WO2003093467A1 - Proteine mit (r)-hydroxynitril lyase-aktivität aus prunus laurocerasus und sorbus aucuparia - Google Patents

Proteine mit (r)-hydroxynitril lyase-aktivität aus prunus laurocerasus und sorbus aucuparia Download PDF

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WO2003093467A1
WO2003093467A1 PCT/EP2003/004679 EP0304679W WO03093467A1 WO 2003093467 A1 WO2003093467 A1 WO 2003093467A1 EP 0304679 W EP0304679 W EP 0304679W WO 03093467 A1 WO03093467 A1 WO 03093467A1
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protein
amino acid
sequence
proteins
protein according
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PCT/EP2003/004679
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Thomas Friedrich
Maria Kesseler
Bernhard Hauer
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Basf Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/002—Nitriles (-CN)
    • C12P13/004—Cyanohydrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Definitions

  • the invention relates to novel proteins with (R) -hydroxynitrile lyase ((R) -mandelonitrile lyase) activity of plant origin, nucleic acid sequences coding therefor, expression cassettes, vectors and recombinant microorganisms; Process for the production of these proteins and their use for the enzymatic, in particular enantioselective, enzymatic synthesis of mandelonitrile and / or mandelic acid.
  • Mandelic acid is an important, optically active intermediate in chemical synthesis.
  • (R) - and (S) -mandelic acid are both in demand.
  • Optically active mandelic acid is either produced from (R / S) -mandelonitrile by enzymatic saponification of an enantiomer or directly from HCN and benzaldehyde by enzymatic synthesis using hydroxynitrile lyases. These lyases are particularly accessible from plants. So far there are only a limited number of hydroxynitrile lyases.
  • the object of the present invention was therefore to provide further (R) -hydroxynitrile lyases from new plant sources in order to be able to use a broader range of useful enzymes for the enzymatic synthesis of mandelonitrile and mandelic acid enantiomers.
  • enzymes should be provided which, in comparison with the corresponding enzyme from almond (Prunus duicis), have an increased stability towards surface-active substances, e.g. SDS (sodium dodecyl sulfate).
  • This task was surprisingly achieved by providing new protein with (R) - hydroxynitrile lyase activity (E.C.4.1.2.10) isolatable from leaves of Prunus laurocerasus or seeds from Sorbus aucuparia.
  • proteins isolable from leaves of Prunus laurocerasus which are characterized by an amino acid sequence comprising at least 10, such as 10 to 15, consecutive amino acid residues according to SEQ ID NO: 1, 2, or 3 or functional Equivalents thereof; and b) proteins isolable from seeds of Sorbus aucuparia, characterized by an amino acid sequence comprising at least 10, such as 10 to 24, successive amino acid residues according to SEQ ID NO: 4 or functional equivalents thereof;
  • the functional equivalent also having at least a partial sequence of at least 5, e.g. 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more consecutive amino acid residues from an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4.
  • LAETSAHDFSYLKFV (SEQ IN NO: 1)
  • LAXTSAHDFSYLKFV (SEQ IN NO: 2)
  • SPTHDFEYLKFVYNA (SEQ IN NO: 3)
  • LATPSEHDFSYXLVWDATDLETE (SEQ IN NO: 4)
  • Non-limiting examples of preferred partial sequences are:
  • SEQ ID NO: 3 aa1-aa5, aa1-aa6 or aa1-aa7
  • SEQ ID NO: 4 amino acid residue
  • “functional equivalents” or analogs of the specifically disclosed polypeptides or proteins are, in particular, different polypeptides or proteins from the specifically described, which furthermore have the desired biological activity, in particular enzyme activity.
  • “functional equivalents” are understood to mean, in particular, mutants which, in at least one of the sequence positions mentioned, have a different amino acid than the one specifically mentioned but nevertheless have at least one biological activity according to the invention. "Functional equivalents” thus encompass the mutants obtainable by one or more amino acid additions, substitutions, deletions and / or inversions, the changes mentioned being able to occur in any sequence position as long as they lead to a mutant with the property profile according to the invention. Examples of suitable amino acid substitutions are summarized in the following table:
  • “Functional equivalents” naturally also include polypeptides that are accessible from other sources or organisms, as well as naturally occurring variants. For example, areas of homologous sequence regions are determined by sequence comparison and, based on the specific requirements of the invention, ascertain equivalent enzymes.
  • “Functional equivalents” also include fragments, preferably individual domains or sequence motifs, of the polypeptides according to the invention, which e.g. have the desired biological function.
  • Salts means both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules according to the invention.
  • Salts of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts, such as, for example, sodium, calcium, ammonium, iron and zinc salts, and salts with organic bases, such as, for example, amines, such as triethanolamine, arginine , Lysine, piperidine and the like.
  • Acid addition salts such as, for example, salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and salts with organic acids, such as acetic acid and oxalic acid, are also a subject of the invention.
  • “Functional derivatives” of polypeptides according to the invention can also be prepared on functional amino acid side groups or on their N- or C-terminal end using known techniques.
  • Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups, obtainable by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups, produced by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxyl groups, produced by reaction with acyl groups.
  • “Functional equivalents” also include enzyme forms which can be obtained from the original form by varying the carbohydrate content (chemical modification, partial or complete elimination or addition of carbohydrate residues).
  • Fusion proteins are also fusion proteins which contain one of the abovementioned polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one further, functionally different, heterologous sequence in functional N- or C-terminal linkage (ie without mutual substantial functional impairment of the fusion protein - parts).
  • heterologous sequences are, for example, signal peptides, enzymes or immunoglobulins.
  • “Functional equivalents” encompassed according to the invention are homologs to the specifically disclosed polypeptides or proteins. These have at least 60%, preferably at least 75%, especially at least 85%, e.g. 90, 95, 96, 97 98 or 99%, homology to one of the specifically disclosed sequences, calculated according to the algorithm by Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Be. (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448. “Disclosed sequences” in the sense of the invention are also those complete protein sequences which can be identified with the aid of generally known working methods, starting from the partial sequences described here.
  • Such complete sequences can be produced and sequenced by peptide fragments of the enzymes or by isolation , Sequencing and translation of the corresponding coding nucleic acid sequence are provided.
  • "Homology” in the sense of the invention relates in particular to the total length of such full sequences. “Homology” preferably means percentage identity of the amino acid residues between a sequence “disclosed” here and a further sequence to be compared therewith.
  • Homologs of the proteins or polypeptides of the invention can be generated by mutagenesis, e.g. by point mutation or shortening of the protein.
  • the term "homolog” as used here relates to a variant form of the protein which acts as an agonist or antagonist of the protein activity.
  • Homologs of the protein according to the invention can be identified by screening combinatorial banks of mutants, such as, for example, shortening mutants.
  • a varied bank of protein variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, such as, for example, by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides.
  • methods that can be used to generate banks of potential homologs from a degenerate oligonucleotide sequence. Chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be performed in an automated DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into an appropriate expression vector.
  • degenerate set of genes makes it possible to provide all sequences in a mixture which encode the desired set of potential protein sequences.
  • Methods for the synthesis of degenerate oligonucleotides are known to the person skilled in the art (eg Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) known (e.g. Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).
  • a bank of coding sequence fragments can be obtained by treating a double-stranded PC (R) fragment of a coding sequence with a nuclease under conditions where nicking occurs only about once per molecule, denaturing the double-stranded DNA, renaturing the DNA to form double-stranded DNA, which may include sense / antisense pairs from various nodded products, removing single-stranded sections from newly formed duplexes by treatment with S1 nuclease and ligating the resulting fragment library into an expression vector.
