FI108300B - Geenitekninen menetelmä ja isäntä ksylitolin valmistamiseksi - Google Patents

Geenitekninen menetelmä ja isäntä ksylitolin valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI108300B
FI108300B FI952148A FI952148A FI108300B FI 108300 B FI108300 B FI 108300B FI 952148 A FI952148 A FI 952148A FI 952148 A FI952148 A FI 952148A FI 108300 B FI108300 B FI 108300B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
host
xylitol
dehydrogenase
gene
arabitol
Prior art date
Application number
FI952148A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI952148A (fi
FI952148A0 (fi
Inventor
Juha Heikki Antero Apajalahti
Anu Marjukka Harkki
Andrey Novomirovich Myasnikov
Ossi Antero Pastinen
Original Assignee
Xyrofin Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xyrofin Oy filed Critical Xyrofin Oy
Priority to FI952148A priority Critical patent/FI108300B/fi
Publication of FI952148A0 publication Critical patent/FI952148A0/fi
Publication of FI952148A publication Critical patent/FI952148A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI108300B publication Critical patent/FI108300B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

108300
Geenitekninen menetelmä ja isäntä ksylitolin valmistamiseksi
Keksinnön tausta 5 1. Keksinnön kenttä Tämä keksintö koskee yleisesti menetelmiä, joissa käytetään geneettisesti muunnettuja mikro-organismeja käyttökelpoisten kemiallisten yhdisteiden valmistamiseksi (metabolinen manipulaatio), ja tarkemmin määriteltynä sello laisten mikrobikantojen konstruoimista geeniteknisesti, joilla on kyky muuttaa helposti saatavissa olevia hiili-lähteitä, kuten D-glukoosia, arvokkaammiksi tuotteiksi, esimerkiksi ksylitoliksi.
2. Aiheeseen liittyvä kirjallisuus 15 Ksylitoli on kemiallinen yhdiste, jolla on huomat tava arvo erikoismakeutteena. Se on suunnilleen yhtä makeaa kuin sakkaroosi, myrkytöntä ja kariesta aiheuttamatonta.
Ksylitolia valmistetaan nykyisin hydraamalla D-ksy-20 loosia kemiallisesti. D-ksyloosia saadaan erilaisten kasvimateriaalien hydrolysaateista, joissa se on aina läsnä seoksena muiden pentoosien ja heksoosien kanssa. Ksyloosin ja myös ksylitolin puhdistus on siksi merkittävä ongelma. Joukko tämäntyyppisiä menetelmiä tunnetaan. Esimerkkeinä 25 voidaan mainita US-patenttijulkaisut 3 784 408, 4 066 711, *:**: 4 075 406 ja 4 008 285.
D-ksyloosin pelkistys ksylitoliksi voidaan saada t · • aikaan myös mikrobiologisella prosessilla, jossa käytetään * · · 1 joko luonnosta eristettyjä kantoja [Barbosa, M. F. S. et
• · I
30 ai., J. Industrial Microbiol. 3 (1988) 241 - 251] tai gee-. # , niteknisesti aikaansaatuja kantoja [Hallborn, J. et ai., ... Biotechnology 9 (1991) 1090 - 1095] . Substraatin, D-ksy- * t « « · i • * f « * t • · * · 2 108300 loosin, saanti hiivafermentointiin sopivassa muodossa on kuitenkin myös merkittävä ongelma, koska halvat ksyloosi-lähteet, kuten sellu- ja paperiprosesseista saatava sul-fiittiliemi, sisältävät hiivan kasvua estäviä epäpuhtauk-5 siä.
Yksi houkutteleva vaihtoehtoinen menetelmä ksylitolin valmistamiseksi olisi sen valmistaminen fermentoi-malla halpaa ja helposti saatavissa olevaa substraattia, kuten D-glukoosia. Ei kuitenkaan tunneta mikro-organis-10 meja, jotka tuottavat merkittäviä määriä ksylitolia yksivaiheisen fermentoinnin aikana muista yleisistä hiililäh-teistä kuin D-ksyloosista ja D-ksyluloosista, jotka molemmat ovat rakenteellisesti hyvin läheistä sukua ksylitolille.
15 Monet mikro-organismit, erityisesti osmofiiliset hiivat, esimerkiksi Zygosaccharomyces rouxii, Candida po-lymorpha ja Torulopsis Candida, tuottavat toisaalta merkittäviä määriä yhtä läheistä sukua olevaa pentitolia, D-arabitolia, D-glukoosista [Lewis, D. H. ja Smith, D. C., 20 New Phytol. 66 (1967) 143 - 184]. Hyödyntämällä tätä osmo-fiilisten hiivojen ominaisutta H. Onishi ja T. Suzuki ovat kehittäneet menetelmän D-glukoosin muuttamiseksi ksylitoliksi kolmella peräkkäisellä fermentoinnilla [Appi. Micro-biol. 18 (1969) 1031 - 1035]. Tässä prosessissa D-glukoosi 25 muutettiin ensin D-arabitoliksi fermentoimalla osmofiili- *:·*: sella hiivakannalla. Toiseksi D-arabitoli hapetettiin :*·,? D-ksyluloosiksi Acetobacter suboxydans -fermentoinnilla.
j Lopuksi D-ksyluloosi pelkistettiin ksylitoliksi kolmannes- • · < t sa fermentoinnissa käyttämällä yhtä monista hiivakannois-
I | I
30 ta, joilla on kyky pelkistää D-ksyluloosi ksylitoliksi.
. Tämän menetelmän yksi ilmeinen epäkohta on, että siihen liittyy kolme eri fermentointivaihetta, joista ku- * · ··' kin kestää 2-5 vuorokautta; lisäksi tarvitaan lisävai- , ' Λ heitä, kuten sterilointi ja solujen poisto, mikä suurentaa 35 valmistuskustannuksia. Vaiheittaisen fermentointiprosessin saanto on alhainen, ja sivutuotteiden määrä on suuri.
« « 108300 3
Niinpä on edelleen olemassa tarve saada menetelmiä ksylitolin tuottamiseksi taloudellisesti mikrojärjestelmissä helposti saatavissa olevista substraateista.
Keksinnön yhteenveto 5 Tämä keksintö tarjoaa käyttöön menetelmiä yhdistel- mäisäntien konstruoimiseksi ja siten konstruoituja yhdis-telmäisäntiä, joilla isännillä on kyky tuottaa ksylitolia kasvatettaessa niitä muilla hiililähteillä kuin D-ksylu-loosilla tai D-ksyloosilla ja niiden polymeereillä tai 10 oligomeereillä tai seoksilla. Keksinnön mukaisten isäntien hyödyntämät hiililähteet ovat halpoja ja helposti saatavissa olevia. Keksinnön mukaisilla mikro-organismeilla on myös kyky erittää syntetisoitu ksylitoli kasvualustaan. Tämä päämäärä saavutetaan muuntamalla halutun mikro-orga-15 nismin, edullisesti luonnossa esiintyvän hiivamikro-orga-nismin, metaboliaa tuomalla organismiin haluttuja hetero-logisia geenejä ja saattamalla ne ilmentymään. Tämä päämäärä saavutetaan myös muuntamalla mainitunlaisten haluttujen mikro-organismien metaboliaa edelleen siten, että 20 tietyt, mainitunlaiselle mikro-organismille luonnollisessa tilassaan homologiset geenit saadaan yli-ilmentymään ja/ tai inaktivoidaan niiden ilmentymisaktiivisuus.
Tämän keksinnön yhtenä päämääränä on siten tarjota ·; käyttöön menetelmä ksylitolin tuottamiseksi, jonka yhtey- ' 25 dessä hyödynnetään uutta ja uudenlaista mikrobikantaa, ·;·*: yhdistelmäisäntää, jota kutsutaan tässä myös geenitekni- sesti käsitellyksi mikro-organismiksi, mainitunlaisen ksy- • · : ., litolin tuottajana, joka mainitunlainen geeniteknisesti .·?-. käsitelty mikro-organismi tuottaa mainitunlaista ksylito- 30 lia joko de novo tai suurempia määriä luontaiseen käsitte lemättömään mikro-organismiin verrattuna.
Tämän keksinnön yhtenä lisäpäämääränä on tarjota käyttöön menetelmä ksylitolin tuottamiseksi, jonka yhtey- dessä hyödynnetään uutta metaboliatietä, joka on aikaan-35 saatu geeniteknisesti mikro-organismiin ja johtaa siihen, i · 4 108300 että mainitunlainen mikro-organismi tuottaa ksylitolia de novo tai suurempia määriä.
Tämän keksinnön yhtenä lisäpäämääränä on tarjota käyttöön menetelmä ksylitolin tuottamiseksi, jonka yhtey-5 dessä hyödynnetään edellä kuvatun kaltaista uutta metabo-liatietä ja mainitunlainen tie muuntaa D-arabitolin biosynteesi- ja/tai metaboliatietä sillä tavalla, että mikro-organismi tuottaa ksylitolia sellaisten hiililähteiden fermentoinnin kautta, joita muuntamaton isäntä hyödyntää 10 D-arabitolin biosynteesiin.
Tämän keksinnön yhtenä lisäpäämääränä on tarjota käyttöön menetelmä ksylitolin tuottamiseksi, jonka yhteydessä hyödynnetään edellä kuvattua muutettua D-arabitoli-tietä ja mainitunlaista tietä muutetaan joko pidentämällä 15 olemassa olevaa D-arabitolin biosynteesitietä (lisävaiheilla D-arabitolin hyödyntämiseksi) tai korvaamalla yksi tai useampia D-arabitolitien vaiheista vastaavilla, ksylitolin muodostumiseen johtavilla vaiheilla.
Tämän keksinnön yhtenä lisäpäämääränä on tarjota 20 käyttöön menetelmä ksylitolin tuottamiseksi, jonka yhteydessä hyödynnetään edellä kuvattua muutettua D-arabitolin biosynteesitietä ja mainitunlaista tietä muutetaan joko pidentämällä olemassa olevaa D-arabitolitietä tuomalla D-arabitolia tuottavaan mikro-organismiin D-ksyluloosia ,, 25 muodostavaa D-arabitolidehydrogenaasia (EC 1.1.1.11) ja * *i”: ksylitolidehydrogenaasia (EC 1.1.1.9) koodittavia geenejä :*·,· ja saattamalla ne yli-ilmentymään.
• j Tämän keksinnön yhtenä lisäpäämääränä on tarjota * * .·:* käyttöön menetelmä ksylitolin tuottamiseksi käyttämällä 30 edellä kuvatun kaltaista uutta mikro-organismia, jonka menetelmän yhteydessä hyödynnetään edellä kuvattua muutet- • « ... tua D-arabitolin biosynteesitietä ja mainitunlaista tietä * ψ ';· muutetaan lisäksi inaktivoimalla kemiallisesti indusoitua : : : mutageneesia tai geenin katkaisua käyttäen mainitussa mik- . ; 35 ro-organismissa transketolaasia (EC 2.2.1.1) koodittava 5 108300 geeni tai D-ksylulokinaasia (EC 2.7.1.17) koodittava geeni.
Tämän keksinnön yhtenä lisäpäämääränä on tarjota käyttöön menetelmä ksylitolin tuottamiseksi käyttämällä 5 edellä kuvatun kaltaista uutta mikro-organismia, jonka menetelmän yhteydessä hyödynnetään pentoosi-fosfaattitien oksidatiivisen haaran entsyymejä, tarkemmin määriteltynä D-glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasia (EC 1.1.1.49) ja/tai 6-fosfo-D-glukonaattidehydrogenaasia (EC 1.1.1.44) maini-10 tunlaisessa mikro-organismissa koodittavien geenien geeni teknisesti aikaansaatua muuttunutta yli-ilmentymistä.
Tämän keksinnön yhtenä lisäpäämääränä on tarjota käyttöön menetelmä ksylitolin tuottamiseksi käyttämällä edellä kuvatun kaltaista uutta mikro-organismia, jonka me-15 netelmän yhteydessä hyödynnetään pentoosi-fosfaattitien oksidatiivisen haaran entsyymejä koodittavien geenien samoin kuin D-ribuloosi-5-fosfaattiepimeraasigeenin (EC 5.1.3.1) geeniteknisesti aikaansaatua muuttunutta yli-il-mentymistä.
20 Piirustusten lyhyt kuvaus
Kuvio 1 on plasmidissa pARL2 olevan insertin rest-riktiokartta. Tämä insertti on peräisin Klebsiella terri-genan kromosomilokuksesta Phpl ja sisältää K. terrigenan D-arabitolidehydrogenaasigeenin. Avoin laatikko edustaa K. 25 terrigenan kromosomi-DNA:ta. Nuoli osoittaa D-arabitolide- *:**: hydrogenaasia (EC 1.1.1.11) koodittavan geenin sijainnin :*·,· ja suunnan tässä DNArssa.
• . Kuvio 2 esittää pYARD:n konstruointia pADH:sta ja »< .
.*:· pAAH5: stä. Plasmidikaavioissa yksinkertaisella viivalla • ( · 30 (-) merkitään bakteerisekvenssejä, aaltoviivalla merkitään ,.· " . S. cerevisiaen 2pm-DNA:ta; avoimella nuolella (=>) merki- • · ... tään ADCI-promoottoria (ADCI-geeni koodittaa S. cerevi- t * siaen alkoholidehydrogenaasia eli ADCl:tä, josta aiemmin : on käytetty nimitystä ADHI); avoimella vinoneliöllä (O) 35 merkitään RDCI-transkription terminaattoria; suorakulmiol- 6 108300 la merkitään LEi/2-geeniä? varjostetulla nuolella merkitään D-arabitolidehydrogenaasigeeniä.
Kuvio 3 esittää plasmidin pJDG(AX)-16 konstruointia. XYL2 on Pichia stipitisistä peräisin oleva ksylitoli-5 dehydrogenaasigeeni. dalD on D-arabitolidehydrogenaasigee-ni. ADCI on ADCJ-geenin transkription säätelyalue (promoottori), joka edeltää dalD-kooditussekvenssiä ja on kytkeytynyt siihen toiminnallisesti. Symbolit eivät ole samat kuin kuviossa 4. Plasmidikaavioissa merkitään yksinkertai-10 sella viivalla (-) bakteerisekvenssejä ja 2pm-DNA:ta, kun se on mainittu; tummennetulla muolella ADCJ-promoottoria; tummennetulla vinoneliöllä (♦) ADCI-transkription termi-naattoria; suorakulmiolla LEi72-markkerigeeniä; varjostetulla nuolella XYL2-geeniä ja varjostetulla suorakulmiolla 15 dalD-geeniä.
Kuvio 4 esittää E. coli - Z. rouxii -sukkulavekto-rin pSRT(AX)-9 konstruointia. Symbolit ovat kuten kuviossa 3.
Kuvio 5 esittää kloonatun T. Candida -rDNA-fragmen-20 tin restriktiokarttaa.
Kuvio 6 esittää plasmidin pTC(AX) konstruointia.
Kuvio 7 esittää kloonatun T. Candida -rDNA-fragmentin restriktiokarttaa.
Kuvio 7a esittää plasmidin pCPU(AX) konstruointia.
( 25 Kuvio 8 esittää ZWF1- ja gnd-geenin kloonausta.
·:**: Kuvio 8a esittää plasmidin PAAH(gnd) konstruointia.
;\· Kuvio 9 esittää plasmidin pSRT(ZG) konstruointia.
• · ; Kuvio 10 esittää kannan Z. rouxii ATCC 13356 • m [pSRT(AX)-09] viljelyä fermentorissa.
• · < 30 Kuvio 11 esittää kannasta Z. rouxii ATCC 13356 [pSRT(AX)-9] johdetun mutantin viljelyä fermentorissa.
Edullisten suoritusmuotojen yksityiskohtainen ku- • f • · ·' vaus I. Määritelmät 35 Seuraavassa kuvauksessa käytetään laajasti joukkoa yhdistelmä-DNA-tekniikassa käytettäviä termejä. Selityksen 7 108300 ja patenttivaatimusten, mukaan luettuna merkitysalue, joka on määrä antaa mainitunlaisille termeille, selkeän ja yhdenmukaisen ymmärtämisen mahdollistamiseksi esitetään seu-raavat määritelmät.
5 Muu hiililähde kuin ksyloosi tai ksyluloosi: Tässä käytettynä termillä "muu hiililähde kuin D-ksyloosi ja D-ksyluloosi" tarkoitetaan ksylitolin tuotantoon tarkoitettua hiililähdettä, joka on muu kuin D-ksyloosi ja D-ksyluloosi tai niiden polymeeri, oligomeeri tai seos 10 (kuten ksylaani ja hemiselluloosa). Hiililähde tukee edullisesti keksinnön mukaisten geeniteknisesti käsiteltyjen mikrobi-isäntien kasvua ja fermentointia hiivaisännissä. Monia halpoja ja helposti saatavissa olevia yhdisteitä voidaan käyttää hiililähteinä ksylitolin tuottamiseksi -15 tämän keksinnön mukaisissa mikrobi-isännissä, mukaan luettuina D-glukoosi ja erilaiset D-glukoosia sisältävät siirapit ja D-glukoosin seokset muiden sokereiden kanssa. Muut sokerit, jotka ovat keksinnön mukaisten isäntien, hiivat ja sienet mukaan luettuina, assimiloitavissa, kuten 20 erilaiset aido- ja ketoheksoosit (esimerkiksi D-fruktoosi, D-galaktoosi ja D-mannoosi) ja niiden oligomeerit ja polymeerit (esimerkiksi sakkaroosi, laktoosi, tärkkelys, inu-liini ja maltoosi) on tarkoitettu kuuluviksi tämän termin ·;' piiriin. Muut pentoosit kuin ksyloosi ja ksyluloosi ja ei- ; 25 hiilihydraattihiililähteet, kuten glyseroli, etanoli, eri- ·:··· laiset kasviöljyt tai hiilivedyt (edullisesti n-alkaanit, jotka sisältävät 14 - 16 hiiliatomia) on myös tarkoitettu • · : .·, kuuluviksi tämän termin piiriin. Sellaisten hiililähteiden • · joukko, jotka ovat käyttökelpoisia substraatteina ksylito- • · · 30 Iin tuottamiseksi tämän keksinnön mukaisten isäntien avulla, vaihtelee mikrobi-isännän mukaan. Glukoosi ja glukoosia sisältävät siirapit ovat esimerkiksi edullinen hiili- • · · * · ··.’ lähde ksylitolin tuottamiseksi keksinnön mukaisen geeni- teknisesti käsitellyn Zygosaccharomyces rouxiin avulla, ; . 35 kun taas n-alkaanit, edullisesti 14 - 16 hiiliatomia si- 8 108300 sältävät, ovat edullinen hiililähde muunnetuille Candida tropicalis -kannoille.
Geeni: DNA-sekvenssi, joka sisältää templaatin RNA-polymeraasia varten. Geenistä transkription kautta 5 muodostunut RNA voi koodittaa tai olla koodittamatta proteiinia. Proteiinia koodittavaa RNA:ta kutsutaan lähetti-RNA:ksi (mRNA:ksi), ja sen transkription saa eukaryooteissa aikaan RNA-polymeraasi II. Voidaan myös konstruoida geeni, joka sisältää sellaisen RNA-polymeraasi 10 II -templaatin (RNA-polymeraasi II -promoottorin seurauksena), että transkriptiossa syntyy RNA-sekvenssi, jolla on jollekin määrätylle mRNA:lle komplementaarinen sekvenssi, mutta joka ei transloidu normaalisti. Tällaista geenirakennetta kutsutaan tässä "antisense-RNA-geeniksi" 15 ja mainitunlaista RNA-transkriptiä kutsutaan "antisense-RNA:ksi". Antisense-RNA:t eivät ole normaalisti transloitavissa, koska antisense-RNA-sekvenssissä on läsnä translaation lopetuskodoneja.
Termin "komplementaarinen DNA"- eli "cDNA"-geeni 20 piiriin kuuluvat yhdistelmägeenit, joita syntetisoidaan esimerkiksi mRNA:n käänteistranskriptiolla ja joista puuttuvat siten välisekvenssit (intronit). Genomi-DNA:sta kloonatut geenit sisältävät yleensä introneja.
\\ Kloonauskuljettaja: Plasmidi- tai faagi-DNA tai muu 25 DNA-sekvenssi, jolla on kyky kuljettaa geneettistä infor-maatiota, erityisesti DNA:ta, isäntäsoluun. Kloonauskul- • * . . jettäjalle on usein tunnusmerkillistä yksi endonukleaasi- • ·« ,* ,* tunnistuskohta tai pieni määrä endonukleaasitunnistuskoh- • « · ··· * tia, joista mainitunlaiset DNA-sekvenssit voidaan katkaista ··· • · « *·' * 30 määriteltävissä olevalla tavalla hävit-tämättä kuljettajan olennaista biologista toimintaa ja joihin voidaan liittää haluttu DNA tämän kloonaamiseksi isäntäsoluun. ·’**: Kloonauskuljettaja voi lisäksi sisältää markkerin, joka soveltuu käytettäväksi kloonauskul j että j alla transformoi-, 35 tujen solujen tunnistamiseen, ja replikaation aloituskoh- * t 9 108300 tia, jotka mahdollistavat kuljettajan säilymisen ja repli-kaation yhdessä tai useammasa prokaryoottisessa tai euka-ryoottisessa isännässä. Markkereita ovat esimerkiksi tet-rasykliiniresistenssi tai ampisilliiniresistenssi. Sanaa 5 "vektori" käytetään joskus "kloonauskuljettajasta". "Plas-midi" on kloonauskuljettaja, yleensä rengasmainen DNA, joka säilyy ja replikoituu autonomisesti vähintään yhdessä isäntäsolussa.
Ilmentymiskul jettaja: Kloonauskulj että jän kaltainen 10 kuljettaja tai vektori, joka kuitenkin tukee itseensä kloonatun geenin ilmentymistä isännän transformoinnin jälkeen. Kloonattu geeni sijoitetaan tavallisesti tiettyjen kontrollisekvenssien, kuten promoottorisekvenssien, ohjaukseen (ts. kytketään niihin toiminnallisesti), joita 15 sekvenssejä voi tarjota käyttöön kuljettaja tai klooonatun geenin muodostama yhdistelmärakenne. Ilmentymistä ohjaavat sekvenssit vaihtelevat sen mukaan, onko vektori suunniteltu saamaan aikaan toiminnallisesti kytketyn geenin ilmentyminen prokaryootti- vai eukaryootti-isännässä, ja ne 20 voivat sisältää lisäksi transkriptioon liittyviä element tejä, kuten edistäviä elementtejä (edellä olevia aktivaa-tiosekvenssejä) ja terminaatiosekvenssejä ja/tai translaation aloitus- ja lopetuskohtia.
•;v Isäntä: Isäntä on prokaryoottinen tai eukaryootti- ( 25 nen solu, jota hyödynnetään yhdistelmämateriaalin vastaan- *:··· ottajana ja kantajana.
