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Die vorliegende Erfindung beschreibt
die erfolgreiche Expression von (S)-Hydroxynitrillyase (E.C. 4.1.2.39)
aus M. esculenta in E. coli und damit die Möglichkeit dieses technisch
sehr bedeutende Enzym in deutlich verbesserter Ausbeute zugänglich zu
machen.
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Oxynitrilasen, auch als Hydroxynitrillyasen
bekannt, sind Enzyme, die die reversible Addition von HCN an Aldehyde
bzw. Ketone katalysieren. Die sich aus einer solchen HCN-Addition ableitenden
Produkte bezeichnet man auch als Cyanhydrine.
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Chirale Cyanhydrine sind von großem Interesse
für die
Herstellung von optisch aktiven Aminoalkoholen, α-Hydroxycarbonsäuren, und
Zwischenprodukten in der Pyrethroidsynthese (Effenberger, 1999).
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Die Gewinnung optisch aktiver (S)=Cyanhydrine
durch die enzymkatalysierte Addition von Blausäure wurde bereits von Effenberger
et al. beschrieben (Effenberger, 1987; Effenberger, 1990). Die Reaktionen
finden in der Regel in einem Zwei-Phasen-System, bestehend aus Wasser
und einer mit Wasser nicht mischbaren, wäßrig-gesättigten organischen Phase statt
(
EP 0927766 , WO 9830711).
Dabei kann das Enzym in löslicher
bzw. immobilisierter Form (
EP
0927766 , WO 9830711) oder als Gel-Einschlußverbindung
(
DE 10058342 ) zum Einsatz
kommen. Bei der Cyanhydrierungsreaktion kommen im wesentlichen aufgearbeitete
Enzymkonzentrate zum Einsatz. Eine weitere Möglichkeit besteht jedoch auch
in der Verwendung getrockneter Zellen, die die Hydroxynitrillyasen
zuvor überexprimiert
haben (
EP 1026256 ).
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Neben dem direkten Einsatz von HCN
als Cyaniddonor gibt es auch alternative Methoden für dessen Bereitstellung.
Bei der Transhydrocyanierung wird durch Zusatz eines preiswerten,
achiralen Cyanhydrins, z.B. Acetoncyanhydrin, HCN in situ generiert
und steht somit der Reaktion unmittelbar zur Verfügung (
DE 4139083 ; Ognyanov, 1991).
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Die Gewinnung von Hydroxynitrillyasen
kann entweder aus natürlicher
(Zandbergen, 1991) oder rekombinanter Quelle (Hevea brasiliensis:
WO 9830711, WO 9703204,
DE 19529116 ,
Hasslacher, 1996 und 1997a,b; Manihot esculenta:
EP 0799894 ,
EP 1026256 , Förster, 1996, Hughes 1994 und
Hughes, 1997; Linum usitatissimum: Trummler, 1998, Breithaupt, 1999)
erfolgen. Für
den industriellen Einsatz sind besonders rekombinante Expressionssysteme
von Bedeutung. Solche Systeme eröffnen
zusätzlich
die Möglichkeit
durch Optimierung Hydroxynitrillyasen gezielt an spezifische Substrate
bzw. Reaktionsbedingungen anzupassen. So konnten bereits unterschiedliche
Positionen im Bereich des aktiven Zentrums von (S)-Hydroxynitrillyasen
aus Hevea brasiliensis bzw. Manihot esculenta substituiert werden,
mit dem Resultat einer verbesserten Substratakzeptanz gegenüber sterisch
anspruchsvollen Carbonylverbindungen (Wajant, 1996;
EP 0969095 ).
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Heutzutage kennt man (R)- und (S)-spezifische
Hydroxynitrillyasen, die sich in ihrer Größe, Struktur und anderen physikalischen
Eigenschaften grundsätzlich
voneinander unterscheiden (Griengl, 2000; Johnson, 2000). (R)-spezifische
Hydroxynitrillyasen, wie sie sich z.B. in den Gattungen Prunus oder
Arabidopsis finden, haben eine Größe von ca. 60 kD, besitzen
FAD als Cofaktor und sind mehrfach glykosyliert (Schmidt, 1999; Griengl,
2000). (S)-Hydroxynitrillyasen besitzen hingegen üblicherweise
eine Größe zwischen
25 und 40 kD und haben eine typische Sekundärstruktur (α/β-Hydrolase-Faltung, Gattungen
Hevea, Manihot oder Sorghum). Verschiedene Vertreter dieser Gruppe
konnten bisher heterolog exprimiert werden (Johnson, 1999; Griengl,
2000; Johnson, 2000; WO 01/45178 A1).
