(Aspergillus oryzae) 또는 아스퍼길러스 니게르(Aspergillus niger); 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 예컨대, 스트렙토마이세스 캐스피토서스(Streptomyces caespitosus) 또는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus); 칸디다 종; 진균; 후미콜라(Humicola) 종; 리족토니아(Rhizoctonia) 종; 사이토파기아(Cytophagia); 뮤코(Mucor) 종; 및 동물 조직, 특히 췌장, 예컨대, 돼지 췌장, 소 췌장 또는 양 췌장을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 천연 발생(야생형) 효소의 돌연변이체도 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 야생형 효소의 돌연변이체는 예를 들어, 당업자에게 공지된 돌연변이유발 기법(랜덤 돌연변이유발, 부위-지정 돌연변이유발, 지정된 진화, 유전자 셔플링 등)을 이용하여 야생형 효소를 코딩하는 DNA를 변경함으로써 상기 DNA가 1개 이상의 아미노산에서 야생형 효소와 상이한 효소를 코딩하거나 야생형 효소에 비해 짧은 효소를 코딩하게 하고 이로써 변경된 DNA를 적절한 (숙주) 세포에서 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 효소의 돌연변이체는 예를 들어, 기질 범위, 활성, 안정성, 유기 용매 내성, 온도 프로파일, 합성/가수분해 비 및 부반응 프로파일 중 하나 이상의 특징에서 개선된 성질을 나타낼 수 있다.
바람직한 방법에서, 리파아제 및/또는 프로테아제는 상기 반응들 중 하나 이상의 반응을 촉진하는 데 사용된다.
적절한 리파아제 또는 에스터라제는 EC 3.1 하에 분류될 수 있는 효소들로 구성된 군으로부터 선택된다. 특히, 카복실산 에스터 하이드롤라제(hydrolase)(E.C. 3.1.1) 또는 티올에스터 하이드롤라제(E.C. 3.1.2)를 사용할 수 있다. 바람직한 방법에서, 칸디다로부터 유래된 리파아제들로 구성된 군으로부터 선택된 리파아제가 사용된다. 우수한 결과, 특히 (티오)에스터화를 촉진하는 면에서 우수한 결과는 칸디다 안타크티카 리파아제, 특히 칸디다 안타크티카 리파아제 B를 사용하는 경우 수득된다.
적절한 프로테아제는 EC 3.4 하에 분류될 수 있는 효소들로 구성된 군으로부터 선택된다. 프로테아제는 2종의 서브클래스, 즉 펩티드의 말단 근처에서만 작용하는 엑소펩티다제 및 펩티드 내부에서 작용하는 엔도펩티다제로 더 분류될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 에스터 또는 티오에스터의 효소적 제조는 리파아제 또는 에스터라제에 의해 촉진되고, 효소적 커플링은 프로테아제에 의해 촉진된다.
펩티드의 N-말단에서 작용하는 엑소펩티다제는 단일 아미노산(아미노펩티다제 E.C. 3.4.11), 다이펩티드(다이펩티다제, E.C. 3.4.13) 또는 다이펩티드 및 트라이펩티드 둘다(다이펩티딜-펩티다제 또는 트라이펩티딜-펩티다제, E.C. 3.4.14)를 방출시킨다. 펩티드의 C-말단에서 작용하는 펩티다제는 카복시펩티다제로 지칭되고 단일 아미노산(카복시펩티다제, E.C. 3.4.16-18) 또는 다이펩티드(펩티딜-다이펩티다제, E.C. 3.4.15)를 방출시킨다. 카복시펩티다제는 그의 촉매 기작에 따라 예를 들어, 세린-타입 카복시펩티다제(E.C. 3.4.16), 메탈로카복시펩티다제(E.C. 3.4.17), 시스테인-타입 카복시펩티다제(E.C. 3.4.18), 또는 치환된 말단 아미노산, 고리화된 말단 아미노산 또는 이소펩티드 결합(측쇄를 수반하는 펩티드 결합)을 가진 말단 아미노산을 절단하는 오메가-펩티다제(E.C. 3.4.19)로 분류된다.
구체적으로, 엔도펩티다제, 특히 세린 엔도펩티다제(E.C. 3.4.21), 시스테인 엔도펩티다제(E.C. 3.4. 22), 아스파르트 엔도펩티다제(E.C. 3.4.23) 및 메탈로엔도펩티다제(E.C. 3.4.24)로 구성된 군으로부터 선택된 엔도펩티다제를 사용할 수 있다.
