JP2000507087A

JP2000507087A - ファフィア株を形質転換する改良法、そのようにして得られた形質転換したファフィア株及び前記方法における組換えｄｎａ

Info

Publication number: JP2000507087A
Application number: JP09523340A
Authority: JP
Inventors: ヤンコルネリスフェルドゥース; ヤンヴェリー
Original assignee: ギストブロカデスベスローテンファンノートシャップ; オーイェンアルベルトヨハネスヨセフ
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-23
Publication date: 2000-06-13
Also published as: EP1640456A3; US7205123B2; US20040091958A1; EP0870042B1; DE69633343D1; ATE275632T1; ES2229288T3; AU1308797A; US6329141B1; AU725340B2; CA2241267C; EP1640456A2; CA2241267A1; EP0870042A1; WO1997023633A1; DE69633343T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、転写プロモーター及び発現すべき下流配列を作用可能な結合で含む組換えＤＮＡであって、該転写プロモーターが高度に発現したファフィア遺伝子、好ましくは解糖系遺伝子、更に好ましくはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流に見られる領域を含む、前記組換えＤＮＡを提供する。本発明の組換えＤＮＡは、好ましくは、リボソームタンパク質コード化遺伝子のプロモーターを含み、更に好ましくは、該転写プロモーターが配列番号24〜50のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列の１つで表されるタンパク質をコード化するオープンリーディングフレームの上流に見られる領域を含む。本発明の態様によれば、ファフィア・ロドザイマのカロテノイド生合成経路に関与する酵素をコードする単離したＤＮＡ配列、好ましくは、前記酵素がイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ活性、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性、フィトエンシンターゼ活性、フィトエンデサチュラーゼ活性及びリコペンシクラーゼ活性より選ばれた活性をもつ単離したＤＮＡ配列、更に好ましくは配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21又は配列番号23で表される配列より選ばれたアミノ酸配列を有する酵素をコードする単離したＤＮＡ配列が提供される。実施態様は、ベクター、形質転換したホスト生物、タンパク質及び／又はアスタキサンチンのようなカロテノイドの作成方法、及びファフィアから高度に発現したプロモーターを単離する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ファフィア株を形質転換する改良法、そのようにして得られた形質転換したファフィア株及び前記方法における組換えＤＮＡ技術分野本発明は、ファフィア(Phaffia)酵母を形質転換する方法、形質転換したファフィア株、及びそれに使用するための組換えＤＮＡに関する。発明の背景酵母ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma)の形質転換方法は、欧州特許出願第0 590 707 A1号に開示されている。その方法は、プロトプラストとＤＮＡのインキュベーション又はファフィア細胞とＤＮＡのインキュベーションに続いて酢酸リチウム処理を必要とする。その方法でファフィア株を形質転換するために用いられる組換えＤＮＡは、G418又はフレオマイシンに対する耐性をコードする選択マーカー遺伝子の発現を引き起こすファフィアアクチン遺伝子プロモーターから構成された。該方法は長時間のＰＥＧと酢酸リチウムのインキュベーション時間を含み、形質転換頻度が低い。プロトプラストが用いられる場合、形質転換頻度はプロトプラスト浮遊液の品質に依存し、方法の信頼性を低くする。最近、ファフィア株を形質転換する方法がAdrio J.L．& Veiga M.(Jul．1995, Biotechnology Techniques Vol.9，No.7，pp.509-512）によって報告された。その方法においては形質転換頻度はＤＮＡ１μgあたり形質転換細胞３〜13個の範囲であり低い。その著者らによって開示された方法の欠点は、更に、形質転換細胞の倍加時間が長いことにある。これは自律複製ベクターの染色体複製による妨害によるものであると著者らは仮定した。ファフィア株を異種ＤＮＡで形質転換する信頼性のあるかつ効率のよい方法がなお求められていることは明らかである。本発明の目的は、それを達成する方法と手段を提供することである。本発明の目的は、更に、ファフィアをある種の有効な化合物の適切な生産ホストにするためにファフィア・ロドザイマ中でのある種の遺伝子の発現を最適化することである。発明の要約本発明は、形質転換したファフィア株を得る方法であって、ファフィア株の細胞又はプロトプラストと組換えＤＮＡとをその取込みを伝達する条件下で接触させ、前記組換えＤＮＡが転写プロモーターと前記転写プロモーターと異種である発現すべき下流配列を操作可能な結合で含む工程、前記組換えＤＮＡを発現可能な形で得たファフィア・ロドザイマ細胞又はプロトプラストを同定し、該転写プロモーターが高度に発現したファフィア遺伝子のオープンリーディングフレームの上流に見られる領域を含む工程を含む、前記方法を提供する。本発明の好適実施態様によれば、前記高度に発現したファフィア遺伝子は解糖系遺伝子であり、更に好ましくは該解糖系遺伝子はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)をコードする。本発明の態様によれば、前記異種下流配列は、G418 又はフレオマイシンのような選択薬剤に対する耐性をコードするオープンリーディングフレームを含んでいる。本発明の他の好ましい方法は、前記組換えＤＮＡが発現すべき前記ＤＮＡから下流の転写ターミネーターを作用可能な結合で更に含み、その転写ターミネーターはファフィア遺伝子のオープンリーディングフレームの下流に見られる領域を含んでいる。組換えＤＮＡは、更に、線状ＤＮＡの形であることが好ましい。他の好適実施態様は、上記工程のほかにファフィア細胞又はプロトプラストとＤＮＡとを接触させた後に電気パルスをかける工程を含む。別の実施態様によれば、本発明は、本発明の方法によって得られる、異種ＤＮＡ配列の高レベル発現が可能な形質転換したファフィア株を提供する。好ましくは、前記ファフィア株は、少なくとも１０コピーの染色体のようなゲノムに組込まれた前記組換えＤＮＡを、特に前記染色体のリボソームＤＮＡ遺伝子座に含む。本発明は、また、転写プロモーター及び発現すべき異種下流配列を作用可能な結合で含む組換えＤＮＡであって、該転写プロモーターが高度に発現したファフィア遺伝子のオープンリーディングフレームの上流に見られる領域、好ましくは解糖遺伝子、更に好ましくはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む、前記組換えＤＮＡを提供する。また、該異種下流配列が選択薬剤、好ましくはG418又はフレオマイシンに対する感受性低下をコードするオープンリーディングフレームを含む本発明の組換えＤＮＡが提供される。前記組換えＤＮＡは、好ましくは、前記発現すべき異種ＤＮＡ配列から下流の転写ターミネーターを作用可能な結合で更に含む。本発明の態様は、更に、本発明の組換えＤＮＡを保持する微生物、好ましくはファフィア株、更に好ましくはファフィア・ロドザイマ株、及びその培養物に関する。他の好適実施態様によれば、ファフィアGAPDH遺伝子又はその断片を含む単離したＤＮＡ断片、及び組換えＤＮＡ構築物を作成するためのかかる断片の使用が提供される。本態様の実施態様によれば、前記断片は、GAPDHをコードするオープンリーディングフレームの上流又は下流に位置する調節領域であり、発現すべき異種配列と共にその制御下で用いられる。別の態様によれば、本発明は、タンパク質又は色素の生産を伝達する条件下でファフィア株を培養することによりタンパク質又は色素を生産する方法であって、該ファフィア株が本発明の形質転換したファフィア株である、前記方法を提供する。本発明の他の態様によれば、形質転換したファフィア株を得る方法であって、ファフィア株の細胞又はプロトプラストと組換えＤＮＡとをその取込みを伝達する条件下で接触させ、前記組換えＤＮＡが転写プロモーター及び発現すべき下流配列を作用可能な結合で含む工程、前記組換えＤＮＡを発現可能な形で得たファフィア・ロドザイマ細胞又はプロトプラストを同定する工程を含み、該発現すべき下流配列がファフィア・ロドザイマのカロテノイド生合成経路に関与する酵素をコードする単離したＤＮＡ配列を含む、前記方法が提供される。好ましくは、前記酵素は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(crtE) 、フィトエンシンターゼ(crtB)、フィトエンデサチュラーゼ(crtI)及びリコペンシクラーゼ(crtY)より選ばれた活性をもち、更に好ましくは、配列番号13、配列番号15、配列番号17及び配列番号19で表される配列より選ばれたアミノ酸配列をもつ。実施態様によれば、更に、該転写プロモーターはファフィアの解糖系遺伝子のような前記単離したＤＮＡ配列に対して異種である。本実施態様によれば、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)遺伝子プロモーターであることが特に好ましい。また、本発明の方法によって得ることができかつカロテノイド生合成経路遺伝子に関与する酵素をコード化するＤＮＡ配列を発現することができる、好ましくは過剰発現することができる形質転換したファフィア株が提供される。本発明は、また、本発明の単離したＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ、好ましくはベクターの形で具体化される。また、ファフィア株のようなホストを形質転換するためのかかるベクターの使用が主張される。請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を用いて形質転換で得られるホスト、場合によっては祖先のホストは本発明に従ってＤＮＡを過剰発現できることが好ましい。実施態様によれば、更に、酵素の生産を伝達する条件下で本発明のホストを培養することにより、カロテノイド生合成経路に関与する酵素を発現する方法が提供される。また、カロテノイドの生産を伝達する条件下で本発明のホストを培養することにより、カロテノイドの生産方法が提供される。図面の説明図１．ファフィア・ロドザイマGAPDH遺伝子前後の制限部位のマッピング。臭化エチジウム染色0.8%アガロースゲル(A)及び染色体ＤＮＡのサザンブロット(B)及び数種の制限酵素で消化しファフィア・ロドザイマGAPDH遺伝子の300bp PCR断片とハイブリッド形成したコスミドpPRGDHcosI(C)。レーン1，DNA×KpnI；2,×Pst I；3,×SmaI；4,×SphI；L,BstEIIで消化したλDNA；5，×SstI；6,×XbaI及び7 ,×XhoI。ブロットを6×SSC，5×デンハルト溶液，0.1%SDS，100ng/mlニシン精子ＤＮＡ中 65℃でハイブリッド形成した。オートラジオグラムの露光時間はコスミドについては16時間であり、染色体ＤＮＡを含むブロットからは48時間とした。図２．２つのサブクローンの体制；ファフィア・ロドザイマのGAPDH遺伝子（の一部）を含むpPRGDH3と誘導体(A)及びpPRGDH6と誘導体(B)。PCRプローブを黒い枠で示す。配列決定の方向と程度を矢印で示す。黒い枠: GAPDHコード配列白い枠: GAPDHの5'上流とプロモーター領域白い枠: ファフィア・ロドザイマGAPDH3'非コード配列実線: GAPDHイントロン斜線枠: 異なる制限酵素に対するポリリンカー含有部位点線: 欠失断片図３．ファフィア形質転換ベクターのクローニング図;pPR2。黒い枠: GAPDHの5'上流とプロモーター斜線枠: G418 実線: pUC19 白い枠: ファフィア・ロドザイマのリボソームＤＮＡクローニングに用いられる制限部位のみ示す。図４．pPR2TからpPR2Tの構築白い枠(BamHI-HindIII断片):ファフィア由来GAPDH転写ターミネーター。他の枠と線は全て図３の通りである。適切な詳細のみ示した。図５．pGB-Ph9の詳細な物理的地図。bps=塩基対;ファフィアのｒＤＮＡリボソームＤＮＡ座;act.pro 2=アクチン転写プロモーター;act.1オープンリーディングフレームの5'非翻訳領域とアミノ末端領域;NON COD．=G418遺伝子の下流の非コーディング領域。図６．pPR2の詳細な物理的地図。GPDHpro=ファフィア由来GAPDH転写プロモーター領域。他の略号は図５の通り。図７．pPR2Tの詳細な物理的地図。Tgdh=ファフィアのGAPDH転写ターミネーター。他の略号は図５と図６の通り。図８．エルウィニア・ウレドボラ(Erwinia uredovora)のカロテノイド生合成経路の概要。図９．ｃＤＮＡ断片の例示及びプラスミドpPRcrtE(A)，pPRcrtB(B)，pPRcrtI(C) 及びpPRcrtY(B)の制限酵素地図。発明の詳細な説明本発明は、一般的には、形質転換したファフィア株を得る方法であって、ファフィア株の細胞又はプロトプラストと組換えＤＮＡとをその取込みを伝達する条件下で接触させ、前記組換えＤＮＡが転写プロモーター及び前記転写プロモーターと異種である発現すべき下流配列を作用可能な結合で含む工程、前記組換えＤＮＡを発現できる形で得たファフィア・ロドザイマ細胞又はプロトプラストを同定する工程を含み、該転写プロモーターが高度に発現したファフィア遺伝子のオープンリーディングフレームの上流に見られる領域を含む、前記方法を提供する。本発明を実施する様々な方法を具体的に説明するために、実施態様を示し、特定の用語の意味又は範囲を説明する。発現組換えＤＮＡの意味は、遺伝子修飾の技術において周知であり、ＤＮＡ分子は少なくとも２種の異なる起原の断片の結合を特徴とする一本鎖又は二本鎖、線状又は環状、ニック等であることを意味する。かかる結合は、一般的であるが必ずしも試験管内で行われない。従って、異なる生物又は同じ生物の異なる遺伝子由来のＤＮＡ、又は領域が天然には隣接しないが同じ遺伝子の異なる領域由来のＤＮＡさえも含む分子が請求の範囲内である。本発明の組換えＤＮＡは、異種ＤＮＡ配列に融合した高度に発現したファフィア遺伝子のオープンリーディングフレームの上流に見られる転写プロモーターを特徴とする。異種については、‘ 天然には隣接しない’を意味する。従って、非相同ＤＮＡ配列は、異なる生物由来、同じ生物由来の異なる遺伝子、又は下流配列が試験管内で一般的に修飾されるのであればプロモーターと同じ遺伝子とさえすることができる。かかる修飾は、挿入、欠失又は置換であり、コード化タンパク質及び／又は分泌経路に入ること、及び／又は翻訳後プロセシング、及び／又はコドン使用に働きかけることができる。本発明の強力な転写プロモーターは、転写及び翻訳機構を開始シグナルを認識させるために異種下流と作用可能な結合でなければならない。