CN104284901A - 使用有机溶剂中的枯草杆菌蛋白酶的侧链被保护的寡肽片段缩合 - Google Patents

使用有机溶剂中的枯草杆菌蛋白酶的侧链被保护的寡肽片段缩合 Download PDF

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Abstract

酶促合成寡肽的方法，包括将(任选地N被保护的)被保护的寡肽酯与(任选地C被保护的)被保护的寡肽亲核剂在含有0.1体积％以下的水含量的有机溶剂或有机溶剂混合物中通过以任何可能的形式的枯草杆菌蛋白酶偶联。

Description

使用有机溶剂中的枯草杆菌蛋白酶的侧链被保护的寡肽片段缩合
本发明涉及酶促合成寡肽的方法。
肽类(尤其是寡肽)具有许多应用，例如作为药物、食品或饲料成分、农用化学品或化妆品成分。
已知寡肽可以在溶液中或者通过高度优化的流程而在固相中化学合成。然而，在化学肽合成、尤其是大规模的化学肽合成中仍然存在一些局限性。例如，大于10-15个氨基酸的肽难以在固相上合成，因为它们有形成三级结构(通过所谓的“疏水塌缩”)的倾向，所述三级结构使得肽延伸非常困难，以使得需要大量过量的试剂和氨基酸构建模块。此外，由于存在大量的相似长度的肽，终产品的纯化通常是成本低效的。因此，多于10个氨基酸的肽通常通过被保护的寡肽片段的固相合成的联合来合成，在所述被保护的寡肽片段的固相合成之后，在溶液中进行化学缩合，例如10+10缩合来制备20个氨基酸的肽。被化学保护的寡肽片段缩合的主要弊端是，除了使用C末端Gly或Pro残基的情况之外，在C末端氨基酸残基的活化中发生外消旋作用。因此，化学保护的寡肽片段缩合策略被限制于使用C末端活化的Gly和Pro残基，或者由于所不期望的非对映异构体的形成而不得不处理非常困难的纯化。相比之下，酶催化的寡肽偶联完全避免了外消旋作用，并相比于化学肽合成具有一些其他的优点。对于工业应用，基于动力学方法的酶促肽类合成概念(即使用活化的羧基组分)是最吸引人的(例如参见Sewald和H.D.Jakubke在“肽类：化学和生物学”，1st翻版，Wiley-VCH Verlag GmbH出版，魏因海姆2002)。
化学-酶促肽合成可能需要侧链未被保护的寡肽片段的酶促偶联，所述寡肽片段已各自被使用化学合成法、发酵法或通过化学和酶促偶联步骤的结合来合成。已经公开了一些关于侧链完全未被保护的寡肽在水环境下的酶促缩合(Kumaranet al.Protein Science,2000,9,734；et al.Bioorg.Med.Chem.1998,6,891；Homandberg et al.Biochemistry,1981,21,3387；Komoriya et al.Int.J.Pep.Prot.Res.1980,16,433)。然而，在水体系下的这种酶促寡肽片段缩合的主要弊端在于，同时发生寡肽酰胺键和C末端酯的水解，导致低产量和许多副产物。为了降低昂贵的寡肽起始原料和肽类产物的水解的量，通常使用大量过量的寡肽亲核剂(5-10当量)来增加缩合速率，并因此减少水解副反应，从经济角度上看这是一种非常不具吸引力的策略。为了进一步降低水解的量，已经在低水反应混合物中使用有机助溶剂来实施酶促完全未被保护的寡肽片段的缩合，显示了较高的产品收率和较少的水解副反应(Slomczynska et al.Biopolymers,1992,32,1461；Xaus et al.Biotechnol.Tech.1992,6,69；Nishino et al.Tet.Lett.1992,33,3137；Clápes et al.Bioorg.Med.Chem.1995,3,245,Kolobanova et al.Russian J.of Bioorg.Chemistry2000,26,6,369)。因为在这些报道中，需要大量的水用于酶的活性(1-5体积％的水)，所以水解副反应仍然没有被完全消除。为了几乎消除酶促水解副反应，可以使用近乎无水的反应混合物(少于1体积％的水)。然而，在这些条件下，只有非常少的酶是有活性和稳定的(G.Carrea,S.Riva,Fundamentals ofBiocatalysis in Neat Organic Solvents,Whiley,2008)，并且在这些有机溶剂中，含有未被保护的侧链官能团的寡肽通常展示出非常小的溶解性或者不溶解。一些报道公开了二肽和三肽在无水有机溶剂中的酶促合成(例如Chen et al.J.Org.Chem.1992,57,6960)，但是没有实施寡肽片段的缩合。尽管近乎无水的溶剂几乎消除水解副反应，但是通常来说许多酶活性丧失，并且因此寡肽偶联反应趋向于非常慢，并且不完全。
如从液相化学肽合成中所获知的，被保护的寡肽由于其疏水性而易溶于几种未掺水的有机溶剂中。因此，使用被保护的寡肽可以实施在无水有机溶剂中的酶促寡肽片段缩合。然而，可以预期的是多个空间上需要疏水保护的侧链保护基团阻碍酶识别。例如，Yan et al.Tetrahedron,2005,61,5933报道了使用蛋白酶枯草杆菌蛋白酶A，用侧链被保护的氨基酸完全得不到缩合产物。根据他们的观察，枯草杆菌蛋白酶A排除在其侧链官能团上承载大体积的保护基的氨基酸残基；然而，当这些大体积的保护基被除去时，氨基酸残基容易被接受。
Gill等人(J.Am.Chem.Soc 1995,117,6175-6181)也描述了一种用于寡肽的酶促合成的方法。然而，如Gill等人所述的合成需要特定的酶用于每次个别添加氨基酸来合成片段，并且还需要另外的酶用于两个片段的偶联。不同的酶必须用于两个片段的组合，并且另一种酶用于两个片段的缩合的事实使得该方法不适用于工业规模的应用。此外，如Gill等人所描述的片段缩合步骤需要移除其中一个片段的两个侧链烯丙基保护基，以使得V8蛋白酶的使用能够实现偶联。因此，如Gill等人所描述的方法不是一种用于制备包含8个或更多个氨基酸残基的寡肽的通用方法。
因此，仍然存在对用于合成包含至少8个氨基酸残基的肽而不存在或者很少存在水解副反应的简单通用的酶促方法的需求。这样的酶促法目前已经出乎意料地被发现了。
在本发明的框架中，将一种寡聚肽酯i)限定为包含4个或更多氨基酸残基的寡聚肽酯，
-包含至少两个氨基酸残基，每个氨基酸残基带有被保护基保护的侧链官能团，并且包含活化的C-末端酯，其由C(＝O)-O-CX2-C(＝O)N-R1R2的化学式表示，其中，每个X独立地代表氢原子或烷基或芳基，R1代表氢原子或烷基或芳基，R2代表氢原子或烷基或芳基或带有C末端羧基酰胺或羧酸官能团的氨基酸残基或肽残基，所述氨基酸残基或肽残基任选地在氨基酸残基的侧链官能团或在肽残基的一个或多个侧链官能团上被保护，
-并且，其中寡肽酯任选地包含N末端保护。
将如用于本发明的方法的寡肽亲核剂ii)限定为包含4个或更多氨基酸残基的寡肽亲核剂，
-包含N末端胺基，和至少两个氨基酸残基，每个氨基酸残基带有被保护基保护的侧链官能团，并且
-其中，所述寡肽亲核剂任选地包含C末端保护。
本发明的方法是一种用于酶促合成寡肽的方法，所述方法包括将如上所限定的4个或更多氨基酸残基的寡肽酯i)与包含如上所限定的包含4个或更多氨基酸残基的寡肽亲核剂ii)偶联，所述偶联在包含相对于偶联反应显著地发生于其中的液体总量的0.1体积％以下的水的有机溶剂或有机溶剂混合物中，在枯草杆菌蛋白酶的存在下进行，其中，除去在偶联反应过程中由所述酶释放的水。
出于本发明的目的，在溶剂混合物中的水的百分比是通过正如在实验部分中所描述的来进行的由Karl Fischer滴定法来测定的水的百分比。
如以上i)所述的寡肽酯在本文中也可被称为“酰基供体”，而寡肽亲核剂ii)通常也被称为“亲核剂”。
采用本发明的方法，已发现可能酶促地缩合被保护的寡肽片段。尤其是，已出乎意料地发现了，带有多个侧链保护基团的寡肽酰基供体(即如上所述的寡肽酯)被酶接受为底物。进一步地，发生被保护的寡肽缩合，而没有明显的副反应。采用根据本发明所述的方法，可获得大于80％的产率，该百分比通过将已经转化成所需的产物的酰基供体的摩尔数除以剩余的酰基供体、所需产物和水解产物的总摩尔数，再乘以100％来计算。优选地，获得大于90％的产率，最优选大于95％的产率。
出乎意料地，可获得大于80％的产率，即便是在使用过量非常少或者不过量的偶联搭档i)或ii)中的一种。这与在水中或含水量少的溶液中的酶促肽合成形成对比，其需要非常大量过量的亲核剂来获得大于80％的产率，通常是5-10当量。