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
werden unter (S)-Hydroxynitrillyasen Enzyme verstanden, die die
(S)-spezifische Addition von Cyanwasserstoff an allgemein Carbonylverbindungen
des Typs „Aldehyd" bzw. „Keton" oder Carbonyl-verwandte
Verbindungen (z.B. Sulfoxide) bzw. deren Umkehrreaktion katalysieren.
(S)-Hydroxynitrillyasen
mit dieser Aktivität
finden sich z.B. in der Gattung Manihot (Hughes et al, 1994), Sorghum,
Sambucus und Hevea (Hasslacher 1996).
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Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung
wird unter einem Polynucleotid ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer
von Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotidbasen verstanden. Polynucleotide
schließen
RNA und DNA ein und können
rekombinant oder chemisch hergestellt werden; sie können auch
aus einer Kombination von natürlich
vorkommenden und künstlichen
Molekülen
hergestellt werden. Die Länge
eines Polynucleotids ist mindestens 100 bp.
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es, ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von (S)-Hydroxynitrillyase
bereitzustellen, das eine hohe Ausbeute ermöglicht.
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Es wurde gefunden, daß bei der
rekombinanten Expression der (S)-Hydroxynitrillyase aus M. esculenta
durch die Verwendung einer Gensequenz, die mehrere Mutationen gegenüber der
Wildtypsequenz SEQ ID NO:1 aufweist, eine hohe Ausbeute an (S)-Hydroxynitrillyase
erhalten werden kann. Die mutierte Gensequenz ist in SEQ ID NO.
3 dargestellt. Der für
Aminosäuren
der (S)-Hydroxynitrillyase aus M. esculenta codierende Bereich von
SEQ ID NO:3 ist in SEQ ID NO:2 dargestellt.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist daher ein Polynucleotid umfassend eine Nucleotidsequenz, die
für ein
Polypeptid mit (S)-Hydroxynitrillyaseaktivität codiert und eine Identität von mindestens
95% zu der Nucleotidsequenz SEQ ID NO:2 aufweist. Vorzugsweise beträgt die Identität zu der
Nucleotidsequenz SEQ ID NO:2 mindestens 97%, am bevorzugtesten mindestens
99%. Alle Angaben von Sequenzidentitäten zwischen Nucleotidsequenzen
in der vorliegenden Anmeldung beziehen sich auf die folgenden Bedingungen: Der
Sequenzvergleich erfolgt mit dem Programm "Blast 2 Sequences version Blastn" (Tatusova et al.
(1999) FEMS Microbiol. Lett. 174, 247-250) mit folgenden Parametern:
reward for a match: 1; penalty for a mismatch:. -2; open gap penalty:
5; extension gap penalty: 2; gap x_drop oft: 50; expect: 10; word
size: 1; filter: no. Die Länge
des Bereichs, auf den sich der Sequenzvergleich erstreckt, beträgt mindestens
700 Nucleotide, bevorzugt mindestens 750, am bevorzugtesten mindestens
774 Nucleotide.
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Ertindungsgemäß codiert das Polynucleotid
für ein
Polypeptid mit (S)-Hydroxynitrillyaseaktivität. Die spezifische
Aktivität
des Proteins beträgt
mindestens 10 Units/mg Protein, vorzugsweise mindestens 50 Units/mg
Protein. In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich die (S)-Hydroxynitrillyaseaktivität auf die
Aktivitätsbestimmung
wie sie in Beispiel B angegeben ist. Eine Aktivität von 1
U bedeutet die Umsetzung von 1 μmol R/S-Mandelonitril
pro Minute. Die Umsetzung des Mandelonitrils kann bei einer Wellenlänge von
250 nm photometrisch verfolgt werden. Aus der Anfangssteigung der
Extinktionsänderung
kann mittels des Extinktionskoeffizienten (εBenzaldehyd250nm:
13.2 × 103/mol × cm)
die Enzymaktivität
berechnet werden.
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Das Polynucleotid codiert vorzugsweise
für ein
Polypeptid, das von der (S)-Hydroxynitrillyase
von Manihot esculenta abgeleitet ist. Die Wildtyp-Aminosäuresequenz
der (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta ist in SEQ ID NO:5
dargestellt.