«*· ' Keksinnön mukainen isäntä: "Keksinnön mukainen • ·< * · : .·. isäntä" on mikrobi-isäntä, joka ei luonnostaan fermentoin- .···, nin aikana tuota merkittäviä määriä ksylitolia muista * * · 30 yleisistä hiililähteistä kuin D-ksyloosista tai D-ksylu-loosista tai niiden polymeereistä, oligomeereistä tai seoksista, mutta joka on käsitelty tekemään niin keksinnön « « mukaisilla menetelmillä. Ilmaisulla "merkittävä määrä" tarkoitetaan määrää, joka soveltuu puhtaassa muodossa ole-:35 van ksylitolin eristämiseen tai määrää, joka voidaan luo- ίο 1 08300 tettavasti mitata analyysimenetelmin, joita normaalisti käytetään mikrobien fermentointiliemessä olevien hiilihydraattien analysointiin.
Arabitolidehydrogenaasi: On olemassa kaksi D-arabi-5 tolidehydrogenaasityyppiä, D-ksyluloosia muodostava (EC 1.1.11) ja D-ribuloosia muodostava. D-ribuloosia muodostavia dehydrogenaaseja esiintyy villiä tyyppiä olevissa hiivoissa ja sienissä. D-ksyluloosia muodostavia arabitolide-hydrogenaaseja tunnetaan vain bakteereista. Ellei toisin 10 mainita, tässä yhteydessä tarkoitetaan D-ksyluloosia muodostavaa arabitolidehydrogenaasia, ja sitä kutsutaan tässä arabitolidehydrogenaasiksi.
Pentoosi-fosfaattitien oksidatiivinen haara: Termin "pentoosi-fosfaattitien oksidatiivinen haara" piiriin on 15 tarkoitettu sisältyväksi se pentoosi-fosfaattireitin osa, joka katalysoi hapetusreaktioita, kuten D-glukoosi-6-fos-faattidehydrogenaasin (EC 1.1.1.49) ja 6-fosfo-D-gluko-naattidehydrogenaasin (EC-1.1.1.44) katalysoimia reaktioita, ja joka hyödyntää heksoosisubstraatteja pentoosifos-20 faattien muodostamiseksi. Pentoosi-fosfaattitien "ei-oksi- datiiviselle" osalle (joka katalysoi myös riboosin netto-muodostusta D-glukoosista) ovat tunnusmerkillisiä ei-ha-pettavat isomeraatiot, kuten riboosi-5-fosfaatti-isomeraa-sin, D-ribuloosi-5-fosfaatti-3-epimeraasin ja transaldo-25 laasin katalysoimat reaktiot. Katso H. R. Mahler ja E. H. *:··♦ Cordes, Biological Chemistry, Harper & Row, publishers,
New York 1966, s. 448 - 454.
» · .., Funktionaalinen johdannainen: Proteiinin tai nuk- « 4 i leiinihapon "funktionaalinen johdannainen" on molekyyli, « · .
30 joka on johdettu (saatu) kemiallisesti tai biokemiallises- . ti mainitunlaisesta proteiinista tai nukleiinihaposta, *<>»»· ... jossa on jäljellä (joko toiminnallinen tai rakenteellinen) ♦ » biologinen aktiivisuus, joka on tunnusmerkillinen luontai-; : selle proteiinille tai nukleiinihapolle. Termin "funktio- ; ; 35 naalinen johdannainen" piiriin on tarkoitettu kuuluviksi n 108300 molekyylin "fragmentit", "variantit", "analogit" rai "kemialliset johdannaiset", joissa on jäljellä luontaisen molekyylin toivottu aktiivisuus.
Molekyylin sanotaan tässä yhteydessä olevan jonkin 5 toisen molekyylin "kemiallinen johdannainen", kun se sisältää kemiallisia lisäryhmittymiä, jotka eivät normaalisti ole osa kyseistä molekyyliä. Mainitunlaiset ryhmittymät voivat parantaa molekyylin liukoisuutta, imeytymistä, biologista puoliintumisaikaa jne. Nämä ryhmittymät voivat 10 alentaa molekyylin toksisuutta tai eliminoida molekyylin mahdollisen epätoivottavan sivuvaikutuksen tai lieventää sitä jne. Mainitunlaisia vaikutuksia välittämään kykeneviä ryhmittymiä esitetään teoksessa Remington's Pharmaceutical Sciences 1980. Menettelyt mainitunlaisten ryhmittymien 15 liittämiseksi molekyyliin ovat alalla hyvin tunnettuja.
Fragmentti: Molekyylin, kuten proteiinin tai nukleiinihapon, "fragmentilla" tarkoitetaan osaa luontaisesta aminohappo- tai geneettisestä nukleotidisekvenssistä ja erityisesti keksinnön mukaisia funktionaalisia johdannai-20 siä.
Variantti tai analogi: Proteiinin tai nukleiiniha pon "variantilla" tai "analogilla" tarkoitetaan molekyyliä, joka on rakenteeltaan ja biologiselta aktiivisuudeltaan suurin piirtein luontaisen molekyylin kaltainen, ku-25 ten funktionaalisen alleelin koodittamaa molekyyliä.
: .*. II. Metaboliateiden konstruointi ksylitolin biosyn- • · · · teesiä varten • · »
Keksinnön mukaisesti manipuloidaan mikrobi-isännän luontaisia metaboliareittejä siten, että vähennetään hii-30 Ien hyödyntämistä muihin tarkoituksiin kuin ksylitolin • f tuotantoon tai eliminoidaan se. Kaikki keksinnön mukaiset isännät tuottavat ksylitolia yhdessä fermentointivaihees-sa. Yhdessä suoritusmuodossa keksinnön mukaisilla isännillä voi olla riittävä ksylitolidehydrogenaasiaktiivisuus *. # 35 (EC 1.1.1.9) ksylitolin tuottamiseksi. Kuten jäljempänä 12 1 08300 kuvataan, isännissä, joissa ksylitolidehydrogenaasiaktii-visuuden ylituotanto on toivottua, voidaan isäntäsolu kuitenkin transformoida ksylitolidehydrogenaasia koodittavil-la yhdistelmägeeneillä.
5 Keksinnön käytännön toteutuksen yhteydessä kaikille keksinnön mukaisille isännille on tunnusmerkillistä kyky syntetisoida ksylitolia hiililähteistä, jotka eivät ole sen rakenteellisia sukulaisia, kuten D-glukoosista, eikä pelkästään D-ksyloosista ja/tai D-ksyluloosista. Keksinnön 10 mukaisilla isännillä on myös kyky erittää syntetisoitu ksylitoli alustaan.
Esimerkkeinä esitetyissä ja edullisissa suoritusmuodoissa keksinnön mukaisille isännille on tarkemmin määriteltynä tunnusmerkillistä yksi tai kaksi tietä. Ensim-15 mäinen on tie, jolla arabitoli on välituotteena ksylitolin muodostumisessa, ja toinen on tie, jolla ksyluloosi-5-fos-faatti ohjataan ksylitolin muodostukseen defosforylaatio-ja pelkistysreaktioiden kautta. Niinpä keksinnön mukaisille isännille on tunnusmerkillistä vähintään yksi seuraa-20 vista geenimuutoksista: (1) geeni, joka koodittaa proteiinia, jolla on / D-ksyluloosia muodostava D-arabitolidehydrogenaasiaktiivi- · suus (EC 1.1.1.11), on kloonattu isäntään ja saatu siten aikaan D-arabitolin muuttuminen D-ksyluloosiksi (tunnus-25 merkillistä tielle I) ja/tai : (2) isännän transketolaasiaktiivisuutta koodittava • · « • » · « luontainen geeni on inaktivoitu (tunnusmerkillistä tielle • · · II).
Lisäksi isännille voidaan tehdä erilaisia muita « · * 30 muuntamisia mainitunlaisten isäntien ksylitolintuotantoky- < M • · vyn parantamiseksi. Kohdissa (1) ja (2) kuvatun kaltaisia :*·*: isäntiä voidaan muuntaa lisäksi siten, että 9 (3) isäntään on kloonattu geeni, joka koodittaa proteiinia, jolla on ksylitolidehydrogenaasiaktiivisuus : ” 35 (EC 1.1.1.9); 13 1 08300 (3) isännän D-ksylulokinaasia (EC 2.7.1.17) koodattava luontainen geeni on inaktivoitu; (4) isäntään on kloonattu geeni, joka koodittaa proteiinia, jolla on D-glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi- 5 aktiivisuus (EC 1.1.1.49); (4) isäntään on kloonattu geeni, joka koodittaa proteiinia, jolla on 6-fosfo-D-glukonaattidehydrogenaasi-aktiivisuus (EC 1.1.1.44); (5) isäntään on kloonattu geeni, joka koodittaa 10 proteiinia, jolla on D-ribukoosi-5-fosfaatti-3-epimeraasi- aktiivisuus (EC 5.1.3.1).
Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa keksinnön mukaisissa isännissä on useampia kuin yksi edellä kuvatuista geenimuutoksista. Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa 15 esimerkiksi hiili virtaa D-arabitolista "suoraan" (ts.
yhdessä vaiheessa) D-ksyluloosiin ja D-ksyluloosista "suoraan" ksylitoliin. Mainitunlaisessa suoritusmuodossa keksinnön mukaista isäntää on siten muunnettu sillä tavalla, että isäntään on kloonattu geeni, joka koodittaa proteii-20 nia, jolla on D-ksyluloosia muodostava D-arabitolidehyd- rogenaasiaktiivisuus, ja ksylitolidehydrogenaasia (EC 1.1.1.9) koodittava geeni.
:· Tulisi huomata, että vaikka monissa suoritusmuo- ·; ·· doissa keksinnön mukaiset isännät syntetisoivat sisäisesti : 25 D-arabitolia muista hiililähteistä, voitaisiin D-arabito- «ti ' : .·. lia lisätä myös ulkopuolisesti suoraan alustaan.
• · # .•;-t Yhdessä toisessa edullisessa suoritusmuodossa ksy- * · ♦ litolin biosynteesitiehen ei sisälly arabitolia välituot-t teenä. Hiilen virtaus tapahtuu sen sijaan D-ksyluloosi-5- »tn» 30 fosfaatista D-ksyluloosiin ja edelleen ksylitoliin. Kun « r ···* hiililähteenä käytetään D-glukoosia, hiilen virtaus tapah- tuisi pentoosifosfaattitien oksidatiivisen osan kautta, D-glukoosista D-glukoosi-6-fosfaattiin, siitä 6-fosfo-D- * * « glukonaattiin ja siitä edelleen D-ribuloosi-5-fosfaattiin. \ ” 35 D-ribuloosi-5-fosfaatti epimeroituisi edelleen D-ksyluloo- 14 108300 si-5-fosfaatiksi, defosforyloituisi D-ksyluloosiksi ja pelkistyisi ksylitoliksi. Niinpä tässä suoritusmuossa hyödynnettäväksi sopivien keksinnön mukaisten isäntien piiriin kuuluisi isäntä, jossa 5 (ai) isäntään on kloonattu geeni, joka koodittaa proteiinia, jolla on D-glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi-aktiivisuus (EC 1.1.1.49), tai isännän luontainen geeni yli-ilmentyy ja/tai (a2) isäntään on kloonattu geeni, joka koodittaa 10 proteiinia, jolla on 6-fosfo-D-glukonaattidehydrogenaasi-aktiivisuus (EC 1.1.1.44), tai isännän luontainen geeni yli-ilmentyy ja/tai (a3) isäntään on kloonattu geeni, joka koodittaa proteiinia, jolla on D-ribuloosi-5-fosfaatti-3-epimeraasi-15 aktiivisuus, tai isännän luontainen geeni yli-ilmentyy ja/tai (a4) isäntään on kloonattu geeni, joka koodittaa proteiinia, jolla on ksylitolidehydrogenaasiaktiivisuus (EC 1.1.1.9), tai isännän luontainen geeni yli-ilmentyy; 20 (b) luontainen transketolaasigeeni on inaktivoitu ja/tai (c) isännän luontainen ksylulokinaasia (EC it‘j 2.7.1.17) koodittava geeni on inaktivoitu.
•;"Defosforylaatiovaihe (D-ksyluloosifosfaatin muuttu-25 minen D-ksyluloosiksi) on ainoa vaihe, jota katalysoi ent- « < : .*. syymi, jota ei ole karakterisoitu puhtaassa muodossa. Ent- «»« « syymiaktiivisuuden, joka saa aikaan vastaavan vaiheen • · » (D-ribuloosi-5-fosfaatista D-ribuloosiksi) osmofiilisen hiivan luontaisella D-arabitolin muodostumistiellä, on • « . · * ( · 30 aiemmin osoitettu olevan epäspesifinen ja pystyvän kata- • * ·;·* lysoimaan myös ksyluloosi-5-fosfaatin defosforylaatiota :T; [Ingram, J. M. ja Wood, W. A., J. Bacteriol. 89 (1965) 1186 - 1194]. Transketolaasin mutaatiolla ja oksidatiivi-sen pentoosifosfaattitien näiden kahden dehydrogenaasin 35 yli-ilmentymisellä on kaksoistehtävä. Ne voivat ensinnäkin 108300 ίο parantaa tien I tehoa lisäämällä ribuloosi-5-fosfaatin määrää solussa ja siten arabitolin ksylitolin tuotantoa. Samasta muunnosyhdistelmästä pitäisi toiseksi olla seurauksena myös reitin II toiminnalle välttämättömän ksylu-5 loosi-5-fosfaatin ylikerääntyminen.
Siksi menetelmät, joissa hyödynnetään luonnossa esiintyvää tietä, joka johtaa D-arabitolin muodostumiseen erilaisista hiililähteistä, ja pidennetään tätä tietä kahdella lisäreaktiolla D-arabitolin muuttamiseksi ksylitoli) liksi, eivät ole aina mahdollinen tie keksinnön puitteissa. Muita teitä, jotka johtavat ksylitoliin lopullisena metaboliatuotteena ja joissa ei ole D-arabitolia välituotteena, voidaan konstruoida. Niinpä ksylitoliin D-ribuloo-si-5-fosfaatista johtava tie voidaan toteuttaa yhden tai ' 15 useamman reaktioketjun kautta. D-ribuloosi-5-fosfaatti voidaan muuttaa tehokkaasti D-ksyluloosi-5-fosfaatiksi D-ribuloosi-5-fosfaatti-3-epimeraasin avulla, ja jos D-ksyluloosi-5-fosfaatin muuttuminen edelleen estetään transketolaasigeenissä esiintyvän mutaation kautta, voi-20 daan kerääntynyt D-ksyluloosi-5-fosfaatti defosforyloida saman epäspesifisen fosfataasin avulla kuin D-ribuloosi- 5-fosfaatti [Ingram, J. M. et ai., J. Bacteriol. 89 (1965) 1186 - 1194] ja pelkistää ksylitoliksi ksylitolidehydroge-naasin avulla. Tämän tien toteuttaminen saattaa lisäksi ;\· 25 vaatia D-ksylulokinaasigeenin inaktivointia, jotta mini- : .·. moidaan energiahäviö, jonka aiheuttaa seuraava turha sil- • · · mukka: D-ksyluloosi-5-fosfaatti -* D-ksyluloosi -» D-ksy- • ♦ · luloosi-5-fosfaatti. Geneettinen lisämuutos - D-ribuloki-, naasigeenin (EC 2.7.1.47) tuominen ja (yli)ilmentyminen - *** c # 30 voisi minimoida mainitunlaisten kantojen samanaikaisen • * D-arabitolituotannon sitomalla epäspesifisen fosfataasin vaikutuksesta syntyneen D-ribuloosin. D-ribuloosi muute-taan takaisin D-ribuloosi-5-fosfaatiksi ja edelleen D-ksy-luloosi-5-fosfaatiksi.
16 1 0 8 300 III. Keksinnön mukaisten isäntien konstruointi
Menetelmää keksinnön mukaisten isäntien käsittelemiseksi geeniteknisesti helpotetaan keksinnön mukaisesti eristämällä ja sekventoimalla osittain puhdas proteiini, 5 joka koodittaa kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä, tai kloonaamalla mainittua proteiinia koodittamaan kykeneviä geenisekvenssejä polymeraasiketjureaktiomenetelmin ja saattamalla mainitunlaiset geneettiset sekvenssit ilmentymään. Tässä käytettynä termillä "geneettiset sekvens-10 sit" tarkoitetaan nukleiinihappomolekyyliä (edullisesti DNA:ta). Geneettisiä sekvenssejä, joilla on kyky koodittaa proteiineja, on peräisin erilaisista lähteistä. Näihin lähteisiin kuuluvat genomi-DNA, cDNA, synteettinen DNA ja niiden yhdistelmät. Edullinen genomi-DNA:n lähde on cDNA-15 kirjasto, joka on valmitettu halutun mRNA:n tai proteiinin ilmentymistä tunnetusti indusoivissa olosuhteissa kasvatetun hiivan mRNA:sta.
Keksinnön mukainen cDNA ei sisällä luonnossa esiintyviä introneja, jos cDNA on valmistettu käyttämällä val-20 mistä mRNA:ta templaattina. Keksinnön mukainen genomi-DNA voi sisältää tai olla sisältämättä luonnossa esiintyviä introneja. Lisäksi tällainen genomi-DNA voidaan valmistaa liittyneenä geenisekvenssien 5'-promoottorialueeseen ja/ tai 3'-pään transkription terminaatioalueeseen. Lisäksi : 25 tällainen genomi-DNA voidaan valmistaa liittyneenä geneet-« « : tisiin sekvensseihin, jotka koodittavat mRNA:n 5'-pään • · · ,·;·# transloitumatonta aluetta, ja/tai geneettisiin sekvenssei- • · · hin, jotka koodittavat 3'-pään transloitumatonta aluetta. Mikäli isäntäsolu pystyy tunnistamaan mRNA:n ja proteiinin 30 ilmentymiseen liittyvät transkriptiota ja/tai translaatio- • « ...* ta säätelevät signaalit, voidaan luontaisen geenin 5'- ja/tai 3'-pään transkriptoitumattomat alueet ja/tai mRNA:n 5'- ja/tai 3'-pään transloitumattomat alueet säilyttää ja käyttää niitä transkription ja translaation säätelyyn.
• " 35 Genomi-DNA voidaan eristää ja puhdistaa mistä tahansa ha- 17 108300 luttua proteiinia luonnostaan tuottavasta isäntäsolusta, erityisesti sieni-isännästä, alalla hyvin tunnetuin menetelmin (katso esimerkiksi Guide to Molecular Cloning Techniques, toim. S. L. Berger et ai., Academic Press 1987).
5 Käytettävä mRNA-valmiste on edullisesti rikastettu haluttua proteiinia koodittavan mRNA:n suhteen joko luonnostaan, kyseistä proteiinia suuria määriä tuottavista soluista tapahtuneen eristyksen kautta, tai in vitro, menetelmin, joita käytetään yleisesti mRNA-valmisteiden rikas-10 tamiseen määrättyjen sekvenssien suhteen, kuten sakkaroo-sigradienttisentrifugoinnilla, tai kumpaakin kautta.
Vektoriin tapahtuvaa kloonaamista varten mainitunlaiset soveltuvat DNA-valmisteet (joko genomi-DNA tai cDNA) leikataan tai vastaavasti pilkotaan entsymaattises-15 ti ja ligatoidaan asianmukaisiin vektoreihin (joko genomi-DNA: ta tai cDNArta käsittävän) yhdistelmägeenikirjaston muodostamiseksi.
Haluttua proteiinia tai sen funktionaalisia johdannaisia koodittava DNA-sekvenssi voidaan insertoida DNA-20 vektoriin tavanomaisin menetelmin, mukaan luettuina päiden tekeminen tylpiksi tai portaittaisiksi ligaatiota varten, restriktioentsyymipilkonta asianmukaisten päiden aikaansaamiseksi, tarttuvien päiden täyttäminen tarvittaessa, ; ; käsittely alkalisella fosfataasilla epätoivottavan liitty- : 25 misen estämiseksi ja asianmukaisten ligaasien avulla teh- : .·. tävä ligatointi. Tällaisia käsittelymenetelmiä esitetään * * · teoksessa Maniatis, T. et ai., Molecular Cloning (A Lab- • · · oratory Manual), 2. p., Cold Spring Harbor Laboratory 1988, ja ne ovat alalla hyvin tunnettuja.
* * 30 Haluttua geeniä koodittavia sekvenssejä sisältäviä ♦ · ...* kirjastoja voidaan seuloa ja haluttu geenisekvenssi iden- :*·*: tifioida millä tahansa keinolla, jolla voidaan spesifises- ti valikoida mainitunlaista geeniä tai proteiinia koodittava sekvenssi, kuten esimerkiksi a) tekemällä hybridisaa-• 35 tio yhden tai useamman asianmukaisen nukleiinihappokoetti- 18 108300 men kanssa, joka sisältää tätä proteiinia vastaavalle DNA:lie spesifisen sekvenssin, tai b) hybridisaatiovali-kointi-translaatioanalyysillä, jossa kyseisen kloonin kanssa hybridisoituva luonnon mRNA luetaan in vitro ja 5 karakterisoidaan edelleen translaatiotuotteet, tai c) jos itse kloonatut geneettiset sekvenssit ovat kykeneviä ilmentämään mRNA:ta, immuunisaostamalla kloonin sisältävän isännän tuottama transloitunut proteiinituote.
Tietylle proteiinille spesifisiä oligonukleotidi-10 koettimia, joita voidaan käyttää kloonien toteamiseen tähän proteiiniin liittyviksi, voidaan suunnitella tunnet-taessa proteiinin aminohapposekvenssi tai mainitunlaista proteiinia tai jotakin sukulaisproteiinia koodittavan DNA: n nukleiinihapposekvenssi. Vaihtoehtoisesti voidaan 15 muodostaa vasta-aineita proteiinin puhdistettuja muotoja vastaan ja käyttää niitä ainutlaatuisten proteiinidetermi-nanttien läsnäolon totoeamiseen haluttua kloonattua proteiinia ilmentävistä transformanteista. Peptidin sisältämä aminohapporyhmäsekvenssi merkitään tässä joko käyttämällä 20 yleisesti käytettäviä kolmikirjaimisia merkintöjä tai yksikirjaimisia merkintöjä. Luettelo näistä kolmikirjaimisista ja yksikirjaimisista merkinnöistä on löydettävissä oppikirjoista, kuten Lehninger, A., Biochemistry, Worth ] Publishers, New York, NY 1970. Kun aminohapposekvenssi : 25 esitetään vaakasuorassa, aminopää on tarkoitettu olemaan • · : ,·, vasemmassa ja karboksipää oikeassa päässä, ellei toisin * · · mainita. Vastaavasti, ellei toisin mainita tai käy ilmi
• ( I
asiayhteydestä, nukleiinihapposekvenssi esitetään siten, että 5'-pää on vasemmalla.
’ * 30 Koska geneettinen koodi on degeneroitunut, voidaan • · · käyttää useampaa kuin yhtä kodonia koodittamaan jotakin ;*j*. määrättyä aminohappoa (Watson, J. D. teoksessa Molecular
Biology of the Gene, 3. p., W. A: Benjamin, Inc., Menlo Park, CA 1977). Peptidifragmentit analysoidaan sellaisten ; 35 aminohapposekvenssien identifioimiseksi, joita voivat koo- 19 108300 dittaa oligonukleotidit, joilla degeneraatioaste on alhaisin. Tämä tehdään identifioimalla sekvenssit, jotka sisältävät vain yhden kodonin koodittamia aminohappoja.