高度に発現したファフィア・ロドザイマ遺伝子のオープンリーディングフレームの上流の領域は、キャップサイトの上流の26〜約40ヌクレオチドに位置するTATA様構造を含む。後者は転写開始部位にほぼ一致する。従って、異種下流配列の転写を右の位置から開始させるために、同じ距離が考えられる。しかしながら、転写開始部位に相対するTATAシグナルの位置にある種の許容があることは周知の知識である。典型的には、真核タイプのmRNAは、翻訳の開始までの転写開始部位にかかる領域である 5'非翻訳リーダー配列(5'-utl)を含む。その領域は30ヌクレオチドから200ヌクレオチドを超えるまで変動させることができる。5'-utlの長さも起原もほとんど重要ではない。30〜200ヌクレオチドが好ましい。プロモーターと同じ遺伝子由来とすることができ、異種タンパク質をコードする遺伝子由来とすることもできる。真核遺伝子がオープンリーディングフレームの下流の転写及び／又はポリアデニル化の終結シグナルを含むことは周知である。終結シグナルの位置は可変であるが、典型的には翻訳停止部位（オープンリーディングフレームの末端）から下流の10〜200ヌクレオチド、通常翻訳停止部位から下流の30〜100ヌクレオチドである。転写ターミネーターの選択は重要ではないが、ターミネーターがファフィア遺伝子の下流の領域、好ましくは高度に発現したファフィア遺伝子の下流の領域、更に好ましくはGAPDHコード化遺伝子より選ばれる場合には発現レベル及び形質転換頻度が改善されることがわかる。非常に高濃度のG418(1mg/ml前後）で増殖することができるかなりの数のクローンが得られることがわかった。少なくとも200μg/ml、好ましくは400μg/mlを超え、更に好ましくは600μg/mlを超え、更に好ましくは800μg/mlを超えるG418 の存在下に増殖培地中で実施例に開示されたG418耐性遺伝子に結合したときに形質転換したファフィア細胞を増殖させるために働くことができる場合、本発明の転写プロモーターは高度に発現した遺伝子由来であると言われる。かかるプロモーターの例は、ファフィアのGAPDH遺伝子から上流のプロモーターのほかにピキア(Pichia)、サッカロミセス(Saccharomyces)、クルイベロミセス(Kluyveromyce s)のような他の酵母、又はトリコデルマ(Trichoderma)、アスペルギルス(Asperg illus)のような真菌由来の高度に発現した遺伝子と相同であるファフィア・ロドザイマ遺伝子由来プロモーター等である。本発明の要件を満たすプロモーターは、当業者にそのままで全て用いうる分子生物学手法を用いてゲノムＤＮＡから単離される。本発明は、次のようなファフィア由来の強力なプロモーターを単離する新規な戦略を提供する。ｃＤＮＡライブラリーは、既知の方法を用いてファフィアｍＲＮＡから作成される。次に、ｃＤＮＡ挿入断片による多数のクローンについては、ＤＮＡ断片（発現したｍＲＮＡのｃＤＮＡ補体を示す）の配列が決定される。更に、豊富に発現される遺伝子（解糖プロモーターのような）がｍＲＮＡ集団で過剰呈示される。従って、高度に発現した遺伝子を見つけ出すために配列決定すべきＤＮＡ断片の数は100末満、おそらく50未満に限定される。そのようなものとしての配列決定は通常のものであり、数週間以内に行われる。引き続き、この限定した数の断片から得られたヌクレオチド配列はEMBL又はGe neseqのような電子データベースに記憶された既知の配列と比較される。断片が一定の長さ（好ましくは100塩基対を超える）にわたって50％を超える相同性を示す場合には、その断片は電子データベースに見られる遺伝子のファフィア等価株を示すと思われる。ファフィア以外の酵母においては、多数の高度に発現した遺伝子が同定されている。それらの遺伝子としては、解糖系遺伝子、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホトリオースイソメラーゼ、ホスホグルコムターゼ、エノラーゼ、ピルベートキナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(欧州特許第120 551号、同第0 164 556号;Rosenberg S.ら，1990， Meth．Enzymol．185，341-351;Tuite M.F．1982，EMBOJ．1，603-608;Price V. ら，1990，Meth．Enzymol．185，308-318)及びガラクトースレギュロン(Johnsto n，S.A．ら，1987，Cell 50，143-146)が含まれる。従って、高度に発現した酵母遺伝子にかなり相同であるファフィアｃＤＮＡ断片（50ヌクレオチドを超える範囲、好ましくは100ヌクレオチドを超える範囲にわたる最良適合比較の同一性が40％を超える、好ましくは50％を超える）は、ファフィア由来ゲノムライブラリーをスクリーニングするために用いられ、対応する遺伝子を見出すにちがいない。この方法を用いてファフィア・ロドザイマ由来の14個の高度に発現したｍＲＮＡがＤＮＡにコピーされ、配列決定され、その（推定）オープンリーディングフレームが核酸とアミノ酸配列のデータベースに匹敵した。これらの14個のｃＤＮＡの中の13個がリボソームタンパク質遺伝子をコードし、１個が同時にユビキチンに対してコードすることが判明した。１個のｃＤＮＡはグルコース抑制遺伝子をコードする。これらの遺伝子のコード領域の上流に通常見られる遺伝子とプロモーターの単離は進行中であり、これらの転写プロモーターの各々はカロテノイド生合成遺伝子のような異種遺伝子を発現するために有利に用いられることが予想される。遺伝子の中で、本発明の特に好ましい転写プロモーターは、配列番号10で示されるｃＤＮＡに対応するユビキチンリボソーム40Aタンパク質、配列番号26で示されるグルコース抑制ｃＤＮＡ、配列番号28で示される40S リボソームタンパク質S27コード化ｃＤＮＡ、配列番号30で表される60Sリボソームタンパク質P1αコード化ｃＤＮＡ、配列番号32で示される60Sリボソームタンパク質L37eコード化ｃＤＮＡ、配列番号34で示される60Sリボソームタンパク質L 27aコード化ｃＤＮＡ、配列番号36で示される60Sリボソームタンパク質L25コード化ｃＤＮＡ、配列番号38で示される60Sリボソームタンパク質P2コード化ｃＤＮＡ、配列番号40で示される40Sリボソームタンパク質S17A/Bコード化ｃＤＮＡ、配列番号42で示される40Sリボソームタンパク質S31、配列番号44で示される40 Sリボソームタンパク質S10コード化ｃＤＮＡ、配列番号46で示される60Sリボソームタンパク質L37Aコード化ｃＤＮＡ、配列番号48で示される60Sリボソームタンパク質L34コード化ｃＤＮＡ、又は配列番号50で示される40Sリボソームタンパク質S16コード化ｃＤＮＡの上流に見られるプロモーターである。これらの又は他の高度に発現した遺伝子由来プロモーターは、次の通常の技術のみを用いる本発明の方法により集められる。(a)所望の条件下で増殖したファフィア株から単離したｍＲＮＡについてｃＤＮＡライブラリーを作成する工程、 (b)工程(a)で得られた（部分）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（部分）を求める工程、(c)工程(b)で得られた配列データを電子データベースに記憶されたもののような既知の配列データと比較する工程、(d)発現したｃＤＮＡに対応する遺伝子のオープンリーディングフレームのすぐ上流か又は転写開始部位のすぐ上流に位置する遺伝子の推定プロモーター断片をクローン化する工程、及び(e)G418耐性遺伝子のような適切なマーカー、又は(d)で得られた断片から下流の適切な非選択性“リポーター”配列を発現し、そのＤＮＡをファフィア・ロドザイマ株に形質転換し、形質転換細胞のマーカー遺伝子又はリポーター配列の発現レベルを求めることによりプロモーター配列が得られたかを証明する工程。転写プロモーターは、培養液１リットルあたり200μgを超える濃度、好ましくは少なくとも400μg/l、更に好ましくは600μg/lを超える濃度のG418に耐性のあるG418耐性マーカーの上流に結合した前記プロモーターを含むＤＮＡ構築物で形質転換したファフィア・ロドザイマ細胞を作成することが可能である場合には高度に発現した遺伝子を有すると言われる。特に好ましいプロモーターは、増殖培地中で800 μg/mlを超えるG418に対する耐性を与えるものである。場合によっては、推定プロモーター配列のクローニング前に高度に発現した遺伝子に対応するｃＤＮＡに対応する遺伝子の転写開始部位が求められる。これにより、より正確に転写開始部位に位置するように働くことができ、更に、遺伝子の5'非翻訳リーダーの長さを求めることを援助する。転写開始部位の位置を求めるために、ｃＤＮＡ配列の知識に基づいて逆プライマーエクステンション又は古典的S1マッピングが行われる。従って、転写プロモーターの正確な位置が過度の負担を含まずに求められ、転写開始部位の上流及びプロモーターを含む断片のハイブリッド形成ゲノムクローン（例えば、ファージ又はコスミド）からの単離は通常のものである。コード領域、例えば、G418耐性遺伝子のコード領域の前（上流）の推定プロモーター断片をクロー化すること、及びG418耐性のレベルを評価するために遺伝子カセットをファフィアに形質転換すること、よってプロモーターの存在の結果としてのG418耐性遺伝子の発現レベルは通常のものである。上記の他の強力なプロモーターの単離に記載された実質的な方法においては、ターミネーターがオープンリーディングフレームから下流に位置するならば転写ターミネーターが単離される。転写停止部位は、転写開始部位の決定と実質的に同じ方法を用いて求められる。これらの方法は全て当業者に周知である。有用なハンドブックは、Nucleic Acid Hybridisation，Edit．B.D．Hames & S.J.Higgi ns，IRL Press Ltd.，1985;Sambrook，sub．である。しかしながら、転写ターミネーターが高度に発現したファフィア遺伝子から単離されることは発現した遺伝子から単離される限り重要ではない。オープンリーディングフレームがG418に対する感受性低下をコードする本発明の組換えＤＮＡを用いると、40μg/mlの培地中のG418濃度が線状ＤＮＡ１μgあたり形質転換細胞１６０個までの形質転換頻度が得られた。本発明のベクター(pPR2)を用いて欧州特許第0 590 707 A1号に開示される従来技術のベクターpGB-Ph9より約10〜20倍の形質転換コロニーが得られた（表２;実施例７の実験においては改良が顕著である）。本発明の方法は、組換えＤＮＡの取込みを伝達する条件を要求する。かかる条件は、欧州特許第509 707号に開示されている。当業者に既知の標準操作を用いるプロトプラストの調製及び続いての組換えＤＮＡとのインキュベーションが含まれるがこれに限定されない。また、ファフィア細胞はLiAcと組換えＤＮＡの存在下に一晩インキュベートされる。代替的方法は、粒子加速の使用を必要とする。好適実施態様によれば、取込みを伝達する条件は、Faberら，（1994，Current Genetics 25，305-310）に記載されるような組換えＤＮＡのファフィア細胞へのエレクトロポレーションを必要とする。特に好ましい条件は、組換えＤＮＡがファフィアリボソームＤＮＡを含み、前記組換えＤＮＡが線状形であり、最も好ましくは前記リボソーム領域の前記組換えＤＮＡを切断することによるエレクトロポレーションを含む。条件は、更に、組換えＤＮＡの好ましくは１〜10μg/10⁸ 細胞の量での使用を含み、更に好ましくは約５μg/２×10⁸細胞の組換えＤＮＡが用いられ、21℃で16時間培養される。細胞が本方法に従って形質転換されると、形質転換細胞の同定が適切な手法を用いて行われる。従って、同定はハイブリッド形成法、使用した組換えＤＮＡに基づくプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応のようなＤＮＡ増幅法等で行われる。形質転換細胞を同定する好ましい方法は、選択薬剤に対する感受性低下をコードするインキュベートを含む組換えＤＮＡの選択を用いる方法である。有用な選択薬剤はG418、ヒグロマイシン、フレオマイシン及びamdSである。これらの選択薬剤に対する感受性低下をコードする遺伝子は、当該技術において周知である。これらの遺伝子のオープンリーディングフレームは本発明の異種下流配列として用いられ、形質転換細胞の同定前に形質転換細胞の選択的濃縮を可能にする。形質転換細胞が同定されると、更に操作するために用いられるか又は有効な化合物の生産に、好ましくは大規模発酵槽で直接用いられる。ファフィア株を形質転換する非常に効率のよい方法が開示されたことは明らかである。更に、形質転換頻度が高いだけでなく、pGB-Ph9のアクチンプロモーターの制御下のG418耐性遺伝子と比較した場合、G418耐性遺伝子のオープンリーディングフレームが本発明のプロモーターに融合した場合の形質転換ファフィア細胞のG418に対する例外的に高い耐性によって示されるように形質転換ＤＮＡの発現レベルも非常に高い。従って、ファフィア株での高発現レベルを達成するために異種配列と共に適切に用いられるGAPDHプロモーターは高レベルの転写プロモーターであることが結論される。本発明の組換えＤＮＡとしての新しい発現手段の利用可能性がファフィアの新規で有効な生体分子を生産する多くの可能性を生じることは明らかである。好ましくは、下流配列は問題のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでいる。例えば、カロテノイド経路に含まれるもののようなファフィア株に既存の遺伝子は、本発明の高レベルプロモーターの制御下でクローン化することにより操作される。発現増強は、中間体及び／又は最終産物の蓄積を変化させることができ、β−カロテン、カンタキサンチン、アスタキサンチン等の経路を変化させることもできる。エルウィニア・ウレドボラ由来crtB遺伝子の過剰発現は、その遺伝子の産物が律速段階に関与するのでアスタキサンチンレベルを上げると思われる。問題のタンパク質の発現は、また、ゼアキサンチンのようなファフィアで天然に産生されないことが知られるキサントフィルを生じることができる。かかる方法に適切に用いられるオープンリーディングフレームとしては、エルウィニア・ウレドボラ（Misawaら，1990，J.Bacteriol．172：6704-6 712）から得られるタンパク質産生ゼアキサンチン(crtZ遺伝子)をコード化するものが含まれるがそれに限定されない。他のカロテノイド合成遺伝子は、例えば、フラボバクテリウム(Flavobacterium)(グラム陽性菌)、シネココッカス(Synec hococcus)(シアノバクテリウム)又はクラミドモナス(Chlamydomonas)又はデュナリエラ(Dunaliella)(藻類)から得られる。ファフィア株のカロテノイド合成遺伝子は、該遺伝子が単離及びクローン化されると本発明の組換えＤＮＡに適切にクローン化され、ファフィア株のカロテノイド含量を修飾するために用いられる。ファフィア中で適切に過剰発現されるクローン化カロテノイド遺伝子の例は、図８に述べられるものである。この工程はテルムス・テルモフィルス(Thermus the rmophylus)(Hoshino T．ら，1994，Journa1 of Fermentation and Bioengineeri ng 77，No．4，423-424)におけるカロテノイド合成の律速段階であると思われるので、ゲラニルゲラニルニリン酸シンターゼをコード化するフィコミセス・ブラケスレアナス(Phycomyces blakesleanus)、及びフィコエンシンターゼをコード化するcrtBが特に有効である。