서브틸리신으로 구성된 군으로부터 선택된 세린 엔도펩티다제가 특히 적합하다. 이러한 효소는 커플링을 촉진하는 데 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.
다양한 서브틸리신이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,316,935호 및 이 특허에서 인용된 참고문헌 참조).
서브틸리신 A는 노보자임스(Novozymes; 덴마크 백스베르드 소재)으로부터 상업적으로 입수될 수 있는 서브틸리신이다.
리파아제, 예컨대, 칸디다 안타크티카 리파제와 함께 사용될 때 비교적 짧은 시간 이내에 우수한 수율로 펩티드를 합성한다는 점에서 특히 유리한 것으로 밝혀진 서브틸리신 칼스버그가 특히 바람직하다.
알칼라제(Alcalase)(등록상표)는 서브틸리신 칼스버그에 대한 적절한 공급원이다. 이 생성물은 노보자임스로부터 입수될 수 있다. 알칼라제(등록상표)는 저렴하고 바실러스 리체니포르미스에 의해 생성된 산업적으로 이용가능한 단백질분해 효소(서브틸리신 칼스버그를 주요 효소 성분으로서 함유함)이다.
상업적으로 입수될 수 있는 효소, 예컨대, 알칼라제(등록상표)는 액체, 특히 수성 액체로서 공급자에 의해 제공될 수 있다. 이 경우, 상기 효소는 바람직하게는 먼저 원치 않는 액체, 예를 들어, 과량의 물, 또는 원치 않는 부반응을 야기하는 알코올로부터 단리된다. 이것은 적절하게는 침전에 이어서 통상적으로 액체로부터의 고체의 분리 및/또는 건조에 의해 달성될 수 있다. 침전은 알코올, 예컨대, t-부탄올, 또는 본 발명의 방법에서 사용되는 알코올 또는 티올을 사용하여 달성할 수 있다. 또 다른 알코올 또는 티올이 사용되는 경우, 이 알코올 또는 티올이 (티오)에스터화 반응 또는 커플링 반응에 불리한 영향을 미치지 않도록 주의해야 한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 효소들 중 1종 이상의 효소는 고체 지지체 상에 고정된다. 적어도 일부 실시양태에서, 이것은 특히, (티오)에스터화의 촉매작용을 위한 효소 및 커플링의 촉매작용을 위한 상이한 효소 둘다가 사용되는 1-용기 공정에서 비교적 짧은 반응 시간 후 합성된 펩티드의 수율을 증가시킬 수 있다. 본원에서, (티오)에스터화를 촉진하기 위한 고정된 효소, 특히 리파아제의 경우 예컨대, 칸디다 안타크티카 리파아제 및 프로테아제, 예컨대, 서브틸리신 칼스버그를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 특히, 알칼라제가 글루타르알데하이드와의 축합에 의해 고정된 알칼라제 가교-결합된 효소 침전물(알칼라제-CLEA)을 사용하는 경우 우수한 결과가 수득된다.
특정 실시양태에서, 2종 이상의 상이한 효소, 즉 (티오)에스터의 제조를 촉진하는 1종 이상의 효소, 및 커플링을 촉진하는 1종 이상의 다른 효소가 사용되는데, 이때 상기 상이한 효소들은 동일한 지지체 상에 고정된다.
(티오)에스터화를 위한 알코올 및 경우에 따라 불활성 유기 용매, 예를 들어, 아세토니트릴, 탄화수소, 예컨대, 톨루엔, 또는 에테르, 예컨대, 메틸-t-부틸 에테르(MTBE)를 포함하는 혼합물 중에서 반응을 수행할 수 있다.
에스터화될 아미노산 또는 펩티드 면에서 과량으로 존재하는 (티오)에스터의 제조에 사용되는 티올 또는 알코올을 가질 필요는 없다는 것이 본 발명의 한 이점이다. 예를 들어, 상기 아미노산 또는 펩티드에 대한 상기 티올 또는 알코올의 몰비는 50:1 이하, 바람직하게는 25:1 이하, 특히 20:1 이하, 보다 특히 10:1 이하일 수 있다. 통상적으로, 상기 몰비는 1:1 이상이다. 바람직하게는, (티오)에스터화가 유리한 속도로 진행될 수 있게 하기 위해 상기 몰비는 3:1, 특히 5:1이다.
