CN101432429B - 产生芳香分子的酵母表达系统 - Google Patents

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Abstract

包括至少一个编码香草醇氧化酶的基因的酵母，所述基因的序列为序列SEQ ID No.1或与序列SEQ ID No.1至少70％、优选80％、非常优选90％同源的任何序列，以及产生松柏醇、阿魏酸和香草醛的方法。

Description

产生芳香分子的酵母表达系统
本发明涉及天然芳香分子的产生。更特别地，本发明涉及酵母的新表达系统，所述表达系统使用表达盒且允许通过生物转化产生酚类衍生物，所述酚类衍生物可能用于产生用作食品调味剂或用于香料(香味或香水)的天然芳香分子。
天然芳香分子的产生可通过生物过程或化学合成获得，例如，可以通过这两种途径的一种或另一种获得香草醛。
香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)是对衍生自香草(Vanillia planifolia)荚的香草提取物的嗅觉和味觉性质负责的主要成分。它是工业上最常用的芳香分子之一。然而，从香草荚或香草提取物产生的天然香草醛只占市场的20％；其应用受限，这首先归因于全球可用荚的潜力，其次是这些荚的高成本，所述成本波动很大(大约从
Figure G2007800158066D00011
到
Figure G2007800158066D00012
即天然香草醛的潜力至少为
Figure G2007800158066D00013
因此，合成香草醛常用作天然香草醛的廉价替代品(约
Figure G2007800158066D00014
然而，尽管合成香草醛适用于香料和化妆品，但是它可以在农业食品业造成管理问题。此外，合成调味剂一般不如天然调味剂为消费者喜爱。
因此，寻求通过生物学方法，特别是生物转化方法获得天然芳香分子，特别是香草醛，所述方法利用微生物(细菌、酵母、霉菌)或植物细胞，或其酶系统。
为本发明的目的，术语“生物转化”是指底物的生物学转化，所述底物优选衍生自天然来源，以便获得天然调味料、香水或者调味料或香水的前体。
香草醛可按照下列反应方案产生：
Figure G2007800158066D00021
丁香酚            松柏醇           阿魏酸       香草醛
只要可获得，提及的每个分子均有可能获得香草醛，所述分子中最重要的是阿魏酸和丁香酚。
例如，申请EP453368、PCT申请WO96/08576和PCT申请WO00/61721描述在存在丝状真菌下通过生物转化从阿魏酸产生天然香草醛的方法。这些方法中使用的阿魏酸来源于提取含阿魏酸酯的农副产品：玉米、水稻、甜菜或小麦。然而，这些副产品的阿魏酸浓度低及其提取-纯化所需的步骤多，意味着从这些酯提取，产量仍然相当低；从而造成该起始材料的高成本，并且因此造成由其衍生的香草醛的高生产成本。
为了使利用微生物的生物方法有可能节省成本，因此优选使用更为广泛可获且廉价的底物。
丁香酚便是如此，其可以作为松柏醇或阿魏酸的来源。
由J.Overhage等发表的文章说明一个事实，即在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达衍生自简青霉(Penicillium simplicissimum)的香草醇氧化酶基因，会使催化丁香酚转化为松柏醇成为可能。为转化松柏醇为阿魏酸，J.Overhage等后来在大肠杆菌中表达其他两个简青霉来源的酶：松柏醇脱氢酶和松柏醛脱氢酶(在大肠杆菌重组菌株中高效生物转化丁香酚为阿魏酸，并进一步转化为香草醛，2003，Applied andEnvironmental microbiology(应用和环境微生物学)，6569-6576)。尽管这种方法的确使用了可用的且相对低廉的底物丁香酚，但是，由于转化丁香酚为阿魏酸需要三份克隆，在大肠杆菌中产生阿魏酸的系统仍然难以实施。
因此，本发明的主题是以比现有技术低的产生成本，用在工业上实施简单的方法，产生天然香草醛前体或天然香草醛本身的方法。
本发明提出的方案是使用或产生廉价可用的天然底物，例如丁香酚和阿魏酸。后者是合成香草醛最常用的底物，通常昂贵而且质量难以控制。
因此，本发明的另一主题是产生天然阿魏酸和/或天然松柏醇的简单而有效的方法，其成本在工业上可以接受。尽管阿魏酸可以用作天然香草醛的前体，然而，松柏醇是罕见香水如佳雷花(fleurs de tiaré)香水中的脱氢松柏醇的来源，并且可通过氧化作为阿魏酸的来源。
本发明方法的必不可少的装置是酵母，所述酵母包括至少一个编码香草醇氧化酶的基因，其属于诸如衍生自简青霉的香草醇氧化酶基因(SEQ ID No.1)(GenBank参考号Y15627)或与SEQ ID No.1的序列至少70％，优选80％，非常优选90％一致的任何核苷酸序列的类型。
因此，本发明的目的是提出在包括至少一个编码香草醇氧化酶基因的酵母中生物转化便宜的底物。
通过本发明的酵母生物转化丁香酚，一方面可以以低成本产生无杂质的天然阿魏酸和/或天然松柏醇，另一方面，可以产生天然香草醛。
根据本发明的一个实施方案，所述酵母包括至少一个包含编码香草醇氧化酶的基因的表达系统。有利的是，该表达系统包括：
(1)整合该系统到所述细胞基因组中的装置，其包括两个核苷酸序列，
(2)选择已经整合了该系统的所述细胞的装置，其包括选择插入片段，该插入片段包括作为启动子、诸如抗生素抗性基因的可选择标志物以及终止子边界的两个LoxP序列，