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Die von den erfindungsgemäßen Polynucleotiden
codierten Polypeptide umfassen nicht nur die Wildtyp-Aminosäuresequenz
der (S)-Hydroxynitrillyase aus M. esculenta (SEQ ID NO:5), sondern
auch Varianten dieser Aminosäuresequenz,
mit Deletionen, Mutationen und/oder Additionen, sowie Veränderungen
durch chemische Modifikationen des exprimierten Enzyms. Diese Varianten
können
auch Fusionsproteine darstellen. Ertindungsgemäß können Fusionen mit bestimmten
Gensequenzen zu einer Expression der (S)-Hydroxynitrillyase im Periplasma
der Bakterien, zu einem Ausschleusen des Enzyms in das umgebende
Kulturmedium oder zu membranständigen
pseudoimmobilisierten Enzymen führen.
Selbstverständlich
müssen
die entstehenden Fusionsproteine nicht dauerhaft stabil sein, sondern
können
durch Spaltung wieder zur reifen (S)-Hydroxynitrillyase zurückgeführt werden.
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Das von dem erfindungsgemäßen Polynucleotid
codierte Polypeptid weist in der Regel höchstens 15 Aminosäuremutationen
gegenüber
der Aminosäuresequenz
SEQ ID NO:5 auf. Die Aminosäuremutationen können Deletionen,
Substitutionen oder Additionen sein. Vorzugsweise führen die
Mutationen im Polypeptid nicht zu einer Verringerung der spezifischen
Aktivität
gegenüber
dem Wiltyp-Protein. Am bevorzugtesten codiert das erfindungsgemäße Polynucleotid
aber für
ein Polypeptid, das die Wildtyp-Aminosäuresequenz
von (S)-Hydroxynitrillyase aus M. esculenta umfaßt.
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Das erfindungsgemäße Polynucleotid kann Mutationen,
also Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen gegenüber der
Nucleotidsequenz SEQ ID NO:2 aufweisen. Im Rahmen der vorliegenden
Anmeldung ist eine Mutation die Addition, Substitution oder Deletion
eines einzigen Nucleotids. Die Anzahl der Mutationen bemisst sich
nach der Anzahl der betroffenen Nucleotide. Beispielsweise stellt
eine Deletion von 3 aufeinanderfolgenden Nucleotiden 3 Mutationen
dar. Vorzugsweise ist die Anzahl der Mutationen gegenüber SEQ
ID NO:2 im erfindungsgemäßen Polynucleotid
nicht höher
als 50, bevorzugter nicht höher
als 40, noch bevorzugter nicht höher
als 30, noch bevorzugter nicht höher
als 20, am bevorzugtesten nicht höher als 10. Es ist ebenfalls
bevorzugt, daß die
Mutationen nicht zu einer Veränderung
des codierten Polypeptids führen.
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Die Länge des erfindungsgemäßen Polynucleotids
beträgt
mindestens 600 bp, bevorzugt mindestens 700 bp, bevorzugter mindestens
750 bp, am bevorzugtesten mindestens 774 bp.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist eines oder mehrere der Codons Nr. 16, 46, 60, 69, 82, 83, 91,
92, 120, 121, 126, 129, 155, 175, 187 und 210 gegenüber der
Wildtypsequenz SEQ ID NO:1 mutiert. Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung
bezeichnet der Ausdruck "Codon" ein Triplett aus
drei aufeinanderfolgenden Nucleotiden, das für eine Aminosäure oder
ein Terminationssignal codiert. Die Nummer des Codons richtet sich
nach der entsprechenden Aminosäureposition,
wie sie in SEQ ID NO:5 dargestellt ist, unabhängig davon, ob dem Polypeptid,
für das
das Polynucleotid codiert, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren im
Vergleich zu SEQ ID NO:5 fehlen. Vorzugsweise sind 1 bis 5 der genannten
Codons mutiert, bevorzugter 6 bis 10, am bevorzugtesten 11 bis 16.
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In einer Ausführungsform codieren die gegenüber der
Wildtypsequenz SEQ ID NO:1 mutierten Codons für die gleiche Aminosäure wie
das entsprechende Codon der Wildtypsequenz SEQ ID NO:1. Am bevorzugtesten
sind die Codons Nr. 16, 46, 60, 69, 82, 83, 91, 92, 120, 121, 126,
129, 155, 175, 187 und 210 mit den entsprechenden Codons der Nucleotidsequenz
SEQ ID NO:2 identisch.
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In einer weiteren Ausführungsform
sind weiterhin die Codons Nr. 13, 14, 15, 28, 41, 45, 65, 110, 111, 159,
161, 177, 178, 197, 212, 213, 234 und 235 gegenüber der Wildtypsequenz SEQ
ID NO:1 mutiert, vorzugsweise sind sie identisch mit den entsprechenden
Codons der Nucleotidsequenz SEQ ID NO:2. Vorzugsweise sind 1 bis
6 der genannten Codons mutiert, bevorzugter 7 bis 12, am bevorzugtesten
13 bis 18.