カロテノイド生合成遺伝子又はｃＤＮＡを単離するのに特に好ましい供給源は、真菌ニューロスポラ・クラサ(Neu rospora crassa)、ブラケスレア・トリスポラ(Blakeslea trispora)である。カロテノイド生合成遺伝子の交差ハイブリッド形成種をもつことがわかっている他の酵母は、シストフィロバシジウム(Cystofylobasidium)、例えば、ビスポリジイ(bisporidii)及びカピタタム(capitatum)である。カロテノイド生合成遺伝子は、また、植物でも同定された。植物ｃＤＮＡ又は植物由来遺伝子も同様に用いられる。場合によっては、ファフィア遺伝子又はｃＤＮＡのコドン使用がホスト生物での好ましい使用に適応される。本発明によれば配列表に示される、ファフィア・ロドザイマのカロテノイド生合成経路において４種類の異なる酵素をコードするＤＮＡ配列が特に興味深い。これらのＤＮＡ配列が一旦役立つとＤＮＡ配列に対するわずかな修飾をアミノ酸配列を変えずに引き起こすことが可能であることは当業者に明らかである。かかる修飾は、遺伝コードの縮重に基づき可能である。かかる修飾は、本発明に包含される。しかしながら、酵素のアミノ酸配列の修飾を生じるコード配列の修飾も企図される。少しの修飾が酵素活性によって完全に許容されることは当業者に周知である。欠失、付加又はアミノ酸置換のようなたいていの変化は酵素活性に少なくとも劇的に影響しない。１個以上のアミノ酸の欠失、付加又は置換を含むような変異株は、明細書に開示される相補性検定を用いて容易に試験される。当業者は、“保守的アミノ酸置換”という用語に通じており、アミノ酸を同じグループに属する類似のアミノ酸で置換することを意味する。当業者は、“対立変異株 ”という用語に通じており、１つの特定酵素の天然に存在する変異株を意味する。これらの保守的置換及び対立酵素変異株は本発明からはずれていない。述べたように、ＤＮＡレベルのかなりの変異が許容しうる。本発明は配列番号 12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20又は配列番号22で示される４種類のＤＮＡ配列を開示するが、詳細には配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号20又は配列番号22で示されるＤＮＡ配列のイソコーディング変異株も本発明によって包含される。当業者は、P.ロドザイマ以外のホストでのコドン使用を最適化するために核酸配列を適応させる点での難しさはない。当業者は、関連ファフィア株から配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20又は配列番号22で示されるＤＮＡ配列の対立変異株をどのように単離するかを知っている。更に、プローブとして配列表に開示されるＤＮＡ配列、特に配列番号12、配列番号14、配列番号16又は配列番号18を用いて、対応する遺伝子型、他の株、又は他の微生物種、又は所望される場合には更に離れた真核種を単離することが可能であり、十分に配列相同性があるならば当該技術において既知のハイブリッド形成又は増幅の手法を用いてそれを検出することが可能である。典型的には、類似のＤＮＡ断片を得る方法は、既知の生物からＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドで形質転換した又は本発明の酵素を生産するために予想されるバクテリア又はバクテリオファージプラークのスクリーニングを含む。ＤＮＡの原位置複製後、ＤＮＡは細胞又はプラークから遊離し、フィルター（通常はニトロセルロース）上に固定化される。次に、配列表に示される配列のいずれかに基づく標識核酸プローブを用いてフィルター中の相補的ＤＮＡ断片がスクリーニングされる。スクリーニングすべき生物が密接に又は密接でなく関連があるか否かによって真のＤＮＡ断片を集め虚偽のＤＮＡ断片量を減少させるためにハイブリッド形成や洗浄条件を適応させなければならない。フィルター固定化ＤＮＡのハイブリッド形成に典型的な手順は、Nucleic acid hybridisation-a practical approach，B.D．Hames & S.J．Higgins Eds.，1985，IRL Press，Oxford，Chap ．5，table 3，pp.120 & 121に記載されている。最適条件は通常経験的に求められるが、密接に関連した配列や密接に関連しない配列に対していくつかの有効な経験法が示される。プローブに極めて密接に関連のあるＤＮＡ断片を同定するために、0.1×SETバッファー（20倍SET=3M NaCl，20mM EDTA，0.4M トリス-HCl，pH7.8，0.1%SDS，6 8℃）中高ストリンジェンシーの最終洗浄工程と共に上記Hames & Higginsの表３（実質は下記に再現される）に記載されるハイブリッド形成が行われる。プローブに対する相同性が限定された配列を同定するために行われるべき方法は、上記Hames & Higginsの表３の通りであるがハイブリッド形成及び洗浄の温度を下げた。例えば、2×SETバッファー，50℃の最終洗浄は、約75％相同性を有する配列を同定することができなければならない。当業者に周知である相同性とハイブリッド形成条件間の正確な関係は、プローブの長さ、塩基組成(G＋Cの%) 及びミスマッチの分布に依存する。ランダム分布は、T_m非ランダム又はクラスターパターンのミスマッチ時に強い減少作用がある。 Hames & Higginsの表３．Chap.5に記載される手順の実質は次の通りである。( 1)プローブ不在下のフィルターの前ハイブリッド形成する工程、(2)0.1〜4×SET バッファー（ストリンジェンシーに依存する）、10×デンハルト溶液(100×デンハルト溶液は２％ウシ血清アルブミン、２％フィコール、２％ポリビニルピロリドンを含む）、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50μg/mlサケ精子ＤＮＡ( 200〜500bpの長さに音波処理し、水浴中20分間放置し、最終濃度１mg/mlまで水で希釈した１mg/mlのサケ精子を溶解することにより得られる保存液から)中50〜 68℃の温度でのハイブリッド形成する工程。ハイブリッド形成時間はあまり重要でなく、１〜24時間、好ましくは約16時間(o/n)である。プローブは、典型的には、5×10⁷〜5×10⁸c.p.m./μgの比活性まで放射性標識として³²Pを用いてニック翻訳により標識される。(3)フィルターを3×SET，0.1%SDS，0.1%ピロリン酸ナトリウム，68℃で50〜68℃の温度（所望のストリンジェンシーに依存する）で（繰り返し）洗浄し、SET濃度を0.1%まで下げつつ繰り返し洗浄し、4×SET中室温で20分間１回洗浄し、フィルターを3MM紙上で乾燥し、フィルターをカセットのＸ線フィルムに−70℃で１〜96時間露光し、フィルムを現像する工程。一般的には、前ハイブリッド形成とハイブリッド形成ミックスの容積は、最小に保持されなければならない。“湿潤”工程は全て予熱水浴中小さな密閉バッグ内で行われる。上記手順は、本発明に従ってハイブリッド形成すると言われるＤＮＡ断片を作成するのに役に立つ。本発明のＤＮＡ断片を同定及び分離する手順に多くの変更が行われることは明らかである。そのようにして得られたＤＮＡ断片がこの手順を用いて実際に同定及び／又は単離されたかとは無関係に上記手順に従って検出される場合には請求の範囲に包含されることは理解されるべきである。本発明のＤＮＡ断片を同定及び単離するために適切に用いられる多くのプロトコールは引用したもの（上記Hames & Higgins）を含む文献やハンドブックに記載されている。定方向ＰＣＲ又は逆方向ＰＣＲのような新しいＤＮＡ増幅技術の出現により、コード領域の配列が既知であるとＤＮＡ断片の試験管内クローン化も可能である。ニトロセルロースフィルターに結合した場合及びハイブリッド形成条件下でのインキュベーション及び続いての洗浄後に、インキュベーションと洗浄後にフィルターのオートラジオグラフィーで検出可能である配列番号12、配列番号14、配列番号16又は配列番号18で示される配列をもつ放射能標識ＤＮＡ断片に対して特異的にハイブリッド形成することが可能なＤＮＡ配列も請求の範囲に包含される。ここで、ハイブリッド形成条件下の前記インキュベーションと続いての洗浄はフィルター結合ＤＮＡを0.3M NaCl、40mMトリス-HCl、2mM EDTA、0.1%SDS,pH7.8 中前記放射能標識ＤＮＡの溶液の存在下に少なくとも50℃、好ましくは少なくとも55℃、更に好ましくは少なくとも60℃の温度で少なくとも１時間インキュベートすることにより行われ、その後オートラジオグラフィーの前にフィルターを0. 3M NaCl、40mMトリス-HCl、2mM EDTA、0.1%SDS，pH7.8中50℃、好ましくは少なくとも55℃、更に好ましくは少なくとも60℃の温度で約20分間少なくとも２回洗浄する。本発明の異種ＤＮＡ配列は、ヒト血清アルブミン、IL-3、インスリン、VIII因子、tPA、EPO、α−インターフェロン等の医薬タンパク質、プロテアーゼ及びリパーゼ等のデタージェント酵素、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ポリガラクツロナーゼ等の細胞壁分解酵素、及び食品又は飼料用添加剤として有用な他の酵素（例えば、キモシン、フィターゼ、ホスホリパーゼ等）のような有効なタンパク質又はその前駆体をコードするオープンリーディングフレームを含むことができる。かかる遺伝子は、続いての使用の前に問題のタンパク質を回収するために発現されるが、タンパク質が未精製の形、例えば、培養ろ液又はファフィア細胞内に封入された形で生成物又はプロセスに添加されるのでしばしば必要としない。カロテノイドを含む酵母細胞は、動物飼料の添加剤としてそのままで又は乾燥形で用いられる。更に、酵母はタンパク質、炭水化物又は油のような他の化合物と混合される。本発明の組換えＤＮＡによって生産されるタンパク質又は色素のような有効な物質は抽出される。カロテノイドは、また、Johnsonら(Appl．Environm． Microbio1．35:1155-1159(1978))に記載されるように単離される。精製したカロテノイドは、食品及び／又は飼料の着色剤として用いられる。また、カロテノイドを化粧品又は医薬組成物に適用することも可能である。異種下流配列は、また、選択薬剤に対する感受性低下をコードするオープンリーディングフレームを含むこともできる。G418耐性を示す酵素をコードするオープンリーディングフレームは、本発明の方法に満足に用いられるが、本発明はこの選択マーカーに限定されない。欧州特許第590 707号に開示されるフレオマイシン耐性遺伝子のような他の有効な選択マーカーも用いられる。これらの遺伝子の各々は、GAPDHプロモーターのような本発明の強力なプロモーターの制御下で有利に発現される。下記の非限定的実施例によって更に詳しく本発明を具体的に説明する。実験菌株 : E．coli DH5α：supE44lacU169（80lacZM15）hsdR17 recA1 endA1 gyrA96thi- 1 relA1 E．coli LE392:supE44 supF58 hsdR514 galK2 galT22 metB1 trpR55 lacY1 P．rhodozyma CBS6938プラスミド : pUC19(Gibco BRL) pTZ19R PUC-G418 pGB-Ph9(Gist-brocades) pMT6(1987，Breter H.-J.，Gene 53，181-190) 培地 : LB:10g/lバクトトリプトン，5g/l酵母エキス，10g/l NaCl.プレート；+20g/l バクト寒天．適切な場合には50μg/mlアンピシリン． YePD:10g/l酵母エキス，20g/lバクトペプトン，20g/lグルコース．プレート;+ 20g/lバクト寒天．適切な場合には50μg/mlアンピシリン．方法 :分子クローニングの手法は全て実質的にはSambookら，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2nd Edit.(1989;Cold Spring Harbor Laborator y Press)によって記載されるように行った。酵素インキュベーションは、製造業者によって記載された使用説明書に従って行った。これらのインキュベーションは、制限酵素消化、脱リン酸化及び連結反応(Gibco BRL)が含まれる。ファフィア・ロドザイマ由来の染色体ＤＮＡの単離はGist-brocadest特許;欧州特許第0 590 707 A1号の実施例３に記載される。K.ラクチス(lactis)及びS.セレビシエ(cerevisiae)由来の染色体ＤＮＡをCryerら(Methods in Cell Biology 12 :39，Prescott D.M.(ed.)Academic Press，New York)に記載されるように単離した。大きな(>0.5kb)ＤＮＡ断片のアガロースからの単離はジーンクリーンIIキットを用いて行われ、小さな(<0.5kb)ＤＮＡ断片又はＰＣＲからの断片とWizard^TMＤＮＡクリーンアップシステム(Promega)を用いて単離した。 E.コリ(coli)の形質転換は、Sambrookらにより記載されたCaCl₂法に従って行われた。コスミド連結反応のパッケージング及びE.コリLE392へのトランスフェクションは、パッカジーンλＤＮＡパッケージングシステム(Promega)を用いてプロメガプロトコールに従って行った。プラスミドＤＮＡのE.コリからの単離は、QIAGEN(Westburg B.V．NL)を用いて行われた。ファフィアCBS6938の形質転換は、上記Faberらに記載されるH.ポリモルファ(p olymorpha)の方法に従って行った。 ‐30mlのYePDに１つのCBS6938コロニーを播種する ‐21℃，300rpmで１〜２日増殖する（前培養） ‐200mlのYePDに前培養物をOD₆₀₀=０〜１まで播種する（１より大きい場合は水で希釈する） ‐21℃，300rpmでo/n OD₆₀₀=1.2まで増殖する（測定前に希釈する） ‐8000rpm，室温で５分遠心分離する。上清を完全に除去する ‐沈降物を25ml 50mM KPi pH7.0，25mM DTTに再懸濁する（新しく調製した） ‐浮遊液を30mlの新しい滅菌遠心管に移し、室温で15分間インキュベートする ‐8000rpm４℃で５分遠心分離する，上清を完全に除去する ‐沈降物を25mlの氷冷STM(270mMスクロース，10mMトリスpH7.5，１mMMgCl₂) ‐8000rpm,4℃で５分遠心分離する ‐洗浄工程を繰り返す ‐細胞を0.5mlの氷冷STM(3×10⁹細胞/ml)に懸濁する。氷上で保冷する! ‐60μlの細胞浮遊液を５μgの形質転換ＤＮＡ（予め冷却した先端部を用いる）を含む予め冷却したエッペンドルフ管に移す，氷上で保冷する ‐細胞／ＤＮＡミックスを予め冷却したエレクトロポレーションキュベットに移す（上から下まで） ‐パルス:1.5kV，400Ω，25μF ‐直ちに0.5mlの氷冷YePDを加える。滅菌パスツールピペットを用いてepに戻す ‐21℃で2.5時間インキュベートする ‐100μlを40μg/mlのG418を含むYePDプレート上に播種する ‐コロニーが出現するまで21℃でインキュベートする GENEナビゲータ+アクセサリ(Pharmacia)を用いてパルスフィールド電気泳動を行った。条件:0.15×TBE，450V，パルス時間0.5s，1.2%アガロース，実験時間2h . 