Vaikka aminohapposekvessiä voi satunnaisesti koo-5 dittaa vain yksi oligonukleotidisekvenssi, voi aminohappo-sekvenssiä usein koodittaa mikä tahansa joukosta vastaavia oligonukleotideja. Tärkeää on, että samalla kun kaikki tämän joukon jäsenet sisältävät oligonukleotidisekvensse-jä, joilla on kyky koodittaa samaa peptidifragmenttia ja 10 jotka siten mahdollisesti sisältävät saman oligonukleoti-disekvenssin kuin kyseistä peptidifragmenttia koodittava geeni, vain yksi tämän joukon jäsen sisältää nukleotidi-sekvenssin, joka on identtinen geenin koodittavan eksoni-sekvenssin kanssa. Koska tämä jäsen on läsnä joukossa ja 15 pystyy hybridisoitumaan DNA:n kanssa jopa joukon muiden jäsenten läsnä ollessa, on mahdollista käyttää fraktioima-tonta oligonukleotidijoukkoa samalla tavalla kuin käytettäisiin yhtä oligonukleotidia peptidiä koodittavan geenin kloonaamiseen.
20 Käyttämällä geneettistä koodia voidaan aminohappo- sekvenssistä identifioida yksi tai useampia erilaisia oli-, gonukleotideja, joista kukin pystyisi koodittamaan halut tua proteiinia. Todennäköisyys, että jokin määrätty oligo-, ; nukleotidi todellisuudessa muodostaa varsinaisen proteii- : 25 nia koodittavan sekvenssin, voidaan arvioida tarkastele- • · : .·. maila epänormaaleja emäspariutumissuhteita ja taajuutta, • » 9 · .···, jolla jotakin määrättyä kodonia todellisuudessa käytetään • « 4 (jonkin määrätyn aminohapon koodittamiseen) eukaryoottiso-, luissa. Käyttämällä "kodoninkäyttösääntöjä" identifioidaan 30 yksi oligonukleotidisekvenssi tai joukko oligonukleotidi- • · ···* sekvenssejä, jotka sisältävät teoreettisen "todennäköi- :*·*: simmän" nukleotidisekvenssin, jolla on kyky koodittaa pro- teiinisekvenssejä.
Sopiva oligonukleotidi tai oligonukleotidijoukko, * '* 35 jolla on kyky koodittaa jonkin tietyn geenin jotakin frag- 20 1 0 8 3 0 0 menttia (tai joka on komplementaarinen tällaiselle oligo-nukleotidille tai oligonukleotidijoukolle), voidaan syntetisoida alalla hyvin tunnetuin keinoin (katso Synthesis and Application of DNA and RNA, toim. S. A. Narang, Aca-5 demic Press, San Diego, CA 1987) ja käyttää koettimena mainitunlaista geeniä vastaavan kloonin identifiointiin ja eristämiseen alalla tunnetuin menetelmin. Menetelmiä nukleiinihappojen hybridisoimiseksi ja kloonien identifioimiseksi esittävät Maniatis, T. et ai. teoksessa Molecular 10 Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY 1982 ja Hames, B. D. et al. teoksessa Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC 1985. Ne edellä kuvatun geenikirjaston jäsenet, joiden havaitaan pystyvän maini-15 tunlaiseen hybridisaatioon, analysoidaan sitten sisältämiensä koodittavien sekvenssien pituuden ja luonteen suhteen.
Halutun koodittavan DNA-sekvenssin detektoinnin helpottamiseksi edellä kuvattu DNA-koetin leimataan detek-20 toitavissa olevalla ryhmällä. Tällainen detektoitavissa oleva ryhmä voi olla mikä tahansa materiaali, jolla on detektoitavissa oleva fysikaalinen tai kemiallinen ominaisuus. Tällaiset materiaalit ovat pitkälle kehitettyjä nuk-leiinihappohybridisaatioalalla, ja yleisesti ottaen lähes : 25 mitä tahansa tällaisissa menettelyissä käyttökelpoista ft i • .·. merkkiainetta voidaan soveltaa tähän keksintöön. Erityisen • · i [·.'/ käyttökelpoisia ovat radioaktiiviset merkkiaineet, kuten 32P, 3H, 14C, 35S, 125I tms. Voidaan käyttää mitä tahansa ra-, dioaktiivista merkkiainetta, joka antaa tulokseksi riittä- 30 vän signaalin ja jolla on riittävä puoliintumisaika. Jos • i ...* oligonukleotidi on yksisäikeinen, se voidaan leimata ra- dioaktiivisesti käyttämällä kinaasireaktioita. Vaihtoeh- # toisesti polynukleotidit ovat käyttökelpoisia nukleiini-happohybridisaatiokoettimina myös leimattuina ei-radioak- 21 1 08300 tiivisella merkkiaineella, kuten biotiinilla, entsyymillä tai fluoresoivalla ryhmällä.
Yhteenvetona voidaan siten todeta, että proteiini-sekvenssin osan selvittäminen antaa mahdollisuuden identi-5 fioida teoreettinen "todennäköisin" DNA-sekvenssi tai joukko tällaisia sekvenssejä, joilla on kyky koodittaa mainitunlaista peptidiä. Konstruoimalla tälle teoreettiselle sekvenssille komplementaarinen oligonukleotidi (tai konstruoimalla "todennäköisimpien" oligonukleotidien jou-10 kolle komplementaarinen joukko oligonukleotideja) saadaan DNA-molekyyli (tai joukko DNA-molekyylejä), joilla on kyky toimia koettimena (koettimina) geenin sisältävien kloonien identifioimiseksi ja eristämiseksi.
Noudatettaessa yhtä vaihtoehtoista tapaa geenin 15 kloonaamiseksi valmistetaan kirjasto käyttämällä ilmenty-misvektoria, kloonaamalla DNA tai edullisemmin kyseistä proteiinia ilmentämään kykenevästä solusta valmistettu cDNA ilmentymisvektoriin. Kirjastosta etsitään sitten jäseniä, jotka ilmentävät haluttua proteiinia, esimerkiksi 20 tutkimalla kirjasto proteiinin vasta-aineilla.
Edellä käsitellyillä menetelmillä pystytään siten identifioimaan geenisekvenssit, joilla on kyky koodittaa proteiinia tai tämän proteiinin biologisesti aktiivisia tai antigeenisiä fragmentteja. Mainitunlaisten geenisek- 25 venssien karakterisoimiseksi tarkemmin ja yhdistelmäpro- : teiinin tuottamiseksi on toivottavaa ilmentää näiden sek- • * · · venssien koodittamia proteiineja. Tällaisella ilmentämi- « sellä identifioidaan ne kloonit, jotka ilmentävät proteii-neja, joilla on halutun proteiinin tunnusmerkilliset piir- i 30 teet. Tällaisiin tunnusmerkillisiin piirteisiin voivat V kuulua mm. kyky sitoa spesifisesti vasta-ainetta, kyky • · · V * herättää luontaista, ei-yhdistelmäproteiinia sitomaan ky- kenevien vasta-aineiden tuotantoa, kyky antaa solulle ent-;·. syymiaktiivisuus, joka on kyseisen proteiinin ominaisuus, 22 1 08300 ja kyky tuoda vastaanottajasoluun jokin ei-entsymaattinen (mutta spesifinen) toiminto.
DNA-sekvenssiä voidaan lyhentää alalla tunnetuin menetelmin halutun geenin eristämiseksi kromosomialueelta, 5 joka sisältää enemmän informaatiota kuin on tarpeellista tämän geenin hyödyntämiseksi keksinnön mukaisissa isännissä. Voidaan hyödyntää esimerkiksi restriktiopilkontaa täyspitkän sekvenssin katkaisemiseksi halutusta kohdasta. Vaihtoehtoisesti tai lisäksi voidaan käyttää DNA-molekyy-10 Iin 3'-päästä käsin katkaisevia nukleaaseja tietyn sekvenssin pilkkomiseksi lyhennettyyn muotoon, minkä jälkeen halutun pituinen jakso identifioidaan ja puhdistetaan gee-lielektroforeesilla ja DNA-sekventoinnilla. Mainitunlaisiin nukleaaseihin kuuluvat esimerkiksi eksonukleaasi III 15 ja Bal31. Muut nukleaasit ovat alalla hyvin tunnettuja.
Toteutettaessa keksintö käytännössä voidaan mallina käyttää osmofiilistä hiivaa Z. rouxii. Z. rouxii soveltuu elintarvikkeiden tuottamiseen, sillä sitä käytetään perinteisesti Japanissa soijakastikkeen valmistukseen. Tätä 20 hiivaa on kuvattu esimerkiksi teoksessa The Yeasts, A Taxonomic Study, toim. Kreger-van Rij, Elsevier Science publishers B.V., Amsterdam 3984, jossa tätä hiivaa kuvataan sivuilla 462 - 465. Muita D-arabitolia tuottavia hiivoja, kuten Candida polymorphaa, Torulopsis candidaa, Can-·, 25 did a tropicalista, Pichia farinosaa, Torulaspora hansenii- : ta jne., samoin kuin D-arabitolia tuottavia sieniä, kuten :*·*: Dendryphiella salinaa tai Schizophyllum communea, voidaan myös käyttää isäntäorganismeina tämän keksinnön tarkoituk-siin.
.·> , 30 D-arabitolia D-ksyluloosiksi hapettavia entsyymejä (EC 1.1.1.11) tiedetään esiintyvän bakteereissa muttei « i « V · hiivoissa eikä sienissä. Tämän keksinnön yhteydessä ,, / Klebsiella terrigena on D-arabitolidehydrogenaasigeenin :·. (D-ksyluloosin muodostumiseen johtavan geenin) edullinen : 35 lähde, sillä se on ei-patogeeninen maabakteeri ja sillä on • > 23 108300 korkea indusoitavissa oleva D-arabitolidehydrogenaasiak-tiivisuus. Esimerkeissä käytetyn Klebsiella terrigena -kannan Phpl toimitti K. Haahtela, Helsingin yliopisto. Tämän kannan eristämistä kuvaavat Haahtela et ai. julkai-5 sussa Appi. Env. Microbiol. 45 (1983) 563 - 570. D-arabi-tolidehydrogenaasigeenin kloonaus voidaan tehdä kätevästi konstruoimalla K. terrigenan kromosomi-DNA:n käsittävä geenikirjasto sopivassa vektorissa, esimerkiksi hyvin tunnetussa ja kaupallisesti saatavissa olevassa plasmidissa 10 pUC19. Tällä kirjastolla transformoidaan jokin monista E. coli -kannoista, joilla on kyky hyödyntää D-ksyluloosia muttei D-arabitolia ainoana hiililähteenä. Stratagenesta saatavissa oleva E. coli -kanta SCSI on yksi esimerkki sopivista kannoista. Transformantit siirrostetaan sitten 15 alustalle, joka sisältää D-arabitolia ainoana hiililähteenä, ja eristetään tällä alustalla kasvamaan kykenevät kloonit. K. terrigenan D-arabitolidehydrogenaasia koodattava alue voidaan eristää kätevästi 1,38 ke:n (kiloemäksen) pituisena BclI-CIal-fragmenttina ja liittää yhteen 20 asianmukaisten promoottori- ja transkriptionlopetussek- venssien kanssa. Saccharomyces cerevisiaen ADCJ-promootto-ri ja transkriptioterminaattori ovat esimerkkejä transkriptiota säätelevistä elementeistä, jotka soveltuvat tämän keksinnön tarkoituksiin käytettäessä isäntäorganismina :, 'ί 25 hiivaa Z. rouxii. HDCI-sekvenssi on saatavissa GenBankis- :.f: ta.
: Vaikka pääosalla hiivoista ja sienistä on ksylito- lidehydrogenaasia (EC 1.1.1.9) koodittava geeni, on maini-.... tun geenin yli-ilmentyminen tyypillisesti välttämätöntä ,<< 30 tämän keksinnön toteuttamiseksi. Pichia stipitisin XYL2- geeni, joka koodittaa ksylitolidehydrogenaasia (EC *.* * 1.1.1.9), voidaan kloonata kätevästi polymeraasiketjureak- tiotekniikalla käyttämällä julkaistuja tietoja XYL2-geenin :·. nukleotidisekvenssistä [Kötter et ai. Curr. Genet. 18 24 1 0 8 3 0 0 (1990) 493 - 500]. Tämä geeni voidaan viedä muihin hiiva-lajeihin ilman muuntamisia ja saattaa ilmentymään oman promoottorinsa ohjauksessa, tai promoottori voidaan vaihtaa toiseksi vahvaksi hiivapromoottoriksi.
5 Geneettisesti stabiileja transformantteja voidaan konstruoida käyttämällä vektorijärjestelmiä tai transfor-maatiojärjestelmiä, jolloin haluttu DNA tulee integroiduksi isännän kromosomiin. Tällainen integroituminen voi tapahtua ne novo solussa, tai sitä voidaan edistää transit) formoimalla vektorilla, joka sijoittuu funktionaalisesti isännän kromosomiin, esimerkiksi faagilla, retrovirusvek-toreilla, transposoneilla tai muilla DNA-elementeillä, jotka edistävät DNA-sekvenssien integroitumista kromosomeihin.
15 D-arabitolidehydrogenaasia ja ksylitolidehydroge- naasia (EC 1.1.1.9) koodittavat, sopivien promoottorien ohjauksessa olevat geenit voidaan yhdistää yhteen plasmi-dirakenteeseen ja viedä D-arabitolia tuottavan organismin isäntäsoluihin transformaation kautta. Plasmidivektorin 20 luonne riippuu isäntäorganismista. Niinpä Z. rouxiin ol- . . lessa kyseessä tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodos sa käytetään kryptisen plasmidin pSRl DNA:ta sisältäviä vektoreja [Ushio, K. et ai. J. Ferment. Technol. 66 (1988) 481 - 488]. Muiden hiiva- tai sienilajien kohdalla, joille *. ; 25 sopivia autonomisesti replikoituvia plasmideja ei tunneta, • · : voidaan käyttää ksylitolidehydrogenaasia (EC 1.1.1.9) ja • tl '·/< i D-arabitolidehydrogenaasia koodattavien geenien integroin tia isännän kromosomiin. Integroinnin kohdistaminen isän-·;*·· nän ribosomi-DNA-lokukseen (ribosomi-RNA: ta koodittava ." . 30 DNA) on edullinen menetelmä näiden kahden geenin suureen • i f • kopiolukumäärään johtavan integroinnin ja voimakkaan il-
• I I
*·* * mentymisen aikaansaamiseksi; tällainen kohdistus voidaan • ♦ » saada aikaan sijoittamalla yhdistelmärakenteeseen riittä-;'· västi yhdistelmä-DNA-sekvenssejä integroitumisen ohjaami- : 35 seksi tähän lokukseen. D-arabitolia tuottavien mikro-orga- „ 108300 nismien transformoiman yhteydessä käytettävät geenimark-kerit ovat edullisesti dominoivia markkereita, jotka antavat resistenssin erilaisille antibiooteille, kuten genta-misiinille tai fleomysiinille, tai raskasmetalleille, ku-5 ten kuparille, yms. Valikointimarkkerigeeni voidaan joko kytkeä suoraan ilmennettäviin DNA-geenisekvensseihin tai viedä samaan soluun kotransformaatiolla.
D-arabitolidehydrogenaasia ja ksylitolidehydroge-naasia (EC 1.1.1.9) koodittavien geenien tuomisen ohella 10 voidaan käyttää muita geneettisiä muuntamisia uudenlaisten ksylitolia tuottavien kantojen konstruoimiseksi. Niinpä voidaan yli-ilmentää geenejä, jotka koodittavat oksidatii-visen pentoosifosfaattitien entsyymejä, D-arabitolin esiasteen, D-ribuloosi-5-fosfaatin syntetisointinopeuden suu-15 rentamiseksi. Voidaan myös inaktivoida transketolaasia -pentuloosi-5-fosfaattien tai pentoosi-5-fosfaattien kata-boliaa katalysoivaa entsyymiä - koodittava geeni tavanomaisin mutageneesi- tai geeninkatkaisumenetelmin, mikä johtaa viisihiilisten sokerifosfaattien lisääntyneeseen 20 kerääntymiseen. D-ksylulokinaasigeenin inaktivointi voi , , suurentaa ksylitolisaantoa eliminoimalla fosforylaation aiheuttaman D-ksyluloosihäviön. Inaktivoivan transketolaa-simutaation yhdistämistä D-ribuloosi-5-epimeraasin yli-' ' ilmentämiseen voidaan käyttää erityyppisen ksylitolintuo- 25 tantotien luomiseksi, jolla ei käytetä D-arabi tolia vä- • » ·.· · lituotteena. Halutun proteiinin ja/tai sen aktiivisten : johdannaisten ilmentämiseksi ovat välttämättömiä asianmu kaisen isännän tunnistettavissa olevat transkriptio- ja ·..«£ translaatiosignaalit. Kloonatut kooditussekvenssit, jotka .··*, 30 on saatu edellä kuvatuin menetelmin ja ovat edullisesti kaksisäikeisessä muodossa, voidaan kytkeä toiminnallisesti • · · *·* * sekvensseihin, jotka ohjaavat transkriptionaalista ilmen- f t» tyrnistä ilmentymisvektorissa, ja viedä isäntäsoluun, joko prokaryoottiin tai eukaryoottiin, yhdistelmäproteiinin tai .·. : 35 sen funktionaalisen johdannaisen tuottamiseksi. Sen mu- 26 108300 kaan, mikä kooditussekvenssin säie kytketään toiminnallisesti transkriptionaalista ilmentymistä ohjaaviin sekvens-seihin, on myös mahdollista ilmentää antisense-RNA tai sen funktionaalinen johdannainen.
5 Proteiinin ilmentäminen erilaisissa isännissä voi johtaa erilaisiin translaation jälkeen tapahtuviin muuntumisiin, jotka voivat muuttaa proteiinin ominaisuuksia. Tämä keksintö käsittää edullisesti proteiinin tai sen jonkin funktionaalisen johdannaisen ilmentämisen eukaryootti-10 soluissa ja erityisesti hiivassa.
Nukleiinihappomolekyylin, kuten DNA:n, sanotaan olevan "kykenevä ilmentämään" polypeptidi, jos se sisältää ilmentymistä ohjaavia sekvenssejä, jotka sisältävät transkription säätelytietoja, ja tällaiset sekvenssit "kytke-15 tään toiminnallisesti" polypeptidiä koodittavaan nukleoti di sekvenssiin.
Toiminnallinen kytkentä on kytkentä, jossa sekvenssi liitetään säätelysekvenssiin (tai -sekvensseihin) sillä tavalla, että sekvenssin ilmentyminen tulee säätelysek-20 venssin vaikutuksen tai ohjauksen alaiseksi. Kahden DNA-sekvenssin (kuten koodittavan sekvenssin ja koodittavan sekvenssin 5'-päähän kytketyn promoottorialuesekvenssin) sanotaan olevan toiminnallisesti kytkettyjä, jos promoot-toritoiminnan induktio johtaa haluttua proteiinia koodit-'·; 25 tavan mRNA:n transkriptioon eikä näiden kahden DNA-sek-|#j : venssin välisen kytkennän luonne (1) muuta koodittavan sekvenssin lukukehystä, (2) häiritse ilmentymistä sääte-levien sekvenssien kykyä ohjata proteiinin ilmentymistä .. .: (antisense-RNA) eikä (3) häiritse DNA-templaatin kykyä 30 tulla kopioiduksi. Niinpä promoottorialue olisi kytkeyty-nyt toiminnallisesti DNA-sekvenssiin, jos promoottorilla • · « *.* * olisi kyky saada aikaan kyseisen DNA-sekvenssin transkrip- tio.
Geenin ilmentymisen vaatimien säätelyalueiden täs-; 35 mällinen luonne voi vaihdella lajien tai solutyyppien kes- 27 108300 ken, mutta niiden tulee yleisesti ottaen sisältää tarpeen mukaan 5'-pään transkriptoitumattomia ja 5'-pään transloi-tumattomia (koodittamattomia) sekvenssejä, jotka ovat mukana transkription ja vastaavasti translaation aloitukses-5 sa, kuten "TATA-box" (TATA-sekvenssi), cap-jakson ("hupun") liittymisalue, CAAT-sekvenssi yms. Tällaisiin 5'-pään kopioitumattomiin ohjaussekvensseihin sisältyy erityisesti alue, joka sisältää promoottorin toiminnallisesti kytkeytyneen geenin transkription ohjaamiseksi. Tällaiset 10 transkriptiota ohjaavat sekvenssit voivat haluttaessa sisältää myös tehostinsekvenssejä tai edellä olevia akti-vaattorisekvenssej ä.
Proteiinin ilmentyminen eukaryootti-isännissä, kuten hiivassa, vaatii mainitunlaisissa isännissä toimivien 15 säätelyalueiden, edullisesti hiivan säätelyjärjestelmien, käyttöä. Voidaan käyttää monia erilaisia transkriptiota ja translaatiota sääteleviä sekvenssejä isännän luonteen mukaan. Nämä säätelysignaalit liittyvät luonnollisessa tilassaan edullisesti johonkin määrättyyn geeniin, jolla on 20 kyky voimakkaaseen ilmentymiseen isäntäsolussa.
Eukaryooteissa, joissa transkriptio ei kytkeydy translaatioon, tällaiset säätelyalueet voivat tarjota tai olla tarjoamatta käyttöön aloitusmetioniinikodonin (AUG) ' ' sen mukaan, sisältääkö kloonattu sekvenssi tällaisen me- i 25 tioniinin. Tällaiset alueet sisältävät yleisesti esitettyjä j nä riittävän promoottorialueen RNA-synteesin käynnistymi- :*·*: sen ohjaamiseksi isäntäsolussa. Hiivageeneistä peräisin olevat promoottorit, jotka koodittavat translaatiokykyistä mRNA-tuotetta, ovat edullisia, ja erityisesti vahvoja pro- • · ,···, 30 moottoreja voidaan käyttää sillä edellytyksellä, että ne "* toimivat promoottoreina myös isäntäsolussa. Edullisiin ♦ · * V : vahvoihin hiivapromoottoreihin kuuluvat GALl-geenin pro- • ♦ t moottori, glykolyyttisten geenien promoottorit, kuten fos-foglyserolikinaasi (PGK) -geenin promoottori, tai konsti-j 35 tutiivinen alkoholidehydrogenaasi (RDCl) -promoottori 28 1 08300 [Ammerer, G., Meth. Enzymol. 101C (1983) 192 - 201; Aho, FEBS Lett. 291 (1991) 45 - 49],
Kuten on laajasti tunnettua, eukaryoottisen mRNArn translaatio käynnistyy kodonista, joka koodittaa ensim-5 mäistä metioniinia. Tästä syystä on edullista taata, ettei eukaryoottipromoottorin ja haluttua proteiinia tai sen funktionaalista johdannaista koodittavan DNA-sekvenssin välinen kytkentäalue sisällä välikodoneja, joilla on kyky koodittaa metioniinia. Tällaisten kodonien läsnäolo johtaa 10 joko fuusioproteiinin muodostumiseen (jos AUG-kodoni on samassa lukukehyksessä kuin proteiinia koodittava DNA-sek-venssi) tai lukukehyksen muuttumisen aiheuttamaan mutaatioon (jos AUG-kodoni ei ole samassa lukukehyksessä kuin proteiinia koodittava sekvenssi).