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Am bevorzugtesten umfaßt das erfindungsgemäße Polynucleotid
die in SEQ ID NO:2 dargestellte Nucleotidsequenz.
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Von der Erfindung umfaßt sind
auch Polynucleotide, die komplementär zu den oben beschriebenen Polynucleotiden
sind. Vorzugsweise sind die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung
isolierte Polynucleotide. Ein Polynucleotid ist isoliert, wenn es
im wesentlichen frei von anderen Genen und Nucleinsäurespezies ist
und in einer ausreichend reinen Form vorliegt, um zur Transfektion
oder Transformation von Wirtszellen verwendet zu werden. Das Polynucleotid
kann aber bestimmte weitere Sequenzen umfassen wie Promotoren und Terminatoren.
Von der Erfindung umfaßt
sind auch alle möglichen
Kombinationen der verschiedenen beschriebenen Ausführungsformen.
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Die Erfindung betrifft auch ein Plasmid
oder einen Vektor enthaltend ein Polynucleotid gemäß der vorliegenden
Erfindung. Dabei kann es sich um Plasmide handeln, die der Vermehrung
der DNA dienen, oder um Expressionsplasmide. Dementsprechend kann
das Plasmid geeignete Sequenzen enthalten, die dem Fachmann an sich
bekannt sind, beispielsweise Sequenzen für die Replikation des Plasmids,
eine Promotorsequenz, Nucleotidsequenzen, die die Transkription
und/oder Translation des Genprodukts verbessern können sowie
Terminationssignale. Als Promotoren können z.B. ein Lac- oder ein
Ara-Promotor eingesetzt werden, ein Ara-Promotor ist bevorzugt.
Die Plasmide können
beispielsweise von den Plasmiden pBR322, pBAD (Invitrogen) oder
pET23a (Novagen) abgeleitet sein. In dem Plasmid können die
erfindungsgemäßen Polynucleotide auch
mit Nucleotidsequenzen verbunden sein, die für Fusionspartner eines Fusionsproteins
codieren. Solche Fusionspartner können die Aufreinigung durch
affinitätschromatographische
Methoden erleichtern, es kann sich aber auch um Sequenzen handeln,
die zu einer Expression des Polypeptids im Periplasma von Bakterien oder
zu einem Ausschleusen des Polypeptids in das umgebende Kulturmedium
führen.
Gegebenenfalls können
derartige anfusionierte Aminosäuresequenzen
wieder abgespalten werden, um das reife Enzym zu erhalten. In einer
bestimmten Ausführungsform
enthält
das Plasmid oder der Vektor ein Polynucleotid, das für ein Polypeptid
codiert, das (S)- Hydroxynitrillyaseaktivität aufweist
und C-terminal mit einem Oligohistidin-tag versehen ist. Das Histidin-tag
kann 6 bis 10 aufeinanderfolgende Histidinreste umfassen, bevorzugt
sind 8 aufeinanderfolgende Histidinreste. Dieses C-terminal mit
einem Oktahistidin-tag versehene Polypeptid kann über Nickelchelatchromatographie
mit Hilfe eines Imidazolgradienten oder pH-Gradienten aufgereinigt
und ebenfalls über
Ammoniumsulfatfällung
aufkonzentriert werden.
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Die Erfindung betrifft auch eine
Zelle enthaltend einen erfindungsgemäßen Vektor oder ein erfindungsgemäßes Plasmid
und/oder ein erfindungsgemäßes Polynucleotid.
Die codierende Region oder das Genkonstrukt kann temporär oder stabil-genomisch
verankert sein. Dem Fachmann ist bewußt, daß durch den Vorgang des Einbringens
der Nucleinsäure
in die Zellen die Nucleinsäure
verändert
werden kann, insbesondere durch Vorgänge innerhalb der Zelle. Zellen,
die derart modifizierte Nucleinsäuren
enthalten, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
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Vorzugsweise handelt es sich um Zellen
von Mikroorganismen, bevorzugter um prokaryontische Zellen, am bevorzugtesten
handelt es sich um E. coli-Zellen. Beispiele für derartige Stämme sind
die Bakterienstämme
Top10, Ori, JM09, BI21 oder LMG194, bevorzugt sind Protease-defiziente
Stämme,
z.B. CAG629, CAG626, CAG748, ER2508, KS1000 und UT5600. Die Erfindung
umfaßt
dabei Zellen in jeglicher Form, als Kultur, als Sediment, in getrockneter
Form und/oder in gefrorener Form.