下記の組成を有する混合液中でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)実験を行った。 ‐5ngのプラスミドＤＮＡ又は１μg染色体ＤＮＡ ‐0.5μgのオリゴヌクレオチド(5μg変性オリゴヌクレオチド+染色体ＤＮＡ) ‐10nmの各dNTP ‐2.5μmのKCl ‐0.5μmトリスpH8.0 ‐0.1μm MgCl₂ ‐0.5μgゼラチン ‐1.3U Taqポリメラーゼ(5U+染色体ＤＮＡ) H₂Oを全量50μlまで加えた反応を自動サーマルサイクラー(Perkin-Elmer)で行った。条件:５'95℃に続いて次のサイクルを25回繰り返した;2'94℃，2'45℃，3'72℃ 最終;10'72℃．末端が一致する２ＤＮＡ断片を鋳型として当モル量で加えた以外は上記のように融合ＰＣＲを行った。オリゴヌクレオチド配列は次の通りとした。実施例１ファフィア形質転換細胞G418-1のG418耐性 G418耐性遺伝子のpGB-Ph9中での発現を求めるために、形質転換細胞G418-1（欧州特許第0 590 707 A1号）をG418の増加濃度に曝露した。G418-1培養物の２種の希釈液を０〜1000μg/mlG418を含むYepD寒天上に播種した(表1)。表１．増加濃度のG418を含むYepD寒天培地上のファフィア形質転換細胞G418-1の生存細胞数 600μg/mlG418の濃度においては1%未満の平板培養細胞が生存した。pGB-Ph9の多コピー組込みにもかかわらずG418-1はG418に対していくぶん弱い耐性を示すと結論され（Scorerら，1994，Bio/Technology 12，p．181〜，Jimenez & Davies，1980，Nature 187p.869〜）、おそらくプラスミド中のファフィアアクチンプロモーター作用が弱いためと思われる。ファフィアアクチンプロモーターの作用が不十分であるという結果が我々を刺激してプロモーター活性の強いファフィアのプロモーター配列を単離した。実施例２ファフィア・ロドザイマ由来解糖遺伝子の特定プローブのＰＣＲによる合成ファフィア・ロドザイマのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒロゲナーゼ(G APDH)、ホスホグルセレートキナーゼ(PGK)及びトリオースリン酸イソメラーゼ(T PI)をコード化する遺伝子の相同プローブを合成する試みにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の手法を用いた。 GAPDH遺伝子(Michelsら，1986，EMBO j．5:1049-1056)，PGK遺伝子(Osingaら，1985，EMBO J．4:3811-3817)及びTPI遺伝子(Swinkelsら，1986，EMBO J．5:12 91-1298)に基づき変性オリゴヌクレオチドセットを設計した。鋳型としてファフィア・ロドザイマ(CBS6938株)の染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲ断片を合成するために可能な全てのオリゴヌクレオチド配列の組合わせを用いた。増幅の特異性をモニターするために鋳型としてサッカロミセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)及びクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromycesl actis）を用いた。上記のようにＰＣＲを行い、ＰＣＲ条件は、1'95℃、2'アニーリング温度(T_a)、５サイクルの5'アニーリング温度〜72℃、2'72℃に続いて25 サイクルの1'95℃、2'55℃及び2'72℃及び10'72℃の他の伸長工程である。３種類のT_aは40℃、45℃及び50℃を用いた。これらの条件下で、プライマーの組合わせの１つだけが鋳型としてのファフィア染色体ＤＮＡ上に予想したサイズの断片を作製した。オリゴヌクレオチド配列の組合わせNo.3005及びNo.3006及びT_a45℃を用いて0.3kb断片が見られた。詳しくは、GAPDHオリゴヌクレオチドが発表されたS.セレビシエのアミノ酸241-246及びアミノ酸331-338と一致する。ファフイア由来のPGK遺伝子及びTPI遺伝子に対応するプロモーターを単離するためにＰＣＲ条件の最適化を必要とするか又は相同プライマーを用いなければならないことが結論された。高レベルプロモーターを単離する他の代替的方法は上記詳細な説明において開示されている。ＰＣＲ反応からの増幅した断片を精製し、BamHIで消化し、pTZ19Rの脱リン酸化BamHI部位に結合した。連結反応混合液をCa₂Cl法により調製したコンピテント E.コリDH5α細胞に形質転換し、50μg/ml Amp及び0.1mM IPTG/50μg/mI X-galを含むLBプレート上に細胞を播種した。pPRGDH1と呼ばれる右挿入断片を有するpTZ 19Rクローンを引き続き挿入断片の配列分析に用いた。 S.セレビシエのGAPDH遺伝子配列との比較によって示されるようにクローン化配列はファフイアGAPDHのカルボキシ末端断片をコード化した(Holland & Holland, 1979，J．of Biol．Chem．254:9839-9845)。実施例３ファフィアのGAPDH遺伝子の単離発現シグナルを含む完全GAPDH遺伝子を得るために、pPRGDH1の0.3kb BamHI断片を用いてファフィアのコスミドライブラリーをスクリーニングした。コスミドクローニング用ベクターの調製 pMT6に二重コス部位が存在することからベクター調製を単純化した。pMT6をブラントエンドカッターPvuIIで完結まで消化してコス部位を遊離した。消化効率は、E.コリDH5αへの形質転換でチェックし、>99%であることがわかった。 PvuAII消化pMT6をフェノール：クロロホルム抽出及びエタノール沈降で精製し、最後に30μl TEに２μg/μlの濃度で溶解した。引き続き、ベクターをクローニング酵素BamHIで消化し、ベクターアームを上記のように精製した(“実験”)。標的ＤＮＡの調製ファフイア株CBS6938のゲノムＤＮＡの単離を“実験”部分に記載されたように行った。25-38kbのコスミドpMT6含有挿入断片は、最も効率よくパッケージされている。従って、ゲノムＤＮＡを制限酵素Sau3Aによる部分消化に供した。標的ＤＮＡを異なる量の酵素とインキュベートした。消化直後に、制限混合液からのＤＮＡをフェノールークロロホルムで抽出することにより反応を停止した。エタノール法を用いてＤＮＡを沈殿させ、遠心分離後の沈降ＤＮＡを少量のTEに溶解した。輪郭クランプ均一電場(CHEF)電気泳動を用いて断片の濃度とサイズを測った(Dawkins，1989，J．of Chromatography 492 ，pp.615-639)。ゲノムコスミドライブラリーの構築約0.5μgのベクターアームＤＮＡと0.5μgの標的ＤＮＡの連結反応を5mM ATP の存在下に（ブラントエンド連結反応を防止する）全量10μlで行った。ファージヘッドのパッケージングとE.コリLE392へのトランスフェクションは実験に記載される通りとした。一次ライブラリーは、制限分析で求めた平均挿入断片が28 kbである7582個のトランスフェクタントから構成された。ライブラリーは、Samb rook（上記）に従って算出したライブラリー中全遺伝子の存在の確率が0.97であるゲノムの3.5倍を示す。ライブラリー増幅のためにトランスフェクタントを8mlのLBブイヨンに再懸濁することによりプールした。4.8mlのグリセロールを追加した。トランスフェクタント混合液を各々800μlの16個の試料に分け、-80 ℃で貯蔵した。この増幅ライブラリーは、2.9×10⁹トランスフェクタントから構成された。コスミドライブラリーのスクリーニングこのライブラリーから100μlの試料を取り、LBブイヨンで更に希釈(10⁶)し、2 00μlをアンピシリンを含む10LBプレート上に播種した。このプレートを37℃で一晩インキュベートした。各プレートは300〜400コロニーを含み、フィルターを調製した。これらのフィルターについて上記のハイブリッド形成と洗浄条件(“ 実験”)を用いてGAPDHプローブをスクリーニングした。16時間露光した後、オートラジオグラムで３個の強いハイブリッド形成シグナルが見られた。これらの陽性コロニーから単離したコスミドＤＮＡをpPRGDHcos1、pPRGDHcos2及びpPRGDHco s3と呼んだ。ファフィア・ロドザイマ株CBS 6938及びコスミドpPRGDHcos1から単離した染色体ＤＮＡを数種の制限酵素で消化した。ＤＮＡ断片を上記にように分離、ブロット及びハイブリッド形成した。オートラジオグラフを-80℃で異なる時間露光した。フィルムは、GAPDHプローブとハイブリッド形成する異なる制限酵素によって消化した異なる長さのＤＮＡ断片を示した(図1)。更に、プローブとしてGAPDH断片を用いるファフィアのゲノムＤＮＡのサザン分析から、GAPDHコード化遺伝子がファフィア・ロドザイマの単コピー遺伝子として存在するがサッカロミセス・セレビシエGAPDHでは３種の密接に関係するが結合していない遺伝子によってコードされると結論した(Boucherieら，1995．FE MS Microb．Letters 135:127-134)。同じ酵素で消化した染色体ＤＮＡの同じ長さの断片が見られるpPRGDHcos1のハイブリッド形成断片をアガロースゲルから単離した。その断片をpUC19の対応する部位に結合した。連結反応混合液をコンピテントE.コリ細胞に形質転換した。 3.3kb SalI挿入断片と5.5kb EcoRI挿入断片を有するプラスミドを各々pPRGDH3と pPRGDH6と呼んだ。pPRGDH3とpPRGDH6の制限地図を図２に示す。pPRGDH1の挿入断片の配列データの分析から、GAPDH遺伝子のＣ末端部分にHindIII部位があることがわかった。このデータから、pPRGDH6の挿入断片がプロモーターとターミネーターの配列を含むGAPDHの完全コード配列を含まねばならないことが示された。実施例４ GAPDH 遺伝子の確認多数の特定の配列プライマーを合成することを必要とせずに配列分析を行うために、GAPDH遺伝子の推定コード領域に又はその近傍に便利な制限部位を用いてプラスミドpPRGDH3とpPRGDH6の多くの欠失構築物を作成した。プラスミドを消化し、インキュベートした後に制限混合液の試料をゲル電気泳動で分析して完全消化をモニターした。フェノールークロロホルムで抽出した後、ＤＮＡをエタノールで沈殿した。-20℃で30分間インキュベートした後、遠心分離でＤＮＡを沈降させ、乾燥し、多量(0.1ng/μl)のTEに溶解する。連結反応後、混合液をE.コリに形質転換した。これらの形質転換細胞から単離したプラスミドＤＮＡを制限分析で分析し、右構築物がわかった。このようにして欠失によりpPRGDH3δHIII、pPRGDH6δBamHI、pPRGDH6δSstI及びpPRGDH6δSsalIが構築される(図1)。このほかに、pPRGDH6由来の0.6kbと0.8kb SstI断片をpUC19の対応する部位でサブクローン化した。 pUC/M13前向き及び逆向きプライマー(Promega)を用いて配列分析を行った。配列戦略を図２に示す（矢印参照）。 S.セレビシエ(Holland & Holland，1979，J．of Biol．Chem．254:9839-9845) とK.ラクチス(Shuster，1990，Nucl．Acids Res．18，4271)のGAPDH遺伝子配列との相同性と既知のスプライス部位の一致(J.L．Woolford，1989，Yeast 5:439 -457)に基づいて、イントロン及び可能なATG出発を仮定した。 GAPDH遺伝子は、６個のイントロン(図1)をもち、339個のアミノ酸のポリペプチドをコード化する。これは全く予想されず、イントロンがなくしかも共に332 個のアミノ酸からなるK.ラクチスとS.セレビシエのGAPDH遺伝子のゲノム体制と考えた。ファフィアとK.ラクチスとS.セレビシエのGAPDH遺伝子間のアミノ酸レベルの相同性は、各々63％と61％である。 GAPDH遺伝子のたいていのイントロンは、遺伝子の5'部分に位置する。イントロンIIIを除く全てのイントロンは、S.セレビシエとS.ポンベ(pombe)に見られる分枝部位保存配列5'-CTPuAPy-3'を含む。 PC遺伝子を用いて上流配列のコンピュータ分析により、２つの推定真核プロモーター要素、TATAボックス(配列番号11の位置249-263)と多数のCap推定シグナル（配列番号11の位置287と302の間に）が同定された。実施例５ pUCG418 におけるG418に融合したGAPDHプロモーターのクローニング GAPDHプロモーターとG418耐性をコード化する遺伝子間の転写融合を構築するために、融合ＰＣＲ法を用いた。プラスミドpPRGDH6を用いて標準ＰＣＲプロトコール(“実験”)によりGAPDHプロモーターが増幅された。ＰＣＲミックスにおいてはpPRGDH6とオリゴヌクレオチド配列No.5177とNo.512 6(“実験”における配列)を用いた。全GAPDHプロモーター配列を含む416bpＤＮＡ断片を作成した。更に、この断片は、5'端にHindIII、XhoI及びKpnI制限部位及びG418耐性をコード化する遺伝子の5'端との12個のオーバーラップを含む。 G418コード配列の5'端の217bp部分を、pUC-G418とオリゴヌクレオチド配列420 6と5127を用いてＰＣＲで増幅した。217bpのG418の5'端を含みかつ前に作成した GAPDHプロモーター断片の3'端との９個のヌクレオチドオーバーラップをもつ226 bpＤＮＡ断片が得られた。３端にMscI部位が含まれた。ウィザードキットを用いてＰＣＲ混合液からＰＣＲ断片を精製した。約１μg のGAPDHプロモーター断片と１μgのG418PＣＲ断片をオリゴヌクレオチド配列517 7と4206と共に融合ＰＣＲ実験（実験）で用いた。G418の5'部分に直接融合したG APDHプロモーターを含む621bpＤＮＡ断片を作成した。精製した後、ＤＮＡ断片をMscIとKpnIで消化した。pUC配列とG418の3'部分を含むpUC-G418の3.4kbのMscI -KpnI断片をベクターとして用いた。連結反応混合液をコンピテントE.コリDH5α細胞に形質転換した。挿入したＰＣＲＤＮＡを含む形質転換細胞コロニーを異なる制限酵素で消化することにより同定した。従って、G418マーカー遺伝子に直接融合したGAPDHプロモーターを含むプラスミドpPR1を得た。独立した形質転換細胞から単離した３種類のpPR1ベクターを更にクローニング実験に用いた。形質転換後、特定の組込み部位に対するプラスミドを標的にするためにファフィアのリボソームＤＮＡの一部を含む3.0bpのSstI断片をpPR1中でクローン化した。プラスミドpGB-Ph11のSstIで消化した後にアガロースゲルからリボソームＤＮＡ断片を単離した（欧州特許第590 707 A1号）。この断片をpPR1の脱リン酸化 SstI部位で結合した。連結反応混合液をコンピテントE.コリ細胞に形質転換した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析を用いて数個のコロニーが予想したプラスミドpPR2を含むことがわかった。完全なクローニング戦略を図３に示す。実施例６ pPR2 によるファフィアの形質転換ファフィア株6938の形質転換は、下記の変更をしてFaberら(1994，Curr．Gene t．1994:25，305-310)により以前に記載されたエレクトロポレーション法を用いて行った。 ‐電気パルスは、パルスコントローラ及びバイオラド２mmキュベットを備えたバイオラドジーンパルサーを用いて行った。 ‐ファフィアを21℃で16時間培養した。 ‐１形質転換あたり２×１０⁸細胞を５μgの線状ベクターと共に用いた。線状化は、ファフィアゲノムのｒＤＮＡ座での組込みを可能にするC1aIを用いてｒＤＮＡ配列中で行った。電気パルス(7.5kV/cm，400Ω及び25μF)後、0.5mlのYePD培地を細胞/DNA混合液に加えた。混合液を21℃で2.5時間インキュベートし、引き続き40μg/mlG418を含む５個の選択YEDP寒天プレート上に広げた。表２に示されるように、ＤＮＡ１μgあたり115個の形質転換細胞を含む形質転換細胞を生成することができた。多くの実験について判断した平均形質転換頻度は、50形質転換細胞／μg pPR2であった。閉環状pPR2の形質転換は形質転換をもたらさず、自律複製配列がベクター配列内に存在しないことを示した。pPR2を用いて、pGB-Ph9と呼ばれるファフィアの以前に構築された形質転換ベクターに比べて10〜50倍の形質転換頻度の増加が見られた。後者のベクターでは、ファフイアとG418のアクチンインキュベートの5'部分間に翻訳融合が行われた。形質転換細胞の耐性レベルを分析するために、混合液又はＤＮＡ／細胞を異なる量のG418を含む選択プレート上に塗布した。形質転換細胞の総数はG418の増加量と共に減少するが、なおかなりの数の形質転換細胞を得ることができた(表３) 。他の実験では、標準選択条件下（40μg/ml）で得られた30個の形質転換細胞を 50、200又は1000μg/mlを含むプレートに移した。そのプレートを21℃で４〜５日インキュベートした後、試験した３０個の中から２３個の形質転換細胞が200 μg/mlのG418を含むプレート上で増殖することができた。１個の形質転換細胞は、1000μg/ml前後のG418を含むプレート上で増殖することができた。表２． pGB-Ph9 とpPR2の形質転換頻度 Exp.1 Exp.2 -- 69 8 pGB-Ph9×BglII 46 7 pPR2 ccc n.d. n.d. pPR2(A)×ClaI 714 56 (B) 639 124 (C) 443 153 ４〜５日インキュベートした後の異なる形質転換実験における形質転換細胞(>１ mm)の総数表３．pGB-Ph9 とpPR2における２種類の異なるG418耐性遺伝子の結果としてのG41 8感受性の比較濃度形質転換細胞 G418(μg/ml) の数 pPR2×ClaI pGB-Ph9×BglII(=pYac4) 40 480 2 50 346 - 60 155 - 70 61 - 80 141 - 90 72 - 100 64 -pPR2 形質転換細胞の分析組込み結果と組込まれたベクターコピー数を分析するために、６個の独立した形質転換細胞由来の全ゲノムＤＮＡを単離した。従って、これらの形質転換を選択条件、即ち、YePD+50μg/mlG418下で培養した。染色体ＤＮＡをClalで消化した。ＤＮＡ断片をゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロースに移し、サザンブロツトをファフィアＤＮＡでプローブした。 9.1kbのｒＤＮＡバンドのほかに7.1kbの類似の蛍光強度の追加バンドが形質転換細胞に見られた。このバンドは、線状のpPR2に対応する。これらのバンドの強度から、コピー数が約100〜140コピーのpPR2であると結論された。これらの結果はpGB-Ph9に見られるものと似ており、G418耐性改善が組込まれたベクターのコピー数の差のみによるものであることを認めなかった。多コピー結果がpPR2の多コピー組込み又はｒＤＮＡの単コピーの増幅又は双方の結果の組合わせによって引き起こされるかはわからない。実施例７ GAPDH ターミネーターをpPR2にクローン化することによるpPR2Tの構築真核ｍＲＮＡは、修飾末端配列、詳しくは3'末端ポリ(A)を含む。G418耐性をコード化する原核遺伝子は、正しい転写終結やｍＲＮＡ安定性を与える真核終結シグナルが存在しないので(1994，Raue，H.A.，TIBTECH 12:444-449)、GAPDHの3 '非コード配列の一部を導入した。これを目的として、GAPDHの281bpの3'非コード領域及び他の追加のクローニング配列からなる307bpをオリゴヌクレオチド配列5137と5138(“実験”)を用いてＰＣＲで増幅した。オリゴヌクレオチド配列5137の上流は、GAPDHのコード領域の最後の14ヌクレオチドと3'非コード領域の17ヌクレオチドからなる。非コード配列の５番目(T--〉A)と８番目(T--〉C)のヌクレオチドの塩基置換によりBamHI制限部位が導入された。更に、この断片は3'端にXhoIとHindIII制限部位を含む。ＰＣＲ断片をウィザード精製キットを用いてＰＣＲ混合液から精製し、BamHI とHindIIIで消化した。288bp断片を単離し、以前に構築したファフィア形質転換ベクターpPR2の対応する部位にクローン化し、pPR2Tを得た。選択薬剤としてG418を用いたファフィアの形質転換の際、改良構築物pPR2Tで得られた形質転換頻度（ＤＮＡ１μgあたりの形質転換細胞数）はpPR2（即ち、ファフィア相同転写終結シグナルを含まない）の形質転換頻度より約５〜10倍高い。典型的な実験結果を表４に示す。表４ pGB-Ph9 ，pPR2及びpPR2Tの50μg/mlG418における形質転換頻度ベクター形質転換細胞形質転換細胞／μg DNA pGB-Ph9（ccc） ‐ ‐ pGB-Ph9(×BglII) 60 1 pPR2（ccc） 1 ‐ pPR2（×ClaI） 3000‐9600 50‐160 pPR2T（ccc） ‐ ‐ pPR2T(×ClaI) 45600 760 pPR2T(×SfiI) 1080 18 pPR2Tで形質転換したファフィア細胞について高レベルのG418の増殖能を試験した。増殖がなお可能であるG418レベルは、ファフィアプロモーター及び／又はターミネーターの存在の結果として形質転換細胞におけるG418耐性遺伝子の発現レベルを尺度とした。予備的結果から、高レベルのG418で増殖できる形質転換細胞数はターミネーターを含まないものより著しく大きいことが示される。要約上記の結果から、GAPDHプロモーター(pPR2)の存在はアクチンプロモーターを含むベクター(pGB-Ph9)と比べた場合に形質転換頻度のかなりの増加（ＤＮＡ１ μgあたり１〜少なくとも50個）をもたらすことが結論された。これらの結果は、GAPDHプロモーターの制御下で優れた発現レベルを示すG418感受性試験で得られた結果（表３及び表４）と一致する。形質転換頻度の差が単にベクターを線状にすることの差によるものである可能性(BglII、ClaI及びSfiIは全てリボソームＤＮＡの内部であるが異なる位置で切断する）は、pPR2(×SfiI)とpGB-Ph9(×Sf iI)との比較により認められなかった。SfiIで線状にした２種のpPR2とpGB-Ph9間の形質転換頻度の差はなおかなりある。しかしながら、線状化部位の選択が形質転換頻度に効果があることが結論される。C1aIによる線状化が好ましい。 GAPDHのような高レベルプロモーター用いて得られた改良は、相同ターミネーターが用いられるかに無関係である(pPR2(相同ターミネーターを含まない)はG41 8感受性試験及び形質転換頻度の双方でpGB-Ph9よりはるかに良好である)。相同ターミネーターの存在は、高形質転換頻度と高発現レベルの双方をもたらす。この結果は、使用プロモーターに依存しないと結論される。予備的結果から、pGB-Ph9構築物がpPR2Tに用いたGAPDHターミネーターのような転写ターミネーターで完結する場合にかなりの改良が得られることが示される。下記の実施例は、ファフィア・ロドザイマのカロテノイド生合成に関与する酵素をコード化するＤＮＡの単離を示すものである。これらのＤＮＡ配列は様々な目的に適切に用いられる。例えば、酵母のような他の生物中で類似の酵素をコード化するＤＮＡを通常のハイブリッド形成法によって検出及び単離するために、発現すべき異種及び同種下流配列の双方の発現ベクターを構築するために用いられる転写プロモーター及び／又はターミネーターを単離するために用いられる。カロテノイド生合成遺伝子をコード化するＤＮＡ配列は、それ自体のプロモーターか又は上記の解糖プロモーターのような異種プロモーターの制御下で過剰発現を実験するために適切に用いられる。例えば、ファフィア・ロドザイマを本発明のカロテノイドコード化ＤＮＡ配列で形質転換すると野生型状態、その結果としてコード化酵素の過剰発現に対する遺伝子の増幅がもたらされる。従って、カロテノイド生合成遺伝子をコード化する１個以上の遺伝子の過剰発現の効果がこのようにして実験される。β−カロテン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン及び／又はアスタキサンチンのような有効なカロテノイドを多量に生じるファフィア変異株を得ることが企図される。同様に、カロテノイド生合成経路に関与する酵素をコード化するＤＮＡ配列が細菌、例えば、E.コリ、酵母、例えば、サッカロミセス、クルイベロミセス、ロドスポリジウム(Rhodosporidium) 、カンジダ(Candida)、ヤロウィア(Yarrowia)、フィコミセス(Phycomyces)、ハンセヌラ(Hansenula)、ピッキア(Picchia)、真菌、例えば、アスペルギルス(Asp ergillus)、フサリウム(Fusarium)のような他のホスト及びニンジン、トマト等の植物に導入される。形質転換と発現に要求される手順は当業者に周知である。菌株 :E.コリXL-Blue-MRF'Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173endA1 supE44 th i-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F'proAB laq^QZΔM15 Tn10(Tet^r)] ExAssist^TM妨害耐性ヘルパーファージ(Stategene^R) P.ロドザイマCBS6938又は P.ロドザイマasta 1043-3クローニングに用いられるプラスミド pUC19 AP^r(Gibco BRL) Uni-ZAP ^TM XRベクター（EcoRI-XhoIで消化したλZAP^R IIベクター，CIAP処理 ;Stategene^R)培地 :LB:10g/lバクトトリプトン，５g/l酵母エキス，10g/l NaCl．プレート;+20 g/lバクト寒天．適切な場合には50-100μg/mlアンピシリン(Ap)、30μg/mlクロラムフェニコール(Cm)及び1mMイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド(IPTG)を添加した。 YePD:10g/l酵母エキス，20g/lバクトペプトン，20g/lグルコース．プレート;+ 2Og/lバクト寒天．分子クローニングの手法は全て実質的にSambrookら，Molecular Cloning:aLab oratory Manual，2nd Edit．(1989;Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載されるように行った。E.コリの形質転換はSambrookらに記載されたCaCl₂法に従って行った。酵素インキュベーションは、製造業者によって記載された使用説明書に従って行った。これらのインキュベーションとしては制限酵素消化、脱リン酸及び連結反応(Gibco BRL)が含まれる。プラスミドＤＮＡのE. コリからの単離は、QIAGEN( Westburg B.V.NL)を用いて行った。配列分析については、欠失構築物とオリゴヌクレオチドを作成してTaq DYEプライマーサイクルシークエンシングキット(Applied Biosystems)を用いて完全配列の配列を決定した。実施例８プラスミドの説明エルウィニア・ウレドボラのカロテノイド生合成に関与する遺伝子の種々の組合わせを含むプラスミド（pACCAR25ΔcrtE，pACCAR25ΔcrtB，pACCRT-EIB，pACCAR 16ΔcrtX及びpACCAR25ΔcrtX）は、ミサワ教授（キリンビール社;日本）から贈与された。エルウィニア・ウレドボラのカロテノイド生合成の生合成経路を図８に示す。更に、pACCAR25ΔcrtXΔcrtIと呼ばれるpACCAR25ΔcrtXの誘導体を我々の実験室で作成した。BamHI制限部位でのフレームシフトの導入によりcrtI遺伝子を不活性化した。このプラスミドを保持するE.コリ株は、コロニーの赤色表現型によってモニターされるフィトエンを蓄積する。プラスミドは全てクロラムフェニコール耐性を与えるマーカーを含むプラスミド pACYC184(Rose RE;Nucl．Acids Res．16(1988)355)の誘導体である。更に、これらのプラスミドとその誘導体はpUCやpBluescriptのようなベクターに適合しうる複製起原を含む。各プラスミドは、E.コリ中で異なるカロテノイドの生成を仲介するエルウィニア・ウレドボラのカロテノイド生合成遺伝子セットを含む。本実験に用いられるプラスミドの全リストを表５に示す。表５：本実験に用いられるカロテノイド産生E.コリ株のまとめ遺伝子コード:crtE，ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ; crtB，フィトエンシンターゼ;crtI，フィトエンデサチュラーゼ;crtY，リコペンシクラーゼ;crt X，β−カロテンヒドロキシラーゼ;crtZ，ゼアキサンチングリコシラーゼ実施例９ファフィア・ロドザイマのｃＤＮＡライブラリーの構築 a) 全ＲＮＡのファフィア・ロドザイマからの単離溶液は全てDEPC処理蒸留水中で調製し、器具は全て0.1%DEPCに一晩浸漬してからオートクレーブにかけた。 60mlのYePD培養液を含む300ml三角フラスコに前培養物からのファフィア・ロドザイマ株CBS6938/1043-3を最終OD₆₀₀0.1まで播種した。この培養物をOD₆₀₀3〜4 に達するまで21℃(300rpm)でインキュベートした。細胞を遠心分離(4℃，8000rpm，5分)で回収し、12mlの氷冷抽出緩衝液(0.1Mトリス-HCl，pH7.5;0.1M LiCl;0.1mM EDTA)に再懸濁した。遠心分離後、細胞を２ml の氷冷抽出緩衝液に再懸濁し、４ｇのガラスビーズ(0.25mm)と２mlのフェノールを加えた。混合液を、30秒の氷上の冷却インキュベーション間隔を含む最大速度で30秒５回攪拌した。細胞／ガラスビーズ／フェノール混合液を遠心分離(5分，15,300rpm，4℃)し、水相(sup１)を新しい試験管に移し、氷上に保った。フェノール相を、追加量の1ml抽出緩衝液と２mlのフェノールを加えることにより後退させた。遠心分離(5分，15,300rpm，4℃)後、水相をsup１に移し、同量のフェノール：クロロホルムで抽出した。遠心分離(5分，15,300rpm，4℃)後、水相を新しい試験管に移し、0.1容量の３M NaAc;pH5.5と2.5容量のEtOHを加えてＲＮＡを沈殿した(-20℃で一晩インキュベーション)。沈殿を遠心分離(5分，15,300rpm，4℃)で集め、過剰の液体を排出し、ＲＮＡ沈降物を70%氷冷EtOHで洗浄した。過剰の液体を除去した後、ＲＮＡを200〜800μl DEPC処理水に再懸濁した。ＲＮＡを-70℃で貯蔵した。60ml培養物は400〜1500μgの全ＲＮＡを生成した。全ＲＮＡの多能性をホルムアルデヒドＲＮＡゲル電気泳動でチェックした。 b)ポリ(A)⁺ＲＮＡの選択全ＲＮＡからのポリ(A)⁺の単離を、下記の溶液を用いて実質的にSambrookら，19 89(Molecular cloning，a laboratory manual，2edit.)