TW201329234A

TW201329234A - 源自人類基因的啟動子

Info

Publication number: TW201329234A
Application number: TW101144256A
Authority: TW
Inventors: Kenji Murakami
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2012-11-27
Publication date: 2013-07-16
Also published as: BR112014012682A2; TW201632625A; AU2012344855A1; IL232848A0; TW201632624A; IN2014CN03882A; AU2012344855C1; SG11201402476XA; ES2670894T3; KR20140100475A; US9862969B2; US20140342401A1; EP2787080B1; KR101931404B1; WO2013080934A1; RU2014121383A; CN104066839B; CN104066839A; JPWO2013080934A1; EP2787080A4

Abstract

本發明係關於藉由使用具有源自人類基因之啟動子的外來基因表現載體，使外來蛋白質分泌能力增強之哺乳動物轉形宿主細胞，以及使用該哺乳動物轉形宿主細胞製造該外來蛋白質之方法。本發明之課題係提供在哺乳動物培養細胞等宿主細胞中，使作為蛋白質性醫藥品之外來蛋白質之產生亢進的手段。本發明之解決手段為提供一種源自人類基因的啟動子，其在哺乳動物培養細胞等宿主細胞中，具有比巨細胞病毒(CMV)啟動子強之啟動子活性。

Description

源自人類基因的啟動子

本發明係關於藉由使用具有源自人類基因的啟動子之外來基因表現載體，使外來蛋白質之轉錄活性增強之哺乳動物轉形宿主細胞，及使用該哺乳動物轉形宿主細胞製造該外來蛋白質之方法。

隨著基因重組技術之發展，所謂治療用蛋白質或抗體醫藥之蛋白質性醫藥品正急速地擴大其市場。其中，抗體醫藥縱使投與至人體不會引起有害之免疫反應，由於其特異性高，開發仍興盛地進行。

就生產以抗體醫藥為代表之蛋白質性醫藥的宿主而言，可列舉微生物或酵母、昆蟲、動植物細胞、基因轉殖動植物等。在蛋白質性醫藥之生理活性或抗原性方面，由於必須進行所謂「折疊(folding)或糖鏈修飾」之轉譯後修飾，無法進行複雜的轉譯後修飾之微生物或糖鏈構造不同之植物不適合作為宿主。具有與人類類似之糖鏈構造，可進行轉譯後修飾，再者考慮安全性方面，為人類近緣生物之CHO細胞(Chinese Hamster Ovary：中國倉鼠卵巢)等哺乳動物培養細胞成為現代之主流。

在以哺乳動物培養細胞作為宿主之情況，與微生物等比較，具有增殖速度降低、生產性降低、高價成本等問題(非專利文獻1)。又，由於為了將蛋白質性醫藥品應用於臨床上必須大量之投與，所以世界各國均有其生產能力不足的問題。由於以哺乳類培養細胞表現系製造蛋白質性醫藥品之情況，與合成低分子醫藥品相比，製造成本高，雖藉由各製造步驟之改良力圖減低製造成本之減低，不過哺乳類培養細胞表現系之生產量提高，亦為製造成本減低之有力方法(非專利文獻2、3)。其中，為了使哺乳動物培養細胞中之外來基因之生產性提高，迄今試行啟動子或增強子(enhancer)、藥劑選擇標記(marker)、基因擴增、培養工學手法等多種途徑。在使用CHO細胞作為宿主細胞之情況，在外來基因之表現，即蛋白質性醫藥品之生產上，一般使用源自病毒之人類巨細胞病毒極早期基因啟動子(Human cytomegalovirus major immediate early promoter)(以下稱為CMV啟動子)(非專利文獻4、5、6)。又，已知在CHO細胞中，使用為人類核糖體蛋白質基因之RPL32或RPS11的轉錄起始點上游區域之聚核苷酸作為DNA元件(DNA element)，可與其他異種啟動子組合而使用於蛋白質表現(非專利文獻7、專利文獻1)

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]WO2006/123097

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Florian M. Wurm., Nat. Biotechnol. 22(11): 1393-1398, 2004

[非專利文獻2]Farid SS., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 848(1): 8-18,2007

[非專利文獻3]Werner RG. Economic aspects of commercial manufacture of biopharmaceuticals. J Biotechnol. 113(1-3): 171-182,2004

[非專利文獻4]Durocher Y et al., Curr Opin Biotechnol. 20(6): 700-707, 2009

[非專利文獻5]Boshart M et al., Cell. 41(2): 521-530, 1985

[非專利文獻6]Foecking MK et al., Gene. 45(1): 101-105, 1986

[非專利文獻7]Hoeksema F. et al., Biotechnology Research International, Volume2011, Article ID 492875, 11pages

本發明之課題，為提供在哺乳動物培養細胞等宿主細胞中，使用具有高外來基因表現亢進活性的啟動子，以使作為蛋白質性醫藥品之外來蛋白質之產生亢進的手段。本發明者藉由發現在CHO細胞等中具有與CMV啟動子同等以上啟動子活性之啟動子，可提供使哺乳動物細胞安定地達成外來基因之高度表現的手段，並可提供在哺乳類培養細胞表現系中使蛋白質生醫藥品之生產量提高、亦即製造成本減低之手段。

本發明人等，為了解決前述課題而反覆專心研究的結果，發現從人類核糖體蛋白基因之轉錄起始點上游約2kbp之核苷酸至對應於起始密碼子之核苷酸序列之緊鄰前方之核苷酸為止的聚核苷酸，具有優良之啟動子活性，可使哺乳動物培養細胞中作為表現對象之外來蛋白質的生產性顯著地提高，而完成本發明。亦即，本發明包含以下之發明：

(1)一種聚核苷酸，其包含在序列表之序列編號1中所記載之核苷酸序列。

(2)一種聚核苷酸，其包含在序列表之序列編號2中所記載之核苷酸序列。

(3)一種聚核苷酸，其包含在序列表之序列編號3中所記載之核苷酸序列。

(4)一種聚核苷酸，其包含與在前述(1)至(3)之任一項中所記載之核苷酸序列比對時具有95%以上相同性之核苷酸序列，且具有啟動子活性。

(5)一種聚核苷酸，其包含與在前述(1)至(3)之任一項中所記載之核苷酸序列比對時具有99%以上相同性之核苷酸序列，且具有啟動子活性。

(6)一種聚核苷酸，其係可與包含互補核苷酸序列之聚核苷酸在嚴苛條件下雜交的聚核苷酸，且具有啟動子活性，其中該互補核苷酸序列係與前述(1)至(3)之任一項所記載之核苷酸序列互補。

(7)一種外來基因表現單元，其係由包含前述(1)至(6)之任一項所記載之聚核苷酸所構成。

(8)如前述(7)所記載之外來基因表現單元，其中該外來基因為編碼多聚體蛋白質(multimeric protein)的基因。

(9)如前述(7)所記載之外來基因表現單元，其中該外來基因為編碼雜多聚體蛋白質的基因。

(10)如前述(7)所記載之外來基因表現單元，其中該外來基因為編碼抗體或其功能性片段的基因。

(11)一種外來基因表現載體，其包含前述(7)至(10)之任一項所記載之外來基因表現單元。

(12)一種外來基因表現載體，其包含前述(7)至(10)之任一項所記載之外來基因表現單元及從下述A群之(a)至(i)所記載之聚核苷酸所選出之任一個或複數個聚核苷酸。

A群

(a)包含在序列表之序列編號10中所記載之核苷酸序列的聚核苷酸；(b)包含在序列表之序列編號11中所記載之核苷酸序列的聚核苷酸；(c)包含在序列表之序列編號12中所記載之核苷酸序列的聚核苷酸；(d)包含在序列表之序列編號13中所記載之核苷酸序列的聚核苷酸；(e)包含在序列表之序列編號14中所記載之核苷酸序列的聚核苷酸；(f)包含在序列表之序列編號10至14之任一個中所記載之核苷酸序列之至少3000個連續核苷酸的聚核苷酸；(g)包含在序列表之序列編號10至14之任一個中所記載之核苷酸序列之至少2000個連續核苷酸的聚核苷酸； (h)包含與在前述(a)至(g)之任一項中所記載之核苷酸序列比對時具有95%以上相同性之聚核苷酸序列，且具有外來基因表現亢進活性的聚核苷酸；(i)包含與在前述(a)至(g)之任一項中所記載之核苷酸序列比對時具有99%以上相同性之核苷酸序列，且具有外來基因表現亢進活性的聚核苷酸。

(13)一種轉形細胞，其導入有前述(11)或(12)所記載之外來基因表現載體。

(14)一種轉形細胞，其導入有前述(11)或(12)記載之外來基因表現載體及元件載體。

(15)如前述(13)或(14)所記載之轉形細胞，其中該細胞為來自哺乳動物的培養細胞。

(16)如前述(15)所記載之轉形細胞，其中該來自哺乳動物之培養細胞係COS-1細胞、293細胞、或CHO細胞。

(17)一種蛋白質之製造方法，其特徵為培養前述(13)至(16)之任一項所記載之轉形細胞，從培養物取得來自外來基因之蛋白質。

(18)一種如前述(1)至(6)之任一項所記載之聚核苷酸序列的使用，其目的為使轉形細胞中之外來基因表現。

(19)一種如前述(11)或(12)所記載之外來基因表現載體的使用，其目的為使轉形細胞中之外來基因表現。

藉由將使用本發明之源自人類基因的啟動子之外來基因表現載體導入哺乳動物宿主細胞，變得可使治療用蛋白質或抗體等之外來基因之表現顯著地亢進。又，本發明之啟動子藉由與DNA元件組合，變得可使治療用蛋白質或抗體等之外來基因的表現更為亢進。

[實施發明之形態]

以下，具體地說明本發明。

在本說明書中，「基因」意指可被轉錄成mRNA，進而被轉譯成蛋白質之部分，其不僅包含DNA，亦包含其mRNA、cDNA及其RNA。

在本說明書中，「聚核苷酸」以與核酸同義來使用，其亦可包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸及引子。

在本說明書中，「多肽」與「蛋白質」在使用上無區別。

在本說明書中，「基因表現」意指某種基因轉錄為mRNA之現象、及/或從該mRNA轉譯為蛋白質之現象。

在本說明書中，「外來基因」意指以人工方式導入宿主細胞的基因。

在本說明書中，「外來蛋白質」意指由外來基因編碼之蛋白質。

在本說明書中，「基因表現單元」意指在轉錄之讀框方向，至少具有啟動子區域、外來基因、轉錄終止子區域(聚A附加信號)的聚核苷酸。

在本說明書中，「外來基因表現亢進活性」意指藉由在包含外來基因之基因表現單元周邊DNA作出對轉錄有利之環境，使轉錄效率大為提高，而使外來蛋白質在宿主細胞中之生產亢進的活性。

在本說明書中，「啟動子」意指參與從DNA轉錄至RNA之起始的轉錄因子所結合之區域。在本說明書中亦稱為「啟動子區域」。就啟動子而言，可例示如從轉錄起始點上游約2kbp的核苷酸至對應起始密碼子之核苷酸序列之緊鄰前方之核苷酸為止的聚核苷酸，亦可包含5’UTR及內含子。

在本說明書中，「啟動子活性」意指轉錄因子與啟動子結合，起始轉錄，進行由基因所編碼之蛋白質之生產的活性，可用由分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)等報告基因(reporter gene)所編碼之蛋白質之活性作為指標進行檢定。

在本說明書中，「具有啟動子活性」意指在與以後述(實施例3)所記載之SEAP表現量作為指標之啟動子活性之評價同樣的條件下，具有與CMV啟動子同等以上之SEAP表現活性。

在本說明書中，「DNA元件」意指在配置於基因表現單元之近傍或基因表現單元所包含之外來基因表現載體上的情況，具有外來基因表現亢進活性之聚核苷酸。

在本說明書中，「抗體之功能性片段」意指與抗原具有結合活性之抗體之部分片段，雖包含Fab、F(ab’)₂等，不過只要具有與抗原結合之能力，不限於此等分子。

在本說明書中，「相同性」，如本領域中所周知，意指藉由序列之比較所決定之2個以上之核苷酸序列或胺基酸序列之序列間關係。在本領域中，「相同性」，視情況又意指由一列之2個以上核苷酸序列間或2個以上之胺基酸序列間之一致性所決定之，核酸分子間或多肽間之序列關連性的程度。「相同性」可藉由特定之數理模型或電腦程式(亦即，「演算法(algorithm)」)算出2個以上之序列中較小者與位址被指定之缺口對準(gap alignment)(存在之情況)之間的一致性百分比來評價。具體而言，雖可藉由使用歐洲分子生物實驗室-歐洲生物資料所(European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute(EMBL-EBI))所提供之ClustalW2等軟體來進行評價，不過只要為本領域人士所使用者即可，並無限定。

在本說明書中，「在嚴苛條件下雜交」意指可形成特異性雜交體，但不會形成非特異性雜交體之條件。例如，可列舉：包含與某核酸之相同性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，最佳為99%以上之核苷酸序列的核酸之互補鏈可雜交，而包含比其相同性低之核苷酸序列的核酸之互補鏈不雜交之條件。更具體而言，意指：在市售之雜交溶液即ExpressHyb雜交溶液(Clontech公司製)中，於68℃進行雜交，或使用固定有DNA之過濾器，在0.7至1.0M之NaCl存在下，於68℃進行雜交後，使用0.1至2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度SSC意指包含150mM之NaCl、15mM之檸檬酸鈉)，於68℃洗淨之條件或與其同等之條件下進行雜交。