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Derartige Zellen können dazu
verwendet werden, um Polypeptide mit (S)-Hydroxynitrillyaseaktivität erfolgreich
zu exprimieren. Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren
zur Herstellung von (S)-Hydroxynitrillyase, das umfaßt, daß man die
genannten Zellen unter geeigneten Bedingungen kultiviert und gegebenenfalls anschließend das
gewünschte
Polypeptid gewinnt. Die Zellen können
in verschiedenen handelsüblichen
Medien kultiviert werden. Alle handelsüblichen Medien wie z.B. Terrific
Broth (TB), Luria-Bertani
Broth (LB), SOB und M9-Minimalmedium können Verwendung finden. Je
nach Beschaffenheit des Genkonstrukts kann während der Kultivierung der
Zellen ein Induktionsmittel zu den Zellen gegeben werden. Das Induktionsmittel
richtet sich nach der Promotorsequenz, die in dem erfindungsgemäßen Plasmid
oder Vektor enthalten ist. So kann das Induktionsmittel z.B. Isopropyl-Thiogalactosid
(IPTG) oder L-Arabinose sein. IPTG wird vorzugsweise in einer Konzentration
von 0,001 bis 100 mM, bevorzugter von 0,01 bis 10 mM, am bevorzugtesten
von 0,1 bis 2 mM eingesetzt. L-Arabinose kann in einem Konzentrationsbereich
von 10–8 bis
10% (w/v), bevorzugt von 10–8 bis 5%, am bevorzugtesten
von 10–4 bis
1% eingesetzt werden.
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Temperatur, Induktionsdauer und -höhe werden
nach gängigen
Erfahrungen vorteilhaft aufeinander abgestimmt. Die Induktionsdauer
beträgt üblicherweise
0,5 bis 120 Stunden, vorzugsweise ungefähr 2 bis 24 Stunden, am bevorzugtesten
2 bis 10 Stunden. Die Temperatur bei der Kultivierung beträgt zwischen
17 und 40°C,
bevorzugt zwischen 20 und 37°C.
In einer Ausführungsform
wird die Temperatur nach Zugabe des Induktors gesenkt. Am bevorzugtesten
findet die Kultivierung vor Zugabe des Induktors bei 37±1 °C statt,
die Kultivierung nach Zugabe des Induktors bei 20±1°C. Das Verfahren
kann aber auch ohne Zugabe eines Induktors durchgeführt werden
(konstitutive Expression).
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Während
der Kultivierung und Induktion der Zellen können Zusätze im Medium anwesend sein,
z.B. Salze, FAD, Redoxsysteme und/oder Alkohole. Weiter kann die
Kultivierung mit erhöhtem
oder erniedrigtem Sauerstoffanteil in der Luft durchgeführt werden.
Die Kultivierung kann auch unter verschiedenen Druckverhältnissen
erfolgen. Die Drücke
können
zwischen 0,05 bar und 5 bar variieren.
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Die Expressionsgeschwindigkeit ist
stark abhängig
von der Kultivierung der Bakterien, weshalb individuelle Anpassungen
und verschiedene Medien Verwendung finden. Vorteilhafte Ausführungsformen
hinsichtlich der Expressionsbedingungen sind auch in den Beispielen
erläutert.
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In einer besonderen Ausgestaltung
des Verfahrens wird das Polypeptid gewonnen, nachdem anfusionierte
Peptide abgespalten wurden. So kann beispielsweise die GroES-Sequenz mit einer
Proteasespaltstelle verbunden werden, so daß das reife Protein die GroES-Sequenz
nicht mehr aufweist. Andere faltungshelfende oder löslichkeitsvermittelnde
Sequenzen (z.B. Maltose-Bindungsprotein oder Glutathiontransferase)
können später wieder
abgespalten werden, man kann ebenso Affinitätstags (z.B. His-tags) nach
der Aufreinigung abspalten, man kann Exportsignalsequenzen abspalten.