本发明的方法的优势在于，其提供了区别在于参与偶联反应的末端氨基酸残基、包括非蛋白氨基酸(Non-proteinogenic amino acid)的多种被保护的寡肽的偶联。不管哪个蛋白或非蛋白氨基酸被用在C末端酯的C末端残基，都不会发生该残基的外消旋作用，然而，在被化学保护的片段缩合的情况下，通常发生外消旋作用，除非Gly或Pro被用于该位点，因此，根据本发明的方法在片段缩合策略上提供了明显更多的自由。
进一步地，本发明的方法的优势在于，被保护的寡肽C末端酯的酯部分的水解程度低，即在为完成偶联的典型的时间框架内是低的，至少在一些实验中，没有观察到可检测到的酯的水解。出于本发明的目的，“低”被限定为少于5％的酰基供体，在根据本发明的方法中，通常是远小于5％的酰基供体被水解。被保护的寡肽片段的酰胺键的水解程度，或者酶促制备的肽产品的水解程度也是低的，至少在一些实验中没有观测到可检测的水解。
出于本发明的目的，“寡肽”是指基于2-200个氨基酸的肽，尤其是基于2-100个氨基酸的肽，还尤其是基于2-50个氨基酸的肽，优选任何2-200个氨基酸的直链的肽、更优选的2-100或2-50个氨基酸的直链的肽，其将被用于根据本发明的方法。出于本发明的目的，“肽”是指基于8个或更多氨基酸的任何氨基酸链，该肽是根据本发明所述的方法的产物。
出于本发明的目的，“被保护的寡肽”是指包含至少4个氨基酸残基的链的任何寡肽，其中至少两个氨基酸残基具有侧链官能团，并且其中至少两个氨基酸侧链官能团分别被保护基保护。侧链官能团例如为羟基、羧酸、伯胺或仲胺(包括吲哚和胍基)、硫醇或羧基酰胺基官能团。优选大于60％、更优选大于70％并更加优选大于80％的存在的所有侧链官能团被保护。
出于本发明的目的，“未被保护的寡肽”是指具有少于两个其侧链官能团被保护的氨基酸残基的任何寡肽。
在本发明的内容中，“氨基酸侧链”是指任何蛋白氨基酸侧链或非蛋白氨基酸侧链。
蛋白氨基酸是通过遗传密码来编码的氨基酸。蛋白氨基酸包括：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(ASP)，谷氨酸(Glu)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe)。
非蛋白氨基酸可以特别选自于D-氨基酸、苯基甘氨酸、DOPA(3,4-二羟基-L-苯丙氨酸)、β-氨基酸、4-氟-苯丙氨酸或Cα-烷基化的氨基酸。
出于本发明的目的，缩合是指两个寡肽之间的新的肽键的形成。
在本发明的框架中，氨基酸残基或肽残基是指减去了该氨基酸或肽的N末端氨基的氨基酸或肽。
在此所用的术语“C末端保护”是表示提供带有保护基团的C末端羧基官能团，通常实质上保护羧基以免被偶联至另一个分子的胺基。C末端保护基团可以是C末端酯，以此使得C末端羧基至少基本上被保护而免于在所使用的肽合成条件下被偶联至胺上。t-烷基是常用的保护基团。C末端保护基团也可以是C末端羧基酰胺。伯羧基酰胺是常用的保护基。C末端保护基也可以是酰肼、氨基甲酰酰肼或硫酯。C末端保护可以是暂时的或永久的，后者是指该保护部分是所需的终产品的部分。
本文中所用的术语“N末端保护”表示提供带有保护基团的N末端胺基，通常至少实质上保护N末端胺基，以免参与C末端羧基与N末端胺基的偶联。
在用于被保护的寡肽的酶促缩合的被保护的寡肽C末端酯i)中的酯–C(＝O)O-CX2-C(＝O)N-R1R2部分是活化的酯。活化的酯是提供能够参与偶联反应的羧基酯的酯。
在此，每个X独立地表示氢原子或烷基或芳基。在本发明的方法中，当其中每个X为氢(-O-CH2-C(＝O)N-，称为Cam酯)时，获得了特别好的效果。
在所述的酯部分中，R1表示氢原子或烷基或芳基，R2表示氢原子或烷基或芳基，或带有C末端羧酰胺或羧酸官能团的氨基酸残基或肽残基，所述氨基酸残基或肽残基任选地在氨基酸残基的侧链官能团或在肽残基的一个或多个侧链官能团上被保护。
在本文中，使用词汇“烷基”或“芳基”之处，使用以下定义：每个烷基可独立地表示(取代或未取代的)C1-C7烷基，优选(取代或未取代的)直链C1-C6烷基，更优选(取代或未取代的)直链C1-C3烷基，并最优选甲基。
每个芳基可独立地表示(取代或未取代的)C4-C13芳基，优选(取代或未取代的)C4-C6芳基，更优选(取代或未取代的)C6芳基，并最优选苯基。芳基可任选地在其环上包含一个或多个杂原子。杂原子可以尤其选自S、O和N的组。烷基或芳基上的取代基可以是不会阻止寡肽酯i)和寡肽亲核剂ii)之间发生偶联反应的任何原子或原子的基团。本领域技术人员可以容易地检验哪个取代基是适用于或不能用于根据本发明所述的方法的。
在本发明的方法中，其中R1和R2两者都表示氢原子或R1表示氢原子而R2表示带有C末端羧基酰胺或羧酸官能团的氨基酸残基或肽残基，所述氨基酸残基或肽残基任选地在氨基酸残基的侧链官能团上或在肽残基的一个或多个侧链官能团上被保护时，获得特别好的效果。
在另一个实施方案中，被保护的寡肽酯的活化的C末端酯基可以以高产率和高纯度并且不发生外消旋作用地引入固相中。使用酯的另一个优点是，它们的活化的C末端酯基可以引入廉价并工业上可获得的2-氯三苯甲基树脂上，其中在所述酯中，R1表示氢原子而R2表示带有C末端羧酸官能团的氨基酸残基或肽残基，所述氨基酸残基或肽残基任选地在氨基酸残基的侧链官能团上或在肽残基的一个或多个侧链官能团上被保护。
被保护的寡肽酯i)的C末端氨基酸理论上可以是任何氨基酸(蛋白氨基酸或非蛋白氨基酸)，并且寡肽酯可以由蛋白氨基酸和/或非蛋白氨基酸构成。
特别是(任选地N末端被保护)活化的酯i)可以通过结构式I的化合物来表示。
在此，P代表氢或N末端保护基团。合适的N末端保护基是那些可以用于合成(寡)肽的N端保护基团。这些基团是本领域的技术人员所公知的。合适的N端保护基团的例子包括氨基甲酸酯或酰基型保护基，例如“Cbz”(苄氧羰基)、“Boc”(叔丁氧羰基)，“For”(甲酰基)，“Fmoc”(9-芴甲氧羰基)，“PhAc”(苯乙酰基)和“Ac”(乙酰基)。For、PhAc和Ac基团可以分别使用酶肽脱甲酰基酶、PenG酰基转移酶或酰基转移酶酶来引入和切除。化学切除方法在本领域中是公知的。
在结构式I中，n表示至少为4的整数。N尤其可以至少为5、至少为6、至少为7、至少为8、至少为9、至少为10。n尤其可以是100或以下、75或以下、50或以下、25或以下、20或以下、15或以下，例如10或以下。
在式I中，每个RA和每个RB各自独立地表示氢原子或有机基团，优选氨基酸侧链。因此，RA无需在所有的n个氨基酸单元中都相同。类似地，RB不需要在所有的n个氨基酸单元中都相同。在根据式I的寡肽酯中，至少两个氨基酸残基各自包含带有保护基的侧链，即对于这些氨基酸残基，RA和RB不是H，并且各自带有被保护的官能团，例如被保护的羟基、羧酸、伯胺或仲胺(包括例如吲哚和胍基)、巯基或伯酰胺官能团，即带有被保护的侧链官能团。优选地，在RA和RB中存在的官能团的总共至少50％应该被本领域中公知的保护基团保护。许多不同的保护基是已知的，并且可以用在根据本发明的方法中。如果使用基于固相肽合成的Fmoc，那么侧链保护基可以选自例如t-Bu(叔丁基)、Boc、Trt(三苯甲基)、Mtt(4-甲基三苯甲基)、Acm(乙酰氨甲基)、Dnp(2,4-二硝基苯基)、Pmc(2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基)或Pbf(2,2,4,6,7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基)基团。如果使用基于固相肽合成的Boc，那么侧链保护基可以选自例如可以选自Bzl(苄基)、Bz(苯甲酰)、2Cl-Z(2-氯苯甲氧羰基)、cHex(环己基)、Tos(甲苯磺酰基)、Xan(呫吨基)、For或Mbzl(4-甲氧基苄基)和3-苄氧基甲基基团。
在一个优选的实施方案中，寡肽酯i)的所有侧链官能团被保护，除了寡肽酰基供体的C末端氨基酸残基的侧链官能团，即活化的C末端酯。该实施方案的优点是，比其中寡肽酰基供体i)的C末端氨基酸残基的侧链官能团被保护的实施方案获得更高的产率和/或更短的反应时间。
将与活化的酯i)偶联的(任选地，C末端被保护的)被保护的寡肽亲核剂ii)理论上可以是基于蛋白氨基酸或非蛋白氨基酸的任何肽。