(3)编码香草醇氧化酶的基因的表达盒，包括允许该基因表达的启动子、允许该基因整合的至少一个克隆位点以及终止子。
术语“表达盒”是指核苷酸序列，其包括启动子、克隆目的基因的插入位点或多克隆位点(MCS)和终止子。术语“启动子”是指启动和控制转录所需的DNA序列，术语“克隆插入位点”或“多克隆位点”是指含有一个或多个限制位点的DNA序列，以及术语“终止子”是指转录终止所需的DNA序列。术语“载体”是指任何可能插入外源核酸片段于其中的DNA序列，所述载体使把外源DNA引入宿主细胞成为可能。载体的实例是质粒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)和P1噬菌体衍生的人工染色体(PAC)，以及病毒衍生载体。术语“可选择标志物”是指基因，其表达赋予含有它的细胞可被选择的特性。它是，例如抗生素抗性基因。
根据本发明的优选实施方案，所述克隆位点包括限制性内切酶NotI、BamHI、MfeI和XhoI的限制性位点，其使香草醇氧化酶核苷酸序列插入所述表达盒。
有利的是，该克隆位点的序列是序列SEQ ID No.2或与序列SEQ IDNo.2至少70％，优选80％，非常优选90％同源的任何序列。
根据本发明的优选实施方案，可选择标志物以两个LoxP位点为边界，这将使该可选择标志物被CRE/Lox系统切除。CRE酶是特异性识别LoxP位点的重组酶。这两个位点之间的核苷酸序列被称作靶DNA，将在CRE酶存在时被除去。这是因为，在CRE酶与LoxP位点结合时，它切开这两个位点，并在靶DNA被除去后又将这两半粘接在一起。
有利的是，序列LoxP的序列是序列SEQ ID No.3或与序列SEQ IDNo.3至少70％，优选80％，非常优选90％同源的任何序列。
根据本发明的优选实施方案，可使所述表达系统整合入该酵母基因组中的序列有多种并选自包括TY序列、端粒序列X和Y′、DUP序列、序列□或在酵母基因组中重复的任何序列的组。
有利的是，该序列是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的TY1A和TY1B序列，其序列优选分别为序列SEQ ID No.4和SEQ ID No.5或与其至少70％，优选80％，非常优选90％同源的任何序列。
根据本发明另一个优选实施方案，用于所述表达系统的启动子是强启动子，即在其控制下，引起所述基因强转录的启动子。强启动子的实例是1)控制基因表达的启动子，其蛋白在酵母中丰富，例如控制糖酵解蛋白或氮代谢蛋白表达的启动子；2)表达特异的启动子，例如其活性受糖或氮的存在调节的启动子；3)转录组实验可见高活性的启动子；或4)设计为使其调节的基因强转录的人工启动子。就用于所述表达系统的终止子允许良好mRNA稳定性的能力，对其选择。有利的是，选择的终止子对应以上选择的强启动子。
有利的是，使目的基因在所述表达系统表达的启动子为酿酒酵母TDH3基因的启动子，其序列优选为序列SEQ ID No.6或与序列SEQ IDNo.6至少70％，优选80％，非常优选90％同源的任何序列。
有利的是，相关的终止子是酿酒酵母CYC1基因的终止子，其序列优选为序列SEQ ID No.7或与序列SEQ ID No.7至少70％，优选80％，非常优选90％同源的任何序列。
有利的是，允许表达所述可选择标志物的启动子及终止子为棉蚜(Ashbya gossypii)TEF1基因的启动子及终止子，其序列优选分别为序列SEQ ID No.8和SEQ ID No.9或与其至少70％，优选80％，非常优选90％同源的任何序列。
根据本发明另一个优选实施方案，用于所述表达系统的可选择标志物为抗生素抗性基因，其选自包括抗遗传霉素(généticine)基因、抗诺尔丝菌素(nourseothricine)基因、抗腐草霉素基因或抗zéocine基因，或抗野生型酵母敏感的支配抗生素的任何其它基因的组。
有利的是，用于所述表达系统的可选择标志物为抗遗传霉素的基因，其序列优选为序列SEQ ID No.10或与序列SEQ ID No.10至少70％，优选80％，非常优选90％同源的任何序列。
根据本发明另一个优选实施方案，含有香草醇氧化酶基因的表达系统序列为SEQ ID No.11核苷酸序列，或与序列SEQ ID No.11至少70％，优选80％，非常优选90％同源的任何序列。
本发明的主题也是包括以上定义的表达系统的载体。
根据本发明另一个优选实施方案，包括所述表达系统的载体为质粒，并且有利的是，为pUC57。
本发明还包括含至少一个以上定义的载体的转化细菌。
这些转化的细菌可能属于允许复制所选载体的任何种。有利的是，这些为大肠杆菌属的细菌。
本发明的主题还是用于切除抗生素抗性基因的载体，该切除载体包括：
(1)选择含有它的细胞的装置，包括棉蚜TEF1基因及诺尔丝菌素抗性基因的启动子及终止子，以及
(2)切除所述表达系统中存在的可选择标志物的装置，包括酿酒酵母GAL1基因、CRE基因的启动子和酿酒酵母CYC1基因的终止子。
有利的是，所述切除载体包括序列SEQ ID No.12或与序列SEQ IDNo.12至少70％，优选80％，非常优选90％同源的任何序列。
根据本发明的优选实施方案，上述切除载体选自在细胞分裂期间分离不佳的载体，从而通过这一特性导致在不存在常见选择压力下丢失载体，所述载体例如多拷贝复制型载体。
有利的是，所述切除载体是质粒pFL44s。
所述切除载体的第一个优点是，它可使存在于酵母基因组的抗生素抗性基因在用所述表达系统转化该酵母后除掉。因此，除了编码香草醇氧化酶的基因外，允许产生根据本发明的芳香分子的酵母不包含源自属于同一属或同一科的菌株的任何DNA。