  • This method can be used to derive an expression bank which encodes N-terminal, C-terminal and internal fragments with different sizes of the protein according to the invention.
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • Preferred functional equivalents according to the invention have a sequence which deviates from SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 in at least one position or, compared to the unchanged native enzyme, show a deviation in a position of the full amino acid sequence outside the sequence region according to SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4, with this change in the sequence the (R) -hydroxynitrile lyase activity preferably only insignificantly, ie not by more than about 90%, in particular 50% or not more than 30%, 20% , 10% or 5% changed, ie increased or decreased.
  • the invention relates in particular to functional equivalents which comprise at least one partial sequence of at least 10 consecutive amino acids from the sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 and which have the above activity towards the reference substrate.
  • the (R) -hydroxynitrile lyases according to the invention preferably have a molecular weight of approximately 85 ⁇ 5 kDa, determined by SDS gel electrophoresis under reducing conditions.
  • the invention also encompasses polynucleotides encoding the above (R) -hydroxynitrile lyases.
  • the invention relates in particular to nucleic acid sequences (single and double stranded DNA and RNA sequences, such as cDNA and mRNA) coding for one of the above polypeptides or proteins and their functional equivalents. These can also e.g. be accessible using artificial nucleotide analogs.
  • the invention relates both to isolated nucleic acid molecules which code for polypeptides according to the invention or proteins or biologically active sections thereof, and to nucleic acid fragments which e.g. can be used as hybridization probes or primers for the identification or amplification of coding nucleic acids according to the invention.
  • nucleic acid molecules according to the invention can also contain untranslated sequences from the 3 'and / or 5' end of the coding gene region
  • An "isolated" nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid and, moreover, can be substantially free of other cellular material or culture medium when produced by recombinant techniques, or free of chemical precursors or other chemicals be when it's chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention can be isolated using standard molecular biological techniques and the sequence information provided according to the invention.
  • cDNA can be isolated from a suitable cDNA library by using one of the specifically disclosed complete sequences or a section thereof as a hybridization probe and standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • a nucleic acid molecule comprising one of the disclosed sequences or a portion thereof can be isolated by polymerase chain reaction using the oligonucleotide primers which have been created on the basis of this sequence.
  • the nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • the oligonucleotides according to the invention can also be obtained by standard synthetic methods, e.g. with an automatic DNA synthesizer.
  • the invention further comprises the nucleic acid molecules complementary to the specifically described nucleotide sequences or a section thereof.
  • the nucleotide sequences according to the invention enable the generation of probes and primes which can be used for the identification and / or cloning of homologous sequences in other cell types and organisms.
  • probes or primers usually comprise a nucleotide sequence region which, under stringent conditions, can be attached to at least about 12, preferably at least about 25, e.g. about 40, 50 or 75 successive nucleotides of a sense strand of a nucleic acid sequence according to the invention or a corresponding antisense strand are hybridized.
  • nucleic acid sequences according to the invention are derived from those coding for the above amino acid sequences (including partial sequences according to SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4) Nucleic acid sequences and differ from them by addition, substitution, insertion or deletion of one or more nucleotides, but continue to code for polypeptides with the desired profile of properties, such as, in particular, the (R) -hydroxynitrile lyase activity.
  • nucleic acid sequences which comprise so-called silent mutations or which have been modified in accordance with the codon usage of a specific source or host organism, in comparison to a specifically named sequence, as well as naturally occurring variants, such as e.g. Splice variants or allele variants, thereof. Sequences that can also be obtained are conservative nucleotide substitutions (i.e. the amino acid in question is replaced by an amino acid of the same charge, size, polarity and / or solubility).
  • the invention also relates to the molecules derived from the specifically open-hard nucleic acids by sequence polymorphisms. These genetic polymorphisms can exist between individuals within a population due to natural variation. These natural variations usually cause a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of a gene.
  • the invention also encompasses nucleic acid sequences which hybridize with the above-mentioned coding sequences or are complementary thereto.
  • These polynucleotides can be found when screening genomic or cDNA libraries and, if appropriate, can be amplified therefrom using suitable primers by means of PCR and then isolated, for example, using suitable probes.
  • Another possibility is the transformation of suitable microorganisms with polynucleotides or vectors according to the invention, the multiplication of the microorganisms and thus the polynucleotides and their subsequent isolation.
  • polynucleotides according to the invention can also be synthesized chemically.
  • the property of being able to “hybridize” to polynucleotides means the ability of a poly- or oligonucleotide to bind to an almost complementary sequence under stringent conditions, while under these conditions there are no unspecific bonds between non-complementary partners.
  • the sequences should be 70-100%, preferably 90-100%, be complementary.
  • the property of complementary sequences of being able to bind specifically to one another is exploited, for example, in the Northern or Southern blot technique or in the primer binding in PCR or RT-PCR. Usually, oligonucleotides with a length of 30 base pairs or more are used for this.
  • Strict conditions mean, for example, in the Northem blot technique the use of a 50-70 ° C, preferably 60-65 ° C warm washing solution, for example 0.1x SSC buffer with 0.1% SDS (20x SSC: 3M NaCI, 0.3M Na citrate, pH 7.0) for the elution of unspecifically hybridized cDNA probes or oligonucleotides.
  • a 50-70 ° C preferably 60-65 ° C warm washing solution
  • 0.1x SSC buffer with 0.1% SDS (20x SSC: 3M NaCI, 0.3M Na citrate, pH 7.0) for the elution of unspecifically hybridized cDNA probes or oligonucleotides.
  • SDS 3M NaCI, 0.3M Na citrate, pH 7.0
  • the invention also relates to expression cassettes which comprise at least one polynucleotide according to the invention which is operatively linked to regulatory nucleic acid sequences.
  • a promoter sequence is preferably located 5 'upstream from the polynucleotide according to the invention and in this way enables controlled expression of the (R) -hydroxynitrile lyase.
  • a terminator sequence and, if appropriate, further customary regulatory elements are particularly preferably located 3 'downstream of the polynucleotide according to the invention, in each case operatively linked to the sequence encoding the (R) -hydroxynitrile lyase.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can perform its function as intended before, during or after expression of the coding sequence.
  • further operatively linkable sequences are targeting sequences and translation enhancers, enhancers, polyadenylation signals and the like.
  • Other useful regulatory elements include selectable markers, reporter genes, amplification signals, origins of replication and the like.
  • the natural regulatory sequence can still be present before the actual structural gene. This natural regulation can possibly be switched off by genetic modification and the expression of the genes increased or decreased.
  • the expression cassette can, however, also have a simpler structure, ie no additional regulation signals are inserted in front of the structural gene and the natural before the promoter with its regulation is not removed. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that regulation no longer takes place and gene expression is increased or decreased.
  • the nucleic acid sequences can be contained in one or more copies in the expression cassette.
  • Examples of useful promoters are: cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, tre -, ara-, SP6-, lambda-P (R) -orlambda-PL-PiOmotor I which are advantageously used in gram-negative bacteria; as well as the gram-positive promoters amy and SPO2, the yeast promoters ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH or the plant promoters CaMV / 35S, SSU, OCS r lib4, usp, STLS1, B33, nos or the ubiquitin - or phaseoline promoter.
  • inducible promoters such as, for example, light-inducible and in particular temperature-inducible promoters, such as the PrPI promoter, is particularly preferred.