特别地，(任选地，C末端被保护的)被保护的寡肽亲核剂ii)可以用通式II的化合物来表示：
其中，n、RA和RB如上所定义。根据通式II的寡肽亲核剂中的至少两个氨基酸残基各自包含带有保护基的侧链，即对于每一个这些氨基酸残基，RA和RB不是H，并且各自具有被保护的官能基团，例如被保护的羟基、羧酸、伯胺或仲胺(包括例如吲哚和胍基)、巯基或伯酰胺官能团，即带有被保护的侧链官能团。优选地，在RA和RB中出现的官能基团的总共至少50％应该被本领域中公知的保护基保护。
在此，Q表示OR部分、胺基、联氨基、氨基甲酰-联氨基或SR基团。
当Q表示OR部分时，R可以表示C末端保护性基团、氢原子或阳离子，例如单价阳离子，例如三取代或四取代的铵离子或者碱金属阳离子。当R时C末端保护性基团时，其可以尤其为(任选被取代的)烷基或(任选被取代的)芳基。当R是C末端保护性基团时，R优选为叔烷基，尽管理论上其也可以是本领域技术人员所公知的任何其他保护性基团。该叔烷基理论上可以是任何保护性叔烷基。优选地，该叔烷基选自叔丁基(2-甲基-2-丙基)、叔戊基(2-甲基-2-丁基)和叔己基(2,3-二甲基-2-丁基)的组中。
当Q表示胺基时，该胺基可以用通式NR3R4来表示，其中，R3和R4可各自独立地表示氢原子、任何(取代或未取代的)烷基或任何(取代或未取代的)芳基。特别地，R3和R4中的一个可以是氢原子，另一个可以是(取代或未取代的)烷基。当R3和R4都是氢原子时获得了特别好的结果。
当Q表示联氨基时，该联氨基可以用通式NR5-NR6R7来表示，其中R5、R6和R7可各自独立地表示氢原子、任何(取代或未取代的)烷基或任何(取代或未取代的)芳基。优选地，R5、R6和R7均为氢原子。
当Q表示氨基甲酰-联氨基时，该氨基甲酰-联氨基可以用通式NR8-NR9C(O)NR10R11来表示，其中，R8、R9、R10和R11可各自独立地表示氢原子、任何(取代或未取代的)烷基或任何(取代或未取代的)芳基。优选地，R8、R9、R10和R11均为氢原子。
当Q表示SR部分时，R可以表示C末端保护性基团、氢原子或阳离子，例如单价阳离子，例如三取代或四取代的铵离子或者碱金属阳离子。当R时C末端保护性基团时，其可以特别地为(任选被取代的)烷基或(任选被取代的)芳基。当R是C末端保护性基团时，R优选为叔烷基，尽管理论上其也可以是本领域技术人员所公知的任何其他保护性基团。该叔烷基理论上可以是任何保护性叔烷基。优选地，该叔烷基选自叔丁基(2-甲基-2-丙基)、叔戊基(2-甲基-2-丁基)和叔己基(2,3-二甲基-2-丁基)的组中。
在本发明的方法中，被保护的寡肽酯与被保护的寡肽亲核剂的偶联由枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)来催化。理论上，能够使用催化该偶联反应的任何枯草杆菌蛋白酶。当提及来自特定来源的枯草杆菌蛋白酶时，起源于第一生物体，但是实际上在(基因改造的)第二生物体中生产的重组枯草杆菌蛋白酶，特指作为来自第一生物体的酶被包括进来。
优选地，在本发明的方法中使用的枯草杆菌蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶A。
多种枯草杆菌蛋白酶在本领域中是公知的，例如见US 5316935及其引用的文献。这样的枯草杆菌蛋白酶可用于根据本发明的方法中。
在根据本发明的方法中使用枯草杆菌蛋白酶A(其中使用在C末端位点带有脯氨酸残基的肽酯i))通常产生非常慢的偶联反应。因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法在限制性条件下实施，即如果反应是在野生型枯草杆菌蛋白酶A的存在下施行时，寡肽酯i)中的C末端氨基酸残基不是脯氨酸残基。同样对于其他枯草杆菌蛋白酶，优选使用其中C末端氨基酸残基不是脯氨酸残基的寡肽酯i)。然而，可以预期的是，使用枯草杆菌蛋白酶A的突变体可以获得可接受的偶联速率。
可以从在本发明的方法中使用的枯草杆菌蛋白酶衍生的生物体的例子包括木霉属物种，比如来自里氏木霉；根霉物种，例如来自米根霉；芽孢杆菌属，例如来自地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(bacillus alkalophilus)、嗜碱芽孢杆菌(bacillushalodurans)；曲霉属，例如来自米曲霉或黑曲霉；链霉菌属，例如来自头状链霉菌或灰色链霉菌；假丝酵母属；真菌；腐质霉属；丝核菌属；嗜纤维菌属(Cytophagia)；毛霉菌属；和动物组织，特别是来自胰腺，如猪胰腺、牛胰腺或羊胰腺。
本领域普通技术人员会清楚的是，在根据本发明的方法中也可以使用天然产生的(野生型)枯草杆菌蛋白酶的变异体。野生型酶的突变体可以例如通过修饰DNA编码的野生型酶，使用本领域技术人员公知的诱导突变技术(随机突变、定位诱变、定向进化、基因改组等)，以使得DNA编码出与野生型酶不同之处在于至少一个氨基酸不同的酶，或者以使得其编码出比野生型更短，并通过影响由此修饰的DNA在合适的(宿主)细胞中的表达的酶。酶的突变体可能具有改善的特性，例如关于以下一个或多个方面：底物范围、活性、稳定性、有机溶剂耐受性、温度曲线、合成/水解比率以及副反应曲线。
在一个优选的方法中，枯草杆菌蛋白酶A被用来催化偶联反应。枯草杆菌蛋白酶A是可从诺维信(Novozymes)商购的枯草杆菌蛋白酶，并且已被发现在缩合被保护的偶联搭档以在相对短的时间里以好的产率产生所需的肽产物方面尤其具有优势。
是枯草杆菌蛋白酶A的合适来源。该产品可以从诺维信(Bagsvaerd，丹麦)获得。是便宜的并且工业上可获得的由地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)生产的蛋白水解酶混合物(包含枯草杆菌蛋白酶A作为主要酶成分)。
可商购的酶例如可能由提供商以液体的形式提供，尤其是以水溶液的形式。在这种情况下，优选将酶先从会引起不需要的副反应的不需要的液体、例如过量的水或醇中分离出来。这可以适当地通过沉淀来完成，通常随后将固体从液体中分离，和/或干燥。可以使用醇、例如叔丁醇来进行沉淀。当使用另一种醇时，需要注意这种醇不能不利地干扰偶联反应。
在优选的实施方案中，以固定不动的形式使用酶。至少在一些实施方案中，这可导致在相对短的反应时间之后所合成的寡肽的增加的产率。使用Alcalase交联酶聚集体(Alcalase-CLEA)或使用固定在固体颗粒上的Alcalase，例如Alcalase-Imibond、Alcalase-Epobond、Alcalase-immozyme或Alcalase-Decalite，已获得尤其好的效果。酶的固定也可以使得酶在偶联反应之后容易复原，以使得其可以被回收或者在连续的偶联反应中重复使用。
在惰性有机溶剂中施行酶促偶联反应是可能的。合适的溶剂的一些例子例如为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，N-甲基-吡咯烷酮(NMP)，N，N-二甲基乙酰胺(DMA)，二甲基亚砜(DMSO)，乙腈，诸如甲苯的碳氢化合物，诸如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或氯仿的卤代烃，诸如甲基叔丁基醚(MTBE)、四氢呋喃(THF)、2-甲基-四氢呋喃(Me-THF)或1,2-二甲氧基乙烷的醚，或诸如2,2,2-三氟乙醇(TFE)的(卤化)醇，或这些有机溶剂的混合物。优选地，酶促偶联反应可以在含有MTBE、THF、Me-THF、1,2-二甲氧基乙烷、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、TFE、DMF、NMP、DMA或DMSO的有机溶剂或有机溶剂混合物中进行。最优选地，酶促偶联反应可以在含有MTBE、MTBE与DMF或NMP或DMA或DMSO的混合物、二氯甲烷，或者二氯甲烷与DMF或NMP或DMA或DMSO的混合物的有机溶剂或有机溶剂混合物中进行。
酶促片段缩合通常在基本上无水的条件下施行。本领域技术人员会理解的是，取决于酶，少量的水可以是需要用来使酶能适当地发挥其催化活性。