1.使外來基因之表現亢進所使用的啟動子

就本發明之源自人類基因的啟動子(以下，亦稱為「本發明之啟動子」)而言，以從人類核糖體蛋白質基因之轉錄起始點之上游約2kbp的核苷酸至在對應起始密碼子之核苷酸序列之緊鄰前方之核苷酸為止的聚核苷酸為較佳，亦可為從轉錄起始點之上游約1kbp或0.5kbp的核苷酸至對應起始密碼子序列之核苷酸序列之緊鄰前方之核苷酸為止的聚核苷酸。

就該人類核糖體蛋白質基因而言，較佳為人類核糖體蛋白質S7基因(以下稱為「RPS7」)、人類核糖體蛋白質L32基因(以下稱為「RPL32」)、人類核糖體蛋白質L34基因(以下稱為「RPL34」)。

就本發明之啟動子而言，較佳為RPS7、RPL32、或RPL34之啟動子，更佳為序列表之序列編號1至9所記載之聚核苷酸，特佳為序列編號1至3之聚核苷酸。

序列編號1至3之核苷酸序列分別為包含從RPS7、RPL32、RPL34之轉錄起始點之上游約2kbp之核苷酸至對應起始密碼子之核苷酸序列之緊鄰前方之核苷酸的序列；序列編號4、6及8分別為包含從RPS7、RPL32、RPL34之轉錄起始點之上游約1kbp之核苷酸至對應起始密碼子之核苷酸序列之緊鄰前方之核苷酸的序列，序列編號5、7及9分別為包含從RPS7、RPL32、RPL34之轉錄起始點之上游約0.5kbp之核苷酸至對應起始密碼子之核苷酸序列之緊鄰前方之核苷酸的序列。

又，本發明之啟動子，只要為包含：與序列編號1至9所示之任一核苷酸序列比對時具有80%以上，較佳 90%以上，更佳95%以上，最佳99%以上之相同性之核苷酸序列，且具有啟動子活性的聚核苷酸即可。

本發明之啟動子可為能與包含互補核苷酸序列的聚核苷酸於嚴苛條件下雜交，並且，具有啟動子活性的聚核苷酸，其中該互補核苷酸序列係與包含從序列編號1至9所記載之核苷酸序列所構成之群組中選出之任一核苷酸序列的聚核苷酸互補。

本發明之啟動子可為變異聚核苷酸，且具有啟動子活性的聚核苷酸，其中該變異聚核苷酸包含：在從序列編號1至9所記載之核苷酸序列所構成之群組中選出之任一核苷酸序列中，欠缺、置換及/或附加1個或複數個，較佳1至300個，更佳1至30個核苷酸而成之核苷酸序列。

前述核苷酸序列之變異(欠缺、置換、及/或附加)的導入，可依照Kunkel法或Gapped duplex法等本技術領域中周知的手法，或以其為基準的方法進行，例如可使用：利用部位特異突變誘發法之變異導入用套組(例如Mutant-K(Takara Bio公司製)或Mutant-G(Takara Bio公司製)、Takara Bio公司之LA PCR試管內致突變(LA PCR in vitro Mutagenesis)系列套組等。亦可使用此等變異聚核苷酸作為本發明之啟動子。

本發明之啟動子所具有之外來基因表現亢進活性，能以SEAP等報告基因所編碼之蛋白質的活性作為指標來檢定。將使用CMV啟動子之情況與使用本發明之啟動子之情況比較，若報告蛋白質之活性為同等以上，較佳1.2倍以上，更佳1.5倍以上地升高，則可判斷該啟動子具有外來基因表現亢進活性。縱使藉由約1.2倍以上之亢進，亦可期待細胞之培養規模之削減、培養時間及精製步驟之縮短，結果可達成產量之提高及培養成本之削減。若產量提高，將可安定地供給作為醫藥之外來蛋白質。又，若培養成本削減，則作為醫藥之外來蛋白質之價格可降低。

又，本發明之啟動子，藉由使用同業者所周知之方法導入宿主細胞，將亦可用於使宿主細胞之內在性基因的表現亢進。

2.外來基因表現單元

本發明之外來基因表現單元(以下，亦稱為「本發明之基因表現單元」)，係在轉錄之讀框的方向，至少具有於前述1.中所記載之本發明啟動子、外來基因、及轉錄終止子區域(聚A附加信號)者。

又，聚A附加序列，只要為對於從啟動子之轉錄，具有引發轉錄終結之活性的序列即可，亦可為與啟動子之來源基因相同或相異的基因所具有者。

3.使外來基因之表現亢進的DNA元件

藉由將於前述2.中所記載之本發明之基因表現單元與DNA元件組合使用，可使外來基因之表現更為亢進。組合而用之DNA元件，如在實施例6中所示，可用與乙醯化組蛋白H3之相互作用作為指標而取得。據報組蛋白(H3、H4)之乙醯化一般參與轉錄之活性化，關於此主要有2假說被列入考慮。即與所謂「組蛋白尾端藉由乙醯化而使電荷中和，DNA與組蛋白之結合變慢」之核小體之立體構造改變有關的假說(Mellor J.(2006)Dynamic nucleosomes and gene transcription.Trends Genet.22(6)：320-329)，以及所謂參與各種轉錄因子之徵召(recruit)的假說(Nakatani Y.(2001)Histone acetylases-versatile players.Genes Cells.6(2)：79-86)。任一種說法，組蛋白之乙醯化參與轉錄活性化的可能性均高，藉由使用抗乙醯化組蛋白H3抗體之染色質免疫沉降(Chromatin Immunoprecipitation；ChIP)，可將與乙醯化組蛋白H3相互作用之DNA元件濃縮。

可列舉A2作為與本發明之啟動子組合使用之用於使外來基因之表現亢進的DNA元件之一。A2為位於人類15號染色體80966429~80974878，AT含量62.2%，8450bp之聚核苷酸。A2之核苷酸序列記載於序列表之序列編號10中。

就同樣之DNA元件而言，可列舉A7、A18、B5、C14。A7為位於人類11號染色體88992123~89000542，AT含量64.52%，8420bp之聚核苷酸。A7之核苷酸序列記載於序列表之序列編號11中。

A18為位於人類4號染色體111275976~111284450，AT含量62.54%，8475bp之聚核苷酸。A18之核苷酸序列記載於序列表之序列編號12中。

B5為位於人類1號染色體143034684~143043084，AT含量66.37%，8401bp之聚核苷酸。B5之核苷酸序列記載於序列表之序列編號13中。

最後，C14為位於人類11號染色體46089056~ 46097482，AT含量63.81%，8427bp之聚核苷酸。C14之核苷酸序列記載於序列表之序列編號14中。

與本發明之啟動子組合使用之DNA元件所具有之外來基因表現亢進活性，可用由SEAP等報告基因所編碼之蛋白質的活性作為指標而進行檢定。

在與本發明之啟動子組合使用之情況，可將前述DNA元件之任1種單獨地使用，亦可將DNA元件之1種複製2個以上使用。或者亦可將2種以上DNA元件組合使用。

就與本發明之啟動子組合使用之DNA元件的較佳例子而言，可列舉A2、A7、A18、B5、C14。

在本發明中所使用之DNA元件，可為包含與序列編號10至14所示之核苷酸序列比對時具有80%以上，較佳90%以上，更佳95%以上，最佳99%以上之相同性之核苷酸序列，且具有外來基因表現亢進活性的核苷酸序列。核苷酸序列之同源性檢索，可以例如日本DNA數據庫(DNA Databank of JAPAN)等為對象，使用FASTA或BLAST等程式來進行。

可與本發明之啟動子組合使用之DNA元件，可為能與包含互補核苷酸序列之聚核苷酸於嚴苛條件下雜交，且具有外來基因表現亢進活性之DNA元件，其中該互補核苷酸序列係與包含從序列編號10至14所記載之核苷酸序列所構成之群組中選出之任一核苷酸序列的聚核苷酸互補。

若為本技術人士，藉由參照Molecular cloning (Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning：a Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,10 Skyline Drive Plainview,NY(1989))等，可容易地取得此等同源基因。又，前述之核苷酸序列之相同性，同樣地可藉由FASTA檢索或BLAST檢索而決定。

前述聚核苷酸之變異(缺失、置換、及/或附加)之導入，可藉由Kunkel法或帶缺口的雙鏈(Gapped duplex)法等本技術領域中周知的手法，或以其為基準之方法而進行，例如可使用利用部位特異性突變誘發法之變異導入用套組(例如Mutant-K(Takara Bio公司製)或Mutant-G(Takara Bio公司製)、Takara Bio公司之LA PCR試管內突變系列套組等。如此的變異聚核苷酸亦可使用作為本發明之DNA元件。

就可與本發明之啟動子組合使用之DNA元件而言，可使用包含在序列表之序列編號10至14之任一個記載之核苷酸序列中至少3000個，或至少2000個連續核苷酸的部分片段。就此種部分片段之例子而言，可列舉為A2之部分片段的A2-1至A2-17、為A7之部分片段的A7-1至A7-18、為A18之部分片段的A18-1至A18-4、為B5之部分片段的B5-1至B5-6、或為C14之部分片段的C14-1至C14-14，不過只要具有外來基因表現亢進活性，不限於此等部分片段。

在本發明中，可將前述部分片段之任1種單獨使用，亦可將部分片段之1種複製2個以上使用。或者，亦可將2種以上部分片段組合使用。又，亦可將各DNA元件之全長序列與部分片段組合使用。該組合中，部分片段可來自構成組合之全長序列DNA元件，亦可來自相異之全長序列DNA元件。

在A2之各片段之聚核苷酸序列中，A2-1相當於包含序列表之序列編號10之第1至3000號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-2相當於包含序列表之序列編號10之第2801至5800號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-3相當於包含序列表之序列編號10之第5401至8450號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-4相當於包含序列表之序列編號10之第701至2700號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-5相當於包含序列表之序列編號10之第701至2200號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-6相當於包含序列表之序列編號10之第701至3700號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-7相當於包含序列表之序列編號10之第2001至5000號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-8相當於包含序列表之序列編號10之第4001至7000號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-9相當於包含序列表之序列編號10之第1至3700號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-10相當於包含序列表之序列編號10之第2001至5800號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-11相當於包含序列表之序列編號10之第2801至7000號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-12相當於包含序列表之序列編號10之第701至5800號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-13相當於包含序列表之序列編號10之第2001至7000號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-14相當於包含序列表之序列編號10之第2801至8450號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-15相當於包含序列表之序列編號10之第1至5800號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-16相當於包含序列表之序列編號10之第701至7000號之核苷酸的聚核苷酸序列，以及A2-17相當於包含序列表之序列編號10之第2001至8450號之核苷酸的聚核苷酸序列。

A7之各片段之聚核苷酸序列中，A7-1相當於包含序列表之序列編號11之第601至3600號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-2相當於包含序列表之序列編號11之第3601至8420號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-3相當於包含序列表之序列編號11之第5401至8420號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-4相當於包含序列表之序列編號11之第3401至6400號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-5相當於包含序列表之序列編號11之第1501至4500號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-6相當於包含序列表之序列編號11之第4401至7400號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-7相當於包含序列表之序列編號11之第2401至5400號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-8相當於包含序列表之序列編號11之第1至3600號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-9相當於包含序列表之序列編號11之第1501至5400號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-10相當於包含序列表之序列編號11之第2401至6400號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-11相當於包含序列表之序列編號11之第3401至7400號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-12相當於包含序列表之序列編號11之第4401至8420號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-13相當於包含序列表之序列編號11之第1至5400號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-14相當於包含序列表之序列編號11之第1501至6400號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-15相當於包含序列表之序列編號11之第2401至7400號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-16相當於包含序列表之序列編號11之第3401至8420號之核苷酸的聚核苷酸序列，A7-17相當於包含序列表之序列編號11之第1至6400號之核苷酸的聚核苷酸序列，以及A7-18相當於包含序列表之序列編號11之第1501至7400號之核苷酸的聚核苷酸序列。

A18之各片段之聚核苷酸序列中，A18-1相當於包含序列表之序列編號12之第1至5040號之核苷酸的聚核苷酸序列，A18-2相當於包含序列表之序列編號12之第1001至6002號之核苷酸的聚核苷酸序列，A18-3相當於包含序列表之序列編號12之第2001至7000號之核苷酸的聚核苷酸序列，以及A18-4相當於包含序列表之序列編號12之第3000至7000號之核苷酸的聚核苷酸序列。

B5之各片段之聚核苷酸序列中，B5-1相當於包含序列表之序列編號13之第1至4001號之核苷酸的聚核苷酸序列，B5-2相當於包含序列表之序列編號13之第1至3200號之核苷酸的聚核苷酸序列，B5-3相當於包含序列表之序列編號13之第2491至5601號之核苷酸的聚核苷酸序列，B5-4相當於包含序列表之序列編號13之第5373至8401號之核苷酸的聚核苷酸序列，B5-5相當於包含序列表之序列編號13之第901至4001號之核苷酸的聚核苷酸序列，以及B5-6相當於包含序列表之序列編號13之第4001至7000號之核苷酸的聚核苷酸序列。