此外，通过所述切除载体消除抗性基因也使酵母转化数次成为可能，从而增加存在于基因组的所述表达系统的拷贝数，并且从而增加香草醇氧化酶蛋白的产量。
本发明的主题为包括含有香草醇氧化酶的表达系统的酵母，该表达系统的序列为序列SEQ ID No.11或与序列SEQ ID No.11至少70％，优选80％，非常优选90％同源的任何序列。
本发明的主题还是上述酵母和/或上述切除载体转化的酵母。
根据本发明的优选实施方案，所述酵母属于能够实现根据已知现有技术方法的香草醛前体(特别是丁香酚、阿魏酸、松柏醇)向香草醛生物转化的酵母的任何种。
为本发明的目的，术语“酵母”是指任何二倍体或多倍体酵母或衍生自这些菌株的一种的孢子形成的任何单倍体克隆，或者可选择地衍生自两个单倍体克隆杂交的任何二倍体克隆。
有利的是，所述酵母属于半子囊菌酵母的任何种，优选属于酵母属(Saccharomyces)或其杂种。非常优选地，所述酵母源自酿酒酵母(Cerevisiae)菌株或其杂种。
本发明的主题是产生天然松柏醇和/或天然阿魏酸的方法，包括以下步骤：
a)将编码香草醇氧化酶的基因的核苷酸序列克隆入所述表达系统，
b)以如此获得的表达系统转化所述酵母，
c)在允许表达香草醇氧化酶的条件下培养所述酵母，
d)使所述酵母与丁香酚接触。
根据本发明的优选实施方案，先将编码香草醇氧化酶的基因的核苷酸序列和包括所述表达系统的载体以一种或多种限制性酶消化。然后，将编码香草醇氧化酶的基因的序列通过简单的连接或其它任何插入装置插入所述载体携带的表达系统中。
为了扩增所述表达系统，用根据任一方法的连接产物(携带含有香草醇氧化酶基因的表达系统的载体)转化细菌。利用存在于载体中的抗生素抗性基因选择已经整合了所述表达系统的细菌，该载体携带含有编码香草醇氧化酶的基因的表达系统。
其次，将携带所述表达系统的载体以一种或多种限制性酶，优选PvuII消化，所述酶切割所述表达系统的两边。接着纯化所述表达系统，然后根据任一已知方法将其用于转化所述酵母。利用存在于所述表达系统中的抗性基因选择已经整合了所述表达系统的酵母。
最后，以本领域技术人员已知的允许表达香草醇氧化酶的条件培养转化的酵母。当把丁香酚添加至培养基时，香草醇氧化酶使催化生物转化所述丁香酚为松柏醇和/或阿魏酸成为可能。
本发明的主题还是产生天然松柏醇和/或天然阿魏酸的方法，其中存在于酵母基因组中的可选择标志物已切除，该方法包括在步骤b)之后且在步骤c)和步骤d)之前的以下步骤b1)、步骤b2)及步骤b3)：
b1)以所述切除载体转化所述酵母，
b2)在允许所述CRE酶表达的条件下培养所述酵母，
b3)分离已丢失所述可选择标志物的酵母。
根据本发明的优选实施方案，将编码香草醇氧化酶的基因的核苷酸序列插入所述表达系统，首先如上所述以该表达系统转化所述酵母。
利用第一可选择标志物的存在，选择整合了所述表达系统的酵母，所述第一可选择标志物优选抗生素抗性基因。然后，用任何已知的方法以所述切除载体转化阳性选择的酵母。利用存在于所述切除载体中的诺尔丝菌素抗性基因选择已经整合了所述切除载体的酵母。
然后，将已经由此整合了所述表达系统和所述切除载体的酵母，在允许表达CRE酶的条件下培养。活性的CRE酶将使切除所述表达系统中以loxP序列为边界的所述第一可选择标志物成为可能。随后，选择已经丢失该可选择标志物的酵母。例如，利用已经丢失该第一抗生素抗性基因的酵母对该抗生素抗性的缺失而对其选择。
采用该选择步骤得到的酵母不再具备存在于所述表达系统中的可选择标志物，但仍拥有存在于所述切除载体中的诺尔丝菌素抗性基因。如上所述，所述切除载体选自在细胞分裂期间分离不佳的载体。利用这一特性，所述切除载体在缺乏通常的选择压力下很容易丢失。术语“选择压力”是指有助于选择所述细胞的任何方法。例如，在培养中，在抗生素存在下，保持具有该抗生素抗性的基因的酵母，对应于选择压力的方法。因此，将在前一步中获得的酵母在没有选择压力下培养，从而丢失所述切除载体，然后就诺尔丝菌素抗性基因的丢失而对其选择。
如此获得的酵母已将允许香草醇氧化酶表达的表达系统整合入其基因组中，而其基因组不再包含任何抗生素抗性基因。然后，将转化的酵母在本领域技术人员已知的允许表达香草醇氧化酶的条件下培养。当将丁香酚添加至所述培养基时，香草醇氧化酶使催化生物转化所述丁香酚为松柏醇和/或阿魏酸成为可能。
最后，本发明的主题还是产生天然松柏醇和/或天然阿魏酸的方法，其中按照所需的所述表达系统的拷贝数，将步骤b)、步骤b1)、步骤b2)及步骤b3)重复许多次，目的在于增加酵母基因组中的表达系统的拷贝数。
根据本发明的优选实施方案，首先以该表达系统转化所述酵母，然后如上所述对其选择。接着以所述切除载体转化这些酵母，从而如上所述消除可选择标志物。如此获得的酵母不再拥有其基因组中的可选择标志物，并整合了所述表达系统的至少一个拷贝。
其次，为了增加所述表达系统的拷贝数，再次以所述表达系统转化这些酵母。进行同上的选择方法，用切除载体转化的方法和最后选择的方法。如此获得的酵母不再拥有可选择标志物，并且已经整合了至少2个拷贝的所述表达系统至其基因组中。该方法可重复所需的多次。
本发明的主题是产生香草醛的方法，其包括上述步骤a)、步骤b)、步骤c)及步骤d)，及随后的将步骤d)中产生的阿魏酸和/或松柏醇转化为香草醛的步骤。
根据本发明的优选实施方案，酵母利用自己的遗传物质，能够将步骤d)中产生的阿魏酸转化为香草醛。
根据本发明的另一个优选实施方案，根据专利EP0606441和EP0804606所述的方法，通过酶法或生化方法进行转化阿魏酸和/或松柏醇为香草醛的步骤。