  • the regulatory sequences mentioned are intended to enable the targeted expression of the nucleic acid sequences and the protein expression. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the expression and thereby increase or decrease it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an increase in translation is also possible, for example, by increasing the stability of the mRNA.
  • Another object of the invention is a method for producing a protein as defined above, wherein a microorganism transformed with a suitable expression vector is cultivated and the protein is isolated from the culture; as well as the recombinant microorganisms used for this.
  • the invention furthermore relates to processes for the recombinant production of one of the lyases according to the invention, wherein a lyase-producing microorganism is cultivated, optionally inducing the expression of the lyase and isolating the lyase from the culture.
  • the lyase can thus also be produced on an industrial scale, if this is desired.
  • the recombinant microorganism can be cultivated and fermented by known methods. Bacteria can be propagated, for example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 ° C and a pH of 6 to 9. Suitable cultivation conditions are described in detail, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
  • the cells are then disrupted and the enzyme is obtained from the lysate by known protein isolation methods.
  • the cells can optionally be operated by high-frequency ultrasound, by high pressure, e.g. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by a combination of several of the processes listed.
  • Purification of the lyase can be achieved using known chromatographic methods, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as Q-Sepharose chromatography,
  • vector systems or oligonucleotides which extend the cDNA by certain nucleotide sequences and thus code for modified polypeptides or fusion proteins which serve for easier purification.
  • suitable modifications are, for example,
  • 'tags' such as, for example, the modification known as hexa-histidine anchor or epitopes which can be recognized as antigens of antibodies (described, for example, in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor (NN.) Press)
  • anchors can be used to attach the proteins to a solid support, such as a polymer matrix. serve, which can be filled, for example, in a chromatography column, or can be used on a microtiter plate or on another support.
  • these anchors can also be used to recognize the proteins.
  • customary markers such as fluorescent dyes, enzyme markers, which form a detectable reaction product after reaction with a substrate, or radioactive markers, alone or in combination with the anchors, can be used to derivatize the proteins.
  • Further preferred methods relate to the isolation of a protein with (R) -hydroxynitrile lyase activity, wherein leaves of Prunus laurocerasus are crushed, an aqueous extract is prepared and this is purified by ion-exchange chromatography; or crushed Sorbus aucuparia seeds, prepared an aqueous extract and purified it by gel chromatography and ion exchange chromatography.
  • the invention also relates to the proteins produced by the above processes.
  • enzyme enrichment is carried out using standard biochemical methods, e.g. described by T.G. Cooper in Biochemical Working Methods, published by Walter de Gruyter, Berlin, New York, (1981).
  • cleaning processes such as precipitation, e.g. B. with ammonium sulfate, ion exchange chromatography, gel chromatography, affinity chromatography, e.g. B. immunoaffinity chromatography, and isoelectric focusing, and combinations of such methods.
  • the invention further relates to a process for the preferably enantioselective synthesis of (R) -mandelic acid using one of the novel proteins according to the invention, wherein
  • step b) the protein or a microorganism expressing this protein is brought into contact with benzaldehyde and HCN; and b) the (R) -mandelonitrile (a cyanohydrin) optionally isolated and then converted to (R) -mandelic acid.
  • the reaction in step b) is preferably carried out chemically. Suitable methods for this are known to the person skilled in the art.
  • EP-A-1 160 235 describes a chemical route for the production of alpha-hydroxycarboxylic acids by hydrolysis of the corresponding cyanohydrins.
  • the microorganisms produced according to the invention can be cultured continuously or batchwise in the batch process (batch cultivation) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) for the production of the nitrite.
  • batch cultivation livestock cultivation
  • feed process fed batch
  • repetitive feed process repetitive feed process
  • a summary of known cultivation methods can be found in the textbook by Chmiel (bioprocess engineering 1. Introduction to bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral devices (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994) ) to find.
  • the culture medium to be used has to meet the requirements of the respective strains in a suitable manner. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology” of the American Society for Bacteriology (Washington D.O., USA, 1981).
  • These media which can be used according to the invention usually comprise one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and / or trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • sugars such as mono-, di- or polysaccharides.
  • very good carbon sources are glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Sugar can also be added to the media through complex compounds such as molasses or other by-products of sugar refining. It can also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible carbon sources are oils and fats such as.
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds.
  • Exemplary nitrogen sources include ammo niac gas or ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate, nitrates, urea, amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soy flour, soy protein, yeast extract, meat extract and others.
  • the nitrogen sources can be used individually or as a mixture.
  • Inorganic salt compounds that may be included in the media include the chloride, phosphorus or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron
  • Inorganic sulfur-containing compounds such as sulfates, sulfites, dithionites, tetrathionates, thiosulfates, sulfides, but also organic sulfur compounds such as mercaptans and thiols can be used as the sulfur source.
  • Phosphoric acid potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the source of phosphorus.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid.
  • the fermentation media used according to the invention usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • growth factors and salts often originate from complex media components such as yeast extract, brass, corn steep liquor and the like. Suitable precursors can also be added to the culture medium.
  • the exact composition of the media connections strongly depends on the respective experiment and is decided individually for each specific case. Information on media optimization is available from the textbook "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 199635773).
  • Growth media can also be obtained from commercial suppliers, such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.
  • All media components are, either by heat (20 min at 1, 5 bar and 121 ° C) or sterilized by sterile filtration.
  • the components can be sterilized either together or, if necessary, separately. All media components can be present at the beginning of the cultivation or can be added continuously or in batches.
  • the temperature of the culture is normally between 15 ° C and 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range from 5 to 8.5, preferably around 7.0.
  • the pH for cultivation can be checked during the cultivation by adding basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid.
  • Antschaummitte.l such. B. fatty acid polyglycol esters can be used.
  • suitable selectively acting substances such as, for. B. antibiotics.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such as. B. ambient air, entered into the culture.
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C and.
  • the culture is continued until a maximum of the desired product has formed. This goal is usually achieved within 10 hours to 160 hours.
  • the fermentation broths thus obtained usually have a dry matter of 7.5 to 25% by weight.
  • the fermentation is carried out with limited sugar at least at the end, but in particular for at least 30% of the fermentation period. This means that the concentration of usable sugar in the fermentation medium is kept to> 0 to 3 g / l or reduced during this time.
  • the fermentation broth is then processed further.
  • the biomass can be wholly or partially separated by methods such as. B. centrifugation, filtration, decanting or a combination of these methods can be removed from the fermentation broth or left completely in it.
  • the fermentation broth using known methods, such as. B. using a rotary evaporator, thin film evaporator, falling film evaporator, by reverse osmosis, or thickened or concentrated by nanofiltration.
  • This concentrated fermentation broth can then be worked up by freeze drying, spray drying, spray granulation or by other processes.
  • the product-containing broth is subjected to chromatography with a suitable resin after the biomass has been separated off, the desired product or the impurities being wholly or partly retained on the chromatography resin.
  • chromatography steps can be repeated if necessary, using the same or different chromatography resins.
  • the person skilled in the art is skilled in the selection of the suitable chromatography resins and their most effective application.
  • the purified product can be concentrated by filtration or ultrafiltration and kept at a temperature at which the stability of the product is maximum.
  • the identity and purity of the isolated compound (s) can be determined by prior art techniques. These include high-performance liquid chromatography (HPLC), spectroscopic methods, staining methods, thin-layer chromatography, NIRS, enzyme tests or microbiological tests. These analysis methods are summarized in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; and Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp.