15 Voidaan valita transkription aloitusta sääteleviä signaaleja, jotka mahdollistavat repression tai aktivaation, niin että voidaan säädellä toiminnallisesti kytkeytyneiden geenien ilmentymistä. Kiinnostavia ovat säätely-signaalit, jotka ovat lämpötilaherkkiä, niin että ilmenty-20 minen voidaan tukahduttaa tai käynnistää muuttamalla lämpötilaa, tai kemiallisen, esimerkiksi metaboliatuotteen aikaansaaman, säätelyn kohteena. Translaatiosignaaleja ei tarvita, kun halutaan ilmentää antisense-RNA-sekvenssejä.
3'-suuntaan haluttua proteiinia koodittavasta sek-25 venssistä olevia transkriptoitumattomia ja/tai transloitu- • · ί :: mattomia alueita voidaan haluttaessa saada aikaan edellä • · · · ;T: kuvatuilla kloonausmenetelmillä. 3'-pään transkriptoituma- ton alue voidaan säilyttää transkription lopettamista sää-televien sekvenssielementtiensä osalta; 3 '-pään transloi- • · ,···. 30 tumaton alue voidaan säilyttää translaation lopettamista *.** säätelevien sekvenssielementtiensä osalta tai polyadeny- • · « V · laation eukaryoottisoluissa ohjaavien elementtien osalta.
t * I
Kun luontaiset ilmentymisenohjaussekvenssisignaalit eivät :·. toimi tyydyttävästi isäntäsolussa, voidaan ne korvata , ; 35 isäntäsolussa toimivilla sekvensseillä.
29 1 08300 Tämän keksinnön mukaiset vektorit voivat lisäksi käsittää muita toiminnallisesti kytkettyjä säätelyelement-tejä, kuten DNA-elementtejä, jotka antavat antibioottiresistenssin, tai replikaation aloituskohtia vektorin pitä-5 miseksi yllä yhdessä tai useammassa isäntäsolussa.
Yhdessä toisessa edullisessa suoritusmuodossa, esimerkiksi Z. rouxiin ollessa kyseessä, soluun tuotava sekvenssi sisällytetään plasmidivektoriin, jolla on kyky replikoitua autonomisesti vastaanottajaisännässä. Mitä tahan-10 sa monista erilaisista vektoreista voidaan käyttää tähän tarkoitukseen.
Jonkin määrätyn plasmidi- tai virusvektorin valinnassa tärkeisiin tekijöihin kuuluvat seuraavat: se, miten helposti vektorin sisältävät vastaanottajasolut voidaan 15 tunnistaa ja valikoida vektoria sisältämättömien vastaanotta jasoluj en joukosta, ja se, onko toivottavaa saada vektori "sukkuloimaan" eri lajia olevien isäntäsolujen välillä.
Edulliset hiivaplasmidit riippuvat isännästä. Z.
20 rouxiin ollessa kyseessä ovat edullisia vektorit, jotka , , perustuvat luontaisiin kryptisiin plasmideihin pSRl [Toh, E. et ai., J. Bacteriol. 151 (1982) 1389 - 1390], pSBl, · pSB2, pSB3 tai pSB4 [Toh, E. et ai., J. Gen. Microbiol.
' · 130 (1984) 2527 - 2534]. Plasmidi pSRT303D [Jearnpipatkul, * * 25 A. et ai., Mol. Gen. Genet. 206 (1987) 88 - 84] on yksi j\: : esimerkki Zygosaccharomyces-hiivan yhteydessä käyttökel- :*·*: poisesta plasmidista.
Kun yhden tai useamman rakenteen sisältävä vektori ja DNA-sekvenssi on valmistettu ilmentämistä varten, DNA- .···, 30 rakenne tai -rakenteet viedään sopivaan isäntäsoluun millä *" tahansa monista soveltuvista keinoista, mukaan luettuna * · · V * transformaatio. Vektorin tuomisen jälkeen vastaanottajaso- i * · luja kasvatetaan selektiivisessä alustassa, joka on vali-koiva vektorin sisältävien solujen kasvun suhteen. Yhden I f < ,; 35 tai useamman kloonatun sekvenssin ilmentyminen johtaa ha- 30 '.08300 lutun proteiinin tai tämän proteiinin jonkin fragmentin tuotantoon. Tämä ilmentyminen voi tapahtua transformoiduissa soluissa jatkuvasti tai säädellystä, esimerkiksi ilmentymisen indusoinnin kautta.
5 Sellaisten keksinnön mukaisten isäntien konstruoi miseksi, joita on muutettu siten, etteivät ne enää pysty ilmentämään jotakin tiettyä geenituotetta, voidaan tehdä suunnattu mutageneesi käyttämällä alalla tunnettuja menetelmiä, kuten geenin katkaisua [Rothstein, R. S., Meth. 10 Enzymol. 101C (1983) 202 - 211].
IV. Ksylitolin tuotanto
Kun keksinnön mukaisina isäntinä käytetään arabito-lia tuottavia yhdistelmähiivoja, edullisesti osmofiilisiä hiivoja, niitä voidaan kasvattaa alustassa, jossa osmoot-15 tinen paine on suuri, esimerkiksi 10 - 60 %, edullisesti 25 %, D-glukoosia sisältävässä alustassa. ("Normaali" alusta sisältää tavallisesti vain 2 - 3 % glukoosia.) Osmoottiselta paineeltaan korkea alusta indusoi D-arabitolin muodostuksen osmofiilisten hiivojen, kuten Z. rouxiin, 20 villiä tyyppiä olevissa kannoissa. Yhdistelmä- ja (villiä tyyppiä olevien) vertailukantojen kasvualustasta analysoidaan ksylitolin läsnäolo alalla tunnetuin menetelmin viljelyn kestettyä eri aikoja. Viljelyolosuhteissa, joita ei ' 1 ollut optimoitu maksimaalisen D-arabitolisaannon saavutta- i 25 miseksi, kokeellinen Z. rouxii -kanta ATCC13356[pSRT(AX)- • « ;.· · 9] tuotti ja eritti kasvualustaan sekä ksylitolia että ϊ Γ: D-arabitolia. Vertailukannan kasvualustassa havaittiin vain D-arabitolia. Ksylitolisaanto oli ensimmäisissä ko- ·...: keissa (katso taulukko 4 esimerkissä 4) noin 7,7 g/1 .··*. 30 48 tuntia kestäneen kasvatuksen jälkeen.
'·’ Ksylitoli voidaan puhdistaa keksinnön mukaisten • · a • · · V * isäntien kasvualustasta millä tahansa alalla tunnetulla tt» *..,· menetelmällä. Esimerkiksi US-patentissa 5 081 026, joka « mainitaan tässä viitteenä, on kuvattu ksylitolin erotta- 4 ,\ ; 35 mistä kromatografisesti hiivaviljelmistä. Niinpä ksylitoli 31 1 08300 voidaan fermentointivaiheen jälkeen puhdistaa kasvualustasta käyttämällä US-patentissa 5 081 026 kuvattujen kaltaisia kromatografisia vaiheita, minkä jälkeen tehdään kiteytys.
5 Kun keksintöä on nyt kuvattu yleisesti, se lienee helpommin ymmärrettävissä tutustumalla tiettyihin erityis-esimerkkeihin, jotka sisällytetään tähän vain valaisemis-tarkoituksessa ja joita ei ole tarkoitettu rajoittaviksi, ellei toisin mainita.
10 Esimerkit
Esimerkki 1
Bakteeeriperäi sen D-arabitoiidehydrogenaasigeenin kloonaus
Klebsiella terrigena Phpl:ä [saatu K. Haahtelalta, 15 Helsingin yliopisto, katso Haahtela et ai., Appi. Env. Microbiol. 45 (1983) 563 - 570] kasvatettiin 1 l:ssa LB-alustaa (1 % tryptonia, 0,5 % hiivauutetta, 1 % NaClta) lämpötilassa 30 °C yön yli. Bakteerisolut (noin 5 g) otettiin talteen sentrifugoimalla, pestiin kerran TE:ssä (10 20 mmol/1 tris-HCl:a, 1 mmol/1 EDTA:a, pH 7,5) ja suspendoi-tiin uudelleen TE:hen, joka sisälsi 1 %:n natriumdodekyy-lisulfaattia ja 200 pg/ml proteinaasi K:ta. Suspensiota inkuboitiin 30 minuuttia lämpötilassa 37 °C ja se uutet-tiin kerran yhtä suurella tilavuudella fenolia ja kahdesti , , 25 kloroformilla. Lisättiin natriumasetaattiliuosta (3 mol/1, / / 1/10 tilavuudesta) ja etanolia (3-kertainen tilavuus) ja • · · :·ί ; saostuneet nukleiinihapot otettiin talteen sentrifugoi- a V ' maila ja liuotettiin uudelleen 5 ml:aan TE:tä. RNA pois tettiin sentrifugoimalla liuosta NaCl-liuoksen (25 ml, 30 1 mol/1) läpi yön yli kierrostaajuudella 30 000 min"1 Beck- ·*'*: man ΤΪ50.2 -roottorissa. Edellä kuvatulla tavalla saadun • · · #.j.# K. terrigenan kromosomi-DNA:n keskimääräinen fragmenttiko ko oli yli 50 000 emäsparia (ep). DNA:ta pilkottiin sitten ;·' restriktioendonukleaasilla Sau3A valmistajan (Boehringer) : 35 puskurissa suhteen entsyymi/DNA ollessa 5 yksikköä (ky)/ 32 1 0 8 300 mg, kunnes DNA-fragmenttien keskimääräinen koko oli pienentynyt noin 5-10 ke:ksi (agaroosigeelielektroforeesin avulla arvioituna). Pilkkomistuote fraktioitiin tekemällä elektroforeesi 0,6-%risen agaroosigeelin läpi (20 x 10 x 5 0,6 cm) TBE-puskurissa (0,09 mol/1 tris-boorihappoa, 1 mmol/1 EDTAra, pH 8,3) yön yli jännitteellä 5 V/cm, leikattiin agaroosilevyyn syvennys kohtaan, joka vastasi suunnilleen fragmenttikokoa 5 ke, asetettiin dialyysiksi-vopala syvennyksen myötäisesti ja jatkettiin elektroforee-10 siä, kunnes käytännöllisesti katsoen kaikki kokoa 5 ke suuremmat DNA-fragmentit olivat adsorboituneet kalvolle. pUC19:n (ostettu Pharmacialta) plasmidi-DNA pilkottiin restriktioendonukleaasilla BamHI ja bakteeriperäisellä al-kalisella fosfataasilla käyttämällä valmistajan puskuria 15 ja reaktio-olosuhteita. Lineaarisessa muodossa oleva pUC19 puhdistettiin preparatiivisella geelielektroforeesilla käyttämällä edellä kuvattua kalvoelektroeluutiomenetelmää ja ligatoitiin Klebsiella terrigenan kromosomi-DNArn 5 -15 ke:n fraktion kanssa. Ligaatioseoksella transformoitiin 20 kompetentit E. coli SCSI -solut (ostettu Stratagenelta) ampisilliiniresistenteiksi. Tässä kokeessa saatiin noin 10 000 yhdistelmäkloonia. Tramsformaatiomaljoilta saadut yhdistetyt solut levitettiin minimialustamaljoille, jotka sisälsivät D-arabitolia (1 %) ainoana hiililähteenä. Kun . , 25 oli inkuboitu 2 vuorokautta lämpötilassa 37 °C, saatiin / / muutamia pesäkkeitä. Eristettiin plasmidi-DNA kahdesta • · · :·; «* (nopeimmin kasvavasta) kloonista ja transformoitiin niillä • tt v * uudelleen E. coli -kanta HB101, joka ei pysty kataboloi- maan D-arabitolia, mutta kykenee käyttämään D-ksyluloosia.
*.*·· 30 Kaikki transformantit osoittautuivat positiivisiksi D-ara- bitolin hyödyntämisen suhteen McConkey-agaria (Difco) ja • · · ^.j.^ D-arabitolia sisältävillä maljoilla, kun taas kaikki ver- 9 * * tailukloonit (sama kanta transformoituna pUC19:llä) olivat ; negatiivisia. Restriktioanalyysi osoitti, että kaksi eris- * '· 35 tettyä kloonia sisälsivät identtisiä plasmideja. Toista 33 1 08300 kahdesta eristetystä plasmidista (nimetty pARL2:ksi) käytettiin jatkokarakterisointiin. pARL2:een kloonatun, D-arabitolidehydrogenaasigeenin sisältävän (noin) 9,5 ke:n K. terrlgena -DNA-fragmentin restriktiokartta esitetään 5 kuviossa 1.
Esimerkki 2
Bakteeriperäisen D-arabitolidehydrogenaasigeenin ilmentäminen hiivassa
Alkuperäisestä D-arabitolidehydrogenaasigeenin si-10 sältävästä 9,5 ke:n K. terrlgena -DNA-kloonista subkloo-nattiin noin 1,8 kein Sacl-ffindlll-fragmentti käyttämällä tavanomaisia yhdistelmä-DNA-menetelmiä ja sen havaittiin sisältävän D-arabitolidehydrogenaasigeeni. Plasmidi, joka sisälsi tämän DNA-fragmentin vektorissa pUC19 (pADH, jossa 15 ADH tarkoittaa D-arabitolidehydrogenaasia), eristettiin E.
coli -kannasta JM110, pilkottiin restriktioendonukleaa-seilla Bell ja Clal ja eristettiin 1,38 ke:n DNA-fragment-ti preparatiivisella agaroosigeelielektroforeesilla. Tämä DNA-fragmentti käsiteltiin DNA-polymeraasi I:n Klenow-20 fragmentilla kaikkien neljän deoksinukleotiditrifosfaatin läsnä ollessa ja ligatoitiin hiivan iImentyrnisvektorin pAAH5 kanssa [Ammerer, Meth. Enzymol. 101 (1983) 192 - 203], joka oli pilkottu ffindlll:11a ja käsitelty Klenow-fragmentilla (kuvio 2). Tuloksena oleva ilmentymisplasmi-, , 25 di, pYARD, on E. coli - Saccharomyces cerevlslae -sukkula-
I 4 I
.· / vektori, joka sisältää bakteerista (E. coli) peräisin ole- • · * · van replikaation aloituskohdan ja ampisilliiniresistenssi- V ' geenin, hiivan (S. cerevisiae) 2 pm -DNA:sta peräisin ole van replikaation aloituskohdan ja hiivan (S. cerevlslae) 30 LE[72-geenin valikoinnin tekemiseksi hiivassa. Ilmentymis- *"kasetti sisältää hiivan alkoholidehydrogenaasi I (ADCI) y». -promoottorin ja (ADCI )-transkriptioterminaattorin K.
terrigenan D-arabitolidehydrogenaasigeenin vieressä ja ; siihen toiminnallisesti kytkeytyneinä.
34 108300
Saccharomyces cerevisiae -kantaa GRF18 (ΜΑΤα, leu2-3, 112, his3-ll,15) ja S. cerevisiae -kantaa DBY746 (ATCC 44773; ΜΑΤα, leu2-3,112 his3-Rl ura3-52 trpl-289) käytettiin kumpaakin samoin tuloksin isäntinä transfor-5 moinnin tekemiseksi edellä kuvatulla D-arabitolidehydroge-naasi-ilmentämisvektorilla pYARD. Transformointi tehtiin tavanomaisella litiumkloridimenettelyllä [Ito et ai. , Bac-teriol. 153 (1983) 163 - 160] käyttämällä pYARD:n LEU2-markkeria transformanttien valikointiin. Transformantteja 10 kasvatettiin nesteviljelmässä minimialustassa [0,67 % Yeast Nitrogen Basea ("Difco"), 2 % D-glukoosia, 100 mg/1 histidiiniä ja tryptofaania] yön yli ravistellen lämpötilassa 30 °C. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla, sus-pendoitiin hyvin pieneen tilavuuteen kaliumfosfaattipusku-15 ria (0,1 mol/1, pH 6,8), joka sisälsi 1 mmol/1 NAD*:aa, ja rikottiin 0,5 mm:n lasihelmillä Bead-jauhatuslaitteessa ("Biospec products") kuusi minuuttia jäähdyttäen jäillä. D-arabitolidehydrogenaasiaktiivisuus mitattiin edellä kuvatulla tavalla. D-arabitolilla kasvatetun K. terrigenan 20 solu-uutetta käytettiin näissä kokeissa positiivisena ver-tailunäytteenä ja pAAH5:llä transformoitua DBY746:a negatiivisena vertailunäytteenä. Taulukossa 2 esitettävät tulokset osoittavat, että K. terrigenasta eristetty D-arabi-tolidehydrogenaasigeeni ilmentyy tehokkaasti hiivassa.
,·. ; 25 .* .* Taulukko 2 • · ·
Mikrobikanta D-arabitolidehydrogenaasiaktiivisuus • t · *·' ' (valinnanvaraisina yksiköinä) ”** 30 K. terrigena Phpl 3,5 DBY746[pYARD] 1,0 .•I·. DBY746 [pAAH5] 0,00 * « t 35 1 08 300
Esimerkki 3
Hiivavektoreiden konstruointi ksylitolidehydroge-naasi- ja D-arabitoiidehydrogenaasigeenien yli-il-mentämiseksi 5 Käytettiin hiivan (Pichia stipitis) ksylitolidehyd- rogenaasia koodattavan geenin, XYL2:n, tunnettua nukleoti-disekvenssiä [Kötter et ai., Curr. Genet. 18 (1990) 493 -500] oligonukleotidien syntetisointiin polymeraasiketjureaktiolla tämän geenin kloonaamista varten. Suunniteltiin 10 kaksi oligonukleotidia CGAATTCTAGACCACCCTAAGTCGTCCC (5’-oligonukleotidi) [SEQ ID No:l:] ja TTCAAGAATTCAAGAAACTCA-CGTGATGC (3'-oligonukleotidi) [SEQ ID No:2:] kätevien re-striktiokohtien XJbal ja EcoRI sisällyttämiseksi PCR-tuotteen 5'- ja 3'-päihin. 51-oligonukleotidi pariutuu XYL2:n 15 asemiin 1 - 24 ja 3'-oligonukleotidi pariutuu asemiin 1531 - 1560 noudatettaessa julkaisussa Kötter et ai.,
Curr. Genet. 18 (1990) 493 - 500 käytettyä numerointia.
Pichia stipitis CBS6054:ää (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, PO Box 273, 3780 AG
20 Baarn, Alankomaat) kasvatettiin yön yli YEPD-alustassa (1 % hiivauutetta, 2 % peptonia, 2 % D-glukoosia), otettiin solut talteen sentrifugoimalla, pestiin ne kerran sorbitoliliuoksella (1 mol/1), joka sisälsi 1 mmol/1 EDTA:a ja jonka pH oli 7,5, suspendoitiin uudelleen samaan , , 25 liuokseen ja pilkottiin Lyticasella (Sigma). Pilkkomista
« ( I
/ / kontrolloitiin seuraamalla suhteessa 1:100 l-%:isella SDS- • · · ··♦; liuoksella laimennetun solususpension optista tiheyttä « · · V 1 aallonpituudella 600 nm. Pilkonta keskeytettiin, kun tämä arvo laski noin seitsemäsosaan alkuperäisestä. Sferoplas-”* * 30 tisuspensio pestiin sitten neljästi sorbitoliliuoksella • (1 mol/1). Sferoplastit hajotettiin l-%:isessa SDS-liuok- y..' sessa ja käsiteltiin liuoksella, joka sisälsi 200 pg/ml proteinaasi K:ta, 30 minuuttia lämpötilassa 37 °C. Yhden ·;’ fenoli- ja kahden kloroformiuuton jälkeen nukleiinihapot ; 35 seostettiin etanolilla ja liuotettiin uudelleen pieneen 36 1 08300 tilavuuteen TE-puskuria. Kromosomi-DNA:n yhtenäisyys tarkistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. DNA-fragmenttien keskimääräinen koko oli yli 50 ke. PCR toteutettiin käyttämällä Taq-DNA-polymeraasia (Boehringer) valmistajan 5 puskurissa. Lämpösykli oli 93 °C, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 °C, 60 s. PCR-tuote uutettiin kloroformilla, seostettiin etanolilla ja pilkottiin EcoRI:llä ja Xbalillä tavanomaisissa olosuhteissa. Agaroosigeelipuhdistuksen jälkeen DNA-fragmentti kloonattiin Xbalillä ja EcoRIillä pilkot-10 tuun pUC18:aan [plasmidi pUC(XYL2)]. Tämän jälkeen tehty restriktioanalyysi vahvisti, että kloonatun fragmentin re-striktiokartta vastaa P. stipitisin XYL2-geenin nukleoti-disekvenssiä.
Hiivaplasmideja D-arabitolidehydrogenaasin ja ksy-15 litolidehydrogenaasin yli-ilmentämiseksi konstruoitiin kuvioiden 3 ja 4 valaisemalla tavalla. Plasmidin pYARD D-arabitoiidehydrogenaasi-iImentyrniskasettia reunustavien restriktiokohtien muuttamiseksi poistettiin koko kasetti pilkkomalla BamHIillä ja kloonattiin se BamHIillä leikat-20 tuun pUC18:aan. Tuloksena oleva plasmidi pUC(YARD) pilkottiin Sällillä ja EcoRI:llä ja eristettiin ainoa 2,0 ke:n DNA-fragmentti preparatiivisella geelielektroforeesilla. Tämä fragmentti ligatoitiin plasmidista pUC(XYL2) eris-' tetyn 1,6 ke: n HindIII-EcoRI-DNA-fragmentin kanssa ja , , 25 ffindlllilla ja Sällillä pilkotun E. coli - hiiva -sukkula- / / vektorin pJDB207 [Beggs, J. D., Nature 275 (1978) 104 - • * · : 109] 6,6 ke:n fragmentin kanssa. Plasmidi pJDB(AX)-16 • · · *·* ’ eristettiin sen jälkeen, kun E. coli oli transformoitu edellä kuvatulla ligaatioseoksella. Tällä plasmidilla on 30 kyky replikoitua sekä E. colissa että Saccharomyces cere- • ’[: visiaessa. S. cerevisiaessa se ohjaa sekä D-arabitolide- hydrogenaasin että ksylitolidehydrogenaasin voimakasta synteesiä. Plasmidi pSRT(AX)-9 syntetisoitiin ligatoimalla plasmidista pJDB(AX)-9 peräisin oleva 4,7 ke:n Sall-frag-: ’·· 35 mentti ja plasmidin pSRT303D [Jearnpipatkul et ai., Mol.
37 108300
Gen. Genet. 206 (1987) 88 - 84] lineaarinen muoto, joka oli saatu hydrolysoimalla osittain Sällillä.