본 발명의 방법은 실질적으로 비-수성 조건 하에서 수행된다. 당업자가 이해할 바와 같이, 효소에 따라 효소가 원하는 촉매 활성을 적절히 발휘하기 위해서는 소량의 물이 필요할 수 있다. 우수한 촉매 활성을 위해, 미량의 물, 예를 들어, 액체 상(phase)을 기준으로 0.005중량% 이상의 물이 필요할 수 있다. 특히, 물 농도는 0.01중량% 이상 또는 0.03중량% 이상일 수 있다.
물 농도에 대한 원하는 상한은 사용되는 구체적인 효소, 알코올 또는 티올, 합성될 펩티드의 성질(예를 들어, 크기, 펩티드의 기초가 되는 아미노산), 원하는 최종 전환 및 원하는 반응 속도에 달려 있다.
반응 매질은 통상적으로 적어도 활성화 또는 (트랜스)에스터화의 개시 시점에서 반응 매질 중의 액체의 중량을 기준으로 2.0중량% 미만의 물을 함유한다. 반응 매질이 제2 액체 상에 분산될 수 있거나, 또 다른 액체 상이 반응 매질에 분산될 수 있다. 다중상(multiphase) 시스템의 경우, 특정된 물 함량은 상기 상 중의 액체의 중량을 기준으로 한 것이고, 이때 (트랜스)에스터화 또는 활성화 반응이 적어도 우세하게 일어난다.
특히, 물 농도는 적어도 (티오)에스터화의 개시 시점에서 1.0중량% 이하일 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 방법은 적어도 반응의 개시 시점에서 0.5중량% 이하의 물, 특히 0.2중량% 이하의 물, 보다 특히 0.1중량% 이하의 물을 함유하는 매질 중에서 수행될 수 있지만, 실질적인 원하는 효소 활성 및 낮은 또는 심지어 검출불가능한 원치 않는 가수분해를 여전히 보유한다. 사실상, 적어도 일부 실시양태에서, 특히 칸디다 안타크티카 리파아제 및/또는 서브틸리신 칼스버그가 사용되는 실시양태에서, 물 함량이 매우 낮은 반응 매질, 특히 물 함량이 0.5중량% 미만 또는 0.1중량% 미만인 반응 매질 중에서 수행된 방법이 1 내지 2.5중량%의 물을 포함하는 반응 매질 중에서 수행된 방법에 비해 개선된 펩티드 합성 속도를 보였다.
유리한 방법에서, 특히 (티오)에스터화 동안에 형성된 물은 연속적으로 또는 간헐적으로 제거될 수 있다. 원칙적으로, 상기 제거는 당분야에 공지된 방식으로 달성될 수 있다. 특히, 분자체를 사용하는 경우 우수한 결과가 수득된다. 또한, 증발, 예컨대, 진공 또는 증류를 이용한 공비 제거도 상기 제거에 매우 적합한다.
원칙적으로, (pH가 선택된 반응 매질에서 존재하는 한) 사용되는 pH는 효소가 충분한 활성을 보이는 pH가 선택된 한 매우 넓은 한계 내에서 선택될 수 있다. 이러한 pH는 사용되는 효소에 대해 통상적으로 공지되어 있고 수성 용액 중에서의 그의 공지된 가수분해 활성에 의거하여 선택될 수 있거나, 공지된 반응 조건 하에서 효소에 대해 공지된 기질을 사용하여 관용적으로 결정할 수 있다. 특히, 약 중성 pH가 되도록 pH를 선택할 수 있다. 원하는 경우, 효소에 따라 알칼리성 또는 산성 조건이 이용될 수 있다. 원하는 경우, pH는 산 및/또는 염기를 사용하여 조절할 수 있거나 산과 염기의 적절한 조합을 이용하여 완충할 수 있다. 적절한 산 및 염기는 특히, 반응 매질 중에서 가용성을 나타내는 산 및 염기, 예를 들어, 암모니아 및 알코올-가용성 산, 예컨대, 아세트산 및 포름산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
원칙적으로, 이용되는 온도는 사용되는 효소가 충분한 활성 및 안정성을 보이는 온도가 선택된 한 중요하지 않다. 이러한 온도는 사용될 효소에 대해 통상적으로 공지되어 있거나 공지된 반응 조건 하에서 효소에 대한 공지된 기질을 사용하여 관용적으로 결정할 수 있다. 일반적으로, 온도는 0℃ 이상, 특히 15℃ 이상 또는 25℃ 이상일 수 있다. 특히, 써모필릭(thermophilic) 유기체로부터 유래된 1종 이상이 효소가 사용되는 경우, 온도는 바람직하게는 40℃ 이상일 수 있다. 원하는 최대 온도는 효소에 달려 있다. 일반적으로, 이러한 최대 온도는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 상업적으로 입수될 수 있는 효소의 경우 제품 데이터 시트에 명시되어 있거나, 통상의 일반적인 지식 및 본원에 개시된 정보에 의거하여 관용적으로 결정할 수 있다. 온도는 통상적으로 70℃ 이하, 특히 60℃ 이하 또는 45℃ 이하이다. 그러나, 써모필릭 유기체로부터 유래된 1종 이상의 효소가 사용되는 경우 온도는 더 높을 수 있고, 예를 들어, 90℃ 이하일 수 있다.