C14之各片段之聚核苷酸序列中，C14-1相當於包含序列表之序列編號14之第960至4015號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-2相當於包含序列表之序列編號14之第1987至5014號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-3相當於包含序列表之序列編號14之第4020至7119號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-4相當於包含序列表之序列編號14之第960至8141號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-5相當於包含序列表之序列編號14之第960至6011號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-6相當於包含序列表之序列編號14之第4939至8141號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-7相當於包含序列表之序列編號14之第960至5014號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-8相當於包含序列表之序列編號14之第2994至7119號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-9相當於包含序列表之序列編號14之第4020至8141號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-10相當於包含序列表之序列編號14之第1至5014號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-11相當於包含序列表之序列編號14之第1987至7119號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-12相當於包含序列表之序列編號14之第2994至8141號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-13相當於包含序列表之序列編號14之第960至7119號之核苷酸的聚核苷酸序列，以及C14-14相當於包含序列表之序列編號14之第1987至8141號之核苷酸的聚核苷酸序列。

4.聚核苷酸之取得

在本發明中，包含編碼外來蛋白質(為後述產生亢進對象)之外來基因的聚核苷酸，可藉由以下所示之一般方法而取得。例如，可藉由使用根據該基因片段所合成之DNA探針，篩選來自可表現外來基因之細胞或組織的cDNA庫而單離。mRNA之調製，可藉由該技術領域中通常所用之手法而進行。例如，用胍試藥、酚試藥等處理前述細胞或組織，得到全RNA，然後，藉由親和性管柱法，或者藉由批次法得到聚(A)+RNA(mRNA)，其中該親和性管柱法係使用寡(dT)纖維素管柱或以瓊脂糖凝膠(sepharose)2B作為承載體之聚U-瓊脂糖凝膠等。再者，亦可藉由蔗糖密度梯度離心法等，將聚(A)+RNA進一步分劃。接著，以所得到之mRNA作為模板，使用寡聚dT引子及逆轉錄酵素合成單股cDNA，然後使用DNA合成酵素I、DNA連接酶(ligase)及RNaseH等，從該單股cDNA合成雙股cDNA。將合成之雙股cDNA藉由T4DNA合成酵素平滑化後，經連接子(adaptor)(例如、EcoRI連接子)之連結、磷酸化等後，藉由組入λgt11等λ噬菌體中進行活體內組裝，製作成cDNA庫。又，除使用λ噬菌體之外，亦可使用質體載體來製作cDNA庫。然後，可從cDNA庫選擇具有目標DNA之株(陽性純系)即可。

又，將生產蛋白質所用之包含前述啟動子、終止子區域的聚核苷酸，包含前述DNA元件、或外來基因的聚核苷酸從基因組DNA單離之情況，可依照一般手法(Molecular Cloning(1989),Methods in Enzymology 194(1991))，從為採取源之生物細胞株抽取基因組DNA，篩選聚核苷酸而進行。基因組DNA之抽取，可依照例如Cryer等之方法(Methods in Cell Biology,12,39-44 (1975))及P.Philippsen等之方法(Methods Enzymol.,194,169-182(1991))來進行。

包含為目標之啟動子、DNA元件、或外來基因之聚核苷酸的取得，亦可藉由例如PCR法(PCR Technology.Henry A.Erlich,Atockton press(1989))來進行。在使用PCR法之聚核苷酸的擴增方面，係使用20~30mer之合成單股DNA作為引子，使用基因組DNA作為模板。經擴增之基因係於確認聚核苷酸序列後使用。就PCR之模板而言，可使用細菌人工染色體(BAC)等之基因組DNA庫。

另一方面，包含序列未知之外來基因的聚核苷酸之取得，可藉由下述(a)及(b)而進行：(a)依照常法製作基因庫，(b)從所製作之基因庫選擇期望的聚核苷酸，並將該聚核苷酸擴增。基因庫，可藉由將依照常法從作為採取源之生物細胞株所得到之染色體DNA，用適當的限制酵素部分消化而片段化，然後將所得到之片段連結於適當的載體，再將該載體導入適當的宿主而調製。又，亦可藉由從細胞抽取mRNA，從其合成cDNA後，連結於適當的載體，將該載體導入適當的宿主而調製。就此時所使用之載體而言，可使用已知作為通常周知之基因庫調製用載體之質體，亦可廣泛地使用噬菌體載體或黏粒(cosmid)等。用於進行轉形或形質導入之宿主，只要依照前述載體之種類而使用即可。包含外來基因之聚核苷酸之選擇，係藉由使用包含外來基因中特有之序列之標識探針的群落雜交法(colony hybridization)、噬菌斑雜交法(plaque hybridization)等從前述基因庫選擇而進行。

又，包含外來基因之聚核苷酸亦可完全以化學方式合成。例如可藉由製作互補之2對寡聚核苷酸，並使其緩冷配對(annealing)之方法，或將數條經緩冷配對之DNA藉由DNA連接酶連結之方法，或製作數條一部分互補之寡聚核苷酸，藉由PCR填補空缺之方法等，合成基因。

聚核苷酸序列之決定，可藉由通常之方法，例如雙脫氧(dideoxy)法(Sanger et al.,Proc.,Natl.Acad.Sci.,USA,74,5463-5467(1977))等而進行。再者，前述聚核苷酸序列之決定，亦可藉由使用市售之序列套組等而容易地進行。

5.外來基因表現載體、元件載體

提供包含在前述2.中所記載之外來基因表現單元的載體作為本發明之外來基因表現載體，其中該外來基因表現單元包含在前述1.中所記載之本發明啟動子。本發明之外來基因表現載體亦可包含：在前述3.中所記載之DNA元件之1種、從前述DNA元件之1種所複製成之2個以上之複製DNA元件、或前述DNA元件之2種以上之組合。藉由前述之外來基因表現載體使外來基因在宿主細胞內表現時，亦可將DNA元件配置於基因表現單元之緊鄰前方或後方，或者亦可配置於與基因表現單元分離的位置。又，亦可使用包含複數個DNA元件之1個外來基因表現載體。再者，DNA元件之方向，可為相對於基因表現單元之順方向或逆方向之任一者。

又，就在本發明中所使用之載體而言，亦包含：含有前述DNA元件之1種、從前述DNA元件之1種所複製成之2個以上之複製DNA元件、或前述DNA元件之2種以上的組合，且不含基因表現單元之載體(以下，稱為「元件載體」)。此種元件載體可與包含前述DNA元件之外來基因表現載體、或只包含外來基因表現單元而不包含DNA元件之外來基因表現載體組合使用。藉由使元件載體並存，由於與單獨使用外來基因表現載體之情況相比，外來基因之表現亢進，所以前述之載體之組合亦包含於本發明之外來基因表現載體中。

就外來基因而言，無特別限定，不過可列舉分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)、綠色螢光蛋白質(GFP)、螢光素酶(luciferase)等報告基因；α-澱粉酶基因、α-半乳糖苷酶基因等各種酵素基因、為醫藥上有用之生理活性蛋白質之干擾素α、干擾素γ等各種干擾素的基因；IL1、IL2等各種介白素的基因；紅血球生成素(EPO)基因、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)基因等各種細胞激素基因；成長因子基因；或編碼多聚體蛋白質的基因，例如編碼為抗體或其功能性片段之雜多聚體的基因等。此等基因亦可為藉由任何手法而得到者。

「抗體之功能性片段」意指具有與抗原結合活性之抗體的部分片段，包含Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、雙特異性抗體(diabody)、線狀抗體、及藉由抗體片段所形成之多特異性抗體等。又，Fab’亦包含於抗體之功能性片段中，該Fab’係將F(ab’)2在還原條件下處理而得之抗體之可變區域的一價片段。但是，只要與抗原具有結合能力，不限於此等分子。又，此等功能性片段中，不僅包含將抗體蛋白質之全長分子用適當酵素處理而得者，亦包含使用經基因工程修改之抗體基因於適當宿主細胞中所產生之蛋白質。

又，本發明之外來基因表現載體及元件載體，可包含用於選取轉形體之選擇標記。例如，可藉由使用藥劑耐性標記等，進行轉形體之選取，其中該藥劑耐性標記賦予對淺藍菌素(cerulenin)、金黃擔子素(aureobasidin)、吉歐黴素(zeocin)、刀豆胺酸(canavanine)、環己醯亞胺、潮黴素(hygromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、保米黴素(blastisidin)、四環素、卡那黴素(kanamycin)、安比西林、新黴素等藥劑之耐性。又，亦可藉由將能賦予對乙醇等之溶劑耐性，對甘油或鹽等之浸透壓耐性、對銅等之金屬離子耐性等之基因作為標記，進行轉形體之選取。

本發明之外來基因表現載體及元件載體亦可為不插入染色體DNA之載體。一般而言，外來基因表現載體導入宿主細胞後，會隨機地插入染色體中，不過，藉由使用來自猿猴病毒40(simian virus 40，簡稱SV40)或乳突病毒(papillomavirus，簡稱BPV、HPV)、EBV等哺乳動物病毒的構成成分，可在導入其之宿主細胞中作為可自行複製之游離型載體(episomal vector)使用。例如，可廣泛使用：具有編碼SV40大型T抗原之序列的載體(其中該SV40大型T抗原為源自SV40之複製起點及反式作用因子(trans-acting factor))，或具有編碼源自EBV之oriP及EBNA-1之序列的載體等。DNA元件之效果，無論載體之種類、或者是否插入染色體中，均可呈現外來基因表現亢進活性。

6.轉形細胞

本發明之轉形細胞係已導入前述5.之外來基因表現載體的轉形細胞。就外來基因表現載體而言，(A)可只導入不含DNA元件之外來基因表現載體，或(B)可將不含DNA元件之外來基因表現載體與元件載體組合並導入，或者(C)可導入包含DNA元件之外來基因表現載體，或(D)可將包含DNA元件之外來基因表現載體與元件載體組合並導入。

藉由前述(B)或(D)之組合而使外來基因於宿主細胞內之表現，可依照例如Girod等人之方法(Biotechinology and Bioengineering,91,2-11(2005))及Otte等人之方法(Biotechnol.Prog.,2007,23,801-807(2007))而進行。

作為被轉形之宿主細胞而言，可為真核細胞，較佳為哺乳動物細胞，更佳為來自人類、小鼠、大鼠、倉鼠、猴、或牛之細胞。就哺乳動物細胞而言，可列舉COS-1細胞、293細胞、CHO細胞(CHO-K1、DG44、CHO dhfr-、CHO-S)等，然而不限於此等。

在本發明中，就將表現載體導入宿主細胞之方法而言，只要為可使導入基因安定地存在於宿主內，並且適當地表現之方法，任何方法均可，一般所使用之方法，可列舉如：磷酸鈣法(Ito et al.,(1984)Agric.Biol.Chem.,48,341)、電穿孔法(Becker,D.M.et al.(1990)Methods.Enzymol.,194,182-187)、原生質球(spheroplast)法 (Creggh et al.,Mol.Cell.Biol.,5,3376(1985))、乙酸鋰法(Itoh,H.(1983)J.Bacteriol.153,163-168)、脂質體轉染(lipofection)法等。

7.外來蛋白質之製造方法

本發明中之外來蛋白質之製造，可藉由以周知之方法培養已導入編碼外來蛋白質之基因之前述6.之項目中所記載的轉形細胞，然後從其培養物中採取、精製該外來蛋白質而進行。「培養物」除意指培養上清液外，亦意指培養細胞、或細胞之破碎物之任一種。再者，就可使用6.之項目中所記載之轉形細胞而產生之外來蛋白質而言，不僅可選擇單體蛋白質，亦可選擇多聚體蛋白質。在生產由複數個不同的亞單元所構成之雜多聚體蛋白質之情況，必須將編碼此等亞單元之複數個基因，分別導入6.之項目中所記載之宿主細胞內。

培養轉形細胞之方法，可依照培養該宿主細胞所使用之通常方法而進行。

轉形細胞為哺乳動物細胞之情況，例如於37℃，5%或8%CO₂條件下培養，培養時間為約24至1000小時，培養可藉由靜置、振動、攪拌、通氣下之分批培養、流加培養或連續培養等而實施。

從前述之培養物(培養液)而來之外來蛋白質基因之表現產物的確認，可藉由SDS-PAGE、西方(Western)解析、ELISA等而進行。為了將所生產之蛋白質單離精製，只要使用通常之蛋白質之單離、精製法即可。培養後，在目標蛋白質被產於細胞內之情況，將細胞藉由超音波破碎機、法式壓濾壺(French Press)、Manton Gaulin均質機、Dyno研磨機等破碎，採收目標蛋白質。又，目標蛋白質被產於細胞外之情況，係將培養液以原樣使用，或藉由離心等除去細胞。然後，亦可藉由有機溶劑之萃取等採收目標蛋白質，並視需要使用各種層析法(疏水性層析法、逆相層析法、親和層析法法、離子交換層析法等)、使用分子篩之凝膠過濾法、使用聚丙烯醯胺凝膠等之電泳法等手法，以單獨或者組合方式進行單離精製即可。