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Gegebenenfalls können nach der Expression die
erfindungsgemäßen Polypeptide
angereichert und/oder gereinigt werden. Dazu werden die Zellen geerntet
und nach gängigen
Methoden aufgeschlossen. Der Zellaufschluß kann beispielsweise durch
Ultraschall, aber auch durch mechanische Einwirkung erfolgen. Besonders
vorteilhaft ist eine Anreicherung der Polypeptide durch Ammoniumsulfatfällung, Ionenaustauschchromatographie
und/oder Gelfiltration. Weitere, dem Fachmann an sich bekannte Verfahren
zur Reinigung von Proteinen können
eingesetzt werden, siehe z. B. Methods in Enzymology, Vol. 182,
Guide to Protein Purification, Academic Press, New York 1990; Scopes
R.K., Protein Purification, Springer-Verlag, Heidelberg 1994 oder
J. M. Walker, The Protein Protocols Handbook, Humana Press 1996.
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Vorzugsweise erfolgt die Aufreinigung
der (S)-Hydroxynitrillyase nach nativem Zellaufschluß (20 mM Tris/HCl
pH 8.0) über
Anionenaustauschchromatographie mit Hilfe eines Stufengradienten
(DEAE FF-Sepharose (Amersham Pharmacia). Die (S)-Hydroxynitrillyase enthaltenden Fraktionen
können
durch Ammoniumsulfatfällung
(75% Sättigung)
aufkonzentriert werden. Abschließend ist es möglich die
Enzymfraktionen gegen einen geeigneten Reaktionspuffer zu dialysieren. Über Größenausschlußchromatographie
kann die rekombinante (S)-Hydroxynitrillyase bei Bedarf weiter aufgereinigt
werden.
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Die C-terminal mit Oktahistidintag
versehene Variante kann über
Nickelchelatchromatographie mit Hilfe eines Imidazolgradienten aufgereinigt
und ebenfalls über
Ammoniumsulfatfällung
aufkonzentriert werden. Durch die zwischengeschalteten Ammoniumsulfatfällungen
wird das Enzym nicht nur aufkonzentriert, sondern gleichzeitig auch
weiter angereichert, da unter den Resuspendierungsbedingungen Fremdproteine
z.T. nicht mehr in Lösung
gehen.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung
ist ein Zellgemisch erhältlich
durch ein Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung. Die Gewinnung des Zellgemisches erfolgt nach Expression
des Polypeptids mit (S)-Hydroxynitrillyaseaktivität. Die Zellen
können
nach der Expression des Polypeptids nach gängigen Verfahren geerntet werden,
beispielsweise durch Zentrifugation. Die Zellen können gegebenenfalls
getrocknet und/oder eingefroren werden. Die getrockneten Zellen
können
zur Herstellung von Cyanhydrinen eingesetzt werden.
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Die durch das erfindungsgemäße Verfahren
hergestellten Polypeptide, die gegebenenfalls angereichert oder
gereinigt wurden, können
zur Herstellung von Cyanhydrinen verwendet werden. Dabei bringt
man eine Carbonylverbindung oder eine Carbonyl-verwandte Verbindung
mit einem Cyanid-Donor und einem erfindungsgemäßen Polypeptid in Kontakt.
Carbonylverbindungen sind insbesondere Aldehyde und Ketone, Carbonyl-verwandte
Verbindungen sind beispielsweise Sulfoxide. Als Cyanid-Donoren kommen
verschiedene Verbindungen in Betracht. Am bevorzugtesten ist HCN,
es können
aber auch achirale Cyanhydrine, z.B. Aceton-Cyanhydrin eingesetzt
werden (Ognyanov, 1991).
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Gegebenenfalls kann das hergestellte
Cyanhydrin aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden. Verfahren
zum Abtrennen sind dem Fachmann an sich bekannt. Das erfindungsgemäße Polypeptid
kann mit der Carbonylverbindung in Kontakt gebracht werden in Form
eines gereinigten Polypeptids, es kann aber auch eine angereicherte
Zusammensetzung, ein Rohextrakt oder sogar das Zellgemisch eingesetzt
werden, das die Zellen enthält,
in denen die erfindungsgemäßen Polypeptide
exprimiert werden. Bei der zuletzt genannten Ausgestaltung muß keine
spezifische Anreicherung oder Reinigung der Polypeptide erfolgen
(siehe z. B.
EP 1 026 256 ).
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Die vorliegende Erfindung stellt
ein Verfahren zur Verfügung,
mit dem eine hohe Ausbeute an rekombinant exprimierter (S)-Hydroxynitrillyase
erreicht werden kann. So werden deutlich höhere Aktivitäten in U/g Zellmasse
unter vergleichbaren Kultur-/ Nährstoftbedingungen
erreicht. So kann gemäß der vorliegenden
Erfindung auch bei Kultur in billigem LB-Medium eine sehr hohe Ausbeute
erzielt werden, ohne daß auf
TB-Medium zurückgegriffen
werden muß.