특정 효소에 대한 최적 온도 조건은 당업자가 통상의 일반적인 지식 및 본원에 개시된 정보에 의거한 관용적인 실험을 통해 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들어, 서브틸리신, 특히 서브틸리신 칼스버그(예를 들어, 알칼라제(등록상표))의 경우 온도는 유리하게는 25 내지 60℃일 수 있다. 알칼라제(등록상표)와 Cal-B의 조합이 이용되는 경우, 온도는 유리하게는 30 내지 55℃일 수 있다.
추가로, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명에 따른 방법에 따른 다양한 실시양태 및/또는 바람직한 특징의 모든 가능한 조합에 관한 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시될 것이다.
[실시예]
달리 명시하지 않은 한, 화학물질은 상업적 공급원으로부터 입수하였고 추가 정제 없이 사용하였다. 1H NMR 스펙트럼은 브루커 아반스(Bruker Avance) 300 MHz NMR(300.1 MHz) 분광계 상에서 기록하였고, 화학적 변동은 달리 명시하지 않은 한 CDCl3(7.26 ppm)을 기준으로 한 ppm(δ)으로 표시된다.
박층 크로마토그래피(TLC)는 예비코팅된 실리카 겔 60 F254 플레이트(머크) 상에서 수행하였고, 점은 UV 광 또는 닌하이드린(ninhydrin)을 이용하여 가시화하였다.
3Å 분자체(8 내지 12 메쉬, 아크로스)는 200℃에서 감암 하에서 활성화하였고, t-부탄올(tBuOH)을 상기 분자체 상에 저장하였다. tBuOH는 사용 전에 액체(45℃)로 예열하였다.
컬럼 크로마토그래피는 머크 등급 9385 60 Å의 실리카 겔을 사용하여 수행하였다. 분석 HPLC는를 40℃에서 역상 컬럼(이너트실(Inertsil) ODS-3, C18, 5 ㎛, 150 x 4.6 mm)을 사용하여 HP1090 액체 크로마토그래프 상에서 수행하였다. UV 검출은 UV-VIS 204 선행 분광계를 이용하여 220 nm에서 수행하였다. 구배 프로그램은 다음과 같다: 5 내지 98% 용출제 A를 사용한 0 내지 25분 선형 구배 증가, 및 5% 용출제 B를 사용한 25.1 내지 30분의 선형 구배 증가(용출제 A: H2O 중의 메탄설폰산(MSA) 0.5 ㎖/ℓ; 용출제 B: 아세토니트릴 중의 MSA 0.5 ㎖/ℓ). 유속은 0 내지 25.1분 동안 1 ㎖/분, 25.2 내지 29.8분 동안 2 ㎖/분, 및 이어서 30분에서 중단될 까지 1 ㎖/분이었다. 주입 부피는 20 ㎕이었다.
알칼라제-CLEA는 CLEA-테크놀로지스로부터 구입하였고 3.5중량%의 물을 함유하였으며, 활성은 1 g 당 650 AGE 유니트이었다(1 AGE 유니트는 40℃ 및 pH 7.5에서 N-아세틸-글리신 에틸 에스터로부터 N-아세틸-글리신 1 μmol을 형성하는 것을 촉진함). 이 알칼라제-CLEA를 사용 전에 다음과 같이 처리하였다: 알칼라제-CLEA 1 g을 tBuOH 20 ㎖에 현탁하고 스패출라를 이용하여 분쇄하였다. 여과 후, 이 절차를 MTBE 20 ㎖를 사용하여 반복하였다.