基本上无水是指反应介质不含水或者含有最小量的水，即基于反应介质中的液体的总体积计，含量为0.1体积％以下的水。反应介质可以被分散在第二液体相中或者另一个液体相可以被分散在反应介质中。在两相或多相系统的情况中，具体的水含量基于偶联反应发生于其中的相中的液体的体积，或者当其中偶联反应至少主要发生于其中的多相系统存在时。水浓度的期望的上限值取决于寡肽酯i)和寡肽剂ii)的浓度，取决于特定的酶、所使用的溶剂、将要合成的肽的性质(例如肽的尺寸和氨基酸序列)、所需的最终转化率以及所期望的反应速率。
在根据本发明的方法中，水浓度是0.1体积％以下，优选0.05体积％以下，更优选0.01体积％以下。
水浓度在此没有下限，因为可能需要存在的最小量的水低于所熟知的分析方法的检测极限。这对于被用来检测根据本发明的方法的水浓度的卡尔费休滴定法的检测限也是适用的。在一个优选的实施方案中，由酶释放的水可以被连续地或间歇地除去。理论上，移除水可以通过本领域公知的方式来完成。非常适用于移除水的是蒸发，例如使用真空或蒸馏共沸移除。使用分子筛已获得特别好的效果。然而，重要的是基本上保持所需的酶的活性。
向酶促偶联反应中添加多种量的分子筛能够使得水浓度的变化低于其检测限。例如通过添加大量的分子筛所获得的太过于低的水浓度在某些情况下可以导致在偶联反应过程中的逐渐的(部分的)酶失活。本领域技术人员通过不同量的分子筛可以容易地确定某个偶联反应的最佳水浓度。在酶促偶联反应过程中(部分的)酶失活的情况中，(部分地)失活的酶可以通过再水化、例如通过在水溶液中搅拌该(部分地)失活的酶来完全或几乎完全地再活化。该再活化可以使得能够在连续偶联反应中能重复使用酶。在一些情况中，尤其是使用冻干的酶，在酶促偶联之前，酶需要被水合，以便获得足够的催化活性。在非固定酶的情况中，这样的水合可以通过在水溶液中搅拌然后沉淀来施行，例如使用易混溶于水的有机溶剂，例如叔丁醇。在固定酶的情况中，这样的水合可以通过使用水溶液洗涤，然后用一种或多种有机溶剂、如使用易混溶于水的有机溶剂例如叔丁醇和不易混溶于水的溶剂例如MTBE洗涤来施行。
尤其是，本发明的方法能够使得寡肽酯i)偶联至寡肽亲核剂ii)上，而不需要基于另外的偶联搭档而言大量过量的其中一种偶联搭档，以在相对短的时间里以可接受的产率获得所合成的肽。寡肽酯i)偶联对寡肽亲核剂ii)的摩尔比通常选自2:1至1:4的范围，尤其是在1:1至1:3的范围，优选在1:1至1:2的范围，更优选1:1至1:1.5的范围，还优选1:1至1:1.2的范围。
在优选的实施方案中，偶联反应在不存在盐的情况下进行。这种盐通常通过添加碱以中和使用例如1-2.5体积％三氟乙酸的二氯甲烷溶液来使被保护的寡肽从固相中酸性切除之后形成的(任选地C末端被保护的)被保护的寡肽亲核剂ii)的盐来形成。可以方便地通过在被保护的寡肽从固相切除之后用碱水萃取二氯甲烷层来避免盐在(任选地C被保护好)被保护的寡肽胺亲核剂ii)中存在。
理论上，所使用的pH(一旦在所选择的反应介质中存在pH)可以选择在宽的限度内，只要在被选择的pH下酶能显示出足够的活性。这样的pH对于要使用的酶而言通常是已知的，并且可能基于其已知的在水溶液中的水解活性，或者可以被常规地测定，使得能够在已知的反应条件下对酶使用已知的底物。其尤其被选择在大约中性。如果期望，可以取决于酶来使用碱性或酸性条件。如果期望，可以使用酸和/或碱调节pH，或者pH可以用合适的酸和碱的结合来缓冲。合适的酸和碱尤其是可溶于反应介质中的那些酸和碱，例如选自氨和可溶解于有机溶剂的酸，例如醋酸和蚁酸。
理论上，所使用的温度不严格，只要在被选择的温度下所使用的酶显示出足够的活性和稳定性。这样的温度对于将要使用的酶而言通常是已知的，或者可以被常规测定，使得能够在已知的反应条件下对酶使用已知的底物。通常，温度可以至少为0℃，尤其是至少15℃或至少25℃。尤其是，如果使用源自于嗜热生物体的一种或多种酶，温度可优选为至少35℃。所需的最大温度取决于酶。通常而言，这样的最大温度在本领域中是已知的，例如在可商购的酶的情况下在产品数据表中所显示的，或者可以通过基于公知常识而常规地测定。温度通常为70℃以下，尤其是60℃以下，或者50℃以下。然而，尤其是如果使用来自嗜热生物体的一种或多种酶，可以选择较高的温度，例如高达90℃。
对于特定的酶，本领域技术人员基于公知常识通过常规实验可以容易地确定最佳的温度条件。例如，对于枯草杆菌蛋白酶，尤其是枯草杆菌蛋白酶A(例如)，温度可有利地处于25-60℃的范围内。
在根据本发明的方法中将要偶联的寡肽酯i)和寡肽亲核剂ii)优选通过固相合成法来合成。
肽C末端氨基甲酰甲基(Cam)和Cam-Xxx-NH2酯(其中Xxx表示任何侧链被保护或未被保护的蛋白氨基酸或非蛋白氨基酸)早前已经被用在蛋白酶催化的肽合成中(例如见Miyazawa et al.Protein&Peptide Letters,2008,15,1050)，并且通常比烷基酯更快速地被酶促缩合，但是也更加倾向于水解得多。
固相合成技术已经被描述用于合成侧链完全未被保护的寡肽C末端Cam-酯(例如见et al.Bioorg.Med.Chem.,1998,6,891)。这些肽C末端Cam-酯在含有Rink或Pal连接物(见示意性表示1，H.Rink,Tetrahedron letters,1987,28,3787；F.Albericio et al.J.Org.Chem.,1990,55,3730)的固相上合成并伴以使用高浓度的TFA(例如TFA/H2O，95/5，v/v)而同时发生侧链脱保护地切掉。遗憾的是，这些苛刻的切掉和侧链脱保护条件也导致Cam-酯的非期望的部分水解。
示意性表示1
侧链未被保护的肽C末端Cam-酯的固相合成。
然而，发明人现在发现，在固相上合成侧链被保护的肽C末端Cam和Cam-Xxx-NH2酯是有可能的。特殊的Sieber或Ramage酰胺基连接物(见示意性 表示2，Sieber，Tetrahedron letters,1987,28,2107；Ramage et al.Tetrahedron letters,1993,34,6599)被使用，肽在非常温和的酸性条件下(例如CH2Cl2中的2.5体积％TFA)被切除，留下侧链保护基不被影响。这些类型的连接物至今为止从未被用于肽C末端Cam酯的合成。
示意性表示2
有利的是，侧链被保护的肽C末端Cam-酯从固相切除不是通过Cam-酯的任何非期望的水解来完成的。除了使用Sieber或Ramage连接物在树脂上合成Cam-酯，发明人现在已经发现，在包含2-氯三苯甲基氯或SASRIN连接物(见示意性 表示3，Barlos,Tetrahedron Letters,1973,95,1328；Mergler et al.Tetrahedron Letters,1988,68,239)的固相上合成侧链被保护的肽C末端Cam-Xxx-OH酯(其中Xxx表示任何侧链被保护的或未被保护的蛋白氨基酸或非蛋白氨基酸)是有可能的。出乎意料的是，这些Cam-Xxx-OH酯在酶促片段缩合反应中表现得与Cam-Xxx-NH2酯一样好。
示意性表示3
2-氯三苯甲基氯和SASRIN连接物
在文献中已经证明了有利的是将固相化学肽合成技术与酶促片段缩合结合起来。然而，这些例子是基于侧链完全未被保护的肽的固相合成和随后这些肽片段在水或部分水溶液中的酶促缩合(例如见et al.J Pept Res.,2000,55,325)。
相比之下，在本发明的优选方法中，侧链被保护的肽片段通过固相技术和随后在无水有机溶剂中的酶促缩合来合成，这是以前从未被公开过的。
因此，本发明还涉及用于合成包含通过如上所述的通式C(＝O)-O-CX2-C(＝O)N-R1R2(即Cam-酯)表示的酯部分的寡肽酯i)的方法。
本发明还涉及用于合成肽的方法，通过
a)如前所述通过固相合成，在温和的酸性条件下，在固相和寡肽之间使用连接物来制备寡肽酯i)，其适合于允许寡肽酯从固相切除，而保留存在于寡肽上的任何侧链保护基，并且其中寡肽酯从固相切除，
b)如前所述通过固相合成，在温和的酸性条件下，在固相和寡肽之间使用连接物来制备寡肽亲核剂ii)，其适合于允许寡肽亲核剂从固相切除出来，而保留存在于寡肽上的任何侧链保护基，并且其中寡肽亲核剂从固相切除，以及
c)随后将寡肽酯i)与寡肽亲核剂ii)偶联，该偶联在包含相对于偶联反应主要发生于其中的液体的总量为0.1体积％以下的有机溶剂或有机溶剂混合物中，在枯草杆菌蛋白酶的存在下进行，并且其中在偶联反应过程中被酶释放的水被移除。