Esimerkki 4
Ksylitolia erittävien hiivakantojen konstruointi 5 Zygosaccharomyces rouxii ATCC 13356 transformoitiin plasmidilla pSRT(AX)-9 muuntamalla hieman aiemmin kuvattua menetelmää [Ushio, K. et ai. J. Ferment. Technol. 66 (1988) 481 - 488]. Lyhyesti esitettynä Z. rouxii -soluja kasvatettiin yön yli YEPD-alustassa (jolloin tuloksena oli 10 viljelmä, jonka optinen tiheys aallonpituudella 400 nm oli 3 - 5), otettiin solut talteen sentrifugoimalla pienellä nopeudella, pestiin ne kahdesti liuoksella, joka sisälsi 1 mol/1 sorbitolia ja 1 mmol/1 EDTA:a ja jonka pH oli 7,5, suspendoitiin uudelleen 1/5:aan viljelmän alkuperäisestä 15 tilavuudesta samaa liuosta, joka sisälsi 1 %:n 2-merkapto-etanolia, ja pilkottiin huoneenlämpötilassa Lyticasella (Sigma). Pilkontaa seurattiin laimentamalla sopiva annos solususpensiota l-%:isella SDS-liuoksella ja mittaamalla laimennetun näytteen optinen tiheys aallonpituudella 20 600 nm. Kun tämä arvo laski seitsemäsosaan alkuperäisestä, pilkonta keskeytettiin jäähdyttämällä suspensio jäillä ja pesemällä (sentrifugointi 10 minuuttia lämpötilassa 0 °C kierrostaajudella 1 000 min'1) sorbitoliliuoksella, kunnes merkaptoetanolin hajua ei enää ollut havaittavissa. Sfero-, , 25 plastit pestiin kerran kylmällä liuoksella, joka sisälsi *· / 0,3 mol/1 kalsiumkloridia ja 1 mol/1 sorbitolia, ja sus- • · · ··- · pendoitiin uudelleen samaan liuokseen, jota käytettiin • « « V 1 noin 1/4 viljelmän alkuperäisestä tilavuudesta. Sekoitettiin 200 μ1:η annoksia tätä suspensiota ja 10 - 20 pg *:**? 30 plasmidi-DNA:ta ja inkuboitiin 40 minuuttia lämpötilassa ·'**; 0 °C. Lisättiin sferoplastisuspensioon 0,8 ml jääkylmää • · · 50-%:ista PEG 6000 -liuosta, joka sisälsi 0,3 mol/1 kai- • · · siumkloridia, ja jatkettiin inkubointia kylmässä 1 tunti. ·;·' Sferoplastit konsentroitiin sentrifugoimalla 10 minuuttia : 35 kierrostaaj uudella 4 000 min'1 pöytäsentrifugissa, sus- 38 1 08 300 pendoitiin ne uudelleen 2 mitään YEPDttä, joka sisälsi 1 mol/1 sorbitolia, ja jätettiin regeneroitumaan yön yli huoneenlämpötilassa. Regeneroituneet solut siirrostettiin YEPD-maljoille, jotka sisälsivät 50 - 100 pg/ml gentami-5 siinia, ja inkuboitiin 4-6 vuorokautta lämpötilassa 30 °C.
Transformantteja kasvatettiin nestemäisessä YEPD-alustassa, valmistettiin solu-uutteet S. cerevisiaen yhteydessä kuvatulla tavalla (esimerkki 2), ja mitattiin 10 D-arabitolidehydrogenaasi- ja ksylitolidehydrogenaasiak- tiivisuudet. Näiden mittausten tuloksia verrataan muilla organismeilla tehtyjen vastaavien mittausten tuloksiin taulukossa 3. Ne osoittavat, että kumpikin geeni ilmentyi tehokkaasti Z. rouxiissa.
15 pSRT(AX)-9:llä transformoituja Z. rouxii ATCC 13356 -soluja kasvetattiin kaksi vuorokautta 50 mlrssa YEPD-alustaa, joka sisälsi 50 pg/ml gentamisiinia, otettiin solut talteen sentrifugoimalla ja inokuloitiin niillä 100 ml YEPD:tä, joka sisälsi 25 paino-% glukoosia ja 50 pg/ml 20 gentamisiinia. Tätä viljelmää kasvatettiin 1 000 ml:n pullossa pyöröravistimella (200 min'1) lämpötilassa 30 °C. Yhdessä toisessa kokeessa (koe 2) käytettiin samaa alustaa ilman hiivauutetta (vähäfosfaattinen alusta). Analysoitiin viljelmäliemen ksylitolisisältö tavanomaisella HPLC- ja . . 25 kaasukromatografialla. Tulokset esitetään taulukossa 4.
” Samassa alustassa (ilman gentamisiinia) kasvatetun trans- • · · ! formoimattoman Z. rouxlin kasvualustassa ei havaittu ksy- • · · ' litolia. 1 « ♦ · · • · ««» « ««· • ♦ · • « « 39 1 08300
Taulukko 3 D-arabitolidehydrogenaasi- ja ksylitolidehydrogenaasi-aktiivisuudet erilaisissa organismeissa ja kannoissa 5 Organismi ja kanta Plasnidi(1) D-arabitolidehydrogenaasi Ksylitolidehydrogenaasi (ky/mg proteiinia) (ky/«g proteiinia)
Klebsiella terri- Ei plasmidia 0,48 ND.(2) gena Phpl 10 s. cerevlsiae Ei plasmidia 0,00 <0,01 DBY746 S. eerevlsiae pJDB(YARD) 3.0 <0,01 DBY746 S. eerevlslae pJDB(AX)-16 1.9 1,2 15 DBY746 Z. rouxii Ei plasmidia 0,00 <0,02 ATCC 13356 Z. rouxi 1 pSRT(AX)-9 1,3 0,7 ATCC 13356 20 (1) Plasmidit on suunniteltu ilmentämään seuraavia entsyymejä: pJDB(YARD) - D-arabitolidehydrogenaasi pJDB(AX)-16 - D-arabitolidehydrogenaasi ja ksylitolidehydrogenaasi pSRT(AX)-9 - D-arabitolidehydrogenaasi ja ksylitolidehydrogenaasi 25 (★1) ND - ei määritetty
Taulukko 4
Plasmidin pSRT(AX)-9 sisältävän Z. rouxii ATCC 13356:n ksylitolituotanto (g/1) . . 30 Viljelyaika (h) Koe 1 Koe 2 « · · ’· 1· Alustassa Alustassa ei • φ ♦ · · ί·1 : hiivauutetta hiivauutetta ··« ♦ · · ♦ ♦ · ♦ ______ 0 0,0 0,0 *:··: 35 48 7,7 0,5 144 7,5 6,1 • « · · · 2 • · 1 Käyttämällä samanlaista lähestymistapaa voidaan konstruoida kantoja, jotka tuottavat ksylitolia muista : ·.. 40 hiililähteistä. Candida tropicalis pystyy esimerkiksi 40 108300 muuttamaan n-alkaaneja D-arabitoliksi hyvällä saannolla [Hattori, K. ja Suzuki, T., Agric. Biol. Chem. 38 (1974) 1875 - 1881]. Plasmidista pJDB(AX)-9 peräisin oleva 4,7 ke: n Sall-fragmentti voidaan insertoida plasmidiin pCUl 5 [Haas, L. et ai., J. Bacteriol. 172 (1990) 4571 - 4577] ja käyttää C. tropicalis -kannan SU-2 (ura3) transformoin-tiin. Samalla ilmentymiskasetilla voidaan vaihtoehtoisesti transformoida prototrooppinen C. tropicalis käyttämällä kuljettajana plasmidivektoria, jolla on dominoiva vali-10 kointimarkkeri.
Esimerkki 5
Integroituvan dominoivan valikointivektorin konstruointi arabi tolidehydrogenaasin ja ksylitolide-hydrogenaasin ilmentämiseksi ja Toxulopsis candi-15 dan transformoimiseksi
Kromosomi-DNA eristettiin T. candidasta (ATCC 20214) S. cerevisiaelle käytetyn tavanomaisen menettelyn kaltaisella menettelyllä. T. Candida -sferoplastien preparointi vaati kuitenkin korkeaa Lyticase (Sigma) -pitoi-20 suutta, noin 50 000 ky/10 g soluja, ja pitkää inkubointi-aikaa, muutamasta tunnista yön yli kestävään inkubointiin huoneenlämpötilassa, soluseinämien tehokkaan hajotuksen ,aikaansaamiseksi. Sferoplastien preparointiin käytetty pus-,,, · kuri oli EDTA-puskuri (1 mmol/1, pH 8), joka sisälsi . . 25 1 mol/1 sorbitolia ja 1 %:n merkaptoetanolia. Sferoplastit • « t ♦ *» .*.· pestiin kolmesti samalla puskurilla (ilman merkaptoetano- • · · lia) ja hajotettiin 15 ml:ssa l-%:ista SDS-liuosta. Tehtiin « φ · *·* * kaksi fenoliuuttoa välittömästi solujen hajotuksen jälkeen ja DNA saostettiin lisäämällä kaksinkertainen tilavuus *!**! 30 etanolia ja sentrifugoimalla (5 minuuttia kierrostaajuu- ·***; della 10 000 min"1). DNA pestiin kahdesti 70-prosent- y.. tisella etanolilla ja kuivattiin alipaineessa. DNA liuo- * * * tettiin 5 ml: aan tris-HCl-puskuria (10 mmol/1), joka si-saisi 1 mmol/1 EDTA:a, lisättiin RNAaasi A:ta pitoisuudek-. 35 si 10 pg/ml ja inkuboitiin liuosta 1 tunti lämpötilassa 41 1 08300 37 °C. DNA:n yhtenäisyys varmistettiin agaroosigeelielekt-roforeesilla käyttämällä pilkkomatonta lambda-DNA:ta moo-limassareferenssinä.
200 pg T. candidan kromosomi-DNA:ta pilkottiin 5 iiindlll: 11a ja EcoRI:llä, laitettiin pilkontatuote 6 cm:n levyiseen syvennykseen 0,7-%:iselle preparatiiviselle aga-roosigeelille (8 x 15 x 0,8 cm) ja tehtiin elektroforeet-tinen erotus. Geelistä leikattiin irti 1 cm:n levyinen liuska ja siirrettiin se positiivisesti varautuneelle nai-10 lonkalvolle (Boehringer 1209 299). Siirretyille fragmenteille käytettiin koettimena 10 ke:n Zygosaccharomyces bailii -rDNA-fragmenttia, joka oli irrotettu Sällillä plasmidista pAT68 [K. Sugihara et ai., Agric. Biol. Chem. 50(6) (1986) 1503 - 151]. Koetin leimattiin ja täplät ke-15 hitettiin käyttämällä DIG DNA Labeling and Detection Kit -välineistöä (Boehringer 1093 657) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Havaittiin kolme hybridisaatiovyöhykettä, jotka vastasivat DNA-fragmentteja, joiden koko oli noin 4,5, 2,7 ja 1,1 ke. Käyttämällä siirrettyjä fragmentteja refe-20 renssinä leikattiin suurinta (4,5 ke) hybridisoituvaa DNA-fragmenttia vastaava vyöhyke irti preparatiivisesta geelistä, elektroeluoitiin DNA ja ligatoitiin se EcoRI:llä ja HindHI: 11a pilkotun pUC19:n kanssa.
Ligaatioseos käytettiin E. colin transformointiin.
. , 25 Transformoidut bakteerit siirrostettiin varautuneelle nai-« · » / / lonkalvolle (Bio-Rad 162-0164), joka oli ampisilliinipi- • * » : toista LB-alustaa sisältävän maljan agarpinnalla. Kun oli V ; inkuboitu 24 tuntia lämpötilassa 37 °C, kalvoa nostettiin ja hajotettiin bakteeripesäkkeet in situ valmistajan oh-*:··: 30 jeiden mukaisesti. Replikamaljoja ei tarvittu, sillä E.
coli läpäisee tämäntyyppisen kalvon, ja suodattimen nosta- * · · .1.^ misen jälkeen agarpinnalla on nähtävissä jälki jokaisesta « · « bakteeripesäkkeestä. Kalvo tutkittiin samalla Z. bailii « · -rDNA-fragmenttikoettimella ja käyttämällä samaa DIG-de-... 35 tektointivälineistöä kuin edellä. Identifioitiin joukko 42 1 08300 positiivisia klooneja (noin 2 - 5 % kaikista klooneista). 8 hybridisaation suhteen positiivisesta kloonista ja 4 hybridisaation suhteen negatiivisesta kloonista valmistetuille plasmidiminipreparaateille tehtiin restriktioana-5 lyysi käyttämällä BcoRIrn, HindiII:n ja EcoRV:n seosta. Kaikki hybridisaation suhteen positiiviset kloonit antoivat tulokseksi identtisen restriktiofragmenttimallin (karakteristiset fragmentit 0,55 ja 1,5 ke), kun taas hybridisaation suhteen negatiivisten kloonien samat mallit oli-10 vat kaikki erilaisia. Yhden hybridisaation suhteen positiivisen kloonin plasmidi-DNA eristettiin preparatiivises-sa mitassa ja nimettiin pTCrDNA:ksi. Pääteltiin, että kloonattu pala oli 27. Candida -rDNA-fragmentti, koska 1) se hybridisoitui voimakkaasti Z. hailiin rDNA:n kanssa ja 15 2) se kloonattiin osittain rikastetusta T. Candida -kromo- somi-DNA-pilkkomistuotteesta, jossa esiintymistiheys on suuri (hiivassa tiedetään olevan noin 100 rDNA-kopiota). Kloonatun DNA-fragmentin osittainen restikriokartta esitetään kuviossa 5.
20 Plasmidi, jossa T. candidan rDNA-fragmentti yhdis tyy dominoivaan valikointimarkkeriin, konstruoitiin seuraavasti. Plasmidi pYT332 [Gatignol, A. et ai., Gene 91 (1990) 35 - 41] pilkottiin HindIII:lla ja Kpnl:llä, eristettiin 1,3 ke:n DNA-fragmentti agaroosigeelielektroforee- , , 25 silla ja ligatoitiin se EcoRI:llä ja Kpnl:llä pilkotusta « · « *· I* pUC19:stä saadun 4,5 ke:n Hindlll-EcoRl-fragmentin kanssa • · · ί·ί ί (kuvio 6). Ligaatioseoksella transformoitiin E. coli ja « · · V * identifioitiin plasmidin pTC(PHLE) sisältävä klooni rest- riktioanalyysillä.
30 pTC(PHLE) pilkottiin osittain Sällillä ja lineaari- ·**': sessa muodossa oleva plasmidi puhdistettiin agaroosigeeli- • « « .1. elektroforeesilla. Se ligatoitiin pJDB(AX)-16:sta (esi- • · < merkki 2) eristetyn 5 ke:n Sali-fragmentin kanssa. Identifioitiin plasmidi pTC(AX) niiden kloonien joukosta, jotka ; 35 saatiin transformoimalla tällä ligaatioseoksella E. coli 43 108300 (kuvio 6). Tämä plasmidi sisältää seuraavat toiminnalliset elementit: a) hiivan promoottorin ja transkriptioterminaatto-rin ohjauksessa oleva bakteeriperäinen fleomysiiniresis- 5 tenssigeeni, joka mahdollistaa tällä plasmidilla transformoituneiden hiivasolujen suoran valikoinnin; b) pala T. Candida -rDNA:ta, joka tarjoaa kohteen homologiselle rekombinaatiolle T. Candida -kromosomin kanssa ja parantaa transformaation tehokkuutta; 10 c) arabitolidehydrogenaasi- ja ksylitolidehydroge- naasigeenien ilmentymiskasetti, joka saa aikaan näiden kahden arabitoli-ksylitolitien entsyymin synteesin. Esimerkki 6 T. candidan transformointi ja ksylitolituotannon 15 analysointi Käytettiin plasmidia pTC(AX) Torulopsis Candida -kannan ATCC 20214 transformointiin. T. candidaa kasvatettiin 36 tuntia YEPD-alustassa, joka sisälsi 10 % glukoosia. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla (10 minuuttia 20 kierrostaajuudella 2 000 min'1 lämpötilassa 4 °C) ja pes tiin kolmesti steriilillä sorbitoliliuoksella (1 mol/1). Solupelletti suspendoitiin yhtä suureen tilavuuteen kylmää .·, sorbitoliliuosta (1 mol/1), sekoitettiin 200 μ1:η annoksia pUT(AX)-DNA:n (20 - 100 yg) kanssa, siirrettiin seos sit-
* I
, , 25 ten jääkylmiin elektroporaatiokyvetteihin (elektrodiväli • « « .* / 2 mm) ja tehtiin elektroporaatio Invitrogen ElectroPorator ··· : -laitteessa seuraavin asetuksin: jännite 1 800 V, kapasi- V : tanssi 50 yF, rinnakkaisvastus 150 Ω. Solut siirrettiin 2 ml:aan YEPD:tä, joka sisälsi 1 mol/1 sorbitolia, ja in-30 kuboitiin yön yli lämpötilassa 30 °C ravistimella. Trans-•"’ί formoidut solut otettiin talteen sentrifugoimalla pienellä nopeudella ja siirrostettiin maljoille, jotka sisälsivät « · * pH-arvoon 7,5 säädettyä YEPD-alustaa, joka sisälsi 30 yg/
* I
ml fleomysiiniä. Maljoja inkuboitiin 7-10 vuorokautta • 35 lämpötilassa 30 °C. Suurin osa tänä aikana kehittyneistä < r r 44 108300 hiivapesäkkeistä oli taustamutantteja, sillä yhtä suuri määrä pesäkkeitä ilmaantui myös vertailumaljoille (jotka sisältävät samalla tavalla, mutta ilman DNA-lisäystä, käsiteltyjä soluja). Todellisten transformanttien erottami-5 seksi spontaaneista mutanteista eristettiin kromosomi-DNA 72 yksittäisestä hiivapesäkkeestä pienemmässä mitassa toteutetulla edellä kuvatun kaltaisella menettelyllä T. can-didan kromosomi-DNA:n eristämiseksi. 10 pg kutakin näistä DNA-preparaateista pilkottiin EcoRI:n ja BamHI:n seoksel-10 la. Pilkontatuotteet erotettiin l-%:isillä agaroosigee-leillä ja siirrettiin sitten positiivisesti varautuneelle nailonkalvolle esimerkissä 5 kuvatulla tavalla. Siirretyt fragmentit tutkittiin käyttämällä koettimena plasmidista pADH (esimerkki 2) saatua DNA:ta, joka sisältää arabitoli-15 dehydrogenaasisekvenssejä ja pUC-sekvenssejä muttei hiiva-peräisiä DNA-fragmentteja (mahdollisten homologisten hii-vasekvenssien välisen hybridisaation välttämiseksi). Koetin leimattiin ja täplät kehitettiin käyttämällä DIG DNA Labeling and Detection Kit -välineistöä (Boehringer 1093 20 657). Löydettiin vain yksi klooni [Γ. Candida::pTC(AX)], jonka hybridisaatiosignaali sopi yhteen transformoivan plasmidin rakenteen kanssa (kolme vyöhykettä alueella 2 - .3 ke), mikä osoittaa hyvin alhaisen transformointitehok-kuuden. Yhden muun kloonin kohdalla havaittiin positiivi-..: 25 nen hybridisaatiosignaali; ainoan hybridisoituvan vyöhyk- ,·. : keen sijainti (noin 5 - 7 ke) osoitti kuitenkin, että joko » · · : ,·* hiivan kromosomiin on integroitunut vain yksi pTC(AX)- fragmentti tai integroitumiskohdassa on tapahtunut jonkin * t » ‘ verran uudelleenjärjestymistä. Otaksuimme, että plasmidi 30 on integroitunut T. candidan kromosomiin. Tämä otaksuma • · · · l ' ‘ sopii yhteen sen havainnon kanssa, että ei-selektiivisellä ...· alustalla tehdyn kasvatuksen ja kloonauksen jälkeen kai- kissa T. Candida::pTC(AX) -klooneissa on jäljellä fleomy-, siinille resistentti fenotyyppi.
45 108300 T. Candida::pTC(AX) -transformanttia kasvatettiin 36 tuntia YEPD-alustassa, joka sisälsi 10 % glukoosia, ja mitattiin arabitolidehydrogenaasi- ja ksylitolidehydroge-naasiaktiivisuudet esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Tulok-5 set esitetään taulukossa 5.
Taulukko 5
Arabitolidehydrogenaasi- ja ksylitolidehydrogenaasi-aktiivisuudet villiä tyyppiä olevassa T. candidassa ja 10 pTC(AX):llä transformoidussa kannassa (ky/mg proteiinia) T. Candida Arabitoli- Ksylitoli- dehydrogenaasi dehydrogenaasi 15 Villi tyyppi 0,02 0,03
Transformantti 0,03 0,05
Ksylitolidehydrogenaasiaktiivisuus ei ollut kohonnut merkittävästi endogeenisen T. Candida -ksylitolidehyd-20 rogenaasin aktiivisuustason yläpuolelle. Plasmidin koodit- taman arabitolidehydrogenaasin aktiivisuutta (EC 1.1.1.11) oli vaikea erottaa endogeenisen synonyymisen mutta erilai-sen (ribuloosia muodostavan, EC 1.1.1) arabitolidehydrogenaasin aktiivisuudesta. Ainoa luotettava johtopäätös 25 tästä kokeesta oli, että kummankin entsyymin ilmentymis- « < .·. ; taso oli paljon alempi kuin Z. rouxiissa. Yritykset lisä- • · · .* .* tä plasmidin kopiolukua ja integroidun plasmidin kahden • · · dehydrogenaasin ilmentymistasoa viljelemällä T. candi- • · < * ’ da::pTC(AX):ää alustoilla, joissa fleomysiinipitoisuudet 30 kasvoivat, eivät onnistuneet.
' * ‘ T. Candida: :pTC(AX) :n ksylitolituotanto testattiin, • · · kun sitä oli kasvatettu 10 % glukoosia sisältävällä YEPD:llä 5-7 vuorokautta. Kolmessa erillisessä kokeessa
< · I
,··, transformantti tuotti 1,1, 1,6 ja 0,9 g/1 ksylitolia, kun 35 taas villin tyypin T. candidan kasvualustassa ei havaittu 46 1 08300 HPLCsllä ollenkaan ksylitolia. Käyttämämme analyysimenetelmän havaitsemisraja on alle 0,1 g/1. Siksi on mahdollista päätellä, että plasmidi on todella määräävä tekijä T. Candida::pTC(AX):n ksylitolituotannossa.
5 Esimerkki 7
Candida polymorphan transformointi arabitolidehyd-rogenaasi- ja ksylitolidehydrogenaasigeeneillä
Arabitolidehydrogenaasi- ja ksylitolidehydrogenaa-sigeenien viemiseksi Candida polymorphaan eristettiin mu-10 tantti, jossa oli muutos orotidiinifosfaattidekarboksylaa-sigeenissä (jäljempänä käytetään myös merkintää URA3), käyttämällä Boeken et ai. menetelmän muunnosta [Boeke, J.
D. et ai., Mol. Gen. Genet. 197 (1984) 345 - 346]. C. polymorpha -kantaa ATCC 20213 kasvatettiin 24 tuntia 15 YEPDsssä, otettiin solut talteen sentrifugoimalla (2 000 min'1, 10 min), pestiin ne kahdesti vedellä ja suspendoi-tiin kolminkertaiseen tilavuuteen steriiliä natriumfos-faattipuskuria (0,1 mol/1, pH 7,0). Lisättiin etyylimetaa-nisulfonaattia pitoisuudeksi 1 % ja soluja inkuboitiin 2 20 tuntia huoneenlämpötilassa. Reaktio keskeytettiin siirtämällä solut natriumtiosulfaattiliuokseen (0,1 mol/1) ja pesemällä kolmesti steriilillä vedellä. Mutagenisoidut solut siirrettiin 0,5 l:aan YEPDstä ja viljeltiin lämpötilassa 30 °C ravistellen kaksi vuorokautta. Hiiva otettiin 25 talteen sentrifugoimalla, pestiin kahdesti vedellä ja siirrettiin 1 Isaan alustaa, joka sisälsi 0,7 % Yeast Ni- • · : trogen Basea (Difco), 2 % glukoosia (SC-alusta), ja inku- ♦ * · boitiin pyöröravistimella 24 tuntia lämpötilassa 30 °C.