Cal-B(노보자임스, 칸디다 안타크티카로부터 유래된 리파아제 노보자임-435, 배치 번호 LC200204)는 임의의 전처리 없이 사용하였다.
다이펩티드 기준 화합물은 다음과 같이 화학적으로 합성하였다: 아미노산 아미드 HCl 염 또는 아미노산 tBu-에스터 HCl 염 1.0 mmol을 CHCl3 10 ㎖와 EtOAc 30 ㎖(다이이소프로필에틸아민(DIPEA, 2.1 mmol, 2.1 당량) 355 ㎕를 함유함)의 혼합물에 용해시켰다. 이 용액을 CHCl3 20 ㎖ 중의 N-Cbz-보호된 아미노산(1 당량) 1 mmol, N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드.HCl(EDCl.HCl, 1.1 mmol, 1.1 당량) 207 mg 및 7-아자-N-하이드록시벤자트라이아졸(HOAt, 1.2 mmol, 1.2 당량)의 용액(0℃)에 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 용액을 진공 중에서 농축하고, 잔사를 EtOAc 25 ㎖에 재용해시키고, 수성 HCl(pH = 3) 20 ㎖(3회), 염수 20 ㎖, 포화 수성 NaHCO3(3회) 20 ㎖ 및 염수 20 ㎖로 세척하고, 건조하고(Na2SO4), 진공 중에서 농축하였다. 필요한 경우, EtOAc/n-헵탄 혼합물을 사용하는 추가 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 순수한 다이펩티드를 수득하였다.
N-Cbz-보호된 아미노산 메틸 에스터는 다음과 같이 합성하였다: MeOH 100 ㎖를 아세톤 중의 드라이아이스 배쓰를 이용하여 -80℃로 냉각시킨 후, SOCl2(5.5 mmol, 3.7 당량)를 적가하였다. 이어서, Cbz-보호된 아미노산 1.5 mmol을 첨가하고, 상기 배쓰를 제거한 후 혼합물을 주위 온도에서 5시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공 중에서 증발시키고, 잔사의 남은 휘발성 물질을 MeOH(3회)로 공증발시켰다. 생성된 잔사를 주위 온도에서 진공 중에서 밤새 건조하여 순수한 N-Cbz-보호된 아미노산 메틸 에스터를 수득하였다.
N-Cbz-보호된 아미노산 Cam 또는 Tfe 에스터의 화학적 합성은 다음과 같이 수행하였다: N-Cbz-보호된 아미노산 1 mmol을 EtOAc 30 ㎖와 카바모일메탄올(CamOH) 또는 2,2,2-트라이플루오로에탄올(TfeOH)(5 당량) 5 mmol의 혼합물에 용해시켰다. 이어서, EDCl.HCl(1.1 mmol, 1.1 당량) 207 mg, HOAt(1.2 mmol, 1.2 당량) 150 mg 및 트라이에틸아민(TEA, 1.1 mmol, 1.1 당량) 292 ㎕를 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 20시간 동안 교반하였다. 그 다음, EtOAc 20 ㎖를 첨가하고, 유기 혼합물을 수성 HCl(pH = 3) 50 ㎖(2회), 탈이온수 50 ㎖(2회) 및 염수 50 ㎖로 세척하고, 건조하고(Na2SO4), 진공 중에서 농축하고, 톨루엔 10 ㎖(2회)로 공증발시켰다. 필요한 경우, EtOAc/n-헵탄 혼합물을 사용하는 추가 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 순수한 에스터를 수득하였다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
실시예 1: 알칼라제-CLEA를 사용하는, Me, Cam 및 Tfe 에스터로부터의 다이펩티드의 효소적 합성
Figure pct00008
알칼라제-CLEA 300 mg을 MTBE 3 ㎖와 3Å 분자체 200 mg의 혼합물에 첨가하였다. 이어서, N-Cbz-보호된 아미노산 에스터 100 mg 및 C-말단 보호된 아미노산 1.0 당량을 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 진탕하였다. 여과 후, 고체를 EtOAc 10 ㎖(3회)로 세척하였다. 모은 유기층을 포화된 NaHCO3 수용액 25 ㎖(3회), HCl 수용액(pH = 3) 25 ㎖(3회) 및 염수 25 ㎖로 세척하고, 건조하고(Na2SO4), 진공 중에서 농축하고, 톨루엔 20 ㎖(2회) 및 CHCl3 20 ㎖(2회)로 공증발시켰다. 필요한 경우, EtOAc/n-헵탄 혼합물을 사용하는 추가 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 순수한 다이펩티드를 수득하였다. 모든 수득된 다이펩티드의 HPLC 보유 시간 및 1H NMR 스펙트럼은 기준 화합물의 HPLC 보유 시간 및 1H NMR 스펙트럼에 완전히 상응하였다. 수득된 수율은 하기 표에 기재되어 있다.