前述之培養法、精製法為一例，不過不限於此等。再者，被精製之基因產物所具有之胺基酸序列之確認，可藉由周知之胺基酸分析，例如根據Edman分解法之自動胺基酸序列決定法等而進行。

8.抗體蛋白質之製造方法

就使用前述7.之項目中所記載之製造方法所製造之雜多聚體蛋白質而言，可列舉抗體蛋白質。抗體蛋白質為包含2分子之重鏈多肽及2分子之輕鏈多肽的4聚體蛋白質。因此，為了以維持抗原結合能力之形態取得抗體蛋白質，必須在前述6.之項目所記載之轉形細胞中，導入重鏈及輕鏈之基因兩者。在此種情況下，重鏈及輕鏈之基因表現單元可存在於相同之表現載體上，或者亦可存在於相異之表現載體上。

就在本發明中所製造之抗體而言，可列舉將兔、小鼠、大鼠等實驗動物以期望之抗原進行免疫而製作之抗體。又，在本發明中所製造之抗體，亦可列舉以前述之抗體作為原料之嵌合抗體、及人型化抗體。再者，關於藉由基因改變動物或噬菌體展示(phage display)法所取得之人型化抗體，亦為在本發明中所製造之抗體。

就抗體製造中所使用之抗體基因而言，只要由該抗體基因所轉錄‧轉譯之重鏈多肽與輕鏈多肽之組合保持與任何抗原蛋白質結合之活性，不限於具有特定聚核苷酸序列的抗體基因。

又，就抗體基因而言，可使用未必將抗體之全長分子編碼，而只將抗體之功能性片段編碼之基因。編碼此等功能性片段編碼之基因，可藉由將編碼抗體蛋白質之全長分子的基因以基因工程方式改變而取得。

9.其他之外來蛋白質之製造方法

就為本發明之製造方法之對象的外來蛋白質而言，除前述之抗體外，可列舉來自人類或非人類動物之各種蛋白質、其之功能性片段、其之改變體等。就此種蛋白質等而言，可列舉心房性利鈉利尿肽(ANP)、腦性利鈉利尿肽(BNP)、C型利鈉利尿肽(CNP)、血管加壓素(vasopressin)、體抑素(somatostatin)、成長激素(GH)、胰島素、催產素(oxytocin)、胃促生長素(ghrelin)、瘦體素(leptin)、脂聯素(adiponectin)、腎素(renin)、降鈣素(calcitonin)、骨保護素(osteoprotegenin)、類胰島素生長因子(IGF)等肽激素、介白素、趨化因子、干擾素、腫瘍壞死因子(TNFα/β以外之TNF超家族等)、神經成長因子(NGF)、細胞增殖因子(EGF、FGF、PDGF、HGF、TGF等)、造血因子(CSF、G-CSF、紅血球生成素等)、脂肪細胞因子(adipokine)等細胞激素、TNF受體等受體、溶菌酶、蛋白酶、蛋白質酶、肽酶等酵素、其之功能性片段(保持一部分或全部之原蛋白質之生物活性的片段)、包含此等蛋白質之融合蛋白質等，不過不限於此等。

[實施例] 10.實施例

以下，藉由實施例具體地說明本發明。不過，此等實施例非對本發明之技術範圍設限。在本發明之實施例中所用之質體、限制酵素、DNA修飾酵素等為市售品，可依照常法使用。又，關於DNA之選殖、聚核苷酸序列之決定、宿主細胞之轉形、轉形細胞之培養、從所得到之培養物採收蛋白質、使用於精製等之操作，為本技術人士所熟知者，或可藉由文獻知悉者。

(實施例1)啟動子活性評價用載體CMV/pSeapIRESpuro之構築

啟動子活性之評價，係以SEAP之表現作為指標而進行，茲進行評價用載體之構築。

1-1)SEAP之cDNA之藉由PCR複製放大時之限制酵素部位的附加

SEAP之cDNA，係藉由使用引子及KOD-Plus(TOYOBO)之PCR進行複製放大，其中在起始密碼子ATG之緊鄰前方使用附加有NheI部位之引子，在終止密碼子之緊鄰後方，使用附加有BglII部位之引子。使用pSEAP2-control(Clontech)作為模板。將所得到之片段以NheI及BglII消化，並用MinElute反應套組(QIAGEN)精製。

使用之引子SEAPF：AAAGCTAGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC SEAPR：AAAAGATCTTCATGTCTGCTCGAAGCGGCCGGCCGC

1-2)CMV/pSeapIRESpuro之構築

將pIRESpuro3(Clontech)以NheI-BamHI消化後，藉由連接(ligation)反應插入在1-1)中所調製之SEAP片段。將所得到之質體命名為CMV/pSeapIRESpuro。

(實施例2)RPS7、RPL32、及RPL34之啟動子區域之選殖

就以mRNA量作為指標，被認定具有轉錄活性高之啟動子的人類基因而言，選出EEF2、YBX1、PPIA、PSAP、RAN、PRL32、PRL34、RPLP1、RPS7、RPS24、TMSB4X、UBC、YWHAE、ARPC2、SERBP1，進行各基因之啟動子區域的選殖，以供實施例3進行啟動子活性的評價。

2-1)RPS7之啟動子區域的選殖

作為RPS7之啟動子區域而言，參考在GenBank中以NM_001011.3登錄之mRNA之序列，使用從RPS7之轉錄起始點之上游約2kbp之核苷酸至對應於起始密碼子序列之核苷酸序列之緊鄰前方之核苷酸為止的序列。

RPS7之啟動子區域，以大腸菌人工染色體之純系RP11-644P19(GenoTechs)作為模板，藉由使用以下所示之引子組及KOD-Plus(TOYOBO)之PCR進行複製放大，並用MinElute反應套組(QIAGEN)精製。將CMV/pSeapIRESpuro用SpeI-NheI消化，去除CMV啟動子後，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech)將RPS7之啟動子區域插入SpeI-NheI部位，而構築成RPS7/pSeapIRESpuro。將所選殖之RPS7之啟動子區域的核苷酸序列示於序列表之序列編號1中。

RPS7之引子組RPS7-F：TTGATTATTGACTAGTATTTATGTATATTAACAGCACATTAACAGC RPS7-R：GCAGCAGCATGCTAGCGGCTTTCTCCTGGGAGAACTGAAGGCACAGCGG

2-2)RPL32之啟動子區域之選殖

作為RPL32之啟動子區域而言，參考於GenBank中以NM_000994.3登錄之mRNA之序列，使用從RPL32之轉錄起始點之上游約2kbp之核苷酸至對應於起始密碼子序列之核苷酸序列之緊鄰前方之核苷酸為止的序列。

RPL32之啟動子區域，以大腸菌人工染色體之純系RP11-767C1(GenoTechs)作為模板，藉由使用以下所示之引子組及KOD-Plus(TOYOBO)之PCR複製放大，並以MinElute反應套組(QIAGEN)精製。將CMV/pSeapIRESpuro用SpeI-NheI消化，除去CMV啟動子後，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech)將RPL32之啟動子區域插入SpeI-NheI部位，構築成RPL32/pSeapIRESpuro。將所選殖之RPL32之啟動子區域的核苷酸序列示於序列表之序列編號2中。

RPL32之引子組RPL32-F：TTGATTATTGACTAGTCTAAAGTGATTCCTA AAGAATTCTTCCC RPL32-R：GCAGCAGCATGCTAGCGATGCCTTTTGGGGAAGAAGCGGCCCC

2-3)RPL34之啟動子區域的選殖

作為RPL34之啟動子區域而言，參考於GenBank以NM_033625.2登錄之mRNA的序列，使用從RPL34之轉錄起始點之上游約2kbp之核苷酸至對應於起始密碼子序列之核苷酸序列之緊鄰前方之核苷酸的序列。

RPL34之啟動子區域，係以大腸菌人工染色體之純系RP11-462C24(GenoTechs)作為模板，藉由使用以下所示之引子組及KOD-Plus(TOYOBO)之PCR進行複製放大，並以MinElute反應套組(QIAGEN)精製。將CMV/pSeapIRESpuro用SpeI-NheI消化，去除CMV啟動子後，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech)將RPL34之啟動子區域插入SpeI-NheI部位，構築成RPL34/pSeapIRESpuro。所選殖之RPL34之啟動子區域的核苷酸序列示於序列表之序列編號3中。

RPL34之引子組RPL34-F：TTGATTATTGACTAGTATGGTGGCACAATCATGGTTCACTGCAGCC RPL34-R：GCAGCAGCATGCTAGCTCTGAGTGCCTAAATTAAGAATAGAGTAACATC

2-4)其他人類基因之啟動子區域的選殖

依據在前述2-1)中所記載之方法，進行EEF2、YBX1、PPIA、PSAP、RAN、PRL32、PRL34、RPLP1、RPS7 、RPS24、TMSB4X、UBC、YWHA、ARPC2、SERBP1之啟動子區域的選殖，構築包含所選殖之聚核苷酸的pSeapIRESpuro。

(實施例3)以CHO-K1多株轉形細胞中之SEAP表現量作為指標之啟動子活性的評價 3-1)轉染

CHO-K1細胞(ATCC)係使用含有10% Ultra-Low IgG FBS(GIBCO)之F-12養分混合物(F-12 Nutrient Mixture)培養基(GIBCO)，於5%CO₂，37℃進行繼代培養。

將CHO-K1細胞以5×10⁵細胞/孔接種於6孔培養盤(IWAKI)中，翌日分別將2μg之在實施例1)、及2)中所製作之CMV/pSeapIRESpuro、RPS7/pSeapIRESpuro、RPL32/pSeapIRESpuro、及RPL34/pSeapIRESpuro等用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染。

3-2)藉由嘌呤黴素之藥劑選擇

於轉染之2日後，將來自6孔培養盤之細胞藉由胰蛋白酶處理而回收，將全量接種於6cm培養皿(Nunc)中，同時在培養基中添加終濃度為8μg/mL之嘌呤黴素(Clontech)，開始藥劑選擇。

3-3)藉由多株轉形細胞株之評價

從開始藥劑選擇算起11日後，用胰蛋白酶回收多株轉形細胞株，並測定細胞數，以1×10⁵細胞/mL/孔接種於24孔培養盤(IWAKI)中，24小時後回收培養上清液，使用SensoLyte^TM pNPP分泌性鹼性磷酸酶報告基因檢定(SensoLyte^TM pNPP Secreted Alkaline Phosphatase Reporter Assay(ANASPEC))測定上清液之SEAP活性。與作為對照之CMV啟動子(CMV/pSeapIRESpuro)的SEAP活性相比較強者為RPS7、RPL32、RPL34之啟動子區域，分別為1.7倍以上、2.0倍以上、2.5倍以上之SEAP活性(第1圖)。EEF2、YBX1、PPIA、PSAP、RAN、PRL32、PRL34、RPLP1、RPS7、RPS24、TMSB4X、UBC、YWHA、ARPC2、SERBP1之啟動子區域與CMV啟動子之SEAP活性相比則較弱。

(實施例4)截短型啟動子之選殖

就RPS7、RPL32、及RPL34之截短型啟動子而言，使用從各基因之轉錄起始點之約1kb上游的核苷酸至對應於起始密碼子之核苷酸序列之緊鄰前方之核苷酸為止的核苷酸序列(T1)、及從轉錄起始點之約0.5kb上游之核苷酸至對應起始密碼子之核苷酸序列之緊鄰前方之核苷酸為止的核苷酸序列(T2)，實施其截短型啟動子之選殖。

4-1)RPS7T1、及RPS7T2之選殖

RPS7T1、及RPS7T2，係以2-1)中所製作之RPS7/pSeapIRESpuro作為模板，藉由使用以下所示之引子組及KOD-Plus(TOYOBO)之PCR進行複製放大，並以MinElute反應套組(QIAGEN)精製。將CMV/pSeapIRESpuro用SpeI-NheI消化，去除CMV啟動子後，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech)將RPS7T1、及RPS7T2之啟動子區域插入SpeI-NheI部位，構築成RPS7T1/pSeapIRESpuro、及RPS7T2/pSeapIRESpuro。將所選殖之RPS7T1、及RPS7T2之啟動子區域的核苷酸序列示於序列表之序列編號4、及序列編號5中。

RPS7T1之引子組RPS7-T1：TTGATTATTGACTAGTCCTAGTGTGGCTTCTGCATTTTTCACAGTGC RPS7-R：GCAGCAGCATGCTAGCGGCTTTCTCCTGGGAGAACTGAAGGCACAGCGG

RPS7T2之引子組RPS7-T2：TTGATTATTGACTAGTCCTCGGCTCACGGCAGCCTCGACCTTTCGGC RPS7-R：GCAGCAGCATGCTAGCGGCTTTCTCCTGGGAGAACTGAAGGCACAGCGG

4-2)RPL32T1、及RPL32T2之選殖

RPL32T1、及RPL32T2係以2-2)中製作之RPL32/pSeapIRESpuro作為模板，藉由使用以下所示之引子組及KOD-Plus(TOYOBO)之PCR進行複製放大，並以MinElute反應套組(QIAGEN)精製。將CMV/pSeapIRESpuro進行SpeI-NheI消化，去除CMV啟動子後，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech)將RPL32T1、及RPL32T2之啟動子區域插入SpeI-NheI部位，構築成RPL32T1/pSeapIRESpuro、及RPL32T2/pSeapIRESpuro。將所選殖之RPL32T1、及RPL32T2之啟動子區域的核苷酸序列示於序列表之序列編號6、及序列編號7中。