从随后的进一步描述中将更加清楚地了解本发明，参考获得包括香草醇氧化酶的表达系统的实施例，包括该表达系统的载体，切除载体及其在通过丁香酚的生物转化产生松柏醇和阿魏酸上的用途。
在后续以说明的方式给出的实施例中，参考附后的图，其中：
图1展示了所述表达系统的方案，
图2展示了所述酵母表达香草醇氧化酶，
图3展示了获得切除载体pFL44s-NAT1-CRE的方法。
实施例1：通过用表达系统转化酵母在酵母中表达香草醇氧化酶
1/表达系统的合成
表达系统包括SEQ ID No.13中所述的2715bp的核苷酸序列。该核苷酸序列由合成序列(SEQ ID No.14)和选择插入片段(SEQ ID No.15)构建。
所述合成序列大小为1225bp，由GenScript公司合成。该序列包括：
-TY1A序列
-LoxP序列
-TDH3基因启动子的序列
-多克隆位点序列
-CYC1基因终止子的序列
-TY1B序列。
所述选择插入片段分离自克隆入大肠杆菌的载体pUG6(Güldener，U.，Heck，S.，Fiedler，T.，BeinHauer，J.，and Hegemann，J.H.1996.A newefficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast(一种在芽殖酵母中重复使用的新的有效基因中断盒).Nucleic Acids Res.24：2519-2524)。所述选择插入片段包含1500bp并且包括：
-loxP序列
-TEF1基因的启动子序列
-kanr基因的序列
-TEF1基因的终止子序列。
以SalI及SacI限制性酶消化pUG6载体，从而分离该插入片段。
通过EcoRI及PstI限制性位点将包括所述合成序列的表达系统克隆入pUC57载体(GenScript公司)。
以SalI及SacI限制性酶消化包含所述表达系统的pUG6载体和pUC57载体。随后，通过简单的连接将所述选择插入片段插入位于SalI及SacI限制性位点任一侧的TY1A和LoxP序列之间的合成序列中。
由此获得的载体称作pM2-KAN(图1)，其包括所述表达系统(合成序列+选择插入片段)。
若用户期望，存在于所述选择插入片段中的XbaI及SacI限制性位点使改变所述可选择标志物及其表达序列成为可能。
SalI及SpeI限制性位点使除去或代替由以该两个LoxP序列为边界的所述可选择标志物及其表达序列所组成的全部序列成为可能。
2/将编码香草醇氧化酶的基因插入表达系统
VAO的核苷酸序列衍生自简青霉(GenBank参考号Y15627)。合成实验中使用的VAO序列(SEQ ID No.1)，其在5′位置有NotI位点，在3′位置有XhoI位点，以使其被克隆至pivex载体中，该克隆符合产生具有C末端六组氨酸标签的蛋白的核苷酸序列的读框。
以NotI及EcoRI消化包含上述VAO序列的pivex载体，以释放VAO-6His序列。接着，以简单的连接将这个序列克隆至pUC57载体，该载体包含事先以NotI和MfeI消化的表达系统。
3/用包括编码香草醇氧化酶的基因的表达系统转化酵母
以PvuII限制性酶消化包含所述表达系统的pUC57载体。该酶切割包含目的基因VAO的表达系统的两边。将衍生自所述消化的DNA片段纯化，根据热激方法在PEG/醋酸锂存在下转化酵母。
在包含300mg/1遗传霉素的YPD丰富培养基(1％酵母提取物、1％蛋白胨、2％葡萄糖)上，利用所述表达系统携带的KANr抗性基因的存在，选择转化的酵母。
转化后(克隆92411KANVAO)，获得酿酒酵母(菌株92411)的24个克隆。
4/分析所转化酵母的香草醇氧化酶的表达
将转化的酵母培养在完全含葡萄糖培养基(YPD)上。随后，使用实施例1中的Ni NTA树脂亲和纯化VAO蛋白。将滞留在该树脂上的蛋白以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE凝胶)分析，以考马斯蓝检测。图2表明，就两个克隆而言，产生了VAO蛋白(柱E92411KANVAO)。92411T克隆对应阴性对照，即未转化的菌株92411，并且不产生任何VAO蛋白，而BL21I+F对应阳性对照，其得自pivex载体中的香草基VAO的克隆及其在大肠杆菌中的产生。
实施例2：在表达香草醇氧化酶的酵母中通过生物转化丁香酚产生松柏醇和阿魏酸
首先，依据上述用包含香草醇氧化酶的表达系统转化的酵母将丁香酚转化为松柏醇的能力，对其选择，然后依据其产生阿魏酸的能力，选择它们中的一些。因此，在预选择其形成松柏醇的能力后，发现93205克隆随后能够通过其衍生物将丁香酚转化为阿魏酸。
93207克隆及其子代被选为能够在发酵罐中转化丁香酚为松柏醇的菌株的实例。
1/用93207菌株及其衍生物93334在发酵罐中产生松柏醇
将93207菌株的两个孢子杂交得到二倍体菌株93334，其因而包括两个拷贝的含有香草醇氧化酶的表达系统。
随后，将93334菌株在100ml麦芽培养基中培养两天，以达到约3×108-6×108细胞/ml的浓度。随后将所述细胞接种至含有3升麦芽培养基的发酵罐。在30℃和500rpm的振摇下，以预培养的一半体积进行接种。通气为1升空气/分钟。
培养20小时后，加入溶于50％葡萄糖的丁香酚(60g丁香酚+120ml以50％溶于水的葡萄糖)。
转化18小时后，停止所述发酵。取样。用磷酸酸化，以乙醇稀释2倍并在8000rpm下离心。用HPLC分析上清液。
结果表明，在18小时中，丁香酚事实上被完全转化，且合成了22g/l的松柏醇(摩尔产率接近100％)。