  • the invention furthermore relates to the use of a protein according to the invention, a polynucleotide, an expression cassette, a vector or a microorganism as defined above for the enantioselective production of a mandelic acid and / or mandelonitrile isomer.
  • Figure 1 (A) an SDS gel of the (R) -hydroxynitrile lyase from P. laurocerasus; Lanes 1 and 4: marker proteins (from above: 106 kDa, 77 kDa, 50.8 kDa), lanes 2 and 3: hydroxynitrile lyase; and (B) an SDS gel of the (R) -hydroxynitrile lyase from S. aucuparia; Lanes 1 and 4: marker proteins (from above: 106 kDa, 77 kDa, 50.8 kDa), lanes 2 and 3: hydroxynitrile lyase.
  • Figure 2 (A) shows an amino acid sequence alignment between SEQ ID NO: 2 (P. laurocerasus), above and (R) -mandelonitrile lyase isoform from almond (Prunus duicis), below (Swiss-Prot Accession No: O 24243); Smith-Waterman score: -93,333% identity overlap 15 amino acids
  • Example 1 Measurement of the enzymatic activity
  • n ⁇ l sample (volume n depending on enzyme activity) (the enzyme from almonds serves as a positive control, it converts (R) -mandelonitrile) dilute ad 600 ⁇ l with water - 200 ⁇ l 1mol / l Na citrate pH 5.0
  • Test buffer Na citrate 1 M pH 5.0
  • Substrate Mandelonitrile (Aldrich 11, 602-5) 40 mM in 0.1 M Na citrate buffer, prepare freshly
  • Reagent blank test batch (in 1.5 ml Eppendorf tube)
  • Test buffer Na citrate 0.1 M pH 5.0
  • Substrate Mandelonitrile (Aldrich 11, 602-5) 8mM in test buffer, freshly prepared Samples: Dilution in test buffer, pH important
  • Controls positive: enzyme from almonds. Negative: sample without substrate
  • Microtiter plate UV Star from Greiner 655801
  • Example 2 Purification of the (R) -hydroxynitrile lyase from Prunus laurocerasus (cherry laurel)
  • the protein purified in this way was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the preparation consists of over 99% only one protein band.
  • the protein has a molecular weight of approximately 85 kDa (FIG. 1 (A)).
  • the protein separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was blotted onto a PVDF membrane and the N-terminal sequence was determined. Three different N-terminal sequences (SEQ ID NO: 1, 2 and 3) were obtained, which indicates the presence of isoenzymes in the preparation.
  • 200g seeds are ground together with dry ice into a fine powder in a household mixer.
  • the powder is then resuspended at 4 degrees Celsius in 20mM MES, 20mM ascorbic acid, 100mM lysine, pH 6.5 and stirred for two hours.
  • Large amounts of HCN (> 20ppm) and a strong smell of benzaldehyde are noticeable at this stage.
  • Coarse particles are removed via gauze and the solution clarified by centrifugation. The supernatant was precipitated with 80% ammonium sulfate saturation, resuspended in 100 ml 20 mM MES, pH 6.5 and dialyzed against the same buffer.
  • the value fraction of the Superdex chromatography was then further purified on a Q-Sepharose (Waters, Protein PAK (HRP, volume 8 ml).
  • the column was equilibrated in 20 mM phosphate buffer pH 7.2 and the sample was applied. After washing, the gradient was linear after 20 mM phosphate, pH 7.2, 1 M NaCl eluted The activity eluted sharply in a peak (94U / mg specific activity).
  • the protein purified in this way was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Over 80% of the preparation consists of only one protein band. The protein has a molecular weight of approximately 85 kDa (FIG. 1 (B)).
  • the protein separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was blotted onto a PVDF membrane and the N-terminal sequence was determined. An N-terminal sequence according to SEQ ID NO: 4 was obtained, which showed a pronounced sequence agreement with the oxynitrile lyase from Prunus serotina (late bird cherry) (FIG. 2 (B)).
  • the enzymes according to the invention are less sensitive to SDS (lower percentage loss in activity) and, at the same SDS concentration, have a higher residual activity than the almond enzyme.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Proteine mit (R)-Hydroxynitril Lyase-Aktivität pflanzlichen Ursprungs, dafür kodierende Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten, Vektoren und rekombinante Mikroorganismen; Verfahren zur Herstellung dieser Proteine und deren Verwendung zur enzymatischen, insbesondere enantioselektiven enzymatischen Synthesen von Mandelonitril und/oder Mandelsäure.

Description

PROTEINE MIT (R) -HYDROXYNITRIL LYASE-AKTIVITÄT AUS PRUNUS LAUROCERASUS UND SORBUS AUCUPARIA
Die Erfindung betrifft neuartige Proteine mit (R)-Hydroxynitril Lyase ((R)-Mandelonitril Lyase)- Aktivität pflanzlichen Ursprungs, dafür kodierende Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten, Vektoren und rekombinante Mikroorganismen; Verfahren zur Herstellung dieser Proteine und deren Verwendung zur enzymatischen, insbesondere enantioselektiven enzymatischen Synthese von Mandelonitril und/oder Mandelsäure.
Hintergrund der Erfindung
Mandelsäure ist ein wichtiges, optisch aktives Zwischenprodukt in der chemischen Synthese. (R)- und (S)-Mandelsäure werden beide nachgefragt. Optisch aktive Mandelsäure wird entweder aus (R/S)-Mandelonitril durch enzymatische Verseifung eines Enantiomeren oder direkt aus HCN und Benzaldehyd durch enzymatische Synthese mit Hilfe von Hydroxynitril Lyasen hergestellt. Diese Lyasen sind insbesondere aus Pflanzen zugänglich. Es gibt bisher nur eine begrenzte Anzahl von Hydroxynitril Lyasen.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung weiterer (R)-Hydroxynitril Lyasen aus neuen pflanzlichen Quellen, um für die enzymatische Synthese von Mandelonitril- und Mandelsäure-Enantiomeren auf eine breitere Palette von brauchbaren Enzymen zurückgreifen zu können. Insbesondere sollten Enzyme bereitgestellt werden, welche im Vergleich zum ent- sprechenden Enzym aus Mandel (Prunus duicis) eine erhöhte Stabilität gegenüber oberflächenaktiven Substanzen, wie z.B. SDS (Natriumdodecylsulfat), aufweisen.
Diese Aufgabe konnte überraschenderweise durch die Bereitstellung neuer Proteins mit (R)- Hydroxynitril Lyase-Aktivität (E.C.4.1.2.10) isolierbar aus Blättern von Prunus laurocerasus oder Samen von Sorbus aucuparia, gelöst.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Insbesondere wurde die obige Aufgabe gelöst durch Bereitstellung von a) Proteinen isolierbar aus Blättern von Prunus laurocerasus, die gekennzeichnet sind durch eine Aminosäuresequenz umfassend wenigstens 10, wie z.B. 10 bis 15, aufeinanderfolgende Aminosäurereste gemäß SEQ ID NO: 1 , 2, oder 3 oder funktionale Äquiva- lente davon; sowie b) Proteinen isolierbar aus Samen von Sorbus aucuparia, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz umfassend wenigstens 10, wie z.B. 10 bis 24, aufeinanderfolgende A- minosäurereste gemäß SEQ ID NO: 4 oder funktionale Äquivalente davon;
wobei das funktionale Äquivalent ebenfalls wenigstens eine Teilsequenz von wenigstens 5, wie z.B. 5 , 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr aufeinanderfolgenden Aminosäureresten aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 2, 3 oder 4 umfasst.