RPL32T1之引子組 RPL32T1：TTGATTATTGACTAGTCCTCTCGAGTAACTGGGACTACAGGCATGC RPL32-R：GCAGCAGCATGCTAGCGATGCCTTTTGGGGAAGAAGCGGCCCC

RPL32T2之引子組RPL32T2：TTGATTATTGACTAGTGCAGTTTCGCCCAGTGGTTAGAAGCGTGG RPL32-R：GCAGCAGCATGCTAGCGATGCCTTTTGGGGAAGAAGCGGCCCC

4-3)RPL34T1、及RPL34T2之選殖

RPL34T1、及RPL34T2係以在2-3)中所製作之RPL34/pSeapIRESpuro作為模板，藉由使用以下所示之引子組及KOD-Plus(TOYOBO)之PCR進行複製放大，並以MinElute反應套組(QIAGEN)精製。將CMV/pSeapIRESpuro用SpeI-NheI消化，去除CMV啟動子後，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech)將RPL34TI、及RPL34T2之啟動子區域插入SpeI-NheI部位，構築成RPL34T1/pSeapIRESpuro、及RPL34T2/pSeapIRESpuro。將所選殖之RPL34T1、及RPL34T2之啟動子區域之核苷酸序列示於序列表之序列編號8、及序列編號9中。

RPL34T1之引子組RPL34T1：TTGATTATTGACTAGTGCTTCCTGGAGGTGCATTCTAAGAGCGCTCCCC RPL34-R：GCAGCAGCATGCTAGCTCTGAGTGCCTAAAT TAAGAATAGAGTAACATC

RPL34T2之引子組RPL34T2：TTGATTATTGACTAGTGTAAAGCTTGTGCTCTGAATAAATGACAAGG RPL34-R：GCAGCAGCATGCTAGCTCTGAGTGCCTAAATTAAGAATAGAGTAACATC

(實施例5)以CHO-K1多株轉形細胞中之SEAP表現量作為指標之截短型啟動子之活性的評價 5-1)轉染

CHO-K1細胞(ATCC)係使用含有10%之Ultra-Low IgG FBS(GIBCO)之F-12養分混合物培養基(GIBCO)，於5%之CO₂，37℃下進行繼代培養。將CHO-K1細胞以2×10⁵細胞/孔接種於6孔培養盤(IWAKI)中，翌日將2μg之在實施例1)、2)及4)中所製作之CMV/pSeapIRESpuro、RPS7/pSeapIRESpuro、RPS7T1/pSeapIRESpuro、RPS7T2/pSeapIRESpuro、RPL32/pSeapIRESpuro、RPL32T1/pSeapIRESpuro、RPL32T2/pSeapIRESpuro、RPL34/pSeapIRESpuro、RPL34T1/pSeapIRESpuro、及RPL34T2/pSeapIRESpuro，分別使用Fugene6(Roche Applied Science)轉染。

5-2)藉由嘌呤黴素之藥劑選擇

轉染之2日後，將來自6孔培養盤之細胞藉由胰蛋白酶處理而回收，將全量接種於6cm培養盤(Nunc)中，同時在培養基中添加終濃度為8μg/mL之嘌呤黴素(Clontech) ，開始藥劑選擇。

5-3)藉由多株轉形細胞株之評價

從藥劑選擇開始算起11日後，藉由胰蛋白酶回收多株轉形細胞株，測定細胞數，以1×10⁵細胞/mL/孔接種於24孔培養盤(IWAKI)中，24小時後回收培養上清液，使用SensoLyte(註冊商標)pNPP分泌性鹼性磷酸酶報告基因檢定(ANASPEC)，測定上清液之SEAP活性。將測定結果示於第2圖中。各截短型啟動子中，亦可得到超過作為對照之CMV啟動子(CMV/pSeapIRESpuro)之SEAP活性的SEAP活性，此等啟動子顯示具有比CMV更強之啟動子活性。

(實施例6)DNA元件之抽出 (6-1)使用抗乙醯化組蛋白H3抗體之染色質免疫沉降

使用抗乙醯化組蛋白抗體之ChIP，係依照下述順序使用EZ ChIP(Upstate)進行。又，只要無特殊記載，下述程序中所使用之抗體、緩衝液等係使用Upstate公司製品。

首先，將293F細胞(Invitrogen)使用GIBCO(註冊商標)FreeStyle^TM 293培養基(Invitrogen)，於37℃、8%之CO₂條件下進行培養，藉由離心(1000rpm，5分鐘，室溫)回收為增殖期之細胞。將2×10⁷個細胞在加入1%甲醛之培養基中攪拌10分鐘後，添加10倍甘胺酸，於室溫進行5分鐘攪拌。藉由離心(3000rpm，5分鐘，4℃)除去上清液，添加PBS使細胞懸浮後，再度藉由離心除去PBS，添加SDS溶裂緩衝液進行細胞之懸浮‧溶解。將溶解之樣品於冰水中冷卻，同時使用超音波均質機(BRANSON)進行DNA之片段化，加入添加有蛋白酶抑制劑混合物(protease inhibitor cocktail)之稀釋緩衝液及蛋白質G固定化瓊脂糖，於4℃下攪拌1小時，離心後進行上清液之回收。繼而添加10μg之正常兔IgG、或α-乙醯基組蛋白H3抗體，並於4℃下攪拌一夜。在該溶液中添加蛋白質G固定化瓊脂糖，並於4℃攪拌1小時後，藉由離心進行顆粒(pellet)之回收。將該顆粒以低鹽免疫複合物沖洗緩衝液洗淨2次，以高鹽免疫複合物沖洗緩衝液洗淨2次，以LiCl免疫複合物沖洗緩衝液洗淨2次，最後以TE緩衝液洗淨4次，添加溶析緩衝液(20μl之1M碳酸氫鈉、10μl之SDS、170μl之滅菌水)，於30分鐘後離心，進行上清之回收。

繼而，在其上清液中添加5M氯化鈉，於65℃加熱一夜，再者，添加RNase A，並於37℃下培育30分鐘。添加0.5M EDTA、1M Tris-HCl、蛋白酶K，並於45℃靜置2小時。

最後，添加已用蛋白酶K處理之溶液之5倍量之試劑A、B、C，藉由旋轉過濾器(Spin filter)進行離心(10000rpm、30秒、室溫)，使染色質免疫沉降，然後精製所得之DNA。

(6-2)微陣列解析

使用GenomePlex完整的全基因組擴增套組(GenomePlex Complete Whole Genome Amplification(WGA)Kit(Sigma))，進行(6-1)之各ChIP樣品的擴增。程序係依照隨附於套組之Sigma公司的規程進行。

為了進行ChIP之確認，以藉由WGA擴增之各DNA 320ng作為模板，使用下述引子及SYBR(註冊商標)Premix Ex Taq^TM(Perfect Real Time)(TAKARA)，依照PCR法(95℃ 5秒、60℃ 20秒×45循環)，進行甘油醛3磷酸酯脫氫酵素(glycelaldehyde-3-phosphate dehydrogenase：GAPDH)基因內部之擴增。再者，GAPDH係作為陽性對照之管家基因，其用於確認藉由ChIP，DNA元件已被濃縮，使用附屬於EZ ChIP(Upstate)之引子實施PCR法。

5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’ 5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’

其結果，可確認以抗乙醯化組蛋白H3抗體進行免疫沉降的樣品具有特異性GAPDH擴增(第3圖)。將藉由WGA所擴增之各DNA樣品付諸於微陣列解析(NimbleGen)，進行晶片上染色質免疫沉降(ChIP on chip)。ChIP on chip為藉由將在(6-1)中所濃縮之DNA付諸於微陣列解析，進行各DNA元件之鑑定的手法。

(6-3)DNA元件之抽出

根據從(6-2)所得到之ChIP on chip解析結果，抽取具有62%以上之AT含量之5個序列。

A2：15號染色體(80966429~80974878)

A7：11號染色體(88992123~89000542)

A18：4號染色體(111275976~111284450)

B5：1號染色體(143034684~143043084)

C14：11號染色體(46089056~46097482)

(實施例7)

以分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)之表現作為指標之DNA元件的效果

(7-1)SEAP表現載體之構築

以pSEAP2-對照組(Clontech)作為模板，使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)並藉由PCR法(94℃ 30秒、68℃ 2分鐘×40循環)進行SEAP基因之擴增。

5’-AAAGCTAGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC-3’ 5’-AAAAGATCTTCATGTCTGCTCGAAGCGGCCGGCCGC-3’

繼而，將藉由瓊脂糖凝膠電泳擴增之SEAP片段分離後，從凝膠切出，並用QIAquick凝膠抽出套組(Qiagen)精製，將該DNA片段作為插子(insert)。將插子用限制酵素NheI、BglII處理，且將載體pIRES hyg3(clontech)用限制酵素NheI、BamHI處理後，藉由瓊脂糖電泳將各個目的片段分離後，從凝膠切出，於精製後，進行連接(ligation)反應、轉形(transformation)。連接反應係使用LigaFast快速DNA連接系統(Promega)來進行。轉形則如下述進行：首先將凍結之勝任細胞(competent cell)JM109(TAKARA)融解，在其溶液中添加10μl之連接反應後之溶液，並於冰上靜置30分鐘。然後，進行熱休克(heat shock)(42℃、45秒)，及冰冷5分鐘。在其菌體懸浮液中添加1ml之LB培養基，並於37℃振動1小時，將其接種於已加入0.1mg/ml安比西林之LB培養皿中，於37℃下培養14~16小時。然後，藉由鹼性法，從LB培養皿上所培養之群落回收目標質體。最後，決定藉由鹼性法所得到之質體中之SEAP之聚核苷酸序列，而構築成pCMV/SEAP ires Hygro。

(7-2)DNA元件之選殖

繼而，使用BAC分段選殖套組(BAC subcloning kit(Gene Bridges))，將在實施例6中所出抽出之DNA元件從具有各個聚核苷酸序列之細菌人工染色體(BAC)選殖入(7-1)之SEAP表現載體中。

首先，將(7-1)之pCMV/SEAP ires Hygro以限制酵素SpeI處理數小時，然後進行乙醇沉殿，並用滅菌水溶解。將經SpeI處理之前述載體作為模板，進行使用下述引子及KOD-plus-(TOYOBO)之PCR法(94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 10分鐘×30分鐘)。

A2D 5’-GGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A2R 5’-CTCATTCTGTGGGTTGTCATTTCACTTCCTTGATGCTATCCTTTCAAGCAAAATCCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

A7D 5’-CTTATTTTCTAAGTAGTATAGACTTAATTGTGAGAACAAAATAAAAACTTGGATCCTATTAATAGTAATCAATT ACG-3’；A7R 5’-CTCTTCCCATTCTCATTTGAATCTACTTCAAAAGGTTTACCATACTAAGACCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

A18D 5’-CGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCGGGTGGATCACCTGAGGTCGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A18R 5’-CATACAGAAGCCAGTTTGAACTGAGACCTCACTCCATTTCTTACAAGTTATGCCCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

B5D 5’-ACCGTTTTATATTGTTTAAGCATTTCCTAGACATATTTGGCTACAAATCTAGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；B5R 5’-GATCTTAGGGGGGCTGATTATATAAAACAATAGAAATGTAGTCTTAGATGAAACCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

C14D 5’-CACAAAGTTCACTGTCAAGGCCAGGTGATGAGGCCCACACATGCCCGGACCTTGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；C14R 5’-CAAAACCTCATCTCTACTGAAAATAGAAAATTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGTGCCCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

使用反應溶液之一部分，藉由瓊脂糖凝膠電泳確認擴增後，殘餘之溶液進行乙醇沉殿，並以滅菌水溶解，作為轉形用DNA。

繼而，進行轉形用大腸菌之調製。

與在實施例6中所抽出之5序列對應之BAC純系如以下所示。

將10μl之已融解的前述BAC(Genotechs股份有限公司)植菌在1mk之培養基(包含最終濃度為15μg/ml之氯黴素(chloramphenicol))中，於37℃下培養一夜。將30μl之其培養液移入1.4ml之培養基(包含最終濃度為15μg/ml之氯黴素)，於37℃下進行2小時培養，重複2次離心及藉由滅菌水之洗淨，並懸浮於20μl之滅菌水中。在已冷卻之比色皿(0.1cm)中添加1μl之pRED/ET(Gene Bridges)及大腸菌，進行電穿孔(1350V、10μF)後、添加1ml之SOC培養基，並於30℃下進行70分鐘之培養，將100μl之培養液接種於LB培養皿(包含最終濃度為3μg/ml之四環素、最終濃度為15μg/ml之氯黴素)，於30℃下培育一夜。次日將所得到之群落植菌於1ml之培養基(包含最終濃度為3μg/ml之四環素、最終濃度為15μg/ml之氯黴素)，並於30℃下培養一夜。將30μl之培養液移入1.4ml之培養基(包含最終濃度為3μg/ml之四環素、最終濃度為15μg/ml之氯黴素)，並於30℃下進行2小時培養，添加50μl之10%L-阿拉伯糖，進一步於37℃下進行1小時之培養。然後，重複2次藉由滅菌水之洗淨，並將懸浮於30μl滅菌水之大腸菌及1μl之轉形用DNA添加於冷卻之比色皿(0.1cm)中，進行電穿孔(1350V、10μF)。添加1ml之SOC培養基，並於37℃下進行90分鐘培養，將培養液全量接種於LB培養皿(包含100μg/ml之安比西林)中，在培養皿中培養，及藉由鹼性法取得目標質體。最後，藉由確認所取得之質體的序列及實施限制酵素確認，進行目標質體的構築(第4圖)。