2/用93205菌株及其衍生物93342在发酵罐中产生阿魏酸
在30℃及150rpm的振摇下，在100ml麦芽培养基中将衍生自93205菌株孢子形成的单倍体菌株93242培养两天。随后，将所述细胞培养在含有3升麦芽培养基的发酵罐中。在30℃和500rpm的振摇下，以预培养的一半体积进行接种。以0.45升空气/分钟通气24小时。
在培养24小时后，以0.25-0.5克丁香酚/小时的流速不断加入丁香酚溶液。
定时取样以监测所述底物向酚衍生物的转化。
以磷酸酸化各样品并在8000rpm离心。以HPLC分析上清。
底物流速：2.5毫升/小时
     浓度为克/升
 
时间(小时) 分布的丁香酚 残留的丁香酚 松柏醇 阿魏酸
0 0 0 0 0
16 1.6 0 0.7 0.75
40 3.8 0 0 3.8
64 7.1 0 0.2 6.7
112 10 0 0 10.11
在这些条件下，从10g/l丁香酚产生10g/l阿魏酸(摩尔产率＝85％)。
实施例3：从所转化酵母的基因组中切除可选择标志物
1/构建用于切除可选择标志物的pFL44s-NAT1-CRE载体
在本实施例中，切除载体的来源载体是pFL44s载体(GenBank参考号X70266)。该载体长度为4319bp，具有：
-URA3基因的序列
-AmpR抗性基因的序列
-多克隆位点
-2micron复制原点的序列
将包括可选择标志物的插入片段和包括CRE酶序列的插入片段插入该PFL44s载体中。
包括可选择标志物的插入片段在此为诺尔丝菌素抗性基因NAT1，自编码诺尔丝菌素的载体(GenBank参考号X73149)获得。以BglII及EcoRI限制性酶消化该载体和pFL44s载体。将包括TEF基因启动子、NAT1基因序列及TEF基因终止子的NAT1插入片段通过简单连接插入pFL44s载体中。由此获得的载体是pFL44s-NAT1载体。
自psh47载体(GenBank参考号AF298782)获得包括CRE酶序列的插入片段。用PvulI限制性酶消化psh47载体和pFL44s-NAT1载体。随后，将包括GAL1基因启动子、CRE基因序列及CYC1基因终止子的CRE插入片段通过简单连接插入pFL44s-NAT1载体。由此获得的载体是pFL44s-NAT1-CRE载体，其序列为序列SEQ ID No.11(图3)。
2/用切除载体转化酵母以除去存在于酵母基因组的可选择标志物
以pFL44s-NAT1-CRE切除载体转化包括含有香草醇氧化酶的表达系统的酵母，例如93334菌株。在添加clonNAT(100mg/ml)的丰富培养基(YPD)上选择转化的酵母。
随后，将阳性选择的酵母培养在YP半乳糖培养基中。由于CRE基因的启动子在半乳糖存在下可诱导，因而该培养条件使诱导酵母中CRE酶的表达成为可能。
该实验的结果表明，80％的所述克隆已经丢失了KanR标志物。
以已经丢失所述可选择标志物的93334菌株进行1/中所述的转化丁香酚为松柏醇的方法。经过18小时的转化后，得到相同的结果，提示丢失了可选择标志物不影响所述菌株的生物转化能力。
序列表
<110>让·玛奈
<120>产生芳香分子的酵母表达系统
<130>BFF060094
<160>15
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1734
<212>DNA
<213>简青霉
<400>1
atgagcggcc  gctcaaagac  tcaagagttc  agaccattga  ctttgccacc  aaagttgtct    60
ttgtcagact  tcaacgagtt  cattcaagac  attattagaa  ttgttggttc  agagaacgtt    120
gaggttattt  catctaagga  ccaaattgtt  gacggttctt  atatgaagcc  aactcatact    180
catgacccac  atcatgttat  ggaccaagac  tatttcttgg  cttctgctat  tgttgctcca    240
agaaacgttg  ctgacgttca  atctattgtt  ggtttggcta  acaagttctc  tttcccattg    300
tggccaattt  caattggtag  aaactctggt  tatggtggtg  ctgctccccg  ggtttcaggt    360
tctgttgttt  tggacatggg  taagaacatg  aacagagttt  tggaggttaa  cgttgaaggt    420
gcttattgtg  ttgttgaacc  aggtgttact  tatcatgact  tgcataacta  tttggaggct    480
aacaacttga  gagacaaatt  gtggttagac  gttccagatc  taggtggtgg  ttctgttttg    540
ggtaacgctg  ttgaaagagg  tgttggttat  actccatacg  gtgatcattg  gatgatgcat    600
tctggtatgg  aggttgtttt  ggctaacggt  gagttgttaa  gaactggtat  gggtgcttta    660
ccagacccaa  aaagaccaga  gactatgggt  ttgaagccag  aagatcaacc  atggtctaag    720