出乎意料的是，酶促片段缩合策略与最常用的基于Fmoc的固相肽合成侧链保护基兼容。甚至含有大的“体积大的”侧链保护基，例如Trt、Pbf或Pmc的肽也能被酶识别并以好至极好的产率缩合。这些类型的保护基至今为止从未被应用在酶促肽合成中。最常用于Fmoc/tBu基固相肽合成的侧链保护基是：用于Asp、Glu、Thr、Ser和Tyr的tBu，用于Lys和Trp的Boc，用于His、Asn、Gln和Cys的Trt，以及用于Arg的Pmc或Pbf。
用于Boc/Bzl基固相肽合成的的最常用的侧链保护基是：用于Arg的Tos或Mts，用于Asp、Glu、Thr和Ser的Bzl或Cy，用于Cys的Acm，用于His的Bom或Dnp，用于Lys的2-Cl-Cbz，用于Trp的For，以及用于Tyr的2-Br-Cbz。
本发明将通过以下实施例来进行阐释，但并不限于这些实施例。
实施例
除非另有说明，否则化学品从商业来源获得，并且使用时不经过进一步纯化。Sieber (或者Xanthenyl连接物)树脂和2-氯三苯甲基树脂从GL Biochen(中国)购买。Savinase、Esperase和Everlase从诺维信购买。来自芽胞杆菌属(三个不同的变异体)和来自的地衣芽孢杆菌的蛋白酶从Sigma购买。Alcalase-immozyme从Chiralvision购买。1H和13C NMR谱在Bruker Avance 300MHz NMR光谱仪上记录，化学位移以相对于TMS(0.00ppm)、DMSO-d6(对于1H为2.50ppm或对于13C为39.9ppm)或CDCl3(对于13C为77.0ppm)以ppm(δ)给出。薄层色谱(TLC)在预涂覆的硅胶60F254板(Merck)上运行；使用UV光或茚三酮可以显现斑点。分子筛(8-12目，Acros)在200℃、减压下活化。叔丁醇(tBuOH)储存在这些分子筛中。在使用前，将tBuOH预热成液体(45℃)。使用硅胶Merck级9385实施柱色谱。分析HPLC在HP1090液相色谱上，使用反相柱(InertsilODS-3，C18，5μm，150 × 4.6mm)，在40℃下进行。UV检测在220nm，使用UV-VIS 204线性分光仪来施行。梯度程序为：0-25min从5％至98％的洗提液B的线性梯度斜坡，从25.1-30min用5％洗提液B(洗提液A：水中0.5mL/L甲烷磺酸(MSA)，洗提液B：乙腈中0.5mL/L MSA)。0-25.1min的流速为1mL/min，25.2-29.8min为2mL/min，然后返回1mL/min，直至在30min停止。进样体积是20μL。使用如下梯度程序来进行大的被保护的疏水肽(>10个氨基酸)的分析：0-60min从0％至100％的洗提液B的线性梯度坡度，在60-65min用100％洗提液B(洗提液A：1mL/L TFA的水/乙腈溶液(80/20，v/v％)，洗提液B：1mL/L TFA的乙腈/2-丙醇/水(50/45/5，v/v/v％))。使用与用于分析HPLC相同的缓冲液和梯度程序来施行LC-MS分析。使用阳离子电喷雾(ESI)以全扫描的模式(300-2000amu的范围)在Deca XP离子阱LC-MS(ThermoFisher Scientific)上记录色谱图。缩合反应的产率通过比较产品峰的总面积与起始原料的总面积来测定，并假定产品的消光系数等于酰基供体的消光系数。使用固定相柱(Pursuit XRs，C18，10μm颗粒尺寸，500×41.4mm)在Varian PrepStar系统上施行制备HPLC。Alcalase-CLEA-OM从CLEA-Technologies购买，并含有3.5wt％水；表观活度是650AGE单位每可(在40℃和pH7.5下，用1AGE单位催化N-乙酰基-氨基乙酸乙酯形成1μmol N-乙酰基-氨基乙酸)。该Alcalase-CLEA-OM在使用之前进行如下处理：将1g Alcalase-CLEA-OM悬浮在20mL tBuOH中，并用刮铲碾碎。过滤之后，用20mL MTBE重复该过程。最后筛分酶(d＝0.250mm)，以除去大的酶颗粒。液体Alcalase在使用之前进行如下处理：用20mL tBuOH稀释10mL Alcalase(褐色液体溶液，Novozymes类型2.5L DX)，然后搅拌，随后离心沉淀物(3500rpm)，倾析上清液。将小团块重新悬浮在30mL tBuOH中，然后搅拌，离心，倾析(3500rpm)。产生的小团块用于根据本发明的方法中。Alcalase-imibond和Alcalase-epobond从SPRIN技术公司(Trieste，意大利)购买，并用磷酸盐缓冲液(10mL/g，100mM，pH 7.5，3次)、tBuOH(3次)和MTBE清洗。同样的清洗过程应用于Alcalase-immozyme。枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K冻干粉(Sigma)在使用之前通过如下水化处理：将1g冻干粉溶解在10mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.5)中，然后添加20mL tBuOH，然后搅拌，接着离心沉淀(3.500rpm)，倾析上清液。将小团块重新悬浮在30mL tBuOH中，然后搅拌，离心和倾析(3500rpm)。该过程重复两次。
将要用于测定反应混合物中的水的百分比的卡尔费休滴定的描述。
使用Metrohm titrino 701KF，用Hydranal 2(Sigma)卡尔费休滴定试剂自动地测量水含量。将反应混合物在惰性气氛下过滤，并且将1.000g液体样品用于卡尔费休滴定。用Hydranal 2漱洗滴管，并将滴定参数设置如下：
·提取时间＝9999秒
·停止标准＝偏移
·停在偏移＝15(μL/min)
·停止＝40.0mL
·最大速率＝1.0mL/min
·最小体积增量＝min(μL)
·I(pol.)＝10μA
·终点＝75mV
·填充速率＝20.0mL/min
将100mL Hydranal溶剂(Sigma)引入干燥的滴定容器中，并用磁力棒搅拌。用Hydranal 2中和Hydranal溶剂，直到消耗速率随着时间保持恒定。将1.000g样品引入滴定容器中，并用Hydranal 2滴定样品。测定消耗的Hydranal 2溶液的量，如图4所示，
X轴：滴定剂消耗量；
Y轴：时间尺度滴定。
从消耗量/时间曲线中推断所消耗的标准体积溶液的量：
·延伸滴定线b至与x轴的交叉点
·测量从与X轴的交叉点至Y轴的垂线距离，作为消耗的Hydranal 2的量的测量量(X轴上的1cm相当于1mL滴定剂)。
使用以下通式计算样品中的水的含量(重量％)：
(v*Tt)/(10*a)
其中，Tt＝在t℃下，mg水等于1.00mL Hydranal 2。
寡肽-OCam酯(寡肽酯i))的合成
使用以下方案来合成寡肽-OCam酯：
用二氯甲烷(10mL，2x 2min)和1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP，10mL，2x 2min)清洗1g Sieber树脂(呫吨基连接物，0.5mmol/g的载量)，并用哌啶/NMP(10mL，1/4，v/v，2x 8min)的Fmoc-去保护。用NMP(10mL，2x 2min)、二氯甲烷(10mL，2x 2min)和NMP(10mL，2x 2min)清洗之后，在二氯甲烷(10mL，45min)中，用二环己基碳二亚胺(DCC)(4当量)将碘乙酸(4当量)偶联至树脂上。用NMP(10mL，2x 2min)、二氯甲烷(10mL，2x 2min)和THF(10mL，2x 2min)清洗之后，在50℃下，将树脂负载Fmoc-保护的氨基酸(在侧链官能团上带有合适的保护基)，使用4当量的Fmoc-Xxx-OH(其中Xxx表示氨基酸)和在DMF/THF(10mL,1/4,v/v)中的10当量的DiPEA 20h。用DMF(10mL，2x 2min)、二氯甲烷(10mL，2x 2min)和NMP(10mL，2x 2min)清洗之后，接着施行标准SPPS方案(见Fmoc Solid Phase Peptide Synthesisby W.C.Chan and P.D.White,Oxford university press,2004)以延长肽。从树脂上切除使用在二氯甲烷(10mL每克树脂)中的2.5体积％三氟乙酸(TFA)来施行15min。用二氯甲烷清洗树脂，合并的滤液在真空中浓缩至原体积的1/3。随后，添加异丙醇/水(1/3，v/v)，混合物在真空中浓缩至原体积的1/2。将沉淀的寡肽-O-Cam酯过滤出来，并用水清洗两次，然后从乙腈/水(3/1，v/v)冻干。根据HPLC分析，产品通常以>90％的产率，>95％的纯度获得。