Die Expression in TB-Medium ist 2- bis 3mal so teuer wie die in
LB-Medium. In der Regel erhält
man nach Expression in LB-Medium eine Aktivität von mindestens 100 U/g Zellmasse,
vorzugsweise von mindestens 500 U/g Zellmasse, bevorzugter von mindestens
1000 U/g Zellmasse am bevorzugtesten von mindestens 1500 U/g Zellmasse.
SEQ
ID NO:1 zeigt die Nucleotidsequenz des Wildtypgens von (S)-Hydroxynitrillyase
aus Manihot esculenta. Es sind nur die für Aminosäuren codierenden Nucleotide
dargestellt.
SEQ ID NO:2 zeigt die Nucleotidsequenz des mutierten
(S)-Hydroxynitrillyase-Gens zur rekombinanten Expression. Es sind
nur die für
Aminosäuren
codierenden Nucleotide dargestellt.
SEQ ID NO:3 zeigt die Nucleotidsequenz
des mutierten (S)-Hydroxynitrillyase-Gens zur rekombinanten Expression.
Die Nucleotide 3-776 entsprechen der Sequenz von SEQ ID NO:2. Am
3'-Ende der für Aminosäuren codierenden
Nucleotide folgen 3 Stop-Codons.
SEQ
ID NO:4 zeigt eine für
ein Oktahistidin-Tag codierende Nucleotidsequenz.
SEQ ID NO:5
zeigt die Wildtyp-Aminosäuresequenz
der (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta.
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Die Erfindung wird anhand folgender
Beispiele erläutert.
Dabei wird unterschieden zwischen den molekularbiologischen Arbeiten
zur Herstellung des neuen (S)-Hydroxynitrillyasegens
(A) und der Expression dieses Genkonstrukts in Bakterien (B).
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Beispiel A: Genaufbau
der (S)-Oxynitrilase
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Ein an den Organismus E. coli angepaßtes und
optimiertes synthetisches Gen der (S)-Hydroxynitrillyase aus Maniok (Manihot
esculenta) mit nachfolgender Sequenz (SEQ ID NO:3) wurde aufgebaut:
(Die
mutierten Codons sind hervorgehoben)
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Insgesamt wurden etwa 13 % der Tripletts
(34 codierende Triplets und 3 Terminationscodons) im Vergleich zum
natürlichen
Gen (Swissprot entry P52705) verändert,
entfernt oder zugefügt,
um eine optimale tRNA-Nutzung in E. coli zu gewährleisten bzw. um die Expression
zu verbessern.
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Parallel zum angeführten Gen,
wurde eine Genvariante mit einem C-terminalen Oktahistidintag aufgebaut
(es befinden sich 8 zusätzliche
Histidincodons (cat cac cat cat cac cat cac cat = SEQ ID NO:4) am
Ende der proteincodierenden Sequenz jedoch vor den Stopcodons.
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Der Aufbau des Gens erfolgte über eine
klassische, in einzelnen Stufen ablaufende Schnittstellenklonierung
mit hybridisierten Oiigonukleotiden (80-100mere), die teils schon
außerhalb
eines Plasmids durch 4-Basen-Überhänge hybridisiert
und ligiert wurden. Die Expression des synthetischen Genes erfolgt
im pBAD-Vektor (Invitrogen), dabei wird das Gen über die Schnittstellen Ncol
(5'-Ende) bzw. HindIII
(3'-Ende) in den
Vektor eingebracht. Aus dem oben angeführten Gen ergibt sich folgende
Aminosäuresequenz:
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Die zweite Genvariante ergibt ein
Protein, das C-terminal ein Oktahistidinpeptid besitzt (in der obigen Sequenz
in Klammern eingefügt).
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Beispiel B: Expression
der (S)-Hydroxynitrillyase
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Die Plasmide (pBAD-Konstrukte) aus
dem obigen Beispiel wurden in bekannte E. coli-Expressionsstämme (Top10, LMG 194 (Invitrogen))
transformiert.
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Die neuen Stämme wurden unter verschiedenen
Expressionsbedingungen analysiert.
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Die Bakterien wurden z.B. in 3 l
eines handelsüblichen
Mediums (LB-Medium mit 200 μg/ml
Ampicillin) bei 37°C
bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD
600)
von 0,8 hochgezogen. Im Gegensatz zu bereits beschriebenen Expressionsstudien,
die mit dem Wildtypgen arbeiten und die bei 37°C durch IPTG reguliert sind (E.
coli, WO 01/48178 A1) oder mit eukaryontischen Expressionssystemen
arbeiten (S. cerevisiae,
EP 1026256 ),
wurden die E. coli-Kulturen mit einer Konzentration von 0,0002%
L-Arabinose für
mindestens 14 Stunden bei 20°C
induziert (am Ende der Fermentation Zelldichte ca. 4 bei 600 nm
[OD
600]).