attgctcatt  tgttcccata  cggtttcggt  ccatatattg  atggtttgtt  ctctcaatct    780
aacatgggta  ttgttactaa  gattggtatt  tggttaatgc  caaacccagg  tggttatcaa    840
tcttatttga  ttactttacc  aaaggatggt  gacttgaagc  aagctgttga  cattattaga    900
ccattgagat  taggtatggc  tttgcaaaac  gttccaacta  ttagacatat  tttattggat    960
gctgctgttt  tgggtgacaa  gagatcatat  tcttcaaaaa  ctgagccatt  gtctgacgag    1020
gagttggaca  agattgctaa  gcaattgaac  ttgggtagat  ggaactttta  tggtgctttg    1080
tatggtccag  aaccaattag  aagagttttg  tgggagacta  ttaaagatgc  tttctctgct    1140
attccaggtg  ttaagttcta  ttttccagaa  gatactccag  agaactctgt  tttgagagtt    1200
agagacaaga  ctatgcaagg  tattccaact  tatgacgagt  taaaatggat  tgactggttg    1260
ccaaacggtg  ctcatttgtt  cttctctcca  attgctaagg  tttctggtga  agacgctatg    1320
atgcaatatg  ctgttactaa  aaagagatgt  caagaggctg  gtttggactt  cattggtact    1380
tttactgttg  gcatgcgtga  gatgcatcat  attgtttgta  ttgttttcaa  caagaaggac    1440
ttgattcaaa  agagaaaggt  tcaatggttg  atgagaactt  tgattgatga  ctgtgctgct    1500
aatggttggg  gtgagtatag  aactcatttg  gctttcatgg  accaaattat  ggagacttat    1560
aactggaaca  actcttcatt  cttgagattc  aacgaggttt  tgaagaacgc  tgttgatcca    1620
aacggtatta  ttgctccagg  taagtcaggt  gtttggccat  ctcaatattc  tcatgttact    1680
tggaagctcg  agcgagctcc  cggggggggt  tctcatcatc  atcatcatca  ttaa          1734
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>多克隆位点
<400>2
gcggccgcgg  atcccaattg  cgactcgag                                          29
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>噬菌体P1
<400>3
ataacttcgt  ataatgtatg  ctatacgaag ttat                                    34
<210>4
<211>149
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>4
ctgtgcttcg  gttacttcta  aggaagtcca  cacaaatcaa  gatccgttag  acgtttcagc    60
ttccaaaaca  gaagaatgtg  agaaggcttc  cactaaggct  aactctcaac  agacaacaac    120
acctgcttca  tctgctgttc  cagagaacc                                         149
<210>5
<211>153
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>5
acctgataca  agaacttaac  aagaaaccaa  ttattaaagg  cttacttact  gatagtagat    60
caacgatcag  tataattaag  tctacaaatg  aagagaaatt  tagaaacaga  ttttttggca    120
caaaggcaat  gagacttaga  gatgaagtat  cag                                   153
<210>6
<211>596
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>6
tcaaaaaact  agtcttttaa  ttctgctgta  acccgtacat  gcccaaaata  gggggcgggt    60