Fmoc-Ala-O-CH 2 -COOH的合成
将1mmol Fmoc-Ala-OH溶解在100mL无水THF/DMF(8/2，v/v)中，然后添加2当量的2-碘代乙酸叔丁基酯和2.5当量的DiPEA。将该混合物在50℃下以150rpm摇20小时。然后，在真空下除去挥发物，并将残余物再溶解在250mLEtOAc和250mL NaHCO3饱和水溶液的混合物中。分离两相，用NaHCO3饱和水溶液(250mL，1x)、HCl水溶液(250mL，pH 1，2x)、盐水(250mL，1x)洗涤有机层，用Na2SO4干燥，在真空中浓缩，用甲苯(50mL，2x)和CHCl3(50mL，2x)共蒸发挥发物。然后，加入10mL TFA/H2O(95/5,v/v，搅拌混合物1h，然后添加100mL IPA/H2O(1/3,v/v)。在真空中除去50mL挥发物，将沉淀物过滤并用50mL H2O洗涤(2x)。剩余的粗酯通过制备HPLC纯化，根据HPLC分析获得52％的产率和＞98％的纯度。
Fmoc-Gln(Trt)-O-CH 2 -COOH的合成
将1mmol Fmoc-Gln(Trt)-OH溶解在100mL无水THF/DMF(8/2，v/v)中，然后添加2当量的2-碘代乙酸苯甲酯和2.5当量的DiPEA。将该混合物在50℃下以150rpm振荡20小时。然后，在真空下除去挥发物，并将残余物再溶解在250mLEtOAc和250mL NaHCO3饱和水溶液中。分离两相，用NaHCO3饱和水溶液(250mL，1x)，HCl水溶液(250mL，pH 1，2x)，盐水(250mL，1x)洗涤有机层，用Na2SO4干燥，在真空中浓缩，用甲苯(50mL，2x)和CHCl3(50mL，2x)共蒸发挥发物。将残渣溶解在250mL MeOH/甲苯(1/1，v/v)中，然后使用1g 10％的Pd/C，在25℃、5bar H2下氢解反应过夜。通过过滤除去固体之后，在真空下除去挥发物。产生的粗酯通过制备HPLC纯化，根据HPLC分析获得63％的产率和＞98％的纯度。
寡肽-Ocam-Xxx-NH 2 酯(带有R 2 的的寡肽酯i)，R 2 为具有C末端羧酰胺 官能团的氨基酸残基)的合成
用二氯甲烷(10mL，2x 2min)、NMP 10mL(2x 2min)清洗1g Sieber树脂(呫吨基连接物，0.5mmol/g的载量)，并用哌啶/NMP(10mL，1/4，v/v，2x 8min)Fmoc-去保护。用NMP(10mL，2x 2min)、二氯甲烷(10mL，2x 2min)和NMP(10mL，2x 2min)清洗之后，用在NMP(10mL，45min)中的HBTU(4当量)，HOBt(4当量)和DiPEA(8当量)将Fmoc-Xxx-OH(4当量)偶联至树脂上。用NMP(10mL，2x 2min)、二氯甲烷(10mL，2x 2min)和NMP(10mL，2x 2min)清洗之后，使用哌啶/NMP(1/4，v/v，2x 8min)将氨基酸Fmoc-去保护，树脂用NMP(10mL，2x 2min)、二氯甲烷(10mL，2x2min)和NMP(10mL，2x 2min)清洗之后，用在NMP(10mL，90min)中的HBTU(2当量)、HOBt(2当量)和DiPEA(4当量)偶联Fmoc-Xxx-O-CH2-COOH(2当量)。在用NMP(10mL，2x 2min)、二氯甲烷(10mL，2x 2min)和NMP(10mL，2x 2min)清洗之后，施行标准SPPS方案(见Fmoc Solid Phase PeptideSynthesis by W.C.Chan and P.D.White,Oxford university press,2004)以延长肽。寡肽-Ocam-Xxx-NH2酯的裂解和纯化与方案2相同。根据HPLC分析，产品通常以>90％的产率，>95％的纯度获得。
寡肽-Ocam-Xxx-OH酯(带有R 2 的寡肽酯i)，R 2 为带有C末端羧酸官能 团的氨基酸残基)的合成
用二氯甲烷(10mL，2x 2min)清洗1g Trityl树脂(2-氯-氯代三苯甲基连接物，1.0mmol/g的载量)，使用在二氯甲烷(10mL，30min)中的DiPEA(5当量)将Fmoc-Xxx-OH(2当量)偶联至树脂上。用DMF(10mL，2x 2min)清洗之后，未反应的氯代三苯甲基用二氯甲烷/MeOH/DiPEA(10mL，80/15/5，v/v/v，2x 10min)盖帽。用NMP(10mL，2x 2min)、二氯甲烷(10mL，2x 2min)和NMP(10mL，2x 2min)清洗之后，使用哌啶/NMP(10ml，1/4，v/v，2x 8min)将氨基酸Fmoc-去保护，然后使用在二氯甲烷(10mL，45min)中的DCC(4当量)偶联碘乙酸(4当量)。用NMP(10mL，2x 2min)、二氯甲烷(10mL，2x 2min)和THF(10mL，2x 2min)清洗之后，在50℃下，用Fmoc-Xxx-OH(4当量)和在DMF/THF(10mL，1/4，v/v)中的10当量的DiPEA处理树脂20h。在用DMF(10mL，2x 2min)、二氯甲烷(10mL，2x 2min)和NMP(10mL，2x 2min)清洗之后，施行标准SPPS方案(见Fmoc Solid PhasePeptide Synthesis by W.C.Chan and P.D.White,Oxford university press,2004)以延长肽。寡肽-Ocam-Xxx-OH酯的裂解和纯化与方案2相同。根据HPLC分析，产品通常以>90％的产率，>95％的纯度获得。
寡肽C末端酰胺亲核剂(寡肽亲核剂ii))的合成
使用标准SPPS方案(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis by W.C.Chan andP.D.White,Oxford university press,2004)在Sieber树脂(呫吨基连接物，0.5mmol/g的载量)上合成寡肽C末端酰胺亲核剂。从树脂上的切除使用在二氯甲烷(10mL每克树脂)中的2.5体积％三氟乙酸(TFA)来施行15min。用10mL二氯甲烷清洗树脂两次，合并的滤液用10mL NaHCO3饱和水溶液洗涤两次，然后在真空中浓缩至其原体积的1/3。沉淀，洗涤和干燥与方案2相同。根据HPLC分析，产品通常以>90％的产率，>95％的纯度获得。
实施例1
被保护的寡肽活化酯i)与被保护的寡肽C末端酰胺亲核剂ii)的片段偶联
将3μmol被保护的寡肽活化酯和4.5μmol被保护的寡肽C末端酰胺亲核剂溶解在0.5mL二氯甲烷，并加入10mg粉碎的分子筛。然后，添加含有Alcalase-CLEA-OM(在二氯甲烷中的20mg/mL)的母液(保存在分子筛中)。该混合物在37℃下，以200rpm振荡24h，并用LC-MS分析。
表1
a反应7之后
表1表明了多种被保护的寡肽C末端酯可以与多种被保护的寡肽C末端酰胺亲核剂偶联，产生高产率的多达至少19个氨基酸长度的肽产物。此外，不使用大量化学计量过量的缩合反应中所使用的任何片段，而获得好的产率。
实施例2
在多种溶剂中，Ac-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln-Ocam(R1和R2 为氢的寡肽i))与H-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-NH 2 (寡肽ii) 的片段偶联
将2.2mmol Ac-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln-OCam(Seq.ID No:16)和3.3mmol H-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-NH2(Seq.ID No:21)溶解在100μL DMF中。然后，添加10mg粉碎的分子筛、10mg Alcalase-CLEA-OM和900μL溶剂。该混合物在37℃下，以200rpm振荡24h，并用HPLC分析。