(7-3)以SEAP表現作為指標之評價

使用宿主細胞CHO-K1細胞(ATCC)、基因導入試藥Lipofectamine2000(Invitrogen)，實施在(7-2)中所構築之各質體的評價。

從基因導入2日後，進行藉由800μg/ml潮黴素(hygromycin)之藥劑選擇約2週，構築多株安定表現株。所建立之細胞株，係在測定前日進行培養基交換，並將一定細胞數接種於24孔培養皿(IWAKI)中。接種24小時後回收培養上清液，並測定SEAP活性。培養上清液中之SEAP活性，係使用SensoLyte^TM pNPP分泌性鹼性磷酸酶報告基因檢定(ANASPEC)來測定。

將測定結果示於第5圖中。將無元件之對照組之SEAP活性當作1時，具有DNA元件A2、A7、A18、B5、C14之CHO安定表現株之培養上清液中的SEAP活性顯示5倍以上之數值。由此，可確認5種DNA元件全部可使SEAP表現劇烈地亢進。再者，前述之5種聚核苷酸序列，係記載於序列表之序列編號之10至14。

(實施例8)併用啟動子之一般性

在實施例7之DNA元件之評價中所使用之載體之啟動子為CMV啟動子，現針對與其他一般啟動子之併用進行檢討。

(8-1)使用EF-1α及SV40啟動子之SEAP表現載體的構築

以pSEAP2-對照組(Clontech)作為模板，藉由使用在(7-1)中所記載之引子及KOD-plus-之PCR法(94℃ 30秒、68℃ 2分鐘×40循環)進行SEAP基因之擴增。經擴增之SEAP，係依照與(7-1)同樣之方法調製成插子。將插子以限制酵素NheI、BglII處理，將載體pIRES puro3(clontech)以限制酵素NheI、BamHI處理，並以與(7-1)同樣之方法構築pCMV/SEAP ires Puro。

接著，以pEF1/V5-His A(Invitorogen)作為模板，使用下述引子及KOD-plus-，並藉由PCR法(94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 2分鐘×30循環)，進行EF-1α啟動子之複製放大。

5’-AAAACTAGTCAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACC-3’ 5’-AAAGATATCCCTAGCCAGCTTGGGTGGTACCAAGC-3’

以前述所構築之pCMV/SEAP ires Puro作為載體，分別用限制酵素SpeI、EcoRV處理，依據在(7-1)中所記載之方法，進行pEF/SEAP ires Puro之構築。

同樣地，將pcDNA3.1+(Invitrogen)作為模板，使用下述引子及KOD-plus-，並藉由PCR法(94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘×30循環)，進行SV40啟動子之複製放大。

5’-AAAACTAGTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTG-3’ 5’-AAAGATATCAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTC-3’

以前述所構築之pCMV/SEAP ires Puro作為載體，分別用限制酵素SpeI、EcoRV處理，依據在(7-1)中所記載之方法進行pSV40/SEAP ires Puro之構築。

(8-2)DNA元件A2或A7之選殖

以在(8-1)中所構築之pEF/SEAP ires Puro及pSV40/SEAP ires Puro作為基本骨架，進行DNA元件A2或A7之選殖。

首先，將pEF/SEAP ires Puro及pSV40/SEAP ires Puro用限制酵素SpeI處理數小時，進行乙醇沉殿，並以滅菌水溶解。將經SpeI處理之各個載體作為模板，使用下述引子及KOD-plus-，藉由PCR法(94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 10分鐘×30循環)調製轉形用DNA。

A2(EF/D)5’-GGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGCTAGTCAGAGAGGAATCTTTGCAGC-3’；A2(SV40/D)5’-GGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGCTAGTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAG-3’；A2(共通/R)5’-CTCATTCTGTGGGTTGTCATTTCACTTCCTTGATGCTATCCTTTCAAGCAAAATTTTAAAACTTTATCCATCTTTGCA-3’。

A7(EF/D)5’-CTTATTTTCTAAGTAGTATAGACTTAATTGTGAGAACAAAATAAAAACTTGCTAGTCAGAGAGGAATCTTTGCAGC-3’；A7(SV40/D)5’-CTTATTTTCTAAGTAGTATAGACTTAATTGTGAGAACAAAATAAAAACTTGCTAGTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAG-3’；A7(共通/R)5’-CTCTTCCCATTCTCATTTGAATCTACTTCAAAAGGTTTACCATACTAAGAACTAGTTTTAAAACTTTATCCATCTTTGCA-3’。

使用已以所調製之轉形用DNA及pRed/ET轉形之BAC，將DNA元件A2、A7選殖入在(8-1)中所記載之載體中。又，操作係依據在(7-2)中所記載之方法來進行。

(8-3)以SEAP表現作為指標之評價

使用宿主細胞CHO-K1細胞(ATCC)、基因導入試藥Lipofectamine 2000(Invitrogen)，實施在(8-2)中所構築之各質體之評價。

從基因導入2日後，進行藉由8μg/ml嘌呤黴素之藥劑選擇約2週，構築多株安定表現株。所建立之細胞株，於測定前日進行培養基交換後，以一定細胞數接種於24孔培養皿中。於接種24小時後回收培養上清液，並測定SEAP活性。培養上清液中之SEAP活性，係使用SensoLyte^TM pNPP分泌性鹼性磷酸酶報告基因檢定(ANASPEC)來測定。

將測定結果示於第6圖。以無元件之對照組之SEAP活性當作1時，DNA元件A2或A7與EF-1α啟動子併用時呈現2倍以上之表現亢進效果，與SV40啟動子併用時呈現4倍以上之表現亢進效果。由此，可確認此等DNA元件，藉由與一般啟動子併用，展現使外來基因表現亢進之效果。

(實施例9)以抗體表現作為指標之評價 (9-1)人類輕鏈表現載體pEF6KCL之構築

以質體pEF6/V5-HisB(Invitrogen)作為模板，使用下述引子及KOD-plus-，藉由進行PCR法，取得從BGHpA之緊鄰後方(序列位置：2174)至SmaI(序列位置：2958)為止之DNA片段(包含f1複製起始點及SV40啟動子及起始點之DNA片段，以下稱為「片段A」；再者，片段A之聚核苷酸序列記載於序列表之序列編號15中)。

5’-CCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGC-3’；5’-AAACCCGGGAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGG-3’。

將所得到之片段A，與包含編碼人類κ鏈分泌信號、人類κ鏈恆定區域及人類polyA附加信號之DNA序列的DNA片段(以下稱為「片段B」)藉由重疊PCR結合。將所得到之片段A與片段B結合而成之DNA片段用限制酵素KpnI及SmaI消化，然後與已用限制酵素KpnI及SmaI消化之質體pEF6/V5-HisB(Invitrogen)連接，構築成在EF-1α啟動子之下游具有信號序列、選殖位點(cloning site)、人類κ鏈恆定區域、及人類polyA附加信號序列之人類輕鏈表現載體pEF6KCL。

用限制酵素KpnI及SmaI從前述方法所得到之pEF6KCL切出DNA片段，將該DNA片段與經KpnI及SmaI消化之pEF1/myc-HisB(Invitrogen公司)連接，藉由轉形、鹼性法、序列確認，構築成質體pEF1KCL。

(9-2)人類重鏈表現載體pEF1FCCU之構築

將包含人類IgG1信號序列及編碼恆定區域之胺基酸之DNA序列之DNA片段(該DNA片段所具有之聚核苷酸序列係記載於序列表之序列編號16中)用限制酵素NheI及PmeI消化，並與已用NheI及PmeI消化之質體pEF1KCL結合，構築成在EF-1α啟動子之下游具有信號序列、選殖位點、人類重鏈恆定區域、及人類polyA附加信號序列之人類重鏈表現載體pEF1FCCU。

(9-3)人型化抗體基因X表現單鏈載體(人型化抗體基因X/pEF_LHN#)之構築

藉由使在(9-1)、(9-2)中所構築之L鏈或H鏈表現載體結合，構築人型化抗體表現單鏈載體(pEF_LHN(無可變區域))。

在從pEF1KCL之啟動子上游至polyA之下游為止之基因表現單元的兩端，藉由PCR法附加限制酵素SalI位點，並進行瓊脂糖凝膠電泳、切出、DNA片段之精製，將所得之DNA片段作為插子。藉著將在(9-2)中所構築之pEF1FCCU用限制酵素SalI處理，在位於基因表現單元上游之SalI位點將載體直鏈化，進行與前述插子之連接反應，藉由轉形、鹼性法、序列確認，進行人型化抗體表現單鏈載體(pEF_LHN(無可變區域)之構築。

繼而，將下述寡聚物導入pEF_LHN(無可變區域)之AatII位點。

5’-CGCGGCCGCACTAGTGACGT-3’ 5’-CACTAGTGCGGCCGCGACGT-3’

將各個寡聚物稀釋成5pmol，使用T4聚核苷酸激酶(TAKARA)，於37℃下反應1小時後，添加10×H緩衝液(TAKARA)，藉由於96℃下反應1分鐘，於室溫反應30分鐘，進行緩冷配對(annealing)。將該寡聚物與經限制酵素AatII處理之載體pEF_LHN連接，藉由轉形、鹼性法、序列確認，構築pEF_LHN#(無可變區域)。

將人型化抗體基因X之可變區域插入前文所構築之汎用載體(pEF_LHN#(無可變區域))中，使人型化抗體基因X表現單鏈載體(人型化抗體基因X/pEF_LHN#)之構築完成。

首先，使用下述引子及KOD-plus-，藉由PCR法(94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 1分鐘×30循環)進行人型化抗體基因X之L鏈可變區域之複製放大。

L鏈可變區域：5’-AAACATATGGCGACATCCAGATGAC-3’ 5’-AAACGTACGCTTGATCTCCACCTTGG-3’

將經擴增之L鏈可變區域片段及汎用載體(pEF_LHN#(無可變區域))用限制酵素NdeI、BsiWI處理，藉由瓊脂糖凝膠電泳切出目標片段，並藉由精製、連接反應、轉形、鹼性法、序列確認，進行L鏈可變區域之插入。同樣地，使用下述引子及KOD-plus-並藉由PCR法(94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 1分鐘×30循環)進行人型化抗體基因X之H鏈可變區域之複製放大。

H鏈可變區域；5’-AAAGCTGAGCCAGGTGCAGCTGCAGG-3’ 5’-AAAGCTGAGCTCACGGTCACCAGGGTTC-3’

將已插入經擴增之H鏈可變區域片段及L鏈可變區域之載體用限制酵素BlpI處理，藉由瓊脂糖凝膠電泳切出目標片段，並藉由精製、連接反應、轉形、鹼性法、序列確認進行H鏈可變區域之插入，而構築成人型化抗體基因X表現單鏈載體(人型化抗體基因X/pEF_LHN#)。

(9-4)人型化抗體基因X表現單鏈載體(人型化抗體基因 X/pCMV_LHN#)之構築

以在(9-3)中所構築之人型化抗體基因X表現單鏈載體(人型化抗體基因X/pEF_LHN#)作為載體基本骨格，依照下述程序進行啟動子之交換，以進行人型化抗體基因X表現單鏈載體(人型化抗體基因X/pCMV_LHN#)之構築。

以pIRES puro3作為模板，使用下述引子及KOD-plus-，並藉由PCR法(94℃ 30秒、68℃ 3分鐘×40循環)，進行CMV啟動子片段之複製放大。

H鏈上游：5’-CTTTTGCAAAAAGCTTCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCC-3’ 5’-TTCATGGTGGCGCTAGCCCGCAGATATCGATCCGAGCTCGGTA-3’

L鏈上游：5’-TGACGTCGACAAGCTTCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCC-3’ 5’-CTGGATGTCGCCATATGCGCCGGAGATCCACAGCAGCAGGGAGATGAACACCTGGGTCTGCAGCACCATGGTGGCGCTAGCCCGCAGATATCGATCCGAGCTCGGTA-3’

在PCR反應溶液中添加限制酵素DpnI，使其於37℃反應1小時，並藉由miniElute反應清除套組(miniElute reaction cleanup kit)(Qiagen)進行精製，作為In-Fusion用之樣品。另一方面，將人型化抗體基因X/pEF_LHN#用限制酵素HindIII、NheI、NdeI、FseI處理，並藉由進行瓊脂糖凝膠電泳，使片段中之2個大片段分離。從凝膠分別切出，並從凝膠抽出DNA，作為In-Fusion用之樣品。彙集全部IN-Fusion用樣品，藉由In-Fusion^TM Advantage PCR選殖套組(TAKARA)、轉形、鹼性法、序列確認，構築人型化抗體基因X表現單鏈載體(人型化抗體基因X/pCMV_LHN#)。