tacacagaat  atataacatc  gtaggtgtct  gggtgaacag  tttattcctg  gcatccacta    120
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gaacaggggc  acaaacaggc  aaaaaacggg  cacaacctca  atggagtgat  gcaacctgcc    300
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ccttctatta  ccttctgctc  tctctgattt  ggaaaaagct  gaaaaaaaag  gttgaaacca    420
gttccctgaa  attattcccc  tacttgacta  ataagtatat  aaagacggta  ggtattgatt    480
gtaattctgt  aaatctattt  cttaaacttc  ttaaattcta  cttttatagt  tagtcttttt    540
tttagtttta  aaacaccaag  aacttagttt  cgaataaaca  cacataaaca  aacaaa        596
<210>7
<211>204
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>7
acaggcccct  tttcctttgt  cgatctcatg  taattagtta  tgtcacgctt  acattcacgc    60
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cctatttatt  ttttttaata  gttatgttag  tattaagaac  gttatttata  tttcaaattt    180
ttcttttttt  tctgtacaaa  cgcg                                              204
<210>8
<211>383
<212>DNA
<213>棉蚜
<400>8
gtttagcttg  cctcgtcccc  gccgggtcac  ccggccagcg  acatggaggc  ccagaatacc    60
ctccttgaca  gtcttgacgt  gcgcagctca  ggggcatgat  gtgactgtcg  cccgtacatt    120
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cgaagcaaaa  attacggctc  ctcgctgcag  acctgcgagc  agggaaacgc  tcccctcaca    240
gacgcgttga  attgtcccca  cgccgcgccc  ctgtagagaa  atataaaagg  ttaggatttg    300
ccactgaggt  tcttctttca  tatacttcct  tttaaaatct  tgctaggata  cagttctcac    360
atcacatccg aacataaaca acc                                                 383
<210>9
<211>244
<212>DNA
<213>棉蚜
<400>9
tcagtactga  caataaaaag  attcttgttt  tcaagaactt  gtcatttgta  tagttttttt    60
atattgtagt  tgttctattt  taatcaaatg  ttagcgtgat  ttatattttt  tttcgcctcg    120
acatcatctg  cccagatgcg  aagttaagtg  cgcagaaagt  aatatcatgc  gtcaatcgta    180
tgtgaatgct  ggtcgctata  ctgctgtcga  ttcgatacta  acgccgccat  ccagtgtcga    240
aaac                                                                      244
<210>10
<211>810
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>10
atgggtaagg  aaaagactca  cgtttcgagg  ccgcgattaa  attccaacat  ggatgctgat    60
ttatatgggt  ataaatgggc  tcgcgataat  gtcgggcaat  caggtgcgac  aatctatcga    120
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aatgatgtta  cagatgagat  ggtcagacta  aactggctga  cggaatttat  gcctcttccg    240