a1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇；b2,2,2-三氟乙醇；c使用50mg Alcalase-CLEA-OM。
该表表明了各种溶剂可以被用于被保护的寡肽片段偶联反应。
实施例3
比较Ocam-Xxx-NH 2 酯(带有R 2 的寡肽酯i)，R 2 为带有C末端羧酰胺官 能团的氨基酸残基)
将各种Cbz-Val-Ala-OCam-Xxx-NH2酯与Cbz-Val-Ala-OCam在带有H-Phe-NH2的偶联反应进行比较。将0.028mmol Cbz-Val-Ala-OCam-Xxx-NH2或Cbz-Val-Ala-OCam加入在1.5mLTHF(含有10体积％DMF)、含有5团分子筛的H-Phe-NH2(1.5当量)中。将反应混合物在50℃下搅拌30min，然后添加50mg固体在硅藻土(decalite)上的Alcalase。在50℃下搅拌1h后，将100μL份的反应混合物加入900μL DMF中，并用HPLC分析样品。从Cbz-Val-Ala-Phe-NH2产品校准图中确定产率。应该注意的是，1h之后，各种寡肽活化酯之间的区别变得很明显。使用延长的反应时间和/或更多酶，所有的反应都可以完全转化。
该表格显示了多种C末端-Ocam-Xxx-NH2酯可以被用于酶促偶联反应。
实施例4
Ocam酯和Ocam-Leu-NH 2 酯的比较
将3μmol被保护的寡肽C末端酯和4.5μmol的H-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-NH2(Seq.ID No:21)溶解在0.5mL二氯甲烷中，并加入10mg粉碎的分子筛。然后，加入含有Alcalase-CLEA-OM(在二氯甲烷中，40mg/mL)的0.5mL储备液(保存在分子筛中)。将该混合物在37℃下，以200rpm摇48小时，并通过LC-MS分析。
该结果表明了实施例3中显示的对于[2+1]偶联的结果可以转化为肽片段偶联，并且至少在一些情况中，相比于未取代的-OCam-酯，被保护的寡肽的C末端-OCam-Xxx-NH2酯的使用对于偶联速率和产率是有利的。
实施例5
寡肽-OCam-Xxx-NH 2 酯(C末端羧酰胺官能团)和寡肽-OCam-Xxx-OH酯 (C末端羧酸官能团)的比较
如实施例3所述，将Cbz-Val-Ala-OCam-Leu-NH2和Cbz-Val-Ala-OCam-Leu-OH与H-Phe-NH2酶促缩合。将Cbz-Val-Gln(Trt)-OCam-Gly-NH2和Cbz-Val-Gln(Trt)-OCam-Gly-OH和如实施例3所述的H-Phe-NH2进行酶促缩合，但是使用5倍量的酶。在酶促偶联之前，使用哌啶(1当量)来中和羧酸部分。
该结果显示了C-末端-Ocam-Xxx-NH2酯以及-Ocam-Xxx-OH酯可以用于酶促偶联反应，并且至少在一些情况中展示出相当的反应速率。
实施例6
多种酶和固定形式的使用
将2.2mmol Ac-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln-OCam和3.3mmolH-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-NH2溶解在100μL DMF中。然后，加入10mg粉碎的分子筛、10mg酶和900μL MTBE。将这些混合物在37℃下，以200rpm振荡24h，并用HPLC分析。下列酶产生了很好的产率(＞80％)：Alcalase-CLEA-OM、Alcalase-imibond、Alcalase-epobond、Alcalase-immozyme、Liquid Alcalase、枯草杆菌蛋白酶A、蛋白酶K。
将2.2mmol Cbz-Phe-OCam和3.3mmol H-Phe-NH2溶解在100μL DMF中。然后，加入10mg粉碎的分子筛、10mg酶和900μL MTBE。将这些混合物在37℃下，以200rpm振荡24h，并用HPLC分析。下列酶产生了很好的产率(＞80％)：Savinase、Esperase、Everlase、来自芽胞杆菌属的蛋白酶(三种可用的变异体)、来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的蛋白酶。
实施例7
被保护的寡肽活化Cam酯i)与H-Leu-Phe-NH 2 的片段缩合
将3μmol被保护的寡肽酰基供体溶解在0.5mL二氯甲烷中，并加入10mg粉碎的分子筛。然后，加入含有在二氯甲烷中的12μmol/mL的H-Leu-Phe-NH2和20mg/mL的Alcalase-CLEA-OM的0.5mL母液(保存在分子筛中)。将该混合物在37℃下，以200rpm振荡24h，并通过LC-MS分析。应注意，24h之后，多种Cam酯之间的差异变得很明显。使用延长的反应时间和/或更多酶，所有反应可以变成完全转化。
如可从条目1-4观察到的，多种侧链保护基可以用于寡肽C末端酯的C末端GIn残基，但是如果该C末端GIn残基具有未被保护的侧链官能团则是有利的。条目5-13证明了带有多种氨基酸序列和侧链保护基的被保护的寡肽C末端酯可以用于酶促偶联反应。
实施例8
被保护的寡肽C末端酰胺亲核剂ii)与Cbz-Phe-OCam的偶联
将3μmol被保护的寡肽C末端酰胺亲核剂溶解在0.5mL二氯甲烷中，并加入10mg粉碎的分子筛。然后，加入含有在二氯甲烷中的12μmol/mL的Cbz-Phe-OCam和20mg/mL的Alcalase-CLEA-OM的0.5mL的储备液(保存在分子筛中)。将该混合物在37℃下，以200rpm振荡24h，并通过LC-MS分析。应注意，24h之后，各种被保护的寡肽C末端酰胺亲核剂之间的差异变得很明显。使用延长的反应时间和/或更多酶，所有反应可以变成完全转化。
条目1-9证明了带有多种氨基酸序列和侧链保护基的被保护的寡肽C末端酰胺亲核剂可以用于酶促偶联反应。
实施例9
水含量在对合成/水解比率的影响
将2.2μmol Cbz-Phe-OCam和4.4μmol H-Phe-NH2溶解在1mL二氯甲烷中，并加入5mg Alcalase-CLEA-OM(制备六份这样相同的混合物)。向这些混合物中加入0、0.1、0.5、1.0、2.0和3.0μL水(相当于在反应混合物中≈0、0.01、0.05、0.1、0.2和0.3体积％的水)。将这六份混合物在37℃下，以200rpm振荡2h，并用HPLC分析。
S/H比率定义为所形成的二肽产物Cbz-Phe-Phe-NH2的量(mmol)除以所形成的水解产物Cbz-Phe(mmol)的量(mmol)。如从所包含的图1中所见的，低的水浓度对于避免Cam酯的水解至关重要。
实施例10
通过再水化的酶再活化
失活
将5mg Alcalase-CLEA-OM和25mg分子筛分别在1mL DMF、1mL二氯甲烷和1mL DMF/MTBE(1/9，v/v)中在37℃下振荡。对于三种溶剂，制备三份这样相同的混合物。对于所有三种溶剂，分别在1、24和48h之后过滤三份混合物，在每种情况下加入含有5mg Cbz-Phe-OCam和1.5当量的H-Phe-NH2的1mLDMF/THF(1/9，v/v)，并在37℃下振荡反应混合物。为了比较，将1mL含有5mg Cbz-Phe-OCam和1.5当量的H-Phe-NH2的1mL DMF/THF(1/9，v/v)与之前未在有机溶剂中振荡的5mg Alcalase-CLEA-OM和25mg分子筛在37℃下振荡。1h后取出样品，并通过HPLC测定转化成Cbz-Phe-Phe-NH2的转化率。通过将用有机溶剂处理过的Alcalase-CLEA-OM获得的Cbz-Phe-Phe-NH2的量(mmol)除以用未经处理的Alcalase-CLEA-OM获得的Cbz-Phe-Phe-NH2的量(mmol)x 100％来计算相对活性。
如在所附的附图2中可见，Alcalase-CLEA-OM在含有分子筛的干燥的有机溶剂中缓慢失活。
再活化