(9-5)DNA元件A7之選殖

從SEAP之表現亢進效果已被認定之5種DNA元件中選擇A7，將其選殖入抗體表現載體中。

依照與(7-2)同樣之方法，分別以經限制酵素NotI處理之人型化抗體基因X表現單鏈載體(人型化抗體基因X/pEF_LHN#、人型化抗體基因X/pCMV_LHN#)作為模板，使用下述引子及KOD-plus-，並藉由PCR法(94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 11分鐘×30循環)進行轉形用DNA之調製。

人型化抗體基因X/pEF_LHN# D 5’-CTCTTCCCATTCTCATTTGAATCTACTTCAAAAGGTTTACCATACTAAGACTCGAGGCACTAGTGACGTCAGGTGGCACT-3’；人型化抗體基因X/pEF_LHN# R 5’-CTCTTCCCATTCTCATTTGAATCTACTTCAAAAGGTTTACCATACTAAGAGCACTAGTGACGTCAGGTGGCACTTTTCGG-3’。

使用人型化抗體基因X/pCMV_LHN# D；人型化抗體基因X/pEF_LHN# D。

使用人型化抗體基因X/pCMV_LHN# R；人型化抗體基因X/pEF_LHN# R。

使用已以所調製之轉形用DNA及pRed/ET轉形之BAC，將DNA元件A7選殖入在(9-3)、(9-4)中所記載之人型化抗體基因X表現單鏈載體。在第7圖中展現載體之概略圖。又，操作係依據在(7-2)中所記載之方法進行。

(9-6)以抗體表現作為指標之評價

使用宿主細胞CHO-K1細胞(ATCC)、基因導入試藥Lipofectamine 2000(Invitrogen)，實施在(9-5)中所構築之各質體之評價。

從基因導入2日後，進行藉由800μg/ml之見他黴素(Geneticin(Roche))的藥劑選擇約2週，以進行多株安定表現株之構築。所建立之細胞株，係於測定前日，培養基交換後，將一定細胞數接種於24孔培養皿中，接種24小時後，回收培養上清液，並藉由ELISA法測定培養上清液中之抗體表現量。又，ELISA係依照以下之方法進行。在被覆有50ng/孔之抗-κ輕鏈的96孔培養皿中，添加100μl之已去除細胞之培養上清液，並於37℃靜置1小時。繼而，除去樣品(培養上清液)，用PBS-Tween(0.05%)200μl清洗各孔後，將經HRP標識之抗-人類IgG(Fc)100μl添加於孔中，進一步於37℃靜置1小時。然後，除去經HRP標識之抗-人類IgG(Fc)，用PBS-Tween(0.05%)清洗各孔後，使用POD基質A.B.T.S.套組(nacalai)使其顯色，測定於波長405nm之吸光度。抗-κ輕鏈、抗-人類IgG(Fc)及樣品之稀釋，係使用PBS-Tween(0.05%)。將經階段稀釋(12ng、6ng、3ng、1.5ng、0.75ng、0.375ng、0.1875ng)之人類IgG作為標準，算出樣品濃度。

將結果示於第8圖中。在具有EF-1α啟動子或CMV啟動子之抗體表現載體中，可確認具有DNA元件A7之樣品，比無元件之對照組呈現更大之抗體生產亢進效果。

(實施例10)展現外來基因表現亢進活性之序列長度 (10-1)序列長度相異之DNA元件之選殖

以實施例7中所用之序列長度為基礎，構築所具有之各DNA元件之序列長度相異之載體。

具有根據DNA元件A2、A7、A18、B5、C14之全長所設計之不同序列長度的元件之細節示於第9、11、13、15、17圖中。將(7-1)之pCMV/SEAP ires Hygro用限制酵素SpeI處理數小時，進行乙醇沉殿，並以滅菌水溶解。將經SpeI處理之前述載體作為模板，使用下述引子及KOD-plus-並藉由PCR法(94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 10分鐘×30循環)進行轉形用DNA之調製。使用已以所調製之轉形用DNA及pRed/ET轉形之各個BAC，將序列長度相異之各DNA元件選殖入(7-1)之pCMV/SEAP ires Hygro中。又，操作係依據(7-2)中記載之方法進行。

A2-1D 5’-CATGCACAGATTAGCCATTTAGTACTTACTAAATCAAACTCAATTTCTGAAGTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A2-1R 5’-CTCATTCTGTGGGTTGTCATTTCACTTCCTTGATGCTATCCTTTCAAGCAAAATTCAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3’。

A2-2D 5’-ACACTGGTCAAAGGGACAGGTCATTGTTATGCTGGCAATGCAGGCTGCTGAAAACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A2-2R 5’-ACTGTAGCTTCTTATTTTTTACCTGCAGTGCATTCCTGTAAAAGTAGTGTGGAGTCAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3’。

A2-3D 5’-CTGGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A2-3R 5’-CCAAGCTTGTCCAACCGCGGCCTGCAGGCTGCATGCAGCCTGTGAAGGCTTTGATCAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3’。

A2-4D 5’-TCAATCATTTATCAATTTTATCTTCAAAGTCCCTCACTTCAGGGAGATGATATACTAGTTATTAATAGTAATCA ATTACG-3’；A2-4R 5’-ATATATAAAAGTTCATGTATATATAAAATCATGCAATACACGGCCTTTTGTGACTCAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3’。

使用A2-5D 5’-CGCATAAAAGGAAAAGCATCCTTAAAATAAACACCATCAATGGCTCCTCGGTGGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A2-5R；A2-4R。

使用A2-6D：5’-GGGAGGCTACAGCTTGCCTCTCTAACCACTAAAAGGCATGACCCTCCTCAAAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A2-6R；A2-4R。

A2-7D 5’-TCTGGCTTCCCTGGGCCACGCTGGAAGAAGAATTGTCTTGCGCCACACATAAAACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A2-7R 5’-AGCTGATTTTTACGTTAAATGTAACATGTAAAGAAATATATGTGTGTTTTTAGATCAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3’。

A2-8D 5’-GTGAAGAGGAGGAGATGTCAAAATTCAAAGTCTTAAATGATGTAGTTTTAAGTACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A2-8R 5’-ATGACACTTGATATTGTTGTTTATATTGCTGGTTAGTATGTGCCTTCATTTACCTCAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3’。

使用A2-9D；A2-6D。

使用A2-9R；A2R。

使用A2-10D；A2-2D。

使用A2-10R；A2-7R。

使用A2-11D；A2-8D。

使用A2-11R；A2-2R。

使用A2-12D；A2-2D。

使用A2-12R；A2-4R。

使用A2-13D；A2-8D。

使用A2-13R；A2-7R。

使用A2-14D；A2D。

使用A2-14R；A2-2R。

使用A2-15D；A2-2D。

使用A2-15R；A2R。

使用A2-16D；A2-8D。

使用A2-16R；A2-4R。

使用A2-17D；A2D。

使用A2-17R；A2-7R。

A7-1D 5’-AAAAACAAAACTGGAGTAAACAAGATGAATTGTTTTAATAGAGGCACTGTATTACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A7-1R 5’-ATACAATGTTCCATGTATTCTGTGCCTGAACCTATGCAGCTGATGTAGCTGAAGTCAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3’。

A7-2D 5’-GATCTTATTTTCTAAGTAGTATAGACTTAATTGTGAGAACAAAATAAAAACTTGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A7-2R 5’-TGTTGTTTTCAGCCACTAAGTTTGAGGTGATTTGTTCTGGCAGTCCTAGGAAACTCAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3’。

使用A7-3D；A7-2D；A7-3R 5’-AGCCTACACTACCCTTTGCAGCCTTTGGTAACTATCCTTCTGCTGTCTACCTCCTCAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3’。

A7-4D；5’-AGGAGCTCCTGAATGAAGGACATCACTCAGCTGTGTTAAGTATCTGGAACAATACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A7-4R；5’-GACATAAAATGTAAGATATGATATGCTATGTAAGATATGATACCTGCCTTAAAATCAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3’。

A7-5D 5’-CACTGCTTGATACTTACTGTGGACTTTGAAAATTATGAATGTGTGTGTGTGTGTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A7-5R 5’-CAATTACATTCCAGTGATCTGCTACTTAGAATGCATGACTGAACTCCTGGGTGGTCAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3’。

A7-6D 5’-TTATTTTGAAGAGAAACTCCTGGTTCCCACTTAAAATCCTTTCTTGTTTCCAAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A7-6R 5’-AAGCAGTGTGTGTTTACCTGCATGTGTATGTGAATTAACTCTGTTCCTGAGGCATCAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3’。

A7-7D 5’-ATTGCATGTTCTCATTTATTTGTGGGATGTAAAAATCAAAACAATAGAACGTATCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A7-7R 5’-TTGGGAGGCCGCAGCTGGTAGATCACTTGAGGCCACGAATTTGACACCAGCAGGTCAATAATCAATGTCAAC GCGTATAT-3’。

使用A7-8D；A7-1D。

使用A7-8R；A7R。

使用A7-9D；A7-7D。

使用A7-9R；A7-5R。

使用A7-10D；A7-4D。

使用A7-10R；A7-7R。

使用A7-11D；A7-6D。

使用A7-11R；A7-4R。

使用A7-12D；A7-2D。

使用A7-12R；A7-6R。

使用A7-13D；A7-7D。

使用A7-13R；A7R。

使用A7-14D；A7-4D。

使用A7-14R；A7-5R。

使用A7-15D；A7-6D。

使用A7-15R；A7-7R。

使用A7-16D；A7-2D。

使用A7-16R；A7-4R。

使用A7-17D；A7-4D。

使用A7-17R；A7R。

使用A7-18D；A7-6D。

使用A7-18R；A7-5R。

使用A18-1 5’-ATCCCCTGCTCTGCTAAAAAAGAATGGATGTTGACTCTCAGGCCCTAGTTCTTGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A18-1R；A18R。

使用A18-2D 5’-CTAAAGTGCTGGGATTACAGGCATAAGCCACCGTGCCCGGCTGGAGCATTGGGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A18-2R 5’-ACTACTTACACATTTCGAGTTTTAAATAAGGCGTTC AATATAGAGTGAACACCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

A18-3D 5’-CAGGCATAAGCCACCGCACCCGGCCACCCCTTACTAATTTTTAGTAACGTCGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；A18-3R 5’-CTGATTGACTTTGACCTCTGCTTTCCAACTTTGCCCCAAAGAAAGTTAGTCACCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

使用A18-4D；A18-3D；A18-4R；5’-TTCAATGAAACAAGCTCTGTGAGGCTCATTTGTACCCATTTTGTTCAGTACTGCCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

使用B5-1D 5’-ACATACCCAGAGACACTGAGAGAGACAGACAGACAGTAAACAGAGGAGCACGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’； B5-1R；B5R。

使用B5-2D 5’-GCTCAATTGTATCTTATGAAAACAATTTTTCAAAATAAAACAAGAGATATGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；B5-2R；B5R。

B5-3D 5’-CCTGTGCTGAATACCGTCTGCATATGTATAGGAAAGGGTTAACTCAGCAGGGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；B5-3R 5’-TATGTGAATGGAAATAAAATAATCAAGCTTGTTAGAATTGTGTTCATAATGACCCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

使用B5-4D；B5D；B5-4R 5’-GAAAGTCTACAATTTTTTCAGTTTAAAATGGTATTT ATTTGTAACATGTACCCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

使用B5-5D；B5-1D；B5-5R 5’-CAAAGATGAAGGATGAGAGTGACTTCTGCCTTCATTATGTTATGTGTTCATATCCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

使用B5-6D 5’-CAGTGAATTATTCACTTTGTCTTAGTTAAGTAAAAATAAAATCTGACTGTGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；B5-6R 5’-GAACAGACAGGTGAATGAGCACAGAGGTCATTTGTAAACCGTTTGTGGTTAGCCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

C14-1D 5’-CTTTTTGGCTTCTGTGTTTAAGTTATTTTTCCCCTAGGCCCACAAACAGAGTCGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’； C14-1R 5’-AACCTTGGAAAAATTCTGTTGTGTTTAGAAGCATGTACCAATCTATCACTCCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

C14-2D 5’-CTATTCACTGTCTGTAGGATGAAAAAGTTAATAACACCCTGAGAGGTTTCGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；C14-2R 5’-CCTTAGATTAGTTTATTGTATTTTTTATCAGCTACTATAAGGTTTACACACCCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

C14-3D 5’-CAAGACCCTCAAAATTCAAAAATTTCCTTTATCTTGCTGTAGCACCTCCTGCGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；C14-3R 5’-GGAGGGGATAGGAAGGGGATGAGGCCTAACAGGTTGATGATCTAGGCTTTACCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

使用C14-4D 5’-CTCAAAAAGGAGATAATTCCAGCCCCTCGCCTTAAAGAATCCCTATCAAGTGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；C14-4R；C14-1R。

使用C14-5D 5’-CGCTTGAACCTGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGTTGGATCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3’；C14-5R；C14-1R。

使用C14-6D；C14-4D；C14-6R 5’-TTAACTTTTTCATCCTACAGACAGTGAATAGTAAAGCTTTCTGTGAAGACATACCCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