に記載された通り行った。溶液は全てDEPC処理水で調製し、オートクレーブにかけた。ＲＮＡ変性緩衝液:１M NaCl;18%(v/v)DMSO. カラム充填緩衝液(HEND):10mMヘペス，pH7.6;１mM EDTA;0.5M NaCl;9%(v/v)DMSO . 溶離緩衝液(HE):10mMへペス，pH7.6;１mM EDTA. オリゴ(dT)−セルロース７型をファーマシアバイオテックから購入した。0.1ｇ（乾燥重量）のオリゴ(dT)−セルロースを１mlのHENDに加え、浮遊液を４℃で１時間穏やかに振盪した。全ＲＮＡ(1.5mgを500μlに溶解した)及び１mlの１MNaCl ;18(v/v)DMSOを65℃で５分間加熱した。次に、600μlのNaCl/DMSOをＲＮＡに加え、混合し、氷上で５分間置いた。ポリ(A)⁺の単離を２サイクルの精製で行った。最終収量は、約45μgポリ(A)⁺ＲＮＡであった。 c)ｃＤＮＡ合成 7.5μgのポリ(A)⁺ＲＮＡからｃＤＮＡ合成キット(#200401;Strategene^R)を用いてｃＤＮＡを合成した。わずかに変更した説明マニュアルに従って合成を行った。 SuperScript^TMII RNase H^-逆転写酵素(Gibco BRL)をMMLV-RTの代わりに一次鎖反応に用いた。下記の試薬をミクロ遠心分離管に加えた。３μlのポリ(A)⁺ＲＮＡ２μlのリンカー−プライマー 23.5μlのDMQ 70℃で10分間インキュベートし、ミクロ遠心分離管で急速回転し、下記の試薬を加えた。 10μlの５×一次鎖緩衝液(Gibco BRL製) ５μlの0.1M DTT(Gibco BRL製) ３μlの一次鎖メチルヌクレオチド混合液１μlのRNaseブロックリボヌクレアーゼインヒビター(40U/μl) 鋳型とプライマーの混合液を25℃で10分間、次に42℃で２分間インキュベートすることによりアニーリングし、最後に下記の試薬を加える。 2.5μlのSuperscript^TMII RNase H^-逆転写酵素一次鎖反応を42℃で１時間行った。サイズ分画をGeneclean^R IIキット(BIO 101社製)を用いて行った。XhoI消化後に得られたｃＤＮＡ混合液の容量を、DMQを加えることにより最終容量200μlにした。３容量のNaIを加え、ミクロ遠心分離管を氷上に５分間置いた。ガラスミルクの沈降物を500μlの新しい洗浄液を用いて３回洗浄した。最後に、ｃＤＮＡを 20μlのDMQ中で溶離した。これらの条件を用いたｃＤＮＡの収量は約１μgであった。 d)ｃＤＮＡクローニング 100ngのｃＤＮＡを用いてUni-ZAP^TMXRベクター中でｃＤＮＡライブラリーを構築した。連結反応は、12℃の一夜インキュベーションを２回行った。Packagene^Rλ ＤＮＡパッケージングシステム(Promega)を用いて使用説明書のマニュアルに従ってｃＤＮＡライブラリーをパッケージングした。ｃＤＮＡライブラリーの滴定計算値は3.5 10⁶pfuであった。 e)集団切除アクセプター株としてE.コリXL-Blue-MRF'の誘導体を用いるプロトコールで集団切除を行った（表５参照）。細胞混合液の希釈液をアンピシリン、クロラムフェニコール及びIPTGを含む145mm LB寒天プレート上に播種し、各プレート上で250 〜7000コロニーを得た。プレートを37℃で一晩インキユベートし、室温で１日又は２日以上更にインキュベートした。実施例10 ファフィア・ロドザイマのゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ遺伝子(crtE) のクローニング a) ｃＤＮＡクローンの単離全ライブラリーを、プラスミドpACCAR25ΔcrtEを保持するE.コリXL-Blue-MRF'(X L-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtE]と表される)のファルネシルピロリン酸／イソペンテニルピロリン酸蓄積細胞へ切除した。crtE遺伝子のスクリーニングは、形質転換細胞の呈色に基づいた。XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtE]の遺伝的バックグラウンドにcrtE遺伝子を導入することにより、黄色／橙色のコロニーの存在でモニターされるゼアキサンチン−ジグルコシドの生合成の完全経路の回復がもたらされる。適切な抗生物質とIPTGを含むLB寒天プレート上に約8,000コロニーが広がった。１コロニーが黄色／橙色に変化したことがわかった。b) 相補的ｃＤＮＡクローンの確認これらのコロニーをLBアンピシリン寒天プレート上に線状に塗った。この黄色コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、1.85kb断片を含むことがわかった（図2A ）。pPRcrtEと呼ばれる得られたプラスミドを形質転換実験に用いた（表６）。X L-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtE]のpPRcrtEによる形質転換のみ表現型が白色から黄色に変化した。色の変化が相補によるものでありｃＤＮＡによるものでないかを試験するためにpPRcrtEだけをXL-Blue-MRF'に形質転換した。IPTGを含むLB-アンピシリン寒天プレート上の形質転換細胞の選択は、コロニーの色の変化を生じなかった（表６）。従って、IPPとFPPのGGPPへの変換に関与するGPPPシンターゼをコード化するP.ロドザイマのｃＤＮＡがクローン化されたと我々は暫定的に結論した。表６： pPRcrtEで形質転換したカロテノイド産生E.コリ株の表現型の呈色形質転換:10ngの各プラスミドをCaCl₂コンピテントE.コリ細胞に混合した。適切な抗生物質（角括弧内）を含むLB寒天培地上に1/10〜1/100容量のＤＮＡ／細胞混合液を播種することにより形質転換細胞を選択した。c) ｃＤＮＡ断片の配列分析プラスミドpPRcrtEを用いて1.85kb ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を求めた。配列は1830ヌクレオチドと31bpポリ(A)尾部から構成された。375個のアミノ酸のオープンリーディングフレーム(ORF)を予想した。ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を各々配列番号14及び配列番号15として示す。ブリッツアミノ酸配列アラインメントプログラムを用いるSWISS-PROTタンパク質配列データベースの検索から、特に異なる生物のゲラニルゲラニル-PPiシンターゼｃＤＮＡ酵素の保存ドメインＩ(Botellaら，Eur．J．Biochem.(1995)233;238-248)に対するアミノ酸相同性(52%の132aaオーバーラップ;ニューロスポラ・クラッサ）が示された。実施例11 ファフィア・ロドザイマのフィトエンシンターゼ遺伝子(crtB)のクローニング a) ｃＤＮＡクローンの単離全ライブラリーを、プラスミドpACCAR25ΔcrtBを保持するE.コリXL-Blue-MRF'(X L-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtB]と表される)のゲラニルゲラニルピロリン酸蓄積細胞へ切除した。crtB遺伝子のスクリーニングは、形質転換細胞の呈色に基づいた。XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtB]の遺伝的バックグラウンドにcrtE遺伝子を導入することにより、黄色／橙色に着色したコロニーの存在でモニターされるゼアキサンチン−ジグルコシドの生合成の完全経路の回復がもたらされる。適切な抗生物質とIPTGを含むLB寒天プレート上で約25,000コロニーをインキュベートした。３コロニーが黄色／橙色に変化したことがわかった。b) 相補的ｃＤＮＡクローンの確認これらのコロニーをLB-アンピシリン寒天プレート上に線状に塗った。これらの黄色のコロニーからpPRcrtB1〜3と呼ばれるプラスミドＤＮＡを単離し、2.5kb断片を含むことがわかった（図2B）。得られたプラスミド、pPRcrtBの１つを形質転換実験に用いた（表７）。XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtB]のpPRcrtBによる形質転換のみ表現型が白色から黄色に変化した。従って、GGPP2分子のプレフイトエンピロリン酸を介してフィトエンへの変換に関与するフィトエンシンターゼをコード化するP.ロドザイマのｃＤＮＡがクローン化されたと我々は暫定的に結論する。表７： pPRcrtBで形質転換したカロテノイド産生E.コリ株の表現型の呈色説明:表６参照。 c) ｃＤＮＡ断片の配列分析最長のｃＤＮＡ挿入断片を含むプラスミドpPRcrtB2を用いて2.5kbｃＤＮＡのヌクレオチド配列を求めた。配列は2483ヌクレオチドと20bpポリ(A)尾部から構成された。684個のアミノ酸のオープンリーディングフレーム(ORF)を予想した。ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を各々配列番号12及び配列番号13として示す。ブリッツアミノ酸配列アラインメントプログラムを用いるSWISS-PROTタンパク質配列データベースの検索から、他の生物のcrtB遺伝子とのアミノ酸相同性(ニューロスポラ・クラッサのcrtB遺伝子の441aaオーバーラップの同一性26%)が示された。実施例12 ファフィア・ロドザイマのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子(crtB)のクローニング a) ｃＤＮＡクローンの単離全ライブラリーを、プラスミドpACCAR25ΔcrtXΔcrtIを保持するE.コリXL-Blue- MRF'(XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtXΔcrtI]と表される)のフィトエン蓄積細胞へ切除した。crtI遺伝子のスクリーニングは、形質転換細胞の呈色に基づいた。XL -Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtXΔcrtI]の遺伝的バックグラウンドにcrtI遺伝子を導入することにより、黄色／橙色のコロニーの存在でモニターされるゼアキサンチンの生合成の完全経路の回復がもたらされる。適切な抗生物質とIPTGを含むLB寒天プレート上で約14,000コロニーをインキュベートした。２コロニーが黄色／橙色に変化したことがわかった。b) 相補的ｃＤＮＡクローンの確認これらのコロニーをLB−アンピシリン寒天プレート上に線状に塗った。これらの黄色のコロニーからpPRcrtI.1とpPRcrtI.2と呼ばれるプラスミドＤＮＡを単離し、2.0kb断片を含むことがわかった（図2C）。得られたプラスミド、pPRcrtI.１の１つを形質転換実験に用いた（表８）。XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtXΔcrtI] のpPRcrtIによる形質転換のみが表現型の白色から黄色への変化を生じた。従って、フィトエンのリコペンへの変換に関与するフィトエンデサチュラーゼをコード化するP.ロドザイマのｃＤＮＡがクローン化されたと我々は暫定的に結論する。表８： pPRcrtIで形質転換したカロテノイド産生E.コリ株の表現型の呈色説明:表６参照。 c) ｃＤＮＡ断片の配列分析プラスミドpPRcrtIの１つを用いて2.0kbｃＤＮＡのヌクレオチド配列を求めた。配列は2038ヌクレオチドと20bpポリ(A)尾部から構成された。582個のアミノ酸のオープンリーディングフレーム(ORF)を予想した。ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を各々配列番号16及び配列番号17として示す。ブリッツアミノ酸配列アラインメントプログラムを用いるSWISS-PROTタンパク質配列データベースの検索から、N.クラッサのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子に対するアミノ酸の相同性が示された(529aaオーバーラップの同一性53%)。実施例13 ファフイア・ロドザイマのリコペンシクラーゼ(crtY)のクローニング a) ｃＤＮＡクローンの単離プラスミドpACCRT-EIBを保持するE.コリXL-Blue-MRF'(XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB ]と表される)のリコペン蓄積細胞へ全ライブラリーを切除した。crtY遺伝子のスクリーニングは、形質転換細胞の呈色に基づいた。XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB]の遺伝的バックグラウンドにcrtY遺伝子を導入することにより、黄色のコロニーの存在でモニターされるβ-カロテン生合成の完全経路の回復がもたらされる。適切な抗生物質とIPTGを含むLB寒天プレート上で約8,000コロニーをインキュベートした。１コロニーが黄色に変化したことがわかった。b) 相補的ｃＤＮＡクローンの確認このコロニーをLB−アンピシリン寒天プレート上に線状に塗った。この黄色のコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、2.5kb断片を含むことがわかった(図2B) 。pPRcrtYと呼ばれる得られたプラスミドを形質転換実験に用いた（表９）。驚くべきことに、XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB]のpPRcrtIによる形質転換だけでなくX L-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtB]の形質転換も表現型の赤色から黄色への変化を生じた。表９： pPRcrtYで形質転換したカロテノイド産生E.コリ株の表現型の呈色説明:表６参照。以前にクローン化したpPRcrtBのｃＤＮＡを含む第２形質転換実験を行った。表６に示されるようにフィトエンシンターゼをコード化するものとして以前に（実施例３）単離したｃＤＮＡはcrtY欠失を相補うことができ、XL-Blue-MRF'[pACC RT-EIB]のβ−カロテン生合成を生じる。 pPRcrtY(配列番号18及び配列番号19)のｃＤＮＡ挿入断片の配列分析からpPRcrtB のｃＤＮＡ断片の配列と似ていることがわかった。これらのデータから、GGPP２分子のプレフィトエンピロリン酸を経由するβ−カロテンに対するフィトエンとリコペンへの変換に関与するフィトエンシンターゼとリコペンシクラーゼをコード化するP.ロドザイマのｃＤＮＡがクローン化されたと我々は暫定的に結論する。これは、２種の酵素活性をコード化するカロテノイド生合成の生合成経路の最初の遺伝子である。表10:ファフィア・ロドザイマの異なるｃＤＮＡで形質転換したカロテノイド産生E.コリ株(Ap，Cm，IPTG)の表現型の呈色説明:表６参照。実施例14 ファフィア・ロドザイマのイソペンテニルニリン酸(IPP)イソメラーゼ(idi)のクローニング a) ｃＤＮＡクローンの単離全ファフィアライブラリーを、各々がプラスミドpACCRT-EIBを保持するE.コリXL -Blue-MRF'(XL-B1ue-MRF'[pACCRT-EIB]と表される)のフィトエン蓄積細胞へ切除した。適切な抗生物質とIPTGを含むLB寒天プレート上で約15,000コロニーをインキュベートした。１コロニーが暗赤色の表現型をもつことがわかった。