Figure pct00009
실시예 2: Cam 및 Tfe 에스터의 효소적 합성
Figure pct00010
후술되는 바와 같이 프로토콜 1, 2 및 3 중 하나를 이용하여 여러 Cam 및 Tfe 에스터를 합성하였다.
프로토콜 1: 알칼라제-CLEA를 사용하는 Cam 또는 Tfe 에스터의 합성
알칼라제-CLEA 300 mg을 MTBE 3 ㎖, 3Å 분자체 200 mg, 카바모일메탄올 또는 2,2,2-트라이플루오로에탄올 200 mg 및 N-Cbz-보호된 아미노산 50 mg의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 150 rpm으로 72시간 동안 진탕하였다. 여과 후, 고체를 EtOAc 10 ㎖(3회)로 세척하였다. 모은 유기층을 탈이온수 25 ㎖(3회), HCl 수용액(pH = 3) 25 ㎖(3회) 및 염수 25 ㎖로 세척하고, 건조하고(Na2SO4), 진공 중에서 농축하고, 톨루엔 20 ㎖(2회) 및 CHCl3 20 ㎖(2회)로 공증발시켰다.
프로토콜 2: Cal-B를 사용하는 Cam 또는 Tfe 에스터의 합성
Cal-B 100 mg을 아세토니트릴 3 ㎖, 3Å 분자체 100 mg, 카바모일메탄올 또는 2,2,2-트라이플루오로에탄올 200 mg 및 N-Cbz-보호된 아미노산 50 mg의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 진탕하였다. 여과 후, 고체를 EtOAc 10 ㎖(3회)로 세척하였다. 모은 유기층을 탈이온수 25 ㎖(3회), HCl 수용액(pH = 3) 25 ㎖(3회) 및 염수 25 ㎖로 세척하고, 건조하고(Na2SO4), 진공 중에서 농축하고, 톨루엔 20 ㎖(2회) 및 CHCl3 20 ㎖(2회)로 공증발시켰다. 필요한 경우, EtOAc/n-헵탄 혼합물을 사용하는 추가 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 순수한 에스터를 수득하였다.
Figure pct00011
프로토콜 3: Cal-B를 사용하는 Tfe 에스터의 합성
Cal-B 100 mg을 MBTE 3 ㎖, 3Å 분자체 100 mg, 2,2,2-트라이플루오로에탄올 200 mg 및 N-Cbz-보호된 아미노산 50 mg의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 150 rpm으로 54시간 동안 진탕하였다. 여과 후, 고체를 EtOAc 10 ㎖(3회)로 세척하였다. 상응하는 Tfe 에스터로의 전환은 HPLC 분석으로 측정하였다.
Figure pct00012
실시예 3: Cam 또는 Tfe 알코올을 첨가제로서 사용하는 다이펩티드의 효소적 합성
Figure pct00013
여러 다이펩티드를 후술하는 바와 같이 프로토콜 1 내지 3 중 하나를 이용하여 합성하였다.
프로토콜 1: 알칼라제-CLEA와 함께 Cam 또는 Tfe 알코올을 첨가제로서 사용하는 다이펩티드의 합성
알칼라제-CLEA 300 mg을 MBTE 3 ㎖, 3Å 분자체 200 mg 및 적절한 알코올 200 mg의 혼합물에 첨가하였다. 이어서, N-Cbz-보호된 아미노산 50 mg 및 아미노산 아미드 1 당량을 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 진탕하였다.
프로토콜 2: Cal-B와 함께 Cam 또는 Tfe 알코올을 첨가제로서 사용하는 다이펩티드의 합성
Cal-B 100 mg을 아세토니트릴 3 ㎖, 3Å 분자체 200 mg 및 적절한 알코올 200 mg의 혼합물에 첨가하였다. 이어서, N-Cbz-보호된 아미노산 50 mg 및 아미노산 아미드 1 당량을 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 진탕하였다.