LAETSAHDFSYLKFV (SEQ IN NO:1) LAXTSAHDFSYLKFV (SEQ IN NO:2) SPTHDFEYLKFVYNA (SEQ IN NO:3) LATPSEHDFSYXLVWDATDLETE (SEQ IN NO:4)
worin X für eine beliebige Aminosäure steht.
Nichtlimitierende Beispielen für bevorzugte Teilsequenzen sind:
SEQ ID NO:3: aa1-aa5, aa1-aa6 oder aa1-aa7
SEQ ID NO:4: aa1-aa5, aa1-aa7, aa4-aa8, aa13-aa17, aa13-aa18, aa13-aa23 (aa= Aminosäurerest)
Die oben genannten Proteine werden im Folgenden der Einfachheit halber als (R)-Hydroxynitril Lyasen bezeichnet.
"Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Polypeptide oder Proteine sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere von den konkret Beschriebenen verschiedene Polypeptide oder Proteine, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, insbesondere Enzymaktivität besitzen. Unter "funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere Mutanten, welche in wenigstens einer der oben genannten Sequenzpositionen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem wenigstens eine erfindungsgemäße biologische Aktivität besitzen. "Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Beispiele geeigneter Aminosäuresubstitutionen sind in folgender Tabelle zusammengefasst:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gin; His
Asp Glu
Cys Ser
Gin Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn ; Gin lle Leu; Val
Leu lle; Val
Lys Arg ; Gin ; Glu
Met Leu ; lle
Phe Met ; Leu ; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp ; Phe
Val lle; Leu
Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.
"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Quellen oder Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise las- sen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.
"Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch Präkursoren der beschriebenen Polypeptide sowie funktionale Derivate und Salze der Polypeptide. Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Cal- cium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktioneilen Aminosäure- Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken eben- falls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.
„Funktionale Äquivalente" umfassen außerdem Enzymformen, welche durch Variation des Koh- lenhydratanteils (chemischen Modifikation, teilweise oder vollständige Abspaltung oder Hinzufügung von Kohlehydratresten) aus der ursprünglichen Form erhältlich sind.
"Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche ein der oben genannten Po- lypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsprote- inteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Sig- nalpeptide, Enzyme oder Immunoglobuline.
Erfindungsgemäß mit umfasste "funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offen- barten Polypeptiden oder Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90, 95, 96, 97 98 oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Sequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. „Offenbarte Sequenzen" im Sinne der Erfindung sind auch solche Protein-Vollsequenzen, welche unter Zuhilfenahme allgemein bekann- ter Arbeitsmethoden, ausgehend von der hierin beschriebenen Teilsequenzen, identifizierbar- sind. Beispielsweise können derartige Vollsequenzen durch Herstellung und Sequenzierung von Peptidfragmenten der Enzyme oder durch Isolierung, Sequenzierung und Translation der korrespondierenden kodierenden Nukleinsäuresequenz bereitgestellt werden. „Homologie" im Sinne der Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Gesamtlänge solcher Vollsequenzen. „Ho- mologie" bedeutet bevorzugt prozentuale Identität der Aminosäurereste zwischen einer hierin „offenbarten" Sequenz und einer damit zu vergleichenden weiteren Sequenz.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins. Der Begriff "Homolog", wie er hier verwendet wird, betrifft eine Variante Form des Proteins, die als Agonist oder Antago- nist der Protein-Aktivität wirkt.
Homologe des erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäure- ebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen codieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (Z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura etal. (1984) mann bekannt (Z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura etal. (1984) Annu. Rev. Bio- chem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).
Zusätzlich können Banken von Fragmenten des Protein-Codons verwendet werden, um eine variegierte Population von Protein-Fragmenten zum Screening und zur anschließenden Selektion von Homologen eines erfindungsgemäßen Proteins zu erzeugen. Bei einer Ausführungsform kann eine Bank von kodierenden Sequenzfragmenten durch Behandeln eines doppelsträngigen PC(R)-Fragmentes einer kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, unter denen ein Nicking nur etwa einmal pro Molekül erfolgt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA, die Sense-/Antisense-Paare von verschiedenen genickten Produkten umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger Abschnitte aus neu gebildeten Duplices durch Behandlung mit S1-Nuclease und Ligieren der resultierenden Fragmentbank in einen Expressionsvektor erzeugt werden. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbank hergeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne Fragmente mit verschiedenen Größen des erfindungsgemäßen Proteins kodiert.
Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese von erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressi- onsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen codiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:7811- 7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331 ). Bevorzugte erfindungsgemäße funktionale Äquivalente weisen eine von SEQ ID NO: 1 , 2, 3 oder 4 in mindestens einer Position abweichende Sequenz auf oder sie zeigen, verglichen mit mit dem unveränderten nativen Enzym, eine Abweichung in einer Position der Aminosäurevollsequenz außerhalb des Sequenzbereichs gemäß SEQ ID NO: 1 , 2, 3 oder 4, wobei diese Veränderung in der Sequenz die (R)-Hydroxynitril Lyase-Aktivität vorzugsweise nur unwesentlich, d.h. nicht um mehr als etwa 90 %, insbesondere 50 % oder nicht mehr als 30 %, 20% ,10% oder 5% verändert, d.h. erhöht oder erniedrigt. Diese Veränderung kann unter Verwendung eines Referenzsubstrates, wie z.B. (R)-Mandelonitril unter standardisierten Bedingungen (wie z.B. 40mM Substrat, 0,2M Citratpuffer, pH 5, T = 20 °C) bestimmt werden.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere solche funktionalen Äquivalente, welche wenigstens eine Teilsequenz von mindestens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 2, 3 oder 4 umfassen und obige Aktivität gegenüber dem Referenzsubstrat besitzen.
Die erfindungsgemäßen (R)-Hydroxynitril Lyasen weisen vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 85 ± 5 kDa, bestimmt durch SDS-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen auf.
Die Erfindung umfasst auch Polynukleotide, die für die obigen (R)-Hydroxynitril Lyasen kodieren.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträn- gige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide oder Proteine und deren funktionalen Äquivalenten. Diese können auch z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sein.
Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, sowie Nukleinsäure- fragmente, die z.B. als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standard- Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der kon- kret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können ferner durch Standard- Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Pri- mem, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologer Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.
Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen sind abgeleitet von den für obige Aminosäuresequenzen (umfassend Teilsequenzen gemäß SEQ ID NO:1, 2, 3 oder 4) kodierenden Nukleinsäuresequenzen und unterscheiden sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide, kodieren aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil, wie insbesondere die erfindungsgemäße (R)-Hydroxynitril Lyase-Anktivität.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon. Gegens- tand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offen- harten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidse- quenz eines Gens.
Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen hybridisieren oder dazu komplementär sind. Diese Polynukleotide lassen sich bei Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.
Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide "hybridisieren" zu können, versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vor- zugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Sou- thern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unterstringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northem-Blot-Technik die Verwendung einer 50 - 70 °C, vorzugsweise 60 - 65 °C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1x SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20x SSC: 3M NaCI, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z.B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Gegenstand der Erfindung sind auch Expressionskassetten, die wenigstens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid umfassen, das mit regulatorischen Nukleinsäuresequenzen operativ ver- knüpft ist. Vorzugsweise liegt 5'-stromaufwärts vom erfindungsgemäßen Polynukleotid eine Promotorsequenz und ermöglicht auf diese Weise eine kontrollierte Expression der (R)- Hydroxynitril Lyase. Besonders bevorzugt liegt 3'-stromabwärts vom erfindungsgemäßen Polynukleotid eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulatorische Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der die (R)-Hydroxynitril Lyase kodierenden Sequenz. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulatorische Elemente derart, dass jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion vor, während oder nach Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für weitere operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Translationsverstärker, Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere brauchbare regulatorische Elemente umfassen selektierbare Marker, Reportergene, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen.
Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Die Expressionskassette kann aber auch einfacher aufgebaut sein, d.h. es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürli- ehe Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette enthalten sein.
Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, tre-, ara-, SP6-, lambda-P(R)-oderlambda-PL-PiOmotorI die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SPO2, die Hefepromotoren ADC1 , MFalpha , AC, P-60, CYC1 , GAPDH oder die Pflanzen- promotoren CaMV/35S, SSU, OCSrlib4, usp, STLS1, B33, nos oder der Ubiquitin- oder Phaseo- lin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z.B. licht- und insbesondere temperaturinduzierbarer Promotoren, wie der PrPI-Promotor.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet wer- den. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und die Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkripti- onssignale wie Promotoren und/oder Enhancer verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA erhöht wird.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß obiger Definition, wobei man einen mit einem geeigneten Expressionsvektortransformierten Mikro- Organismus kultiviert und das Protein aus der Kultur isoliert; sowie die dafür verwendeten re- kombinanten Mikroorganismen.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer der erfindungsgemäßen Lyasen, wobei man einen Lyase-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Lyase induziert und die Lyase aus der Kultur isoliert. Die Lyase kann so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.
Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecu- lar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
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Die Zellen werden dann, falls die Monooxygenase nicht in das Kulturmedium sezerniert wird, aufgeschlossen und das Enzym nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lyti- 15 sehen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Lyase kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose-Chromatographie,
20 lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.
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Besonders vorteilhaft ist es, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende so-
30 genannte 'Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (NN.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.
Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Er- kennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmar- ker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.
Weitere bevorzugte Verfahren betreffen die Isolierung eines Proteins mit (R)-Hydroxynitril Lyase- Aktivität, wobei man Blätter von Prunus laurocerasus zerkleinert, einen wässrigen Extrakt herstellt und diesen durch lonenaustauscherchromatogrophie aufreinigt; oder Samen von Sorbus aucuparia zerkleinert, einen wässrigen Extrakt herstellt und diesen durch Gelchromatographie und lonenaustauscherchromatogrophie aufreinigt.
Gegenstand der Erfindung sind auch die nach obigen Verfahren hergestellten Proteine.
Die Isolierung bevorzugter Enzyme wird in den Ausführungsbeispielen näher beschrieben. Soweit keine näheren Angaben gemacht werden, erfolgt die Enzym-Anreicherung mit Hilfe biochemischer Standardverfahren, wie z.B. beschrieben von T.G. Cooper in Biochemische Arbeitsme- thoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York, (1981 ). Beispielsweise eignen sich Reinigungsverfahren, wie Fällung, z. B. mit Ammoniumsulfat, lonenaustauschchromatographie, Gelchromatographie, Affinitätschromatographie, z. B. Immunoaffinitätschromatographie, und isoelektrische Fokussierung, sowie Kombinationen solcher Verfahren.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur vorzugsweise enantioselektiven Synthese von (R)-Mandelsäure unter Verwendung eines der neuartigen erfindungsgemäßen Proteine, wobei
a) das Protein oder ein dieses Protein exprimierender Mikroorganismus mit Benzaldehyd und HCN in Kontakt gebracht wird; und b) das gebildete (R)-Mandelonitril (ein Cyanhydrin) gegebenenfalls isoliert und anschließend zu (R)-Mandelsäure umsetzt. Die Umsetzung gemäß Schritt b) erfolgt vorzugsweise auf chemischem Weg. Geeignete Methoden dafür sind dem Fachmann bekannt. So beschreibt beispielseweise die EP-A-1 160 235, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird, einen chemischen Weg zur Herstellung von alpha-Hydroxycarbonsäuren durch Hydrolyse der entsprechenden Cyanhydrine.
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zur Produktion des Nitrits kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Biopro- zeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.
Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacteriol- ogy (Washington D. O, USA, 1981) enthalten.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder mehrere Koh- lenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.
Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker- Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind öle und Fette wie z. B. Sojaöl. Sonnenblumenöl. Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische Säu- ren wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure.
Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammo- niak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen
Als Schwefelquelle können anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydro- genphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocate- chuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Me- lassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physi- ology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 199635773). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1 ,5 bar und 121°C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 40°C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht läßt sich während der Anzucht durch Zugabe von basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der-Schaumentwicklung können Antischaummitte.l wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur einge- tragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die so erhaltenen Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-%.
Vorteilhaft ist außerdem auch, wenn die Fermentation zumindest am Ende, insbesondere jedoch über mindestens 30% der Fermentationsdauer zuckerlimitiert gefahren wird. Das heißt, dass während dieser Zeit die Konzentration an verwertbarem Zucker im Fermentationsmedium auf >0 bis 3 g/l gehalten, beziehungsweise abgesenkt wird.
Die Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden.
Anschließend kann die Fermentationsbrühe mit bekannten Methoden, wie z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, oder durch Nanofiltration, eingedickt beziehungsweise aufkonzentriert werden. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Gefriertrocknung, Sprühtrocknung, Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren aufgearbeitet werden.
Es ist aber auch möglich die gewünschte Verbindung, weiter aufzureinigen. Hierzu wird die pro- dukthaltige Brühe nach dem Abtrennen der Biomasse einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Produkt oder die Verunreinigungen ganz oder teilweise auf dem Chromatographieharz zurückgehalten werden. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werdenr Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindung(en) kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie(HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575- 581 und S.581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistryand Mo- lecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins, eines Polynukleotids, einer Expressionskassette, eines Vektors oder eines Mikroorganismus gemäß obiger Definition zur enantioselektiven Herstellung eines Mandelsäure- und/oder Mandelonitril-Isomers.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren näher erläutert. Dabei zeigt: Figur 1 (A) ein SDS-Gel der (R)-Hydroxynitril Lyase aus P. laurocerasus; Bahnen 1 und 4: Markerproteine (von oben: 106 kDa, 77 kDa, 50,8kDa), Bahnen 2 und 3: Hydroxynitril Lyase; und (B) ein SDS-Gel der (R)-Hydroxynitril Lyase aus S. aucuparia; Bahnen 1 und 4:Markerproteine (von oben: 106 kDa, 77 kDa, 50,8kDa), Bahnen 2 und 3: Hydroxynitril Lyase.