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ggcaaaacag  cattccaggt  attagaagaa  tatcctgatt  caggtgaaaa  tattgttgat    360
gcgctggcag  tgttcctgcg  ccggttgcat  tcgattcctg  tttgtaattg  tccttttaac    420
agcgatcgcg  tatttcgtct  cgctcaggcg  caatcacgaa  tgaataacgg  tttggttgat    480
gcgagtgatt  ttgatgacga  gcgtaatggc  tggcctgttg  aacaagtctg  gaaagaaatg    540
cataagcttt  tgccattctc  accggattca  gtcgtcactc  atggtgattt  ctcacttgat    600
aaccttattt  ttgacgaggg  gaaattaata  ggttgtattg  atgttggacg  agtcggaatc    660
gcagaccgat  accaggatct  tgccatccta  tggaactgcc  tcggtgagtt  ttctccttca    720
ttacagaaac  ggctttttca  aaaatatggt  attgataatc  ctgatatgaa  taaattgcag    780
tttcatttga  tgctcgatga  gtttttctaa                                        810
<210>11
<211>3745
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>包括VAO基因的表达系统
<400>11
gaattccagc tgtgcttcgg ttacttctaa ggaagtccac acaaatcaag atccgttaga  60
cgtttcagct tccaaaacag aagaatgtga gaaggcttcc actaaggcta actctcaaca  120
gacaacaaca cctgcttcat ctgctgttcc agagaaccga taacttcgta taatgtatgc  180
tatacgaagt tatatgggta aggaaaagac tcacgtttcg aggccgcgat taaattccaa  240
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gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa  360
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ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa  660
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acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga  900
gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat  960
gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc taacaaccct taatataact  1020
tcgtataatg tatgctatac gaagttatta ggtcaaaaaa ctagtctttt aattctgctg  1080
taacccgtac atgcccaaaa tagggggcgg gttacacaga atatataaca tcgtaggtgt  1140
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gcatccagaa aaaaaaagaa tcccagcacc aaaatattgt tttcttcacc aaccatcagt  1260
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tattagaatt gttggttcag agaacgttga ggttatttca tctaaggacc aaattgttga  1800
cggttcttat  atgaagccaa  ctcatactca  tgacccacat  catgttatgg  accaagacta    1860
tttcttggct  tctgctattg  ttgctccaag  aaacgttgct  gacgttcaat  ctattgttgg    1920
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tggtggtgct  gctccccggg  tttcaggttc  tgttgttttg  gacatgggta  agaacatgaa    2040
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agagatgaag  tatcagctgc  tgcag                                           3745
<210>