프로토콜 3: 알칼라제-CLEA 및 Cal-B와 함께 Cam 또는 Tfe 알코올을 첨가제로서 사용하는 다이펩티드의 합성
알칼라제-CLEA 300 mg 및 Cal-B 100 mg을 아세토니트릴 3 ㎖, 3Å 분자체 200 mg 및 적절한 알코올 200 mg의 혼합물에 첨가하였다. 이어서, N-Cbz-보호된 아미노산 50 mg 및 아미노산 아미드 1 당량을 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 진탕하였다. 여과 후, 효소를 EtOAc 10 ㎖(3회)로 세척하였다. 모은 유기층을 탈이온수 25 ㎖(3회), HCl 수용액(pH = 3) 25 ㎖(3회) 및 염수 25 ㎖로 세척하고, 건조하고(Na2SO4), 진공 중에서 농축하고, 톨루엔 20 ㎖(2회) 및 CHCl3 20 ㎖(2회)로 공증발시켰다.
Figure pct00014
실시예 4: Cal -B를 사용하는 다이펩티드 및 트라이펩티드의 Tfe 에스터의 효소적 합성
Cal-B 100 mg을 메틸 t-부틸 에테르 3 ㎖, 3Å 분자체 100 mg, 2,2,2-트라이플루오로에탄올 200 mg 및 N-Cbz-보호된 다이펩티드 또는 트라이펩티드 50 mg의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 150 rpm으로 진탕하였다. 상응하는 C-말단 Tfe 에스터로의 전환은 HPLC 분석으로 모니터링하였다. 모든 경우, 출발 화합물은 상응하는 C-말단 Tfe 에스터만으로 전환되었다. 출발 화합물 및 Tfe 에스터 생성물(P)의 HPLC 보유 시간은 하기 표에 기재되어 있다.
1일, 2일, 3일 및/또는 7일 후 반응 혼합물로부터 샘플을 취하였다. 하기 표에 기재된 % Tfe 에스터 생성물(% P) 값은 하기 수학식 1로 계산하였다:
Figure pct00015
[수학식 1]
% P = 면적% Tfe 에스터 생성물/(면적% 출발 화합물 + 면적% Tfe 에스터 생성물)
Figure pct00016
Cbz-Ala-Ala-OTfe로의 Cbz-Ala-Ala의 에스터화의 반응 혼합물은 다음과 같이 마무리 처리하였다. 7일 후 수득된 반응 혼합물을 여과하고 고체를 EtOAc 10 ㎖(3회)로 세척하였다. 모든 유기층을 탈이온수 25 ㎖(3회), HCl 수용액(pH = 3) 25 ㎖(3회) 및 염수 25 ㎖로 세척하고, 건조하고(Na2SO4), 진공 중에서 농축하였다. 생성된 잔사 중의 휘발성 물질은 톨루엔 20 ㎖(2회) 및 CHCl3 20 ㎖(2회)로 공증발시켜 제거하였다. 생성물의 크로마토그래피 정제는 85% 수율로 순수한 Cbz-Ala-Ala-OTfe를 제공하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 1.32 (d, J = 7.4 Hz, 3 H, CH3), 1.37 (d, J = 7.3 Hz, 3 H, CH3), 4.13-4.24 (m, 1 H, CαH), 4.29-4.40 (m, 1 H, CαH), 4.49-4.61 (m, 2 H, OCH2CF3), 5.05 (s, 2 H, CH2OCO), 5.18 (bs, 1 H, NH), 6.41 (bs, 1 H, NH), 7.28 (m, 5 H, CArH);
13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ = 16.7, 16.8, 46.9, 49.4, 60.0, 66.1, 119.8, 123.5, 127.1, 127.3, 127.6, 138.3, 170.2, 170.9.