Figur 2 (A) ein Aminosäuresequenz-Alignment zwischen SEQ ID NO:2 (P. laurocerasus), oben und (R)-Mandelonitril Lyase Isoform aus Mandel (Prunus duicis), unten (Swiss-Prot Accession No: O 24243); Smith-Waterman-Score:-93.333% Identität bei Overlap von 15 Aminosäuren
(B) ein Aminosäuresequenz-Alignment zwischen SEQ ID NO:4 (S. aucuparia), oben, und (R)-Mandelonitril Lyase aus Prunus serotina, unten ( Swiss-Prot Accession No: P
52706);
Smith-Waterman-Score: 66.667 % Identität bei Overlap von 24 Aminosäuren
Beispiel 1 : Messung der enzymatischen Aktivität
a) ee-Test R/S-Mandelonitril zur Bestimmung der Spezifität von Hydroxynitril Lyasen
Testansatz:
n μl Probe (Volumen n abhängig von Enzymaktivität) (als positiv Kontrolle dient das Enzym aus Mandeln, es setzt (R)-Mandelonitril um) ad 600μl mit Wasser verdünnen - 200μl 1mol/l Na-Citrat pH 5,0
- 200μl 250 mmol/l R/S-Mandelonitril in 0,1 M Na-citrat (+ 0,2 % Triton X-100 red.) suspendiert
Probenverdünnung für die chirale HPLC: - 200μl Ansatz entnehmen und 1/5 mit 100 mmol/l HCI verdünnen, pH sollte unter 3,0 sein
- zentrifugieren
- Überstand auf HPLC geben (5μl bei -10 mmol/l Lösungen)
(HPLC: Agilent 1100; Säule: Nucleodex ß-PM; Macherey & Nagel; T= 40 °C; 0,8ml/min; E- luent A: 14,8 mM H3PO4; Eluent B: Methanol) Retentionszeiten: R-Mandelsäureamid 4,7 min S- Mandelsäureamid 4,9
R- Mandelsäure 10,0
S- Mandelsäure 10,7
R-Mandelonitril 24,5
S-Mandelonitril 25,6
Benzaldehyd 26,8
b) Benzaldehyd-Bestimmung (HPLC)
Testpuffer: Na-Citrat 1 M pH 5,0
Substrat: Mandelonitril (Aldrich 11 ,602-5) 40 mM in 0, 1 M Na-Citrat-Puffer, frisch ansetzen
Proben: Verdünnung in Testpuffer, pH 5,0
Kontrollen: Positiv-Kontrolle
Reagenzien-Blank Testansatz: (in 1 ,5 ml Eppendorfgefäß)
Max. 500μl Probe (bei Blank 500 μl MES-Puffer) ad 600 μl mit H20 200 μl 1 M Na-Citrat
100 μl 40 mM Mandelonitril
in Thermoblock bei 25 °C unter Schütteln inkubieren für 1-2 h
Stoppen mit 200 μl 2 M HCI (pH-Kontrolle!)
Abzentrifugieren, in HPLC-Probegläschen überführen
Gerät: Beckmann; Säule: Merck LiChrosorb RP18 (5μm); Eluent A:H2O/ 0,1% TFA; Eluent B:
Acetonitril/0,1% TFA
c) Test für die Mikrotiterplatte
Testpuffer: Na-Citrat 0,1 M pH 5,0 Substrat: Mandelonitril (Aldrich 11 ,602-5) 8mM in Testpuffer, frisch ansetzen Proben: Verdünnung in Testpuffer, pH wichtig
Kontrollen: positiv: Enzym aus Mandeln Neagtiv: Probe ohne Substrat Reagenzienblank
Mikrotiterplatte: UV Star Fa.Greiner 655801
Messung: 10 Min. Kinetik Spectramax 280nm (Values=Vmax=mOD/min.;
U/ml=(Vmax/1000)*2,643*Verdünnung d.Probe
Ansatz:
100μl Probenverdünnung 100μl Substratlösung Messung bei 280nm
Beispiel 2: Reinigung der (R)-Hvdroxynitril Lyase aus Prunus laurocerasus (Kirschlorbeer)
a) Extraktion
350g Blätter (bei -20Grad Celsius eingefroren) werden in einem Haushaltsmixer zusammen mit Trockeneis zu feinem Pulver zermahlen. Das Pulver wird dann bei 4 Grad Celsius in 20mM MES, 20mM Ascorbinsäure, 100mM Lysin, pH 6,5 resuspendiert und zwei Stunden gerührt. Grobteile werden über Gaze entfernt und die Lösung durch Zentrifugation geklärt. Der Überstand wird eine Woche gegen 5mM MES, pH 6,5 bei täglichem Pufferwechsel dialysiert. Dies entfernt die großen Mengen an Benzaldehyd, die sich in der Lösung befinden und den Test stören. Das Dialysat (750ml) enthält ca 0,05mg/ml Protein (38mg gesamt). Diese Lösung wird an Q- Sepharose chromatographiert (Aktivität 7U/mg vor Säulenauftrag).
b) Q-Sepharose Chromatographie
Durchmesser der Säule 5cm, Länge 5,5cm, Volumen 108ml. Die Säule war äquilibriert in 200mM Natriumphosphat, pH 7,2. Nach dem Auftrag des Dialysats (pH nachgestellt ebenfalls auf 7,2) wurde die Säule mit gleichem Puffer bis zur Grundlinie der Absorption gewaschen und dann im linearen Gradienten nach 20mM Natriumphosphat, 1 M Natriumchlorid, pH 7,2 eluiert. Die enzymatische Aktivität eluiert ab ca 600mM Salz. In der Wertfraktion waren noch 0,96mg Protein mit einer spezifischen Aktivität von 197U/mg enthalten.
c) N-terminale Sequenzbestimmung
Das so gereinigte Protein wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Das Präparat besteht zu über 99% nur aus einer Proteinbande. Das Protein hat ein Molekulargewicht von ca 85kDa (Figur 1 (A)). Das durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese getrennte Protein wurde auf eine PVDF-Membran geblottet und die N-terminale Sequenz bestimmt. Man erhielt drei verschieden N-terminale Sequenzen (SEQ ID NO:1, 2 und 3) was auf das Vorkommen von Isoenzymen in der Präparation hindeutet.
Die ermittelten Sequenzen zeigten signifikante Sequenzübereinstimmung mit ©-Mandelonitril Lyase aus Mandel (Figur 2(A)).
Beispiel 3: Reinigung der (R)-Hvdroxynitril Lyase aus Sorbus aucuparia (Vogelbeere)
a) Extraktion
200g Samen werden in einem Haushaltsmixer zusammen mit Trockeneis zu feinem Pulver zer- mahlen. Das Pulver wird dann bei 4 Grad Celsius in 20mM MES, 20mM Ascorbinsäure, 100mM Lysin, pH 6,5 resuspendiert und zwei Stunden gerührt. Bereits in dieser Stufe machen sich große Mengen HCN (>20ppm) sowie starker Benzaldehydgeruch bemerkbar. Grobteile werden über Gaze entfernt und die Lösung durch Zentrifugation geklärt. Der Überstand wurde mit 80%iger Ammoniumsulfat-Sättigung gefällt, in 100ml 20mM MES, pH 6,5 resuspendiert und gegen den gleichen Puffer dialysiert.
b) Superdex Gelfiltration
12ml des Dialysats wurden auf einer Superdex Molekularsiebsäule getrennt (4ml/min, 2Minuten Fraktionen, 2Stunden, Laufpuffer wie oben, Durchmesser der Säule 2,6cm, Länge 50cm, Volumen 320ml). Aktive Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt. In der Wertfraktion waren noch 5,8mg Protein mit einer spezifischen Aktivität von 9U/mg enthalten.
c) Präparative Q-Sepharose Chromatographie
Die Wertfraktion der Superdex-Chromatographie wurde dann auf einer Q-Sepharose (Waters, Protein PAK (HRP, Volumen 8ml) weiter gereinigt. Die Säule wurde in 20mM Phosphatpuffer pH 7,2 äqulibriert und die Probe aufgetragen. Nach dem Waschen wurde im linearen Gradienten nach 20mM Phosphat, pH 7,2, 1 M NaCI eluiert. Die Aktivität eluierte scharf in einem Peak. (94U/mg spezifische Aktivität).
d) N-terminale Sequenzbestimmung
Das so gereinigte Protein wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Das Präparat besteht zu über 80% nur aus einer Proteinbande. Das Protein hat ein Molekulargewicht von ca 85kDa (Figur 1(B)). Das durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese getrennte Protein wurde auf eine PVDF-Membran geblottet und die N-terminale Sequenz bestimmt. Man erhielt eine N-terminale Sequenz gemäß SEQ ID NO:4 welche eine ausgeprägte Sequenzübereinstimmung mit der Oxynitril Lyase aus Prunus serotina (Späte Traubenkirsche) zeigte (Figur 2(B)).