将5mg Alcalase-CLEA-OM和25mg分子筛分别在1mL DMF、1mL二氯甲烷和1mL DMF/MTBE(1/9，v/v)中在37℃下振荡。对于所有三种溶剂，制备三份相同的混合物。对于所有三种溶剂，分别在1、24和48h之后过滤三份混合物，在每种情况下加入含有5mg Cbz-Val-Phe-OMe的1mL(1/1，v/v)DMF/磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH＝7.5)，并在37℃下振荡反应混合物。为了比较，将1mL含有5mg Cbz-Val-Phe-Ome的(1/1，v/v)DMF/磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH＝7.5)与之前未在有机溶剂中振荡的5mg Alcalase-CLEA-OM和25mg分子筛在37℃下振荡。1h后取出样品，并通过HPLC测定转化成Cbz-Val-Phe-OH的转化率。通过将用有机溶剂处理过的Alcalase-CLEA-OM通过水解获得的Cbz-Val-Phe-OH的量(mmol)除以用未经处理的Alcalase-CLEA-OM通过水解获得的Cbz-Val-Phe-OH的量(mmol)x 100％来计算相对活性。
如在所附的附图3中可见，在含有分子筛的干燥的有机溶剂中缓慢失活的Alcalase-CLEA-OM，可以在含水缓冲溶液中再活化。
实施例11
使用多种含量的分子筛的酶失活和在含水缓冲溶液中再活化
失活
向在0.5mL二氯甲烷中的10mg Alcalase-CLEA-OM的四份同样的混合物中分别加入10、20、30和50mg分子筛将混合物在37℃下，以200rpm振荡20小时。然后，加入含有0.2mM Cbz-Phe-OCam和0.3mM H-Phe-NH2的0.5mL二氯甲烷，并将反应混合物在37℃下，以200rpm振荡。1h后取出样品，并通过HPLC测定转化成Cbz-Phe-Phe-NH2的转化率。通过将通过酶促偶联反应获得的Cbz-Phe-Phe-NH2的量(mmol)除以通过具有最高的转化率的酶促偶联反应(即10mg分子筛的情况)获得的Cbz-Phe-Phe-NH2的量(mmol)x 100％来计算相对活性。
使用已用多种用量的分子筛使其失活的Alcalase-CLEA-OM来合成Cbz-Phe-Phe-NH2。
如在以上表格中可见，由于使用较大量的分子筛而太干燥的条件可导致较高的酶失活。
再活化
使用氮气流将以上四份反应混合物的二氯甲烷蒸发。然后，加入含有5mgCbz-Asn-OMe的1mL 100mM磷酸盐缓冲液(pH8)，将反应混合物在37℃下以200rpm振荡。1h后取出样品，并通过HPLC测定转化成Cbz-Asn-OH的转化率。通过将通过酶促水解获得的Cbz-Asn-OH的量(mmol)除以通过具有最高的转化率的酶促水解(即50mg分子筛的情况)获得的Cbz-Asn-OH的量(mmol)x 100％来计算相对活性。
使用已用多种用量的分子筛使其失活的Alcalase-CLEA-OM水解Cbz-Asn-OMe。
如从以上表格可见，水解性Alcalase-CLEA-OM的活性与其之前的失活程度相当，并且不依赖于其之前的失活程度，表明了酶活性可以在水溶液中恢复。
在序列表中使用的简写：
Ac            ＝   乙酰基
Boc           ＝   叔丁氧羰基
NH2           ＝   胺
OCam          ＝   羧酰胺甲酯
OtBu          ＝   叔丁酯
Pbf           ＝   2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并-呋喃-5-磺酰基
tBu           ＝   叔丁基
Tmob          ＝   2,4,6-三甲氧基苄基
Trt           ＝   三苯甲基
Xan           ＝   呫吨基
附图：
图1：水含量对Alcalase-CLEA-OM的合成/水解(S/H)比率的影响。
图2：Alcalase-CLEA-OM在含有分子筛的三种不同的有机溶剂(混合物)中的失活。
图3：Alcalase-CLEA-OM在含水缓冲溶液中的失活。
图4：随时间消耗的Hydranal  2溶液的量。

Claims (17)

1.酶促合成寡肽的方法，所述方法包括将
i)包含4个或更多氨基酸残基的寡肽酯，
-其包含至少两个氨基酸残基，每个氨基酸残基带有被保护基保护的侧链官能团，并且包含活化的C末端酯，所述C末端酯由通式C(＝O)-O-CX2-C(＝O)N-R1R2表示，其中，每个X各自独立地表示氢原子或烷基或芳基，并且R1表示氢原子或烷基或芳基，R2表示氢原子或烷基或芳基或带有C末端羧酰胺或羧酸官能团的氨基酸残基或肽残基，所述氨基酸残基或肽残基任选地在氨基酸残基的侧链官能团或在肽残基的一个或多个侧链官能团上被保护，
-并且其中，寡肽酯任选地包含N末端保护，
与
ii)包含4个或更多氨基酸残基的寡肽亲核剂，
-其包含N末端胺基，和至少两个氨基酸残基，每个氨基酸残基带有被保护基保护的侧链官能团，并且
-其中，所述寡肽亲核剂任选地包含C末端保护，
偶联，所述偶联在包含相对于偶联反应主要发生于其中的液体总量的0.1体积％或以下的水的有机溶剂或有机溶剂混合物中，在枯草杆菌蛋白酶的存在下施行，并且其中除去在偶联反应过程期间通过酶释放的水。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，寡肽酯通过使用连接物的固相合成来获得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，连接物是Sieber或Ramage连接物。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，所有侧链官能团中的至少50％被保护。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，每个X表示氢原子。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于，R1和R2两者都表示氢原子。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于，R1表示氢原子，R2表示带有C末端羧酰胺或羧酸官能团的氨基酸残基或肽残基，任选地，其氨基酸残基的侧链官能团或者肽残基的一个或多个侧链官能团被保护。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于，除了寡肽酯的C末端氨基酸残基的侧链官能团之外，寡肽酯和寡肽亲核剂的所有侧链官能团被保护。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于，枯草杆菌蛋白酶是野生型枯草杆菌蛋白酶的变异体。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其特征在于，使用固定形式的枯草杆菌蛋白酶。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其特征在于，枯草杆菌蛋白酶以交联酶聚集体的形式固定。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其特征在于，有机溶剂或有机溶剂混合物包含MTBE、THF、Me-THF、1,2-二甲氧基乙烷、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、TFE、DMF、NMP、DMA或DMSO。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，有机溶剂或有机溶剂混合物包含MTBE、MTBE与DMF或NMP或DMA或DMSO的混合物、二氯甲烷或者二氯甲烷与DMF或NMP或DMA或DMSO的混合物。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其特征在于，有机溶剂或有机溶剂混合物具有0.05体积％或以下的水含量。
15.根据权利要求1-14中任意一项所述的方法，其特征在于，连续除去通过酶释放的水。
16.根据权利要求1-15中任意一项所述的方法，其特征在于，使用分子筛除去通过酶释放的水。
17.根据权利要求1-16中任意一项所述的方法，其特征在于，偶联反应在不存在盐的条件下进行。
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