Claims (15)

  1. (i) N-말단 보호된 아미노산, N-말단 보호된 아미노산 C-말단 에스터, N-말단 보호된 펩티드 또는 N-말단 보호된 펩티드 C-말단 에스터, 및 (ii) 하기 화학식 1로 표시되는 알코올 또는 하기 화학식 2로 표시되는 티올로부터 에스터 또는 티오에스터를 효소적으로 제조하는 단계를 포함하는, 펩티드의 효소적 합성 방법으로서, 상기 에스터 또는 티오에스터의 제조가 반응 매질 중의 액체의 중량을 기준으로 2중량% 이하의 물을 포함하는 반응 매질 중에서 수행되고, 제조된 에스터 또는 티오에스터를 C-말단 보호된 또는 비보호된 아미노산 또는 C-말단 보호된 또는 비보호된 펩티드와 효소적으로 커플링시킴으로써 반응 매질의 총 중량을 기준으로 2중량% 이하의 물을 포함하는 반응 매질에서 펩티드를 합성하는, 펩티드의 효소적 합성 방법:
    화학식 1
    HO-CX2-Z
    화학식 2
    HS-CX2-Z
    상기 식에서,
    X는 각각 독립적으로 할로겐 원자 또는 수소 원자를 나타내고;
    Z는 sp3-혼성화된 탄소에 직접 부착된 헤테로원자를 포함하는 2개 이상의 치환기를 포함하는 sp3-혼성화된 탄소, 및 sp2-혼성화된 탄소에 직접 부착된 헤테로원자를 포함하는 1 또는 2개의 치환기를 포함하는 sp2-혼성화된 탄소로 구성된 군으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서,
    커플링이 에스터 또는 티오에스터의 제조를 촉진하는 데 사용되는 효소의 존재 하에서 수행되는, 펩티드의 효소적 합성 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    에스터 또는 티오에스터의 제조 및 커플링이 라파아제(lipase), 에스터라제(esterase) 및 프로테아제(protease)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소에 의해 촉진되는, 펩티드의 효소적 합성 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    프로테아제, 및 리파제 및 에스터라제로 구성된 군으로부터 선택된 효소가 사용되고, 이 효소들 중 1종 이상의 효소가 에스터 또는 티오에스터의 제조를 촉진하고 나머지 효소들 중 1종 이상의 효소가 커플링을 촉진하는, 펩티드의 효소적 합성 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    에스터 또는 티오에스터의 제조 및 커플링이 리파아제, 에스터라제 및 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택된 단일 효소에 의해 촉진되는, 펩티드의 효소적 합성 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    리파아제가 칸디다(Candida), 바람직하게는 칸디다 안타크티카(Candida antarctica)로부터 유래된 리파아제로 구성된 군으로부터 선택된 리파아제, 특히 칸디다 안타크티카 리파아제 B가 사용되는, 펩티드의 효소적 합성 방법.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    프로테아제가 세린-타입 카복시펩티다제(carboxypeptidase), 메탈로카복시펩티다제(metallocarboxypeptidase), 시스테인-타입 카복시펩티다제, 세린 엔도펩티다제(endopeptidase), 시스테인 엔도펩티다제, 아스파르트 엔도펩티다제 및 메탈로엔도펩티다제(metalloendopeptidase)로 구성된 군으로부터 선택되는, 펩티드의 효소적 합성 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    프로테아제가 서브틸리신(subtilisin), 바람직하게는 서브틸리신 칼스버그(subtilisin Carlsberg)로 구성된 군으로부터 선택된 세린 엔도펩티다제인, 펩티드의 효소적 합성 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    1종 이상의 고정된 효소가 사용되는, 펩티드의 효소적 합성 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    에스터의 제조 및 커플링이 1.0중량% 이하의 물, 특히 0.5중량% 이하의 물, 보다 특히 0.1중량% 이하의 물을 포함하는 반응 매질 중에서 수행되는, 펩티드의 효소적 합성 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    Z가 카바모일 기, 트라이플루오로메틸 기 또는 트라이클로로메틸 기인, 펩티드의 효소적 합성 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    2개의 X 모두가 수소 원자를 나타내는, 펩티드의 효소적 합성 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    에스터 또는 티오에스터의 제조가 제조된 에스터 또는 티오에스터와 커플링되는 C-말단 보호된 또는 비보호된 아미노산 또는 C-말단 보호된 또는 비보호된 펩티드의 존재 및 커플링 반응을 촉진하는 효소의 존재 하에서 수행되는, 펩티드의 효소적 합성 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    C-말단 보호된 또는 비보호된 아미노산 또는 C-말단 보호된 또는 비보호된 펩티드가 에스터 또는 티오에스터의 제조 후 첨가되는, 펩티드의 효소적 합성 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    커플링이 제조된 에스터 또는 티오에스터를 반응 매질로부터 먼저 단리하지 않으면서 수행되는, 펩티드의 효소적 합성 방법.
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