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Nach der Produktionsphase wurden
die Zellen sedimentiert (5.000 g, 15 min.), in 20 mM Tris/HCl pH 8.0
gelöst
(5 ml/l Kulturmedium) und durch eine Ultraschallbehandlung (30 min.,
70%, auf Eis) aufgeschlossen.
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Anschließend wurde die Zelldebris sedimentiert
(10.000 g, 45 min.) und in dem gewonnenen, nativ extrahierten Überstand
die Aktivität
der (S)-Hydroxynitrillyase bestimmt. Dieser Vorgang der Extraktion
kann mehrfach wiederholt werden, da die gebildete S-Hydroxynitrillyase
sich sukzessive aus dem Zellsediment auswaschen läßt.
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Der Aktivitätstest wurde in 80 mM Natrium-Citrat
pH 4,8 durchgeführt.
Als Substrat wurde 1 mM R/S-Mandelonitril, in Puffer gelöst, eingesetzt.
Zur Aktivitätsbestimmung
wurden üblicherweise
5 μl des
sogenannten nativ extrahierten Überstandes,
oder aufgereinigte Enzympräparationen
verwendet (Aufreinigung siehe unten). Die Umsetzung des Mandelonitrils
kann bei 250 nm photometrisch verfolgt werden. Aus der Anfangssteigung
der Extinktionsänderung
können
mit dem Extinktionskoeffizienten (εBenzaldehyd250nm:
13.2 × 103/mol × cm)
die erhaltenen Enzymaktivitäten
berechnet werden. Die Aktivität
wird in Units angegeben, wobei eine Aktivität von 1 Unit einem Substratumsatz
von 1 μmol/min
entspricht.
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Aus 3 Liter Fermenterkultur lassen
sich ca. 17 bis 18 g Zellen (Feuchtgewicht) gewinnen. Im Nativextrakt
der aufgeschlossen Zellen kann eine Gesamtaktivität von ca.
25 bis 30 000 Units der rekombinanten (S)-Hydroxynitrillyase ermittelt
werden.
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Aufreinigung:
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Die (S)-Hydroxynitrillyase kann aus
dem nativen Extrakt durch Ionenaustauschchromatographie und Größenausschlußchromatographie,
kombiniert mit einer Ammoniumsulfatfällung, angereichert werden.
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Im Einzelnen wurden 5 ml des nativen
Extraktes auf eine HiPrep 16/10 DEAE FF Anionenaustauschersäule (Amersham
Biosciences) aufgetragen. Die Proteine wurden mit einem Stufengradienten
(0 M NaCl, 80 – 150
mM NaCl, 0,5 M NaCl jeweils in 20 mM Tris/HCl pH 8.0) eluiert und
die Fraktionen (je 5 ml) auf ihre Aktivität hin untersucht. Das aktive
Enzym eluiert zwischen 80 und 150 mM NaCl vom Säulenmaterial.
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Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt
und durch Ammoniumsulfatfällung
(75% Sättigung)
aufkonzentriert. Das resultierende Enzymsediment wurde in 80 mM
Citratpuffer resuspendiert, dabei werden weitere Fremdproteine abgetrennt,
die sich unter den verwendeten Bedingungen nicht lösen lassen.
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Die bakterielle (S)-Nydroxynitrillyase
wurde anschließend
weiter über
Größenausschlußchromatographie
aufgereinigt. Die aktiven Fraktionen wurden wieder vereinigt und
zur Aufkonzentrierung mit Ammoniumsulfat (75 % Sättigung) ausgefällt. Das
Präzipitat
wird zum Abschluß in
geeignetem Puffer gelöst
und entsprechend dialysiert.
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Im Falle der C-terminal mit Oktahistidin-tag
modifizierten (S)-Hydroxynitrillyase erfolgt die Aufreinigung des
Enzyms aus dem nativen Zellextrakt über NTA-Affinitätschromatographie
mit Hilfe eines Imidazol-Stufengradienten oder über einen pH-Gradienten. Die
enzymatisch aktiven Fraktionen können
ebenfalls über
Ammoniumsulfatfällung
(75% Sättigung)
aufkonzentriert oder direkt gegen einen geeigneten Reaktionspuffer
dialysiert werden.
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Die Bestimmung der Aktivität erfolgt,
wie oben beschrieben, in einem Citratpuffersystem pH 4,8 mit R/S-Mandelonitril
als Substrat. Der Enzymtest wird photometrisch durchgeführt und
aus der anfänglichen Änderung
der Extinktion bei 250 nm läßt sich
die Aktivität
der Enzymproben berechnen.
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