使用C14-7D；C14-2D。

使用C14-7R；C14-1R。

使用C14-8D；C14-3D；C14-8R 5’-AAATTATTTCCTGGTGGGCAATATTAGAATATGGGGAATGTTTGCTTCTGAGCCTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3’。

使用C14-9D；C14-4D。

使用C14-9R；C14-3R。

使用C14-10D；C14-2D。

使用C14-10R；C14R。

使用C14-11D；C14-3D。

使用C14-11R；C14-2R。

使用C14-12D；C14-4D。

使用C14-12R；C14-8R。

使用C14-13D；C14-3D。

使用C14-13R；C14-1R。

使用C14-14D；C14-4D。

使用C14-14R；C14-2R。

A2之各片段之聚核苷酸序列中，A2-1相當於包含序列表之序列編號10之第1至3000號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-2相當於包含序列表之序列編號10之第2801至5800號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-3相當於包含序列表之序列編號10之第5401至8450號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-4相當於包含序列表之序列編號10之第701至2700號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-5相當於包含序列表之序列編號10之第701至2200號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-6相當於包含序列表之序列編號10之第701至3700號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-7相當於包含序列表之序列編號10之第2001至5000號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-8相當於包含序列表之序列編號10之第4001至7000號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-9相當於包含序列表之序列編號10之第1至3700號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-10相當於包含序列表之序列編號10之第2001至5800號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-11相當於包含序列表之序列編號10之第2801至7000號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-12相當於包含序列表之序列編號10之第701至5800號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-13相當於包含序列表之序列編號10之第2001至7000號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-14相當於包含序列表之序列編號10之第2801至8450號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-15相當於包含序列表之序列編號10之第1至5800號之核苷酸的聚核苷酸序列，A2-16相當於包含序列表之序列編號10之第701至7000號之核苷酸的聚核苷酸序列，以及A2-17相當於包含序列表之序列編號10之第2001至8450號之核苷酸的聚核苷酸序列。

C14之各片段之聚核苷酸序列中，C14-1相當於包含序列表之序列編號14之第960至4015號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-2相當於包含序列表之序列編號14之第 1987至5014號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-3相當於包含序列表之序列編號14之第4020至7119號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-4相當於包含序列表之序列編號14之第960至8141號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-5相當於包含序列表之序列編號14之第960至6011號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-6相當於包含序列表之序列編號14之第4939至8141號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-7相當於包含序列表之序列編號14之第960至5014號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-8相當於包含序列表之序列編號14之第2994至7119號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-9相當於包含序列表之序列編號14之第4020至8141號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-10相當於包含序列表之序列編號14之第1至5014號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-11相當於包含序列表之序列編號14之第1987至7119號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-12相當於包含序列表之序列編號14之第2994至8141號之核苷酸的聚核苷酸序列，C14-13相當於包含序列表之序列編號14之第960至7119號之核苷酸的聚核苷酸序列，以及C14-14相當於包含序列表之序列編號14之第1987至8141號之核苷酸的聚核苷酸序列。

各片段之全長序列上的起始點及終點亦示於第20圖及第21圖中。

(10-2)序列長度相異之DNA元件的評價

使用宿主細胞CHO-K1細胞(ATCC)、基因導入試藥Lipofectamine 2000，進行(10-1)中所構築之各質體的評價。

與(7-3)之方法同樣地，基因導入後進行藉由潮黴素(hygromycin)之藥劑選擇，建立多株安定表現株。建立之細胞株，於測定前日進行培養基交換後，將一定細胞數接種於24孔培養皿中，接種24小時後回收培養上清液，並測定SEAP活性。

將測定結果示於第10、12、14、16、18圖中。不僅全長之DNA元件，即使具有比全長短之序列長度的純系，亦被確認具有表現亢進效果。因此，DNA元件A2、A7、A18、B5、C14，在具有比全長短之序列長度的情況，雖然亦顯示外來基因表現亢進活性，不過已確認在序列長度為全長之情況，可發揮最大之效果。

(實施例11)於CHO細胞以外之效果

在實施例7~10中之評價細胞方面，雖可使用CHO細胞，不過本實施例選擇CHO細胞以外之細胞株，即HEK293細胞。對於HEK293細胞，使用加入10%FCS之DMEM培養基(Invitrogen)，於37℃，5%CO₂存在下進行靜置培養，於基因導入前日，將一定細胞數接種於6孔培養皿中。為了評價在(8-2)中所構築之具有各DNA元件之SEAP表現載體，使用各質體及基因導入試藥Lipofectamine 2000(Invitrogen)進行基因導入，從基因導入2日後，進行藉由潮黴素之藥劑選擇約2週，以建立多株安定表現株。所建立之細胞株，於測定前日進行培養基交換後，將一定細胞數接種於24孔培養盤中，接種24小時後回收培養上清液，並測定SEAP活性。培養上清液中之SEAP活性，係使用SensoLyte^TM pNPP分泌性鹼性磷酸酶報告基因檢定(ANASPEC)來測定。

將測定結果示於第19圖中。與實施例3之結果同樣地，亦可確認各DNA元件即使於HEK293細胞中，仍具有外來基因(SEAP)之高表現亢進效果。

[產業上之可利用性]

藉由將使用本發明啟動子之外來基因表現單元或者本發明之外來基因表現載體導入哺乳動物宿主細胞中，可使治療用蛋白質或抗體等之外來基因的生產性提高。

第1圖係以CHO-K1多株轉形細胞中之SEAP活性作為指標之啟動子活性的評價。以CMV啟動子之值當作1，展現各啟動子的SEAP活性。展現2次獨立實驗之結果(n=3，平均±SD)。

第2圖係以CHO-K1多株轉形細胞中之SEAP活性作為指標之截短(truncate)型啟動子活性的評價。以CMV啟動子之值當作1，展現各啟動子之活性(n=3，平均±SD)。

第3圖係藉由GAPDH區域之擴增來確認進行過晶片上染色質免疫沉澱(ChIP on chip)之樣品已被抗乙醯化組蛋白H3抗體特異性地染色質免疫沉澱(ChIP)之圖。

第4圖係已插入DNA元件之SEAP表現載體之概略圖。

第5圖係在使用CHO轉形細胞株之情況，以藉由CMV啟動子所表現之SEAP活性作為指標，確認DNA元件A2、A7、A18、B5、C14之表現亢進效果之圖。

第6圖係在使用CHO轉形細胞株之情況，以藉由EF-1α或SV40啟動子所表現之SEAP活性作為指標，確認DNA元件A2、A7之表現亢進效果之圖。

第7圖係已插入DNA元件之抗體表現(抗體基因X重鏈、輕鏈共表現)載體之概略圖。

第8圖係在使用CHO轉形細胞株之情況，以藉由CMV或EF-1α啟動子所表現之抗體生產量作為指標，藉由ELISA法確認DNA元件A7之表現亢進效果之圖。

第9圖係DNA元件A2及關連序列之序列長度。

第10圖係在使用CHO轉形細胞株之情況，以SEAP活性作為指標，確認DNA元件A2及關連序列之表現亢進效果之圖。

第11圖係DNA元件A7及關連序列之序列長度。

第12圖係在使用CHO轉形細胞株之情況，以SEAP活性作為指標，確認DNA元件A7及關連序列之表現亢進效果之圖。

第13圖係DNA元件A18及關連序列之序列長度。

第14圖係在使用CHO轉形細胞株之情況，以SEAP活性作為指標，確認DNA元件A18及關連序列之表現亢進效果之圖。

第15圖係DNA元件B5及關連序列之序列長度。

第16圖係在使用CHO轉形細胞株之情況，以SEAP活性作為指標，確認DNA元件B5及關連序列之表現亢進效果之圖。

第17圖係DNA元件C14及關連序列之序列長度。

第18圖係在使用CHO轉形細胞株之情況，以SEAP活性作為指標，確認DNA元件A2及關連序列之表現亢進效果之圖。

第19圖係在使用HEK293轉形株之情況，以SEAP活性作為指標，確認DNA元件A2、A7、A18、B5、C14之表現亢進效果之圖。

第20圖係展現以DNA元件A2、A7、或A18之全長序列作為基準時成為起始點及終點之核苷酸之圖。

第21圖係展現以DNA元件B5、或C14之全長序列作為基準時成為起始點及終點之核苷酸之圖。

<110> 第一三共有限公司

<120> 人類基因啟動子

<130> DSPCT-FP1232

<160> 16

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 2348

<212> DNA

<213> 人類

<400> 1

<210> 2

<211> 3345

<212> DNA

<213> 人類

<400> 2

<210> 3

<211> 3337

<212> DNA

<213> 人類

<400> 3

<210> 4

<211> 1361

<212> DNA

<213> 人類

<400> 4

<210> 5

<211> 867

<212> DNA

<213> 人類

<400> 5

<210> 6

<211> 2372

<212> DNA

<213> 人類

<400> 6

<210> 7

<211> 1862

<212> DNA

<213> 人類

<400> 7

<210> 8

<211> 2363

<212> DNA

<213> 人類

<400> 8

<210> 9

<211> 1858

<212> DNA

<213> 人類

<400> 9

<210> 10

<211> 8450

<212> DNA

<213> 人類

<400> 10

<210> 11

<211> 8420

<212> DNA

<213> 人類

<400> 11

<210> 12

<211> 8475

<212> DNA

<213> 人類

<400> 12

<210> 13

<211> 8401

<212> DNA

<213> 人類

<400> 13

<210> 14

<211> 8427

<212> DNA

<213> 人類

<400> 14

<210> 15

<211> 1704

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 片段A

<400> 15

<210> 16

<211> 1120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG1信號+人類IgG1恆定區

<400> 16

Claims

一種聚核苷酸，其包含在序列表之序列編號1中所記載之核苷酸序列。
一種聚核苷酸，其包含在序列表之序列編號2中所記載之核苷酸序列。
一種聚核苷酸，其包含在序列表之序列編號3中所記載之核苷酸序列。
一種聚核苷酸，其係包含與如申請專利範圍第1至3項中任一項之核苷酸序列比對時具有95%以上相同性之核苷酸序列的聚核苷酸，且具有啟動子活性。
一種聚核苷酸，其係包含與如申請專利範圍第1至3項中任一項之核苷酸序列比對時具有99%以上相同性之核苷酸序列的聚核苷酸，且具有啟動子活性。
一種聚核苷酸，其係可與包含互補核苷酸序列的聚核苷酸在嚴苛條件下雜交的聚核苷酸，且具有啟動子活性，其中該互補核苷酸序列係與如申請專利範圍第1至3項中任一項之核苷酸序互補。
一種外來基因表現單元，其係由包含如申請專利範圍第1至6項中任一項之聚核苷酸者所構成。
如申請專利範圍第7項之外來基因表現單元，其中該外來基因係編碼多聚體蛋白質之基因。
如申請專利範圍第7項之外來基因表現單元，其中該外來基因係編碼雜多聚體蛋白質之基因。
如申請專利範圍第7項之外來基因表現單元，其中該外來基因係編碼抗體或其功能性片段之基因。
一種外來基因表現載體，其包含如申請專利範圍第7至10項中任一項之外來基因表現單元。
一種外來基因表現載體，其包含如申請專利範圍第7至10項中任一項之外來基因表現單元及從下述A群之(1)至(9)中所記載之聚核苷酸選出之任一種或複數種聚核苷酸；A群(1)包含在序列表之序列編號10中所記載之核苷酸序列的聚核苷酸；(2)包含在序列表之序列編號11中所記載之核苷酸序列的聚核苷酸；(3)包含在序列表之序列編號12中所記載之核苷酸序列的聚核苷酸；(4)包含在序列表之序列編號13中所記載之核苷酸序列的聚核苷酸；(5)包含在序列表之序列編號14中所記載之核苷酸0序列的聚核苷酸；(6)包含在序列表之序列編號10至14之任一個中所記載之核苷酸序列之至少3000個連續核苷酸的聚核苷酸；(7)包含在序列表之序列編號10至14之任一個中所記載之核苷酸序列之至少2000個連續核苷酸的聚核苷酸；(8)包含與在上述(1)至(7)之任一項中所記載之核苷酸序列比對時具有95%以上相同性之聚核苷酸序列的聚核苷酸，且係具有外來基因表現亢進活性的聚核苷酸；(9)包含與在上述(1)至(7)之任一項中所記載之核苷酸序列比對時具有99%以上相同性之核苷酸序列的聚核苷酸，且係具有外來基因表現亢進活性的聚核苷酸。
一種轉形細胞，其係導入有如申請專利範圍第11或12項之外來基因表現載體。
一種轉形細胞，其係導入有如申請專利範圍第11或12項之外來基因表現載體及元件載體。
如申請專利範圍第13或14項之轉形細胞，其中該細胞係來自哺乳動物之培養細胞。
如申請專利範圍第15項之轉形細胞，其中該來自哺乳動物之培養細胞係COS-1細胞、293細胞、或CHO細胞。
一種蛋白質之製造方法，其特徵為培養如申請專利範圍第13至16項中任一項之轉形細胞，並從培養物取得源自外來基因之該蛋白質。
一種如申請專利範圍第1至6項中任一項之聚核苷酸序列之用途，其目的為在轉形細胞中使外來基因表現。
一種如申請專利範圍第11或12項之外來基因表現載體之用途，其目的為在轉形細胞中使外來基因表現。