Beispiel 4: Bestimmung der SDS-Stabilität
Die erfindungsgemäßen Enzympräparate wurde auf ihre Stabilität gegenüber verschiedene SDS-Konzentrationen untersucht. Die absolute und relative Aktivitätsabnahme bei steigender SDS-Konzentration wurde jeweils bestimmt und mit den für das Mandel-Enzym ermittelten Werten verglichen. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengefasst:
Figure imgf000023_0001
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Enzyme weniger empfindlich auf SDS reagieren (geringerer prozentualer Aktivitätsverlust) und bei gleicher SDS- Konzentration eine höhere Restaktivität aufweisen als das Mandel-Enzym.

Claims

Patentansprüche
1. Protein mit R-Hydroxynitril-Lyase-Aktivität (E.C.4.1.2.10) isolierbar aus Blättern von
Prunus laurocerasus oder Samen von Sorbus aucuparia.
2. Protein nach Anspruch 1 isolierbar aus Blättern von Prunus laurocerasus, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz umfassend wenigstens 10 aufeinanderfolgende Aminosäurereste gemäß SEQ ID NO: 1, 2, oder 3 oder funktionale Äquivalente davon.
3. Protein nach Anspruch 1 isolierbar aus Samen von Sorbus aucuparia, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz umfassend wenigstens 10 aufeinanderfolgende Aminosäurereste gemäß SEQ ID NO: 4 oder funktionale Äquivalente davon.
4. Protein nach Anspruch 2 oder 3, wobei das funktionale Äquivalent ebenfalls wenigstens eine Teilsequenz von wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 2, 3 oder 4 umfasst.
5. Protein gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 85kDa, bestimmt durch SDS-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen.
6. Protein gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die enzymatische Umsetzung von Benzaldehyd zu R-Mandelonitril in Gegenwart von HCN bzw. die umgekehrte Reaktion katalysiert.
7. Polynukleotid, das für ein Protein gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert, sowie dessen funktionale Äquivalente, dazu komplementäre Polynukleotide, und die damit hybridisierbaren Nukleinsäuresequenzen.
8. Expressionskassette, umfassend wenigstens ein Polynukleotid gemäß Anspruch 7 operativ verknüpft mit wenigstens einer regulatorischen Nukleinsäuresequenz.
9. Rekombinanter Vektor zur Transformation eines eukaryontischen oder prokaryontischen Wirts, umfassend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 7, oder eine Expressionskassette gemäß Anspruch 8. - —
10. Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei man einen mit einem Vektor gemäß Anspruch 9 transformierten Mikroorganismus kultiviert und das Protein aus der Kultur isoliert.
11. Verfahren zur Isolierung eines Proteins nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Blätter von Prunus laurocerasus zerkleinert, einen wässrigen Extrakt herstellt und diesen durch lonenaustauscherchromatogrophie aufreinigt.
12. Verfahren zur Isolierung eines Proteins nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Samen von Sorbus aucuparia zerkleinert, einen wässrigen Extrakt herstellt und diesen durch Gelchromatographie und lonenaustauscherchromatogrophie aufreinigt.
13. Protein, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12.
14. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Vektor gemäß Anspruch 9 trägt.
15. Verfahren zur enantioselektiven Synthese von R-Mandelsäure unter Verwendung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei a) das Protein oder ein dieses Protein exprimierender Mikroorganismus gemäß Anspruch 14 mit Benzaldehyd und HCN in Kontakt gebracht wird; und
b) das gebildete R-Mandelonitril gegebenenfalls isoliert und anschließend zu R- Mandelsäure umgesetzt wird.
16. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6, eines Polynukleotids nach Anspruch 7, einer Expressionskassette nach Anspruch 8, eines Vektors nach Anspruch 9 oder eines Mikroorganismus nach Anspruch 14 zur enantioselektiven - Herstellung eines Mandelsäure- und/oder Mandelonitril-Isomers.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111819947A (zh) * 2020-07-17 2020-10-27 新疆林业科学院 一种利于天山花楸种子破除休眠的催芽方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001044487A1 (de) * 1999-12-15 2001-06-21 Dsm Fine Chemicals Austria Nfg Gmbh & Cokg Verfahren zur herstellung von optisch aktiven cyanhydrinen unter verwendung von r-oxynitrilase
EP1323829A2 (de) * 2001-12-28 2003-07-02 DSM Fine Chemicals Austria Nfg GmbH & Co KG Verfahren zur Herstellung von geschützten, enantiomeren-angereicherten Cyanhydrinen durch in-situ-Derivatisierung
EP1323828A2 (de) * 2001-12-27 2003-07-02 DSM Fine Chemicals Austria Nfg GmbH & Co KG Verfahren zur Herstellung von eantiomerenangereicherten Cyanhydrinen unter Verwendung von Acetalen oder Ketalen als Substrate

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001044487A1 (de) * 1999-12-15 2001-06-21 Dsm Fine Chemicals Austria Nfg Gmbh & Cokg Verfahren zur herstellung von optisch aktiven cyanhydrinen unter verwendung von r-oxynitrilase
EP1323828A2 (de) * 2001-12-27 2003-07-02 DSM Fine Chemicals Austria Nfg GmbH & Co KG Verfahren zur Herstellung von eantiomerenangereicherten Cyanhydrinen unter Verwendung von Acetalen oder Ketalen als Substrate
EP1323829A2 (de) * 2001-12-28 2003-07-02 DSM Fine Chemicals Austria Nfg GmbH & Co KG Verfahren zur Herstellung von geschützten, enantiomeren-angereicherten Cyanhydrinen durch in-situ-Derivatisierung

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
E. GÄRSTNER ET AL.: "Zur chemischen und biologischen Systematik der Rosaceen", NATURWISSENSCHAFTEN, vol. 55, no. 12, 1968, pages 561 - 563, XP009014917 *
GERSTNER E. AND KIEL U.: "Eine neue Mandelsäurenitril-Lyase aus Prunus laurocerasus (Kirschloorbeer)", HOPPE SEYLER'S Z. PHYSIOL. CHEM., vol. 356, December 1975 (1975-12-01), pages 1853 - 1857, XP009014866 *
GRIENGL H. ET AL.: "The synthesis of chiral cyanohydrins by oxynitrilases", TIBTECH, vol. 18, June 2000 (2000-06-01), pages 252 - 256, XP002249789 *
HICKEL A. ET AL.: "Hydroxynitrile lyases: Functions and properties", PHYSIOLOGIA PLANTARUM, vol. 98, 1996, pages 891 - 898, XP002249788 *
HICKEL A. ET AL.: "Screening for hydroxynitrile lyases in plants", BIOTECHNOLOGY TECHNIQUES, vol. 11, no. 1, January 1997 (1997-01-01), pages 55 - 58, XP009014892 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111819947A (zh) * 2020-07-17 2020-10-27 新疆林业科学院 一种利于天山花楸种子破除休眠的催芽方法

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