• « <
Viljelmään lisättiin 1 mg nystatiinia ja jatkettiin inku-30 bointia 4 tuntia. Nystatiinilla käsitellyt solut erotettiin alustasta sentrifugoimalla, pestiin kahdesti vedellä • « ·..* ja siirrettiin 1 Isaan SC-alustaa, joka sisälsi 50 mg/1 : urasiilia. Soluja inkuboitiin pyöröravistimella 5 vuoro- kautta ja siirrostettiin ne sitten SC-alustalle, joka si-35 sälsi 50 mg/1 urasiilia ja 1 g/1 fluorioroottihappoa. Kun 47 108300 maljoja oli inkuboitu kaksi viikkoa lämpötilassa 30 °C, saatiin noin 400 fluorioroottihapolle resistenttiä pesäkettä ja ne kaikki testattiin urasiiliauksotrofian suhteen. Eristettiin 5 urasiilista riippuvaista pesäkettä.
5 Kolme kloonia kasvoi kuitenkin urasiilittomalla alustalla, vaikkakin pienentyneellä nopeudella. Kaksi kloonia (nimetty C. polymorpha U-2:ksi ja C. polymorpha U-5:ksi), joilla oli selvä urasiilista riippuvainen fenotyyppi, käytettiin transformointikokeisiin.
10 C. polymorphan URA3-geenin kloonaus saatiin aikaan tavanomaisella strategialla. Kromosomi-DNA eristettiin esimerkissä 5 kuvatulla menetelmällä. DNA pilkottiin osittain Sau3A:lla ja fraktioitiin agaroosigeeleillä. Otettiin talteen muutamia fraktioita ja tarkistettiin niiden mooli-15 massajakautuma analyyttisellä geelielektroforeesilla.
Kloonauskokeisiin käytettiin kokoalueella 5 - 10 ke olevia fraktioita. Kirjaston konstruointiin käytetty vektori, pYEpl3 [Broach et ai., Gene 8 (1979) 121 - 123], sisältää S. cerevisiaen LEY2-geenin, 2 μ:η replikaation aloituskoh-20 dan ja yhden ainutkertaisen restriktiokohdan BamHI:ä varten. Vektori leikattiin BamHlrllä, puhdistettiin agaroosi-geelielektroforeesilla ja defosforyloitiin bakteeriperäi-sellä alkalisella fosfataasilla. Testattiin muutamia riippumattomia vektoripreparaatteja ja ligaatio-olosuhteita 25 vaihdellen vektorin suhdetta inserttiin ja reaktiotila- ... . vuutta pienimittaisissa kokeissa suurimman transformantti- * · · ,* .* määrän ja yhdistelmäkloonien suurimman prosenttiosuuden * « i saavuttamiseksi (analyysit tehtiin sattumanvaraisista klooneista saatujen minipreparaattien restriktioanalyysil-30 lä). Laajamittaiset ligaatiot tehtiin käyttämällä optimoi-'**"· tuja olosuhteita ja transformoitiin E. coli -kanta XL1- BLUE. Konstruoitu kirjasto sisälsi noin 15 000 primaarista transformanttia, joista noin 90 % sisälsi insertin.
(··.( Hiivakanta DBY746 (MATalpha, leu2-3,112, his3-Al, 35 trpl-289, ura3-52) transformoitiin C. polymorpha -geeni- 48 108300 kirjastolla. Kullakin kirjastojoukolla transformoitiin erikseen S. cerevisiae käyttämällä noin 20 pg plasmidi-DNA:ta ja siirrostamalla transformaatioseos yhdelle maljalle, jota oli täydennetty urasiililla, tryptofaanilla ja 5 histidiinillä (ts. käyttämällä vain leusiinivalikointia). Saatiin 3 000 - 10 000 hiivatransformanttia maljaa kohden. Hiivatransformantit replikasiirrostettiin maljoille, joissa oli tryptofaanilla ja histidiinillä täydennettyä mini-mialustaa (urasiilittomat maljat). Vertailureplikaviljel-10 mät histidiini-histidiinimaljoilla (urasiilittomat maljat). Tehtiin myös vertailureplikasiirrostukset histidii-nittömille ja tryptofaanittomille maljoille. Lähes jokaisella maljalla esiintyi 1-4 urasiilista riippumatonta kloonia. Saatiin myös histidiinistä riippumattomia ja 15 tryptofäänistä riippumattomia eristettyjä klooneja; niiden lukumäärä oli kuitenkin 2-3 kertaa pienempi kuin eristettyjen URA3-kloonien.
Kuudesta urasiilista riippumattomasta kloonista pelastettiin plasmidit E. coliin, tehtiin eristys prepara-20 tiivisessa mitassa ja transformoitiin uudelleen DBY746 leusiinin suhteen prototrofiseksi. Kustakin transformaa-tioseoksesta tarkistettiin sitten 10 - 20 sattumanvaraista pesäkettä urasiiliriippuvuuden suhteen. Viisi kuudesta pelastetusta plasmidista transformoi DBY746:n Leu* Ura* 25 -fenotyypiksi. Mainittujen viiden plasmidin restriktio- . analyysi antoi tulokseksi hyvin samanlaisia restriktio- • ·♦ .* .* malleja. Nämä mallit olivat liian monimutkaisia kloona- • · * • « · ***/ tun fragmentin yksiselitteisen restriktiokartan aikaan- « · f '·* 1 saamiseksi. Havaittiin kuitenkin, että ffindlll-pilkonta 30 synnyttää kaikissa klooneissa fragmentin, joka kattaa suu- ’·"· rimman osan DNA-insertistä (noin 4,5 ke). Yhdestä eriste- • · · *...ς tystä C. polymorpha URA3 -kloonista - pCP291:stä - saatu « tällainen fragmentti puhdistettiin agaroosigeelielektro-foreesilla ja subkloonattiin HindIII:lla osittain pilkot- '108300 49 tuun pJDB(ΑΧ):ään. Tämän kloonauskokeen tuloksena eristetyn plasmidin pCPU(AX) rakenne esitetään kuviossa 7A.
Yritettiin transformoida sekä C. polymorpha U-2 että C. polymorpha U-5 käyttämällä esimerkissä 6 kuvattu-5 ja elektroporaatio-olosuhteita. Kun elektroporaatiokäsi- teltyjä soluja oli ravisteltu yön yli YEPDissä, joka sisälsi 1 mol/1 sorbitolia, ne siirrostettiin SC-alustamal-joille. Kun oli inkuboitu 10 vuorokautta lämpötilassa 30 °C, havaittiin noin 100 pesäkettä maljalla, joka sisäl-10 si pCPU(AX):llä transformoitua C. polymorpha U-2:a, kun taas vertailumaljalla (sisälsi samalla tavalla, mutta ilman lisättyä DNA:ta käsiteltyjä tämän kannan soluja) pesäkkeiden lukumäärä oli vain 14. C. polymorpha U-5:llä ei saatu merkittävää vaikutusta transformaatiokokeessa 15 DNA:ttomaan vertailunäytteeseen verrattuna. Siirrostettiin sivelymenetelmällä kolme sattumanvaraista pesäkettä C. polymorpha U-2 -transformaatiomaljalta ensin tuoreelle SC-alustamaljalle ja inokuloitiin näillä sivelyviljelmillä YEPD-kasvualustat, jotka sisälsivät 15 % glukoosia. Ver-20 tailuviljelmä inokuloitiin C. polymorpha U-2:11a. Kun oli inkuboitu pyöröravistimella (200 min-1) lämpötilassa 30 °C 10 vuorokautta, analysoitiin kasvualusta HPLC:llä. Tämän : : kokeen tulokset esitetään taulukossa 6.
25 Taulukko 6 .·. : pCPU(AX);llä transformoidun C. polymorpha U-2:n • · · ; >·< ksylitolituotanto
• ♦ I
··♦ < ·♦ « * · · * Kanta Ksylitoli (mg/ml) 30
• - -M — " I — - - .... I
4 C. polymorpha U-2 0,0 • · · ...: C. polymorpha U-2: :pCPU(AX)-l 0,5 C. polymorpha U-2: :pCPU(AX)-2 0,0 .··*. C. polymorpha U-2: :pCPU(AX)-3 2,1 50 108300
Havaittiin huomattavaa ksylitolin tuotantotason vaihtelua eri kloonien välillä. Se voi olla seurausta plasmidin pCPU(AX) integroitumisesta C. polymorphan kromosomin eri lokuksiin. Kanta C. polymorpha U-2::pCPU(AX)-2 5 on todennäköisesti revertantti eikä todellinen transfor-mantti. Nämä kokeet osoittivat kuitenkin selvästi, että arabitoli-ksylitolitie voidaan tuoda myös C. polymorphaan.
Esimerkki 8
Oksidatiivisen pentoosifosfaattitien entsyymien 10 kloonaaminen ja niiden yli-ilmentäminen osmofiili- sessa hiivassa
Oksidatiivisen pentoosifosfaattitien ensimmäistä entsyymiä, D-glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasia, koodit-taa S. cerevisiaessa ZWF1-geeni. Tämän geenin sekvenssi on 15 tunnettu [Nogae, T. ja Johnston, M., Gene 96 (1990) 161 -19; Thomas, D. et ai., The EMBO J. 10 (1991) 547 - 553]. Geeni, mukaan luettuna koko kooditusalue, 600 ep 5'-pään koodittamatonta aluetta ja 450 ep 3'-pään koodittamatonta aluetta, on kloonattu PCR:llä käyttämällä seuraavia kahta 20 oligonukleotidia: CAGGCCGTCGACAAGGATCTCGTCTC (5'-pään oli-gonukleotidi) [SEQ ID No:3:] ja AATTAGTCGACCGTTAATTGGGGC-CACTGAGGC (3'-pään oligonukleotidi) [SEQ ID No:4:]. 5'- pään oligonukleotidi pariutuu asemiin 982 - 1007 ja 3'-pään oligonukleotidi asemiin 3523 - 3555 numeroitaessa 25 D-glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi julkaisussa Nogae, T.
.·. ; ja Johnston, M., Gene 96 (1990) 161 - 19 kuvatulla taval- • »· • ,·, la. Kromosomi-DNA eristettiin S. cerevislae -kannasta • · · GRF18 esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. PCR-parametrit oli- • 4 * ‘ vat samat kuin esimerkissä 3. Monistettu DNA-fragmentti, 30 joka sisälsi ZWFl-geenin, pilkottiin Sällillä ja kloonat- • · · · « tiin samalla restriktaasilla pilkottuun pUC19:ään, jolloin *«* ...· tuloksena oli plasmidi pUC(ZWF). Kloonatun geenin identi- « ; * f. teetti tarkistettiin restriktioanalyysillä.
Pentoosifosfaattitien toista entsyymiä, 6-fosfoglu-35 konihappodehydrogenaasia, koodittaa E. colissa gnd-geeni.
108300 oi Tämän geenin sekvenssi on tunnettu [Nasoff, M. S. et ai., Gene 27 (1984) 253 - 264]. E. colista peräisin olevan gnd-geenin kloonaamiseksi eristettiin E. coli -kannasta HB101 kromosomi-DNA menetelmällä, joka oli samanlainen kuin 5 Klebsiella terrlgena -DNA:n eristämiseen käytetty (esimerkki 1). Geenin gnd PCR-monistukseen tarkoitetut oligonukleotidi t GCGAAGCTTAAAAATGTCCAAGCAACAGATCGGCG [SEQ ID No:5:] ja GCGAAGCTTAGATTAATCCAGCCATTCGGTATGG [SEQ ID No:6:] suunniteltiin monistamaan vain kooditusaluetta ja 10 tuomaan ffindlll-kohdat välittömästi aloituskodonin eteen ja lopetuskodonin perään. 5'-pään oligonukleotidi pariutuu asemiin 56 - 78 ja 3'-pään oligonukleotidi asemiin 1 442 -1 468 numeroitaessa 6-fosfoglukonihappodehydrogenaasi julkaisussa Nasof f, M. S. et ai., Gene 27 (1984) 253 - 264 15 kuvatulla tavalla. Monistettu DNA-fragmentti pilkottiin HindHI: 11a ja ligatoitiin ffindlll:11a pilkotun vektorin pUC19 kanssa. Tuloksena olevan plasmidin pUC(gnd) kymmenen toisistaan riippumatonta näennäisesti identtistä kloonia yhdistettiin. Tämä tehtiin, jotta vältetään mahdollisia 20 ongelmia, jotka liittyvät sekvenssivirheisiin, joita on saattanut tulla PCR-monistuksen aikana. Geenin gnd koodi-tusalue liitettiin S. cerevisiaen ADCI-promoottoriin ja . .V: transkriptioterminaattoriin siirtämällä pUC(gnd)-yhdistel mästä peräisin oleva 1,4 ke:n Hindlll-fragmentti ilmenty-25 misvektoriin pAAH5 [Ammerer, Meth. Enzymol. 101 (1983) .·.; 192 - 203]. Tuloksena olevan plasmidin pAAH(gnd) muutamal- • * · la riippumattomalla kloonilla transformoitiin S. cerevi- • · · *1',* siae -kanta GRF18 käyttämällä litiumkloridimenettelyä [Ito ♦ · t- ‘ et ai., J. Bacteriol. 153 (1983) 163 - 168] ja mitattiin 30 transformanteista 6-fosfo-D-glukonaattidehydrogenaasiak-‘ ‘ tiivisuus. 6-fosfo-D-glukonaattidehydrogenaasiaktiivisuus oli kaikissa transformanteissa kohonnut moninkertaiseksi verrattuna transformoimattomaan isäntään, mikä osoittaa, että bakteeriperäinen 6-fosfo-D-glukonaaattidehydrogenaasi * 35 voi ilmentyä tehokkaasti hiivassa. pAAH(gnd)-klooni, joka 52 1 08300 antoi tulokseksi korkeimman aktiivisuuden hiivassa, valittiin jatkokonstruointeihin. ZWF1- ja gnd-geenien kloonaamista samoin kuin plasmidin pAAH(gnd) konstruointia valaistaan kuvioilla 8 ja 8a.
5 Sekä D-glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi- että 6-fosfo-D-glukonaattidehydrogenaasigeenien yli-ilmentämi-seksi samanaikaisesti osmofiilisessä hiivaisännässä konstruoitiin plasmidi pSRT(ZG). Kuvio 9 valaisee menetelmää tämän plasmidin konstruoimiseksi. Lyhyesti esitettynä 10 plasmidista pAAH(gnd) peräisin oleva 6-fosfo-D-glukonaat-tidehydrogenaasi-ilmentymiskasetti siirrettiin 3,1 ke:n BamHI-DNA-fragmenttina BamHI:llä pilkottuun pUC19:ään. Tuloksena oleva plasmidi pUC(ADHgnd) pilkottiin Sacl:llä ja Xjbal:llä ja puhdistettiin 3,1 ke:n DNA-fragmentti aga-15 roosigeelielektroforeettisesti. Tämä fragmentti ligatoi-tiin samanaikaisesti kahden muun DNA-fragmentin kanssa, jotka olivat pUC(ZWF):n 2,5 ke:n fragmentti, joka oli saatu pilkkomalla Sacl:llä ja osittain Pstl:llä, ja Pstl:llä ja Xjbalrllä pilkotun plasmidin pSRT(AX)-9 (esimerkki 3) 20 vektorifragmentti. Tuloksena olevan plasmidin pSRT(ZG) rakenne varmistettiin restriktioanalyysillä. Kun Z. rouxii ATCC 13356 oli transformoitu pSRT(ZG):llä (esimerkissä 4 kuvatulla menetelmällä), mitattiin transformoidusta kan-nasta D-glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi- ja 6-fosfo-D-, , 25 glukonaattidehydrogenaasiaktiivisuus. Kummankin entsyymin • *· aktiivisuus oli transformoidussa kannassa noin 20-kertai- • * ♦ · · ♦ nen transformoimattomaan vertailukantaan nähden (taulukko 4 ·· • · t '·* 7). Samankaltaisia menetelmiä voidaan käyttää näiden kah den, pentoosifosfaattitien oksidatiivisen osan entsyymejä *·* * 30 koodattavan geenin yli-ilmentymisen aikaansaantiin muissa • hiivalajeissa. Koska ei kuitenkaan ole olemassa vektorei- • · · ta, joita pystyttäisiin pitämään yllä kromosomin ulkopuo- « » t lisinä plasmideina useimmissa muissa hiivalajeissa kuin ;· Saccharomyces- tai Zygosaccharorayces-lajeissa, on integra- * 35 tiivinen transformaatio ainoa käyttökelpoinen menetelmä 53 1 08300 tällaisten isäntien kohdalla. Edullinen integratiivisten vektoreiden tyyppi ovat vektorit, jotka on suunnattu integroitumaan ribosomi-DNA-lokukseen, sillä tämäntyyppiset vektorit saavat aikaan kopiomäärältään korkean integroitu-5 misen ja siten korkeamman ilmentymistason [Lopes, T. S. et ai., Gene 79 (1989) 199 - 206].
Taulukko 7 D-glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi- ja 6-fosfo-D-10 glukonaattiaktiivisuus pSRT(ZG):llä transformoidussa Z. rouxii ATCC 13356:ssa ja transformoimattomassa vertailukannassa [pmol/(min*mg proteiinia)]
Hiivakanta D-glukoosi-6-P- 6-P-glukonaatti- 15 dehydrogenaasi dehydrogenaasi Z. rouxii 0,33 0,45 (transformoimaton) Z. rouxii 7,3 7,7 20 [pSRT(ZG)]
Esimerkki 9
Transketolaasimutanttien konstruointi hiivassa
Transketolaasimutantteja on helpoimmin saatavissa 25 aikaan hiivassa suunnatulla geeninkatkaisumenetelmällä, .* .* vaikkakin tavanomaiset kemialliset mutageneesimenetelmät • · « *;;/ ovat myös käyttökelpoisia. Homologinen transketolaasigee- ♦ · · *·* * ni, joka on kloonattu hiivasta, jossa mutaatio halutaan saada aikaan, on yleensä välttämätön geeninkatkaisutek- *·**'* 30 nilkan käyttämiseksi, vaikka joskus voidaan käyttää myös ··< \φφ· hyvin läheistä sukua olevasta lajista peräisin olevaa heterologista kloonia. S. cerevisiaen transketolaasigee-nin sekvenssi on tunnettu (Fletcher, T. S. ja Kwee, I.
L., EMBL DNA sequence library, ID:SCTRANSK, hakunumero ; '· 35 M63302). Käyttämällä tätä sekvenssiä kloonattiin S. cere- 54 108300 visiaen transketolaasigeeni PCR:llä. Oligonukleotideja AGCTCTAGAAATGACTCAATTCACTGACATTGATAAGCTAGCCG [SEQ ID No:7:] j a GGAGAATTCAGCTTGTCACCCTTATAGAATGCAATGGTCTTTTG [SEQ ID No:8:] ja S. cerevisiaesta saatua (edellä kuvatul-5 la tavalla eristettyä) kromosomi-DNA:ta käytettiin trans-ketolaasigeenin sisältävän DNA-fragmentin monistukseen. 5'-pään oligonukleotidi pariutuu asemiin 269 - 304 ja 3'-pään oligonukleotidi asemiin 2271 - 2305 numeroitaessa transketolaasi T.S. Fletcherin ja I. L. Kween kuvaamalla 10 tavalla (EMBL DNA sequence library, ID:SCTRANSK, hakunu-mero M63302). Fragmentti pilkottiin Xbalcllä ja EcoRI:llä ja kloonattiin samoilla entsyymeillä pilkottuun pUC19:ään. Tuloksena olevan plasmidin pUC(TKT) restriktioanalyysi vahvisti kloonatun DNA-fragmentin identiteetin. Tämä plas-15 midi pilkottiin Bgllhlla ja Claltllä ja suurin DNA-frag-mentti puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Tämä fragmentti ligatoitiin seuraavien kahden plasmidista pUT332 [Gatignol, A. et ai., Gene 91 (1990) 35 - 41] eristetyn fragmentin kanssa: Clal-Pstl-fragmentti, joka sisäl-20 tää URA3-geenin ja 3'-osan bleomysiiniresistenssigeenistä, ja BamHI-Pstl-DNA-fragmentti, joka sisältää hiivan TEF1 (transkriptionpidennysteki jä 1) -promoottorin ja bleomy-siiniresistenssigeenin kooditussekvensin 5'-osan. Kun oli transformoitu E. coli edellä saadulla ligaatioseoksella ja t<i . 25 tehty plasmidikloonien restriktioanalyysi, eristettiin * li .* .* plasmidi pTKT(BLURA). Tämä plasmidi sisältää S. cerevi- • « · siaen transketolaasigeenin koodittavan sekvenssin, jossa • · · *·’ * ClaI- ja Bglll-kohtien välinen 90 ep:n fragmentti on kor vattu pUT332-fragmentilla, joka sisältää kaksi S. cerevi-30 siaessa valikoinnin mahdollistavaa markkeria, URA3-geenin * : ja bleomysiiniresistenssigeenin TEFl-promoottorin ja CYC1- ,«j. transkriptioterminaattorin ohjauksessa. Tällä plasmidilla • · * transformoitiin S. cerevisiae -kanta DBY746 (ATCC 44773; *;* MAToi his3Al leu2-3,112 ura3-52 trpl-289) f leomysiinille • * 35 resistentiksi (10 pg/ml fleomysiiniä YEPD-alustassa) li- 55 1 08300 tiumkloridimenetelmällä [I to et ai., J. Bacteriol. 153 (1983) 163 - 168]. Transformanteista testattiin urasiili-prototrofia ja kyky kasvaa D-ksyluloosilla. Viittä URA3-kloonia, joista kolmen kasvu oli heikentynyttä D-ksyluloo-5 silla, kasvatettiin 100 ml:n viljelmissä, valmistettiin solu-uutteet ravistelemalla lasihelmien kanssa ja mitattiin transketolaasiaktiivisuus raakauutteesta. Määritys tehtiin glysyyli-glysiinipuskurissa (0,1 mol/1 pH 7,6), joka sisälsi 3 mmol/1 magnesiumkloridia, 0,1 mmol/1 tia-10 miinipyrofosfaattia, 0,25 mmol/1 NADH:ta ja 0,2 mg/ml naudan seerumialbumiinia. Välittömästi ennen mittausta lisättiin 3 μΐ liuosta, joka sisälsi 0,5 mol/1 D-ksyluloosi-5-fosfaattia ja 0,5 mol/1 riboosi-5-fosfaattia, 1 ml:aan edellä mainittua puskuria ja sen jälkeen 7,5 ky trioosi-15 fosfaatti-isomeraasia ja 1,5 ky a-glyserolifosfaattidehyd-rogenaasia (molemmat Sigmalta). Reaktio käynnistettiin lisäämällä sopiva annos raakauutetta ja sitä seurattiin rekisteröimällä optisen tiheyden aleneminen aallonpituudella 340 nm. Kannan DBY746 solu-uutetta käytettiin ver-20 tailunäytteenä. Transketolaasiaktiivisuus oli helposti mitattavissa raakauutteista, jotka saatiin DBY746:sta ja • .·, kahdesta D-ksyluloosilla hidastumattomasti kasvavasta transformantista; pitoisuus oli noin 0,25 ky/mg proteii-nia. Kolmen D-ksyluloosilla hidastetusti kasvavan trans-, , 25 formantin transketolaasiaktiivisuus oli menetelmämme ha-
• » I
/ ]· vaitsemisarajan alapuolella (vähintään 20 kertaa alempi • · · !··' ·' kuin villillä tyypillä). Mitattiin myös D-glukoosi-6-fos- • · * V faattidehydrogenaasi- ja 6-fosfo-D-glukonaattidehydroge- naasiaktiivisuudet solu-uutteiden valmistuksen aikana mah-*: *· 30 dollisesti tapahtuneen entsyymin inaktivoitumisen tarkis- ,,r': tamiseksi. Näiden kahden entsyymin aktiivisuudet olivat • 4 1 .1. hyvin samanlaiset kaikissa kuudessa kannassa. Siksi pää- ♦ · · teltiin, että ne kolme kloonia, jotka kasvoivat heikosti ·;·’ D-ksyluloosilla, sisälsivät mutaation transketolaasigee- ; 35 nissä. Katkaistun transketolaasigeenin sisältävien kanto- „ 108300 56 jen kasvu oli jossakin määrin hidastunutta myös synteettisellä alustalla, josta puuttuivat aromaattiset aminohapot fenyylialaniini ja tyrosiini, vaikka vaikutus oli vähäisempi kuin tämän mutaation vaikutus D-ksyluloosin hyödyn-5 tämiseen.