b) 相補的ｃＤＮＡクローンの確認このコロニーをLB−アンピシリン寒天プレート上に線状に塗った。この黄色コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、1.1kb断片を含むことがわかった。pPRcr txと呼ばれる得られたプラスミドを形質転換実験に用いた（表11）。 pPRcrtXで形質転換したXL-Blue-MRF'[pACCAR-EIB]のコロニーは全て暗赤色表現型を有した。これらのデータから、遺伝子操作したE.コリ株のリコペン生産の増加を生じるP.ロドザイマのｃＤＮＡがクローン化されたと我々は暫定的に結論する。表11： pPRcrtIで形質転換したカロテノイド産生E.コリ株の表現型の呈色説明:表６参照。 c) ｃＤＮＡ断片の配列分析この遺伝子の種類を解決するためにpPRcrtXのｃＤＮＡ挿入断片の完全ヌクレオチド配列を求めた。ヌクレオチド配列は1144bpからなる。配列は1126ヌクレオチドと18ヌクレオチドのポリ(A)尾部からを構成された。分子量28.7kDaを有する25 1個のアミノ酸のオープンリーディングフレーム(ORF)を予想した。ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を各々配列番号20及び配列番号21として示す。ブリッツアミノ酸配列アラインメントプログラムデータを用いるSWISS-PROTタンパク質配列データベースの検索から、S.セレビシエのイソペンテニルニリン酸(IPP)イソメラーゼ(idi)に対するアミノ酸の相同性が示された(200アミノ酸オーバーラップの同一性42.2%)。IPPイソメラーゼは、カロテノイドの5-炭素構造ブロックを合成するイソプレン生合成経路の不可欠な活性化工程を触媒する。酵母と同様にファフィアの遺伝子はidi1と呼ばれる。遺伝子を保持するｃＤＮＡクローンはpP Ridiと呼ばれる。実施例15 カロテン産生E.コリにおけるP.ロドザイマのidi遺伝子の過剰生産プラスミドpACCRT-EIBを保持するE.コリXL-Blue-MRF'のリコペン蓄積細胞(XL- Blue-MRF'[pACCRT-EIB]として表される)をpUC19及びpPRidiで形質転換し、 AmpとCmを含む固化LB培地上で形質転換細胞を選択した。XL-Blue-MRF'[pACCRT-E IB/pUC19]及び[pACCRT-EIB/pPRidi]と呼ばれる形質転換細胞をAmp、CmとIPTGを含む30mlのLB培地で250rpm，37℃で16時間培養した。これらの培養物から１mlをカロテノイドの抽出と分析に用いた。遠心分離後、細胞沈降物を200μlのアセトンに溶解し、65℃で30分間インキュベートした。次に、50μlの無細胞アセトン画分を高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)分析に用いた。カラム（クロムパックcat.28265;パッキングヌクレオシル100C18）を水−アセトニトリル−２−プロパノール(9:10:81 0〜45分後、2:18:80 45分)で流速0.4ml/分で展開し、ホトダイオードアレー検出器で470+/-20nmを記録した。リコペンの保持時間は、これらの条件下で約23分であることがわかった。ピーク領域を相対リコペン生産(mAu× s)として用いた。相対リコペン生産は、XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB/pUC19]と[pAC CRT-EIB/pPRidi]について各々395と1165であった。これらのデータから、ファフィア・ロドザイマのidiの発現増強がE.コリでカロテノイド生合成の３倍の増加を引き起こすのでファフィアの代謝経路遺伝子工学の可能性が示される。このｃＤＮＡは、カロテノイド及び／又はキサントフィルレベルを高めるために形質転換ファフィア細胞で過剰発現される。ｃＤＮＡは、本発明の強力なプロモーター、例えば、本明細書に開示されたGAPDH遺伝子プロモーターのようなファフィア解糖系プロモーター、又は本発明のファフィアリボソームタンパク質遺伝子プロモーター（下記参照）のようなファフィアで活性なプロモーターの制御下で適切にクローン化される。場合によっては、ｃＤＮＡはGAPDH遺伝子ターミネーター／ポリアデニル化部位のような本発明の転写ターミネーター及び／又はポリアデニル化部位の前でクローン化される。この方法の可能性を、例示としてエルウィニア・ウレドボラ由来crtB遺伝子がファフィア・ロドザイマで過剰発現される次の実施例に示す。実施例16 エルウィニア・ウレドボラ由来カロテン産生遺伝子のファフィア・ロドザイマでの異種発現エルウィニア・ウレドボラ（Misawaら，1990）のフィトエンシンターゼをコード化するコード配列(crtB)をファフィアのgpd(GAPDH遺伝子)のプロモーターとターミネーター配列間に融合ＰＣＲでクローン化した。２つの別のＰＣＲ反応において、gpdのプロモーター配列とcrtBのコード配列を増幅した。前者の配列をプライマー5177と5128及び鋳型としてpPR8を用いて増幅した。この後者のベクターは、プロモーター配列が拡張しBglII制限部位が除去されたファフィア形質転換ベクターpPR2の誘導体である。プライマー5226と5307及び鋳型としてpPRgp6を用いてＰＣＲでgpdのプロモーター配列を増幅した。増幅したプロモーター断片を単離し、KpnIとBamHIで消化し、ベクターpPR2のKpnI-BglII断片でクローン化してpPR8を得た。プライマー5131と5134及び鋳型としてpACCRT-EIBを用いてcrtBのコード配列を増幅した。プライマー5177と5134を用いる第２融合ＰＣＲ反応では、１μgの増幅プロモーターと鋳型としてcrtBコード領域断片を用いて融合産物P gpd-crtBを得た。プライマー5137と5138及び鋳型としてプラスミドpPRgdh6を用いる標準ＰＣＲ条件下でターミネーター配列を増幅した。プライマー5137は、5' 端にE.ウレドボラのcrtB遺伝子のコード領域の最後の11ヌクレオチドとP.ロドザイマのgpd遺伝子のターミネーター配列の最初の16ヌクレオチドを含む。２つの塩基対置換によって、BamHI制限部位を導入した。増幅した融合産物(Pgpd-crtB) と増幅したターミネーター断片を精製し、HindIIIとBamHIで消化し、クローニングベクターpMTL25の脱リン酸化HindIII部位にクローン化した。構築物Pgpd-crtB -Tgpdを有するベクターをpPREX1.1と名付けた。発現カセットPgpd-crtB-Tgpdを含むHindIII断片をpPREX1.1から単離し、ファフィア形質転換ベクターpPR8の脱リン酸化HindIII部位に結合した。連結反応混合液のE.コリへの形質転換後、正しい挿入断片を有するベクター(pPR8crtB6.1) をファフィア形質転換実験に用いた。発現カセットPgpd-crtB-Tgpdを保持するpPR8crtB61.1でファフィア株CBS6938 を形質転換し、G418を含むプレート上で形質転換細胞を選択した。３種のG418耐性形質転換細胞と野生型ファフィア株のOD₆₀₀あたりのアスタキサンチンの相対量をHPLC分析で求めた（表12）。ファフィアからのカロテノイド単離については Sedmakら(1990;Biotechn．Techiq．4，107-112)によって記載されたDMSO／ヘキサン抽出方法が用いられる。表12．E．ウレドボラのcrtB遺伝子を保持するファフィア形質転換細胞の相対アスタキサンチン生産 gpd配列は太字で示され、crtB配列はイタリックで示され、クローニング用制限部位は下線が引かれ、塩基置換は二重下線が引かれている。実施例17 ファフィアのcrtB遺伝子の単離と確認 crtBに対応するファフィア・ロドザイマ遺伝子を発現すること及びそれ自体の調節領域の制御下又は本発明の高度に発現したプロモーターの制御下で発現することも可能である。本明細書に開示されたファフィア形質転換の手順は、常に導入ＤＮＡの安定に組込まれた高コピー数をもたらし、それ自体のプロモーターの制御下での遺伝子の発現はアスタキサンチンを含むカロテノイドの生産増加をもたらすことも予想される。原理を示すために、下記にcrtBゲノム配列のクローニング用プロトコールを示す。発現シグナルを含むゲノムcrtB遺伝子を得るために、2.5kb BamHI-XhoI断片をベクターpPRcrtBから単離し、ファフィアのコスミドライブラリーをスクリーニングするプローブとして用いた。gapdh遺伝子の代わりにプローブとしてcrtB遺伝子を用いて実施例３に記載されるようにライブラリーの構築とスクリーニングを行った。ハイブリッド形成ラウンド後、２コロニーを同定し、露光後のオートラジオグラムで強いハイブリッド形成シグナルを示した。これらのコロニーから単離したコスミドＤＮＡを各々pPRgcrtB#1.1及びpPRgcrtB#7と呼んだ。ファフィア・ロドザイマ株CBS 6938とコスミドpPRgcrtB#7から単離した染色体ＤＮＡを数種の制限酵素で消化した。ＤＮＡ断片を分離し、ブロットし、上記の条件下でcrtBのアミノ末端特定プローブ(0.45kb XbaI断片)とハイブリッド形成した。露光後、オートラジオグラムはcrtBプローブとハイブリッド形成した異なる制限酵素で消化した異なる長さのＤＮＡ断片を示した。EcoRI部位がｃＤＮＡクローンに存在しないことに基づいて、約4.5kbのEcoRI断片をサブクローニング実験に使用してプロモーター領域の配列を求めかつcrtB遺伝子のイントロン配列の存在を確かめた。似たサイズのハイブリッド形成断片がEcoRIで消化した染色体ＤＮＡにも見られた。その断片をアガロースゲルから単離し、pUC19の対応する部位に結合した。連結反応混合液をコンピテントE.コリ細胞に形質転換した。 pPR10.1及びpPR10.2と名付けられた両方向の正しい挿入断片を有するプロモーターを形質転換細胞から単離した。XbaIで消化したpPR10.1/pPR10.2とpPRcrtBの制限パターンを比較すると、ｃＤＮＡクローンの内部の2.0kbXbaI断片が前者のベクターでは大きいことがわかったので１個以上イントロンの存在を示した。サブクローンpPR10.1をいわゆるプライマーウオーキング法によるプロモーター領域及び構造遺伝子の配列分析に用いた。挿入断片の部分配列を配列番号22に示す。ｃＤＮＡとゲノム配列の比較から４個のイントロンの存在がわかった。実施例18 高発現レベルを有するプロモーター配列の単離本実施例は、高度に発現した遺伝子から転写プロモーターを得るために詳細な説明で言及した“ｃＤＮＡ配列法”の可能性を示すものである。高発現レベルを示すファフィア・ロドザイマ遺伝子からの転写プロモーター配列の単離と同定については、下記の手順でファフィア・ロドザイマのｃＤＮＡライブラリーを分析した。ｃＤＮＡライブラリーをAmpを含む固化LB培地上に播種し、プラスミド単離用に96コロニーをランダムに集めた。精製したプラスミドをXhoIとXbaIで消化し、アガロースゲルに充填した。ｃＤＮＡ挿入断片のサイズは0.5〜3.0kbで変動した。引き続き、これらのプラスミドを鋳型としてT3プライマーを用いる単一配列反応に用いた。17個のｃＤＮＡクローンについては、配列データは得られなかった。得られた配列を３つのリーディングフレームで翻訳した。各ｃＤＮＡ配列については、最長推定アミノ酸配列をブリッツプログラムを用いてEBIのスイスプロットタンパク質データベースと比較した。18個の推定アミノ酸配列については、既知のタンパク質に対する相同性が見られないが、６個のアミノ酸配列は仮定のタンパク質に対してかなりの相同性を示した。55個のアミノ酸配列は機能が既知のタンパク質に対してかなりの相同性があることがわかった。約50%(38/79)が12 個の全長配列が得られたリボソームタンパク質をコード化することがわかった。表13．タンパク質をコード化した発現ｃＤＮＡの概要及び配列表の参照配列相同性によって、ファフィア中で40Sリボソームタンパク質S37が他の生物にも同様に見られるユビキノンに融合することが結論された。全長ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を配列表に示す。６個のリボソームタンパク質は１を超える個々のｃＤＮＡクローンでランダムプールに示された。 40Sリボソームタンパク質S10(配列番号44)、S37(+ユビキノン)(配列番号24)及び S27(配列番号28)が２回示され、60S(酸性)リボソームタンパク質P2(配列番号38) 、L37(配列番号46)及びL25(配列番号36)は３回見られた。これらの結果から、これらのタンパク質が複数の遺伝子によってコード化されること及びこれらの遺伝子が高度に発現されると我々は結論する。従って、これらのプロモーター配列の単離はファフィア・ロドザイマから高レベルの発現シグナルを単離する新しいかつ有望な標的である。更に、ニューロスポラ・クラッサ(Curr．genet.14:545-55 1(1988))由来の豊富なグルコース抑制遺伝子に対する50％相同性を示すｃＤＮＡクローンを単離した。ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を配列番号26に示す。かかるプロモーター配列の利点の１つは、大量ファフイア・ロドザイマ発酵での別個の増殖（バイオマス蓄積）と遺伝子発現（産物蓄積）に用いられることである。問題の（上記）プロモーター配列の単離については、GAPDH遺伝子プロモーターに記載された方法（上記実施例３）に従ってファフィア・ロドザイマのゲノムライブラリーをスクリーニングするために対応するｃＤＮＡクローン由来断片がプローブとして用いられる。プロモーターの決定されたヌクレオチド配列に基づいて、実施例５（上記）に示した手順による融合ＰＣＲ法によってプロモーターと問題の遺伝子間の転写融合を構築するために特定のオリゴヌクレオチドが設計される。実施例19 異種ハイブリッド形成によるカロテン産生遺伝子の単離ファフィア・ロドザイマに関係する生物由来の対応するカロテノイド生合成経路遺伝子の同定と単離については、異種ハイブリッド形成実験を適度なストリンジェンシーの条件下で行った。これらの実験では、２種のカロテン産生真菌（ニューロスポラ・クラッサ及びブラケスレア・トリスポラ）由来染色体ＤＮＡ及び酵母S.セレビシエと３種の酵母及びシストフィロバシジウム(Cystofylobasidium ) 属の真菌種由来の染色体ＤＮＡを用いた。これらの３種のカロテン産生酵母は、系統分類実験に基づいてP.ロドザイマに最も関係のあるものである。酵母種シストフィロバシジウム・インフィルモーミニアタム (Cystofylobasijium infirmo-miniatum)(CBS 323)、C.ビスポリジイ(bisporidii )(CBS 6346)及びC.カピタタム(capitatum)(CBS 6358)由来染色体ＤＮＡを、欧州特許第0 590 707 A1号の実施例３に記載されるファフィア・ロドザイマに開発された方法に従って単離した。該特許の関連した部分の記載は本願明細書に含まれるものとする。真菌ニューロスポラ・クラッサ及びブラケスエア・トリスポラ由来染色体ＤＮＡの単離は、実質的にKolarら(Gene，62:127-134)に記載されたように行った。該文献の関連した部分の記載は本願明細書に含まれるものとする。 C.インフィルモーミニアタム、C.ビスポリジイ、C.カピタタム、S.セレビシエ、P.ロドザイマ、N.クラッサ及びB.トリスポラの染色体ＤＮＡ(5μg)をEcoRIを用いて消化した。ＤＮＡ断片を0.％アガロースゲルで分離し、ブロツトし、下記の条件を用いてハイブリッド形成した。ハイブリッド形成を４種類の異なる³²P標識ファフィアプローブを用いて２種の温度（50℃と55℃）で行った。鋳型としてｃＤＮＡクローンpPRcrtE、pPRcrtB 、pPRcrtI及びpPRidiからXhoI-XbaI断片を用いてランダム開始ヘキサヌクレオチド標識反応を用いてプローブを作成した。ハイブリッド形成を指定した温度でo/ n(16時間)を行った。ハイブリッド形成後、フィルターを3×SSC;0.1%SDS;0.05% ピロリン酸ナトリウムの溶液を用いてハイブリッド形成温度で30分間２回洗浄した。フィルターをカセットのＸ線フィルムに-80℃で20時間曝露した後フィルムを現像した。 P.ロドザイマのcrtEのｃＤＮＡクローンを用いて、C.インフィルモーミニアタム、C.カピタタムについてわずかなシグナルが得られた。P.ロドザイマのcrtBのｃＤＮＡクローンを用いて、C.インフィルモーミニアタム及びC.カピタタム由来ＤＮＡの高分子量部分に対するシグナルが得られた。更に、消化したB.トリスポラ由来染色体ＤＮＡで充填したレーンに強いシグナルが得られた。P.ロドザイマのcrtIのｃＤＮＡクローンを用いて50℃でC.カピタタムについてわずかなシグナルが得られた。P.ロドザイマのidiのｃＤＮＡクローンを用いてC.インフィルモーミニアタム、C.ビスポリジイ及びC.カピタタムで両方の温度でわずかなシグナルが得られた。消化したB.トリスポラ由来染色体ＤＮＡで充填したレーンに強いシグナルが得られた。カロテノイド生合成ｃＤＮＡ又は遺伝子、又はidi ｃＤＮＡ又は遺伝子は、適度なストリンジェントハイブリッド形成及び洗浄条件(50〜55℃,3×SSC)を用いるP.ロドザイマカロテノイド生合成酵素、又はイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼコード配列を各々コードするｃＤＮＡ断片と交差ハイブリッド形成することにより他の生物、特に他の酵母種から単離されると我々は結論する。寄託微生物 pGB-Ph9を含むE.コリを、1993年６月23日、Centraal Bureau voor Schimmelcu ltures，Oosterstraat 1，Baarn，オランダに受託番号CBS 359.3として寄託した。下記の菌株は、1996年２月26日、Centraal Bureau voor Schimmelcultures，O osterstraat 1，Baarn,オランダにブダペスト条約に基づいて寄託した。 ID No. 微生物関連した特徴寄託No. DS31855 E.コリ P.ロドザイマのcrtY CBS 232.96 DS31856 E.コリ P.ロドザイマのcrtI CBS 233.96 DS31857 E.コリ P.ロドザイマのcrtE CBS 234.96 DS31858 E.コリ P.ロドザイマのcrtB CBS 235.96

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 23/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フェルドゥースヤンコルネリスオランダエヌエル―6706イェーエスワーヘニンゲンファンデルワウストラート 50 (72)発明者ヴェリーヤンオランダエヌエル―6703セーハーワーヘニンゲンデイクストラート７

Claims

【特許請求の範囲】 1. 転写プロモーター及び発現すべき下流配列を作用可能な結合で含む組換えＤＮＡであって、該転写プロモーターが高度に発現したファフィア(Phaffia)遺伝子のオープンリーディングフレームの上流に見られる領域を含む、前記組換えＤＮＡ。 2. 前記高度に発現したファフィア遺伝子が解糖系遺伝子である、請求項１記載の組換えＤＮＡ。 3. 前記解糖系遺伝子がグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である、請求項２記載の組換えＤＮＡ。 4. 前記高度に発現したファフィア遺伝子がリボソームタンパク質コード化遺伝子である、請求項１記載の組換えＤＮＡ。 5. 転写プロモーター及び発現すべき下流配列を作用可能な結合で含む組換えＤＮＡであって、該転写プロモーターが配列番号24〜50のいずれか１つに示されたアミノ酸配列の１つで表されるタンパク質をコード化するオープンリーディングフレームの上流に見られる領域を含む、前記組換えＤＮＡ。 6. 前記発現すべき下流配列が該転写プロモーター配列に対して異種である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。 7. 該下流配列が選択薬剤に対する感受性低下に関与するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。 8. 前記選択薬剤がG418である、請求項７記載の組換えＤＮＡ。 9. 前記発現すべき下流配列が、カロテノイド生合成経路に関与する酵素をコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。 10．前記発現すべき下流配列が、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ及びリコペンシクラーゼからなる群より選ばれた活性をもつ酵素をコード化する、請求項９記載の組換えＤＮＡ。 11．前記発現すべき下流配列が、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21又は配列番号23で表される配列から選ばれたアミノ酸配列を有する酵素をコード化する、請求項10記載の組換えＤＮＡ。 12．前記組換えＤＮＡが前記発現すべきＤＮＡ配列から下流の転写ターミネーターを作用可能な結合で更に含む、請求項１〜11のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。 13．該ターミネーターがＧＡＰＤＨコード化遺伝子ターミネーター断片である、請求項12記載の組換えＤＮＡ。 14．該組換えＤＮＡがホスト生物中で複製及び／又は組込み可能なベクターの形である、請求項１〜13のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。 15．ファフィアリボソームＲＮＡコード化ＤＮＡを更に含む、請求項14記載の組換えＤＮＡ。 16．該ファフィアリボソームＲＮＡコード化ＤＮＡ部分の内側で切断することにより線状化される、請求項15記載の組換えＤＮＡ。 17．請求項１〜16のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡを保持する微生物。 18．ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma)である、請求項17記載の微生物。 19．50コピー以上の量でゲノムに組込まれた組換えＤＮＡを有する、請求項18記載の微生物。 20．ファフィアＧＡＰＤＨ遺伝子を含む単離したＤＮＡ断片、又はその機能断片。 21．組換えＤＮＡ構築物を作成するための請求項20記載の機能断片の使用。 22．前記断片が、ファフィア・ロドザイマのＧＡＰＤＨをコードするオープンリーディングフレームの上流又は下流に通常位置する調節領域である、請求項21 記載の使用。 23．形質転換したファフィア株を得る方法であって、（ａ）ファフィア株の細胞又はプロトプラストと組換えＤＮＡとをその取込みを伝達する条件下で接触させ、前記組換えＤＮＡが転写プロモーター及び発現すべき下流配列を作用可能な結合で含む工程、（ｂ）前記組換えＤＮＡを発現可能な形で得たファフィア・ロドザイマ細胞又はプロトプラストを同定する工程を含み、該組換えＤＮＡが請求項１〜22のいずれか１項に記載のものである、前記方法。 24．ファフィア細胞又はプロトプラストと前記組換えＤＮＡとを接触させた後に電気パルスをかける工程を更に含む、請求項23記載の方法。 25．請求項23又は24記載の方法によって得られる形質転換したファフィア株であって、培養時に、前記組換えＤＮＡによる形質転換の結果として前記下流配列の発現が可能である、前記形質転換したファフィア株。 26．前記下流配列が医薬タンパク質をコードする、請求項25記載の形質転換したファフィア株。 27．前記ファフィア株が、少なくとも10コピー、好ましくは少なくとも50コピーのゲノムに組込まれた前記組換えＤＮＡを含む、請求項24〜26のいずれか１項に記載の形質転換したファフィア株。 28．ファフィア・ロドザイマのカロテノイド生合成経路に関与する酵素をコードする単離したＤＮＡ配列。 29．前記酵素が、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ活性、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性、フィトエンシンターゼ活性、フィトエンデサチユラーゼ活性及びリコペンシクラーゼ活性より選ばれた活性をもつ、請求項28 記載の単離したＤＮＡ配列。 30．配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21又は配列番号23で表される配列より選ばれたアミノ酸配列を有する酵素をコードする単離したＤＮＡ配列。 31．請求項30記載の酵素の変異体をコードする単離したＤＮＡ配列であって、前記変異体が（ｉ）対立遺伝子変異体、（ii）１個以上のアミノ酸付加、欠失及び／又は置換がありかつなお一定の酵素活性をもつ酵素より選ばれる、前記単離したＤＮＡ配列。 32．下記の配列より選ばれたカロテノイド生合成経路に関与する酵素をコード化する単離したＤＮＡ配列。 (ｉ)配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20又は配列番号22で表されるＤＮＡ配列; (ii)配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20又は配列番号22で表されるＤＮＡ配列のイソコーディング変異体; (iii)配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20又は配列番号22で表されるＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体; (iv)ニトロセルロースフィルターに結合した場合及びハイブリッド形成条件下でのインキュベーション及び続いての洗浄後に、インキュベーション及び洗浄後の該フィルターのオートラジオグラフィーによって検出可能である、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20又は配列番号22で表される配列を有する放射能標識ＤＮＡ断片に対して特異的にハイブリッド形成することが可能なＤＮＡ配列、ここで、前記ハイブリッド形成条件下でのインキュベーション及び続いての洗浄はフィルター結合ＤＮＡを０.３M NaCl、4 0 mMトリス-HCl、２mMＥＤＴＡ、０.１％ＳＤＳ、pH7.8中前記放射能標識ＤＮＡの溶液の存在下に少なくとも50℃、好ましくは少なくとも55℃で少なくとも１時間インキュベートすることにより行われ、その後、オートラジオグラフィーにかける前に該フィルターを０.３M NaCl、40mMトリス-HCl、２mMEＤＴＡ、０. １％ＳＤＳ、pH7.8中50℃の温度、少なくとも55℃の温度で約20分間少なくとも２回洗浄する。 33．請求項27〜32のいずれか１項に記載の単離したＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ。 34．前記単離したＤＮＡ配列が、適切なホスト中で発現することが可能な転写プロモーターに作用可能に結合され、前記ホスト中で機能する転写ターミネーターに任意に結合されてもよい、請求項33記載の組換えＤＮＡ。 35．前記ホストがファフィア株である、請求項34記載の組換えＤＮＡ。 36．該転写プロモーターが、ファフィアに存在する解糖系遺伝子由来である請求項33〜35のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。 37．前記解糖系遺伝子が、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である請求項36記載の組換えＤＮＡ。 38．該転写プロモーターがリボソームタンパク質コード化遺伝子由来である請求項33〜35のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。 39．該転写プロモーターが、配列番号24〜50のいずれか１項に記載されたアミノ酸配列の１つで表されるタンパク質をコード化するオープンリーディングフレーの上流に見られる領域を含む、請求項33〜35のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。 40．前記組換えＤＮＡが前記発現すべき異種ＤＮＡ配列から下流の転写ターミネーターを作用可能な結合で更に含み、そのターミネーターがファフィア転写ターミネーターである、請求項27〜39のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。 41．ベクターの形である、請求項27〜40のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。 42．ホストを形質転換するための請求項41記載のベクターの使用。 43．該ホストがファフィア株である、請求項19記載の使用。 44．請求項27〜41のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡを用いる形質転換で得られるホスト、場合によっては祖先のホスト。 45．ファフィア株、好ましくはファフィア・ロドザイマ株である、請求項44記載のホスト。 46．カロテノイド生合成経路に関与する酵素をコード化するＤＮＡ配列を過剰発現することが可能である形質転換したファフィア・ロドザイマ株。 47．形質転換していない祖先に相対する多量のアスタキサンチンを産生する、請求項46記載の形質転換したファフィア・ロドザイマ株。 48．前記酵素の生産を伝達する条件下で請求項44又は45記載のホストを培養することにより、カロテノイド生合成経路に関与する酵素を生産する方法。 49．カロテノイドの生産方法であって、請求項44〜47のいずれか１項に記載のホストが該カロテノイドの生産を伝達する条件下で培養されることを特徴とする、前記方法。 50．該カロテノイドがアスタキサンチンである、請求項49記載の方法。 51．前記タンパク質の生産を伝達する条件下で請求項26記載の形質転換したファフィア株を培養することにより、医薬タンパク質を生産する方法。 52．ファフィア中で高度に発現した遺伝子からプロモーターを単離する方法であって、（ａ）所望の条件下で増殖したファフィア株から単離したｍＲＮＡについてｃＤＮＡライブラリーを作成する工程; （ｂ）工程（ａ）で得られた（部分的）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（の一部）を求める工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られた配列データを既知の配列データと比較する工程；（ｄ）発現したｃＤＮＡに対応する遺伝子のオープンリーディングフレームのすぐ上流か又は転写開始部位のすぐ上流に位置する遺伝子の推定プロモーター断片をクローニング増幅する工程；及び（ｅ）形質転換したファフィア株中で該プロモーターの制御下に適切なマーカーを発現することにより、得られたプロモーター配列がファフィア株中で高レベル発現を示すかを証明する工程を含む、前記方法。