Muista hiivalajeista peräisin olevia transketolaa-sigeenejä voidaan kloonata kätevästi edellä kuvatuissa S. cerevisiae -kannoissa olevan transketolaasimutaation komp-lementaatiolla. Kloonaus voidaan edullisesti toteuttaa 10 konstruoimalla muun kuin Saccharomyces-hiivakannan geeni-kirjasto asianmukaisessa vektorissa (esimerkiksi hyvin tunnetussa plasmidissa YEpl3), transformoimalla tällä kirjastolla S. cerevisiae -kanta, jossa on transketolaasimu-taatio (esimerkiksi edellä kuvatulla geenin katkaisulla 15 aikaansaadut mutantit) ja valikoimalla transformantit, joissa kasvu D-ksyluloosilla on palautunut. Plasmidi-DNA voidaan ottaa talteen mainitunlaisista D-ksyluloosiposi-tiivisista transformanteista ja käyttää saman vastaanotta-jakannan transformointiin. Kaikkien tästä transformaatios-20 ta peräisin olevien kantojen pitäisi pystyä kasvamaan hyvin D-ksyluloosilla. Transformanteista voidaan mitata . transketolaasiaktiivisuus ja sen merkittävä ilmaantuminen uudelleen voi toimia osoituksena kloonatun geenin identiteetistä. Lisä- ja lopullinen osoitus voidaan saada sek-: 25 ventoimalla lyhyitä jaksoja kloonatusta DNArsta ja löytäjä·] mällä S. cerevisiaen transketolaasigeenisekvenssille ho- • · · “*.* mologisia sekvenssipaloja tai osoittamalla kloonatun DNA- • · · • ♦ t * fragmentin hybridisaatio S. cerevisiaesta peräisin olevan autenttisen transketolaasikloonin kanssa. Kloonausmenette- ' * 30 ly voi vaihtoehtoisesti perustua DNA-hybridisaatioon pää- • · * menetelmänä transketolaasigeenin sisältävien kloonien va-likoimiseksi muun kuin Saccharomyces-hiivan geenikirjas- • · · tosta. S. cerevisiaen transketolaasigeenifragmenttia voidaan käyttää koettimen pesäkehybridisaatiokokeessa ja 35 kloonit, jotka antavat voimakkaimman hybridisaatiosignaa- „ 108300 b /
Iin, voidaan analysoida tarkemmin osittaisella sekventoin-nilla.
Riippumatta siitä, mitä menetelmää käytetään valitusta hiivalajista peräisin olevan transketolaasigeenin 5 kloonaamiseen, myöhemmät vaiheet mutaation aikaansaamiseksi tässä hiivassa olevassa transketolaasigeenissä ovat samat. Kloonattu DNA-fragmentti tulisi karakterisoida konstruoimalla osittainen restriktiokartta ja edullisesti paikantamalla transketolaasigeenin kooditusalue. Sitten 10 insertoidaan DNA-pala, joka voi toimia valikointimarkkeri-na valitussa hiivassa, transketolaasigeenin sisältävään DNA-fragmenttiin vähintään muutaman sadan emäsparin päähän tämän fragmentin jommastakummasta päästä. Esimerkiksi kasettia, joka sisältää bakteeriperäisen fleomysiinigeenin 15 vahvan hiivapromoottorin ohjauksessa, kuten edellä kuvattua plasmidista pUT332 peräisin olevaa kasettia, voitaisiin käyttää monissa hiivalajeissa dominoivana valikointi-mar.kkerina. On välttämätöntä, että valikointimarkkerin sisältävän DNA-fragmentin insertointi tehdään sillä taval-20 la, että insertoitu DNA joko katkaisee transketolaasigeenin kooditusalueen tai, edullisesti, insertoitu DNA-frag-. · ; mentti korvaa kooditusalueen (osan). Tällaista DNA-raken- · netta voidaan sitten käyttää katkaisemaan transketolaasi- geenin kromosomikopio valitussa hiivassa samanlaisella me- : 25 netelmällä kuin edellä kuvattu menetelmä transketolaasimu- « « « ;'·’ taation aikaansaamiseksi S. cerevisiaessa. Mitä tahansa * · · *".1 sopivaa transformointimenetelmää voidaan käyttää; edulli- • 1 1 * 1 siä menetelmiä ovat protoplastitransformaatio ja elektro- poraatio. Katkaistun transketolaasigeenin sisältävien < * 1 30 kloonien valikointi voidaan tehdä menetelmällä, joka on
* M
*...· samanlainen kuin edellä S. cerevisiaen yhteydessä kuvattu.
Myös transketolaasikromosomialueen rakenteen analysointia * ,··, Southern-hybridisaatiolla voidaan käyttää vaihtoehtoisena menetelmänä tai muiden menetelmien lisäksi.
» · * « 1 * · 58 1 0 8 300
Esimerkki 10 D-ribulokinaasigeenin kloonaus
Edullinen tapa kloonata D-ribulokinaasigeeni on samanlainen kuin esimerkissä 1 kuvattu menetelmä D-arabito-5 lidehydrogenaasin kloonaamiseksi. On tunnettua, että D-ribulokinaasigeeni on muutamissa bakteereissa, kuten E. co-lissa tai Klebsiella aerogenesissa, osa ribitolinhyödyntä-misoperonia [Loviny, T. et ai., Biochem. J. 230 (1985) 579 - 585]. On myös tunnettua, että E. colin B-kannat ei-10 vät sisällä tätä operonia ja ovat siksi kyvyttömiä hyödyntämään ribitolia hiililähteenä. Niinpä E. colin B-kanta (kuten yleiset laboratoriokannat HB101 ja JM103 tai kannat, jotka voidaan transformoida suurella tehokkuudella, kuten Stratagenen kannat SCSI tai XLl-Blue) voidaan trans-15 formoida ribitolia hyödyntävän bakteerin geenikirjastolla, joka on muodostettu missä tahansa sopivassa vektorissa, edullisesti pUC19:ssä. Ei-patogeeniset bakteerilajit, kuten Klebsiella terrigena, ovat D-ribulokinaasigeenin eristämiseen käytettävien organismien edullinen lähde. Sitten 20 voidaan valikoida E. coli -transformantit, joilla on kyky kasvaa minimialustalla, joka sisältää ribitolia ainoana hiililähteenä. Mainitunlaisista ribitolipositiivisista klooneista voidaan eristää plasmidi-DNA ja käyttää sitä E. colin B-kannan uudelleentransformointiin. Kaikkien tällai- . 25 sesta uudelleentransformoinnista saatujen transformanttien * · · .* .* pitäisi pystyä kasvamaan ainoana hiililähteenä olevalla • · · ·;;· ribitolilla. Sitten voidaan konstruoida kloonatun insertin • · · '·* * restriktiokartta. Käyttämällä tätä karttaa voidaan valmis taa alkuperäisen kloonin erilaisia deleetiojohdannaisia ja 30 analysoida niistä ribitolioperonin säilyminen edellä mai- * : nitulla toimintatestillä. Voidaan tehdä useitä peräkkäisiä .···, deleetioita ribitolioperonin sisältävän DNA-fragmentin * · · koon minimoimiseksi alueelle 3,5 - 4 ke (tämän operonin koko K. aerogenesissa). Lopuksi voidaan määrittää D-ribu-: '· 35 lokinaasigeenin (osittainen) nukleotidisekvenssi ja käyt- 59 1 0 8 300 tää sitä tämän geenin kooditusalueen irrottamiseen joko käyttämällä luonnossa esiintyviä restriktiokohtia tai tunnettua PCR-tekniikkaa mainitunlaisten kohtien tuomiseksi molekyyliin. D-ribulokinaasigeeni voidaan saattaa ilmenty-5 mään muissa isännissä, edullisesti hiivoissa, menetelmällä, joka sisältää tavanomaisia toimenpiteitä, kuten D-ri-bulokinaasigeenin koodittavan alueen fuusioinnin sopivaan promoottoriin ja transkriptioterminaattoriin, ilmentymis-kasetin siirtämisen valitun isännän transformointiin so-10 veltuvaan vektoriin, transformanttien aikaansaannin ja lopuksi D-ribulokinaasin i Imen tyrni s tehokkuuden varmistamisen.
Esimerkki 11 D-ribuloosi-5-fosfaatti-3-epimeraasigeenin kloonaus -15 ja yli-ilmentäminen
Menetelmä homogeenisen D-ribuloosi-5-fosfaatti-3-epimeraasin eristämiseksi leivinhiivasta (teollinen Sacc-haromyces cerevisiae -hiiva) on tunnettu [Williamson, W.
T. et ai., Meth. Enzymol. 9 (1966) 605 - 608]. Tämä ent- 20 syymi voidaan eristää ja sen N-terminaalinen sekvenssi samoin kuin osa sisäisestä aminohapposekvenssistä määrittää yleisesti tunnetuin menetelmin. Sitten saatuja osit-; täisiä aminohapposekvenssejä voidaan käyttää käänteis- translaationa tunnetun menettelyn kautta oligonukleotidi- .·. ; 25 sekvenssien muodostamiseen, joita voidaan sitten käyttää * « · alukkeina polymeraasiketjureaktiossa. PCR:llä muodostettu- ♦ · · *!!,* ja DNA-fragmentteja voidaan käyttää hybridisaatiokoettimi- • · · ·* * na täysmittaisen D-ribuloosi-5-fosfaatti-3-epimeraasigee- nikopion etsimiseen hiivageenikirjastosta. Edullinen tapa * : 30 saattaa D-ribuloosi-5-fosfaatti-3-epimeraasigeeni yli-il- ··· mentymään muissa hiivaisännissä on kloonata se vektoriin, jonka kopioluku on suuri halutussa isännässä (esimerkiksi t . · · ·. vektori pSRT303D Z. rouxiin ollessa kyseessä). Vaihtoeh- ·* toinen ja tehokkaampi tapa saattaa geeni yli-ilmentymään • 35 on määrittää ainakin osittain D-ribuloosi-5-fosfaatti-3- 60 .'08300 epimeraasigeenin nukleotidisekvenssi translaation aloitus-kodonin ympäristöstä ja käyttää tätä informaatiota D-ribu-loosi-5-fosfaatti-3-epimeraasigeenin koodittavan sekvenssin eristämiseen ja sen fuusiointiin promoottoriin, jonka 5 tiedetään toimivan tehokkaasti valitussa isännässä. Esimerkki 12 D-ksylulokinaasigeenin kloonaus ja D-ksylulokinaa-simutanttien konstruointi
Menetelmiä D-ksylulokinaasia (EC 2.7.1.17) vastaa-10 van geenin kloonaamiseksi erilaisista hiivalajeista on kuvattu [Ho, N. W. Y. et ai., Enzyme Microbiol. Technol. 11 (1989) 417 - 421; Stevis, P. E. et ai., Applied and Environmental Microbiol. 53 (1987) 2975 - 2977]. Myös menetelmää D-ksylulokinaasimutaation aikaansaamiseksi S. 15 cerevisiaessa geenin katkaisun kautta on kuvattu [Stevis, P. E. et ai., Appi. Biochem. Biotechnol. 20 (1989) 327 -334]. Vastaavia menetelmiä voidaan käyttää D-ksylulokinaa-simutanttien aikaansaamiseen muissa hiivoissa. Muiden hii-valajien kuin S. cerevlslaen ollessa kyseessä D-ksyluloki-20 naasigeenin katkaisun yhteydessä käytettävät geenimarkke-rit ovat edullisesti dominoivia antibioottiresistenssi-markkereita (katso esimerkki 9). Vaihtoehtoisesti voidaan .·, käyttää klassisia mutantinmuodostusmenetelmiä, jotka pe- ,rustuvat kemialliseen (esimerkiksi käsittely etyylimetaa- . . 25 nisulfonaatilla tai akriflaviinilla) tai fysikaaliseen * * · .* .* (ultraviolettivalo, röntgensäteet) mutageneesiin. Mutantin • · ♦ *;·/ rikastus voidaan tehdä kasvattamalla mutagenisoituja solu- • · · *·* ja ainoana hiililähteenä olevalla D-ksyluloosilla vain kasvavia soluja tappavan antibiootin (kuten nystatiinin) *'"* 30 läsnä ollessa. D-ksylulokinaasimutanttien kyvyttömyyttä • · · käyttää kasvaakseen D-ksyluloosia ainoana hiililähteenä ,···, voidaan käyttää mutanttien valikointiin.
• · · C1 1 08300
Dl
Esimerkki 13
Ksylitolia D-arabitolin kautta parannetulla saannolla tuottavat kannat
Esimerkissä 4 kuvataan menetelmää sellaisen hii-5 vakannan konstruoimiseksi, jolla on kyky tuottaa ksylitolia rakenteellisesti kaukaisista hiililähteistä, kuten D-glukoosista, sellaisen tien kautta, jolla hyödynnetään D-arabitolia ratkaisevana välituotteena. Ksylitolisaannon parantamiseksi fermentoinneissa, joissa käytetään tätä 10 "D-arabitolitietä" hyödyntäviä kantoja, täytyy D-arabi-tolisaantoa parantaa. Tietä, joka johtaa D-glukoosista D-arabitoliin D-arabitolia tuottavissa hiivoissa, on kuvattu [Ingram, J. M. et ai., J. Bacteriol. 89 (1965) 1186 - 1194]. D-arabitolia tuotetaan D-ribuloosi-5-fosfaa-15 tista defosforylaation ja NADPH-kytkeytyneen D-ribuloosi-reduktaasin aikaansaaman defosforylaation kautta. D-ribu-loosi-5-fosfaatin muodostuminen D-glukoosi-6-fosfaatista kahden peräkkäisen irreversiibelin dehydrausvaiheen kautta D-glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin ja 6-fosfo-D-gluko-20 naattidehydrogenaasin vaikutuksesta on kaikkialla esiintyvä tie, joka tunnetaan pentoosifosfaattitien (tai hek-soosimonofosfaattitien) oksidatiivisena haarana. Pentoosifosfaattitien ei-oksidatiivisessa haarassa D-ribuloosi-5-fosfaatti isomeroituu reversiibelisti riboosi-5-fosfaatik-. 25 si ja D-ksyluloosi-5-fosfaatiksi. Riboosi-5-fosfaatti ja .' .* D-ksyluloosi-5-fosfaatti metaboloituvat edelleen transke- • · · *”,* tolaasin vaikutuksesta. Siksi voidaan aiheuttaa transketo- • · · laasimutaatio D-arabitolia tuottavassa mikrobikannassa ja suurentaa D-arabitoliksi muuttuvan D-ribuloosi-5-fosfaatin 30 osuutta. Esimerkissä 9 kuvataan menetelmää transketolaasi- • * · *.,.i mutanttien aikaansaamiseksi. D-arabitolisaantoa voidaan suurentaa edelleen, jos D-ribuloosi-5-fosfaattibiosyntee- • · · ··· sin nopeus maksimoidaan saattamalla pentoosifosfaattitien V oksidatiivisen haaran entsyymejä koodittavat kaksi geeniä 35 yli-ilmentymään edellä kuvatulla tavalla (esimerkki 8).
62 108300 Tällä tavalla D-arabitolisaannon suhteen optimoidut kannat voidaan sitten transformoida edelleen yhdistelmä-DNA-ra-kenteilla, joissa on ksylitolidehydrogenaasi- ja D-arabi-tolidehydrogenaasigeenit (esimerkit 3 ja 4), jolloin tu-5 loksena on kantoja, joiden ksylitolintuotantoteho on parantunut .
Esimerkki 14
Ksylitolia vaihtoehtoisten teiden kautta tuottavat kannat 10 Esimerkkien 4 ja 13 mukaiset menetelmät ovat suora- viivaisimpia menetelmiä sellaisten mikrobikantojen konstruoimiseksi, joilla on kyky muuttaa D-glukoosi ja muita hiililähteitä ksylitoliksi. Näissä menetelmissä hyödynnetään luonnossa esiintyvää tietä, joka johtaa D-arabitolin 15 muodostumiseen erilaisista hiililähteistä, ja pidennetään tätä tietä kahdella lisäreaktiolla D-arabitolin muuttamiseksi ksylitoliksi. Tämä tie ei kuitenkaan ole ainoa mahdollinen. Muita teitä, jotka johtavat ksylitoliin lopullisena metaboliatuotteena ja joissa ei käytetä D-arabitolia 20 välituotteena, voidaan konstruoida. Niinpä tie, joka johtaa ksylitoliin samasta esiasteesta, D-ribuloosi-5-fosfaa-.’ tista, voidaan toteuttaa erilaisen reaktioketjun kautta.
D-ribuloosi-5-fosfaatti voidaan muuttaa tehokkaasti D-ksy-luloosi-5-fosfaatiksi D-ribuloosi-5-fosfaatti-3-epimeraa-. 25 sin avulla (esimerkki 11), ja jos D-ksyluloosi-5-fosfaatin * * t j*muuttuminen edelleen estetään transketolaasigeenissä ole-• ' ! *“,* van mutaation kautta, voidaan kerääntynyt D-ksyluloosi-5- • · « '·* * fosfaatti defosforyloida saman epäspesifisen fosfataasin avulla kuin D-ribuloosi-5-fosfaatti [Ingram, J. M. et ai., ·’*· 30 J. Bacteriol. 89 (1965) 1186 - 1194] ja pelkistää ksylito- 4 · · *,,,· liksi ksylitolidehydrogenaasin avulla (esimerkki 3). Tämän * .···, tien toteuttaminen voi lisäksi vaatia D-ksylulokinaasigee- ♦ * * nin inaktivointia (esimerkki 12), jotta minimoidaan ener- I , giahäviö, jonka aiheuttaa seuraava turha silmukka: D-ksy-: " 35 luloosi-5-fosfaatti -> D-ksyluloosi -> D-ksyluloosi-5-fos- „ 103300 63 faatti. Geneettinen lisämuutos - D-ribulokinaasigeenin (EC 2.7.1.47) tuominen ja (yli)ilmentyminen - voisi minimoida mainitunlaisten kantojen samanaikaisen D-arabitolituotan-non sitomalla epäspesifisen fosfataasin vaikutuksesta syn-5 tyneen D-ribuloosin. D-ribuloosi muutetaan takaisin D-ri-buloosi-5-fosfaatiksi ja edelleen D-ksyluloosi-5-fosfaa-tiksi.
Esimerkki 15 Z. rouxii -yhdistelmäkannan stabiilius ja ksylitoli) lituotanto fermentoriviljelyolosuhteissa
Ksylitolituotannon stabiilius jatketun viljelyn aikana tarkistettiin sekä selektiivisissä olosuhteissa (käyttämällä seuraavaa selektiivistä alustaa: YEPD, joka sisältää 50 mg/1 G418:a ja 30 % glukoosia) että ei-selek-15 tiivisissä olosuhteissa (käyttämällä samaa alustaa ilman G418:a). Yhtä juuri saatua Z. rouxii ATCC 13356 [pSRT(AX)- 9]:n transformanttia kasvatettiin 200 mlrssa G418-pitoista YEP.D:tä. Solut siirrettiin 50-%:iseen glyseroliliuokseen ja pakastettiin lämpötilassa -70 °C 1 ml:n annoksina. Ino-20 kuloitiin neljällä pakastetulla Z. rouxii [pSRT(AX)-9] -annoksella kaksi selektiiviseen alustaan ja kaksi ei-se-. : : lektiiviseen alustaan valmistettua 50 ml:n viljelmää. Kun viljelmät olivat saavuttaneet stationaarisen kasvuvaiheen ....: (50 - 60 tuntia lämpötilassa 30 °C sekoitusnopeuden olles- ,·. : 25 sa 200 min'1), otettiin näyte pentitolipitoisuuden HPLC- • i · analyysiä varten ja inokuloitiin 1 ml:11a viljelmää toiset • · · **!,* 50 ml samaa (selektiivistä tai ei-selektiivistä) alustaa.
• · t ** ' Kasvatus-laimennussykli toistettiin vielä neljästi. Tämän kokeen olosuhteet approksimoivat yhdistelmäkannan etene- ··· 4 * ** 30 mistä tavanomaisesta pakastetusta inokulaatista laajamit- .· *...· täisessä fermentoinnissa. Tämän kokeen tulokset esitetään taulukossa 8. Yhdistelmäkannan stabiilius on ennustetta- • · · vissa olevalla tavalla parempi selektiivisellä alustalla.
i
Jopa ei-selektiivisessä alustassa ksylitolisaannon piene- 4 4 ί 35 neminen havaittiin kuitenkin vasta noin 20 sukupolven jäi- • i t t « • > « t 64 1 0 8 3 0 0 keen. Selektiivisissä olosuhteissa ksylitolituotanto oli stabiilia noin 30 sukupolven ajan.
Inokuloitiin yhdellä annoksella pakastettua transformoitua Z. rouxii -varastokantaa 2 litran fermentori, 5 joka sisälsi 1 litran alustaa, jonka koostumus oli seuraa-va (litraa kohden): 0,1 g NaCl:a, 6,8 g kaliumfosfaattia, 0,5 g ammoniumsulfaattia, 20 g hiivauutetta, 400 g glukoosia ja 50 mg G481:ä, pH 6,0. Viljelyolosuhteet olivat seu-raavat: ilmastusnopeus 0,5 V/min; sekoitusnopeus 400 min'1; 10 lämpötila 30 °C.
Kuvio 10 esittää glukoosin kulumista ja ksylitolin kerääntymistä ajan funktiona tässä fermentoinnissa. Liuenneen hapen pitoisuus, joka heijastaa hiivaviljelmän hengi-tysaktiivisuutta, esitetään myös. Havaittiin näennäisesti 15 kaksivaiheinen kasvu: ensimmäisessä vaiheessa saavutettiin tasanne glukoosi- ja ksylitolipitoisuudessa noin 40 tunnissa (alle puolet käytettävissä olevasta glukoosista oli kulunut tässä vaiheessa), toinen vaihe havaittiin noin 200 tuntia kestäneen viljelyn jälkeen, jolloin glukoosin kulu-20 tus ja ksylitolin tuotanto alkoivat uudelleen. Lopullinen ksylitolipitoisuus oli 15 g/1, lähes kaksi kertaa suurempi kuin pulloviljelmissä saavutettu. Kaksivaiheinen kasvu, jossa esiintyi pitkä viivejakso, osoitti, että valikoiduksi tuli spontaani mutantti (jolla oli otaksuttavasti pa-... 25 rempi kyky sietää alkoholia kuin peruskannalla). Tämän hy- : .·. poteesin tarkistamiseksi eristettiin viljelmästä yksi yk- • · « sittäinen klooni fermentoinnin lopussa. Tätä eristettyä • · · kloonia kasvatettiin fermentorissa edellä kuvatuissa olosuhteissa. Tämän kokeen tulokset (kuvio 11) vahvistivat,
• · · I I
30 että oli todella eristetty mutantti, joka pystyy täydelli- • « · sesti assimiloimaan 400 g/1 glukoosia noin 60 tunnissa.
:*·*; Tämä koe osoittaa myös, että ksylitolia tuottava Z. rouxii ♦ -kanta pystyy assimiloimaan myös ksylitolia, kun alustan glukoosi on kulutettu loppuun.
65 1 0 8 3 0 0
Taulukko 8
Kannan Z. rouxii ATCC 13356 [pSRT(ÄX)-9] ksylitolituotan-non stabiilius sarjaviljelyolosuhteissa (g/1, normalisoitu kokonaispentitolisaannon suhteen) 5
Viljelyolosuhteet
Laimennussarjan Viljelmän Selektii- Ei-selek- laimennoksen nro nro viset tiiviset 10 1 1 8,3 8,6 2 8,9 8,6 2 1 8,9 8,9 2 8,5 8,4 3 1 8,5 8,3 15 2 8,6 8,2 4 1 8,7 8,0 2 8,6 6,9 5 1 8,6 7,6 2 8,1 5,6 20 6 1 7,0 7,0 2 6,9 2,4
Kaikki lähdekirjallisuus mainitaan tässä viitteenä. Kun keksintöä on nyt kuvattu kokonaisuudessaan, ammat-25 timiehet ymmärtänevät, että suoja-ala voidaan toteuttaa • käyttämällä laajaa ja vastaavaa pitoisuuksien, parametrien
Ml · .*.··. yms. aluetta vaikuttamatta keksinnön tai minkään sen suo- « · ritusmuodon henkeen tai suoja-alaan.
I ( I
* · • ·» i I # • « · • · · * · ·
« I I • I
66 1 08 30 0
Sekvenssiluettelo (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Harkki, Anu M.
Myasnikov, Andrey N.
Apajalahti, Juha H.A.
Pastinen, Ossi A.
(ii) TITLE OF INVENTION: Manufacture of Xylitol (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 8 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: (B) STREET: (C) CITY: (D) STATE: (E) COUNTRY: (F) ZIP: (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (VX) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: PCT (to be assigned) · (B) FILING DATE: herewith (C) CLASSIFICATION: (vi) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 08/110,672 (B) FILING DATE: 24-AUG-1993 I .-1 (vi) PRIOR APPLICATION DATA: ; (A) APPLICATION NUMBER: US 07/973,325 (B) FILING DATE: 05-NOV-1992 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: (B) REGISTRATION NUMBER: •*’\· (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: * * · (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: (B) TELEFAX: 67 1 08 300 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 28 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: both (D) TOPOLOGY: both (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l: CGAATTCTAG ACCACCCTAA GTCGTCCC 28 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 29 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: both (D) TOPOLOGY: both (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: TTCAAGAATT CAAGAAACTC ACGTGATGC 29 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 26 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: both (D) TOPOLOGY: both • ♦ * · · • · · • · · « (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3 : • * · CAGGCCGTCG ACAAGGATCT CGTCTC 26 .· ♦. (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4: • · · ,.j.# , (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: V : (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: both (D) TOPOLOGY: both 68 10 8 300 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: AATTAGTCGA CCGTTAATTG GGGCCACTGA GGC 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: both (D) TOPOLOGY: both (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: GCGAAGCTTA AAAATGTCCA AGCAACAGAT CGGCG 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 34 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: both (D) TOPOLOGY: both (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: GCGAAGCTTA GATTAATCCA GCCATTCGGT ATGG 34 : (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: • ** · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 44 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: both ..." (D) TOPOLOGY: both « « · • · · , • · ·
«II
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: AGCTCTAGAA ATGACTCAAT TCACTGACAT TGATAAGCTA GCCG : ·., 44 69 1 08 300 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 44 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: both (D) TOPOLOGY: both (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8: GGAGAATTCA GCTTGTCACC CTTATAGAAT GCAATGGTCT TTTG 44 * · * « · • · 1 • « · · • · · • · · « · • » < • · · 1 i • · · « · ·

Claims (30)

1. Menetelmä ksylitolin tuottamiseksi yhdistelmä-isännässä, tunnettu siitä, että menetelmä käsit- 5 tää seuraavaa: (a) konstruoidaan mikrobi-isäntään uusi metabolia-tie, joka johtaa ksylitolin syntetisoitumiseen lopputuotteena muusta hiililähteestä kuin D-ksyloosista, D-ksylu-loosista, D-ksyloosin ja D-ksyluloosin seoksista ja D-ksy- 10 loosia tai D-ksyluloosia pääkomponentteina sisältävistä polymeereistä ja oligomeereistä, (b) kasvatetaan vaiheen (a) mukaista yhdistel- mäisäntää olosuhteissa, jotka saavat aikaan ksylitolin synteesin mainittua tietä käyttämällä ja muulla hiililäh- 15 teellä kuin D-ksyloosilla, D-ksyluloosilla, D-ksyloosin ja D-ksyluloosin seoksilla ja D-ksyloosia tai D-ksyluloosia pääkomponentteina sisältävillä polymeereillä ja oligomee-reillä, ja (c) otetaan talteen vaiheessa (b) tuotettu ksylito- 20 li.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että arabitoli on yksi välituote mainitulla tiellä.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että mainittu uusi metaboliatie • jatkaa ja/tai muuntaa luontaisen isännän metaboliatietä, • * * · joka johtaa luontaisessa isännässä arabitoliin lopputuot-teenä.
. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että mainitun uuden metaboliatien • i ·;· konstruointi käsittää arabitolia tuottavan mikrobi-isännän :: : transformoinnin D-arabitolidehydrogenaasia (EC 1.1.1.11) : : koodittavalla DNA:11a.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, *. 35 tunnettu siitä, että mainitun uuden metaboliatien 71 1 08 300 konstruointi käsittää lisäksi konstruoidun yhdistelmäisän-nän transformoinnin ksylitolidehydrogenaasia (EC 1.1.1.9) koodattavalla DNA:11a.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että luontainen isäntä on joko arabitolia tuottava hiiva tai arabitolia tuottava sieni.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntä ei ilmennä D-ksylulo-kinaasia (EC 2.7.1.17).
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntä ei ilmennä transketo-laasia (EC 2.2.1.1).
9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntä transformoidaan lisäk- 15 si yhdellä tai useammalla koodittavalla sekvenssillä, jotka valitaan ksylitolidehydrogenaasia, D-glukoosi-6-fos-faattidehydrogenaasia (EC 1.1.1.49), 6-fosfo-D-glukonaat-tidehydrogenaasia (EC 1.1.1.44) ja D-ribuloosi-5-fosfaat-ti-3-epimeraasia (EC 5.1.3.1) koodittavien DNA:iden jou-20 kosta.
10. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 mu- '.v kainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiiva va- ti'j' Iitaan joukosta, johon kuuluvat Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis Candida, Pichia farinosa ja
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, « · · tunnettu siitä, että mainittu hiiva on Zygosac-, charomyces rouxii. « « t < 4
12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, M* r tunnettu siitä, että ksylitolia muodostetaan muut- « tamalla D-ksyluloosifosfaatti D-ksyluloosiksi, mitä seuraa « D-ksyluloosin pelkistys ksylitoliksi.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että isäntä transformoidaan lisäk- 72 1 0 8 3 0 0 si rakenteella, joka koodittaa yhtä tai useampaa entsyymiä, jotka valitaan joukosta, johon kuuluvat D-glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi (EC 1.1.1.49), 6-fosfo-D-glu-konaattidehydrogenaasi (EC 1.1.1.44), D-ribuloosi-5-fos-5 faatti-3-epimeraasi (EC 5.1.3.1), D-ribulokinaasi (EC 2.7.1.47) ja ksylitolidehydrogenaasi (EC 1.1.1.9).
14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntä ei ilmennä transketo-laasia (EC 2.2.1.1).
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntä transformoidaan lisäksi rakenteella, joka koodittaa yhtä tai useampaa entsyymiä, jotka valitaan joukosta, johon kuuluvat D-glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi (EC 1.1.1.49), 6-fosfo-D-glu- 15 konaattidehydrogenaasi (EC 1.1.1.44), D-ribuloosi-5-fos- faatti-3-epimeraasi (EC 5.1.3.1), D-ribulokinaasi (EC 2.7.1.47) ja ksylitolidehydrogenaasi (EC 1.1.1.9).
16. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntä ei ilmennä D-ksylulo- 20 kinaasia (EC 2.7.1.17).
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntä transformoidaan lisäksi' si rakenteella, joka koodittaa yhtä tai useampaa entsyy- miä, jotka valitaan joukosta, johon kuuluvat D-glukoosi-6- .'.J 25 fosfaattidehydrogenaasi (EC 1.1.1.49), 6-fosfo-D-glu- : konaattidehydrogenaasi (EC 1.1.1.44), D-ribuloosi-5-fos- * ♦ · ,···. faatti-3-epimeraasi (EC 5.1.3.1), D-ribulokinaasi (EC • · · 2.7.1.47) ja ksylitolidehydrogenaasi (EC 1.1.1.9).
18. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että isäntä ei ilmennä transketo- • · « ...* laasia (EC 2.2.1.1) eikä D-ksylulokinaasia (EC 2.7.1.17). *
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntä transformoidaan lisäk- i < si rakenteella, joka koodittaa yhtä tai useampaa entsyy-> " 35 miä, jotka valitaan joukosta, johon kuuluvat D-glukoosi-6- 108300 fosfaattidehydrogenaasi (EC 1.1.1.49), 6-fosfo-D-glu-konaattidehydrogenaasi (EC 1.1.1.44), D-ribuloosi-5-fos-faatti-3-epimeraasi (EC 5.1.3.1), D-ribulokinaasi (EC 2.7-.1.47) ja ksylitolidehydrogenaasi (EC 1.1.1.9).
20. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 12 - 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiiva valitaan joukosta, johon kuuluvat Zygosaccharomyces rou-xii, Candida polymorpha, Torulopsis Candida, Pichia fa-rinosa ja Torulaspora hansenii, ja sieni valitaan joukos-10 ta, johon kuuluvat Dendryphiella salina ja Schizophyllum commune.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu hiiva on Zygosaccharomyces rouxii.
22. Yhdistelmämikrobi-isäntä, tunnettu siitä, että sillä on kyky syntetisoida ksylitolia yhdessä fermentoinnissa muusta hiililähteestä kuin D-ksyloosista, D-ksyluloosista, D-ksyloosin ja D-ksyluloosin seoksista ja D-ksyloosia tai D-ksyluloosia pääkomponentteinä sisältä-20 vistä polymeereistä ja oligomeereistä ja synteesi on runsaampaa kuin vastaavan ei-yhdistelmämikrobi-isännän ai-kaansaama synteesi sen seurauksena, että isäntä on trans-formoitu D-arabitolidehydrogenaasia (EC 1.1.1.11) koodit-'tavalla DNA: 11a tai ksylitolidehydrogenaasia koodattavalla 25 geenillä tai että isäntä ei ilmennä D-ksylulokinaasia (EC I I • .*. 2.7.1.17) tai transketolaasia (EC 2.2.1.1).
• · « · .··,·. 23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen yhdistelmäisän- • « « u m tä, tunnettu siitä, että luontaista metaboliatie-tä, joka johtaa arabitoliin lopputuotteena ei-yhdistelmä- ♦ · ... 30 isännässä, on jatkettu tai muunnettu tavalla, joka lisää • · ·;·* ksylitolin syntetisoitumista mainitussa yhdistelmäisännäs- • · · : : : sä.
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen yhdistelmäisän-tä, tunnettu siitä, että mainittua tietä on jät- 108300 kettu tai muunnettu transformoimalla isäntä ksylitolide-hydrogenaasia (EC l.1.1.9) koodattavalla DNA:11a.
25. Patenttivaatimuksen 22 mukainen yhdistelmäisän-tä, tunnettu siitä, että isäntä ei ilmennä D-ksy- 5 lulokinaasia (EC 2.7.1.17) eikä transketolaasia (EC 2.2.1.1).
25 Torulaspora hansenii, ja sieni valitaan joukosta, johon : kuuluvat Dendryphiella salina ja Schizophyllum commune. • »# «
26. Patenttivaatimuksen 22 mukainen yhdistelmä-isäntä, tunnettu siitä, että isäntä transformoidaan D-glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasia (EC 1.1.1.49) 10 koodittavalla geenillä.
27. Patenttivaatimuksen 22 mukainen yhdistelmä-isäntä, tunnettu siitä, että isäntä transformoidaan 6-fosfo-D-glukonaattidehydrogenaasia (EC 1.1.1.44) koodittavalla geenillä.
28. Patenttivaatimuksen 22 mukainen yhdistelmä- isäntä, tunnettu siitä, että isäntä transformoidaan D-ribuloosi-5-fosfaatti-3-epimeraasia (EC 5.1.3.1) koodittavalla geenillä.
29. Patenttivaatimuksen 22 mukainen yhdistelmäisän- 20 tä, tunnettu siitä, että isäntä transformoidaan ksylitolidehydrogenaasia koodittavalla rakenteella.
30. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 22 - 29 mu-kainen yhdistelmäisäntä, tunnettu siitä, että ei-yhdistelmämikrobi-isäntä on arabitolia tuottava hiiva tai : \i 25 arabitolia tuottava sieni. « · 108300
FI952148A 1992-11-05 1995-05-04 Geenitekninen menetelmä ja isäntä ksylitolin valmistamiseksi FI108300B (fi)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI952148A FI108300B (fi) 1992-11-05 1995-05-04 Geenitekninen menetelmä ja isäntä ksylitolin valmistamiseksi

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US97332592A 1992-11-05 1992-11-05
US97332592 1992-11-05
FI9300450 1993-11-05
PCT/FI1993/000450 WO1994010325A1 (en) 1992-11-05 1993-11-05 Recombinant method and host for manufacture of xylitol
FI952148 1995-05-04
FI952148A FI108300B (fi) 1992-11-05 1995-05-04 Geenitekninen menetelmä ja isäntä ksylitolin valmistamiseksi

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI952148A0 FI952148A0 (fi) 1995-05-04
FI952148A FI952148A (fi) 1995-07-04
FI108300B true FI108300B (fi) 2001-12-31

Family

ID=25520759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI952148A FI108300B (fi) 1992-11-05 1995-05-04 Geenitekninen menetelmä ja isäntä ksylitolin valmistamiseksi

Country Status (15)

Country Link
JP (1) JP3433295B2 (fi)
KR (1) KR950704503A (fi)
AT (1) ATE184917T1 (fi)
AU (1) AU5421594A (fi)
BR (1) BR9307391A (fi)
CA (1) CA2148622A1 (fi)
DE (1) DE69326559T2 (fi)
ES (1) ES2139024T3 (fi)
FI (1) FI108300B (fi)
HU (1) HU219016B (fi)
NO (1) NO951747L (fi)
NZ (1) NZ257561A (fi)
PL (1) PL178040B1 (fi)
RU (1) RU2142999C1 (fi)
WO (1) WO1994010325A1 (fi)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7226761B2 (en) 1992-11-05 2007-06-05 Danisco Sweeteners Oy Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols
US6723540B1 (en) 1992-11-05 2004-04-20 Xyrofin Oy Manufacture of xylitol using recombinant microbial hosts
GB9514538D0 (en) 1995-07-15 1995-09-13 Cerestar Holding Bv Process for the production of xylitol
FR2762011B1 (fr) * 1997-04-11 1999-06-25 Roquette Freres Procede de preparation de ribitol par voie fermentaire et souche de microorganismes mise en oeuvre dans ce procede
FR2765589B1 (fr) * 1997-07-03 1999-09-17 Roquette Freres Fragment d'adn comprenant le promoteur de la ribulose reductase nadph specifique de yamadazyma ohmeri, vecteur le contenant et procede de preparation de proteines utilisant ce vecteur
JP3855486B2 (ja) * 1997-10-17 2006-12-13 味の素株式会社 キシリトールの製造法
JPH11266888A (ja) * 1997-10-17 1999-10-05 Ajinomoto Co Inc キシリトールの製造法
US6335177B1 (en) * 1998-07-08 2002-01-01 Ajinomoto Co., Inc. Microorganisms and method for producing xylitol or d-xylulose
PE20001023A1 (es) * 1998-07-30 2000-10-10 Ajinomoto Kk Deshidrogenasa de xilitol de bacterias de acido acetico y su gen
NZ512088A (en) 1998-12-08 2004-01-30 Children S Hospital And Region Polymorphic loci that differentiate escherichia coli 0157:H7 from other strains
JP2000210095A (ja) * 1999-01-20 2000-08-02 Ajinomoto Co Inc キシリト―ル又はｄ―キシルロ―スの製造法
JP2000295994A (ja) * 1999-02-09 2000-10-24 Ajinomoto Co Inc キシリトールの製造法
US6830903B1 (en) 1999-07-23 2004-12-14 Archer-Daniels-Midland Company Methods for producing L-amino acids using a corynebacterium glutamicum with a disrupted pgi gene
WO2001007626A2 (en) 1999-07-23 2001-02-01 Archer-Daniels-Midland Company Methods for producing l-amino acids by increasing cellular nadph
DE60141811D1 (de) 2000-01-21 2010-05-27 Danisco Herstellung von durch 5 kohlenstoffatome charakterisierte zucker und zuckeralkohole
US6894199B2 (en) 2001-04-27 2005-05-17 Danisco Sweeteners Oy Process for the production of xylitol
GB2406855A (en) * 2003-02-07 2005-04-13 Danisco Sweeteners Oy Production of xylitol from a carbon source other than xylose and xylulose
WO2005113759A2 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 Biotechnology Research And Development Corporation Microbial production of xylitol via a hexose phosphate and a pentose phosphate intermediate
EP1766021B1 (en) * 2004-05-20 2012-05-09 AES Chemunex S.A. Polynucleotides for the detection of escherichia coli o157:h7 and escherichia coli o157:nm verotoxin producers
KR101246780B1 (ko) * 2010-10-06 2013-03-26 한국과학기술원 아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법
ES2673865T3 (es) * 2014-06-18 2018-06-26 Roquette Frères Producción de xilitol a partir de glucosa mediante una cepa recombinante
WO2023220547A1 (en) * 2022-05-09 2023-11-16 Cargill, Incorporated Genetically modified yeast and fermentation processes for the production of polyols

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4009676A1 (de) * 1990-03-26 1991-10-02 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Dna-sequenz, umfassend ein fuer xylosereduktase und/oder xylitoldehydrogenase codierendes strukturgen
FI901771A (fi) * 1990-04-06 1991-10-07 Valtion Teknillinen Anvaendning av xylos hos hybridjaest.

Also Published As

Publication number Publication date
JP3433295B2 (ja) 2003-08-04
WO1994010325A1 (en) 1994-05-11
AU5421594A (en) 1994-05-24
BR9307391A (pt) 1999-08-31
ATE184917T1 (de) 1999-10-15
ES2139024T3 (es) 2000-02-01
NO951747L (no) 1995-07-05
NO951747D0 (no) 1995-05-04
HU219016B (hu) 2001-01-29
KR950704503A (ko) 1995-11-20
RU2142999C1 (ru) 1999-12-20
NZ257561A (en) 1996-09-25
HUT72187A (en) 1996-03-28
PL308742A1 (en) 1995-08-21
FI952148A (fi) 1995-07-04
DE69326559T2 (de) 2000-02-10
PL178040B1 (pl) 2000-02-29
JPH08505522A (ja) 1996-06-18
RU95113172A (ru) 1997-03-27
CA2148622A1 (en) 1994-05-11
FI952148A0 (fi) 1995-05-04
DE69326559D1 (de) 1999-10-28
HU9501288D0 (en) 1995-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI108300B (fi) Geenitekninen menetelmä ja isäntä ksylitolin valmistamiseksi
EP0672161B1 (en) Recombinant method and host for manufacture of xylitol
Fischer et al. Cloning, sequencing, and molecular analysis of the sol operon of Clostridium acetobutylicum, a chromosomal locus involved in solventogenesis
CA2661090C (en) Stable recombinant yeasts for fermenting xylose to ethanol
US5866382A (en) Xylose utilization by recombinant yeasts
EP2718442B1 (en) Genetic manipulation and expression systems for pucciniomycotina and ustilaginomycotina subphyla
CN105189731A (zh) 制备脂肪二羧酸的生物学方法
US20090053784A1 (en) Expression of an active carrier from xylose in genetically modified saccharomyces cerevisae
US20150218595A1 (en) Fermentative production of alcohols
JPH10229885A (ja) 新規アルコールアルデヒド脱水素酵素
US6723540B1 (en) Manufacture of xylitol using recombinant microbial hosts
EP0373181A1 (en) ENZYME.
Ruohonen et al. Optimization of Bacillus α‐amylase production by Saccharomyces cerevisiae
Saliola et al. Two genes encoding putative mitochondrial alcohol dehydrogenases are present in the yeast Kluyveromyces lactis
DK175566B1 (da) DNA-Streng, der koder for alfa-acetolactat-decarboxylase, gærsvamp transformeret med DNA-strengen, fremgangsmåde til fremstilling af en gærsvamp med nedsat alfa-acetolactat-producerende evne og fremgangsmåde til fremstilling.....
JP3478396B2 (ja) 黒色アスペルギルスカタラーゼ−ｒの産生
Olsson et al. Silencing MIG1 in Saccharomyces cerevisiae: effects of antisense MIG1 expression and MIG1 gene disruption
Nakagawa et al. Isozymes of methanol oxidase in a methanol-utilizing yeast, Pichia methanolica IAM 12901
AU2004272775C1 (en) An NADH dependent L-xylulose reductase
JP3549551B2 (ja) Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性をコードするｄｎａ化合物および組換えｄｎａ発現ベクター
Williams et al. Isolation by genetic complementation of two differentially expressed genes for β-isopropylmalate dehydrogenase from Aspergillus niger
US6391599B1 (en) Sham-sensitive terminal oxidase gene from xylose-fermenting yeast
CN103403143B (zh) 木糖发酵微生物
US20040132074A1 (en) New enzyme for an in vivo and in vitro utilisation of carbohydrates
MXPA98009223A (en) Recombinant yeas stable to ferment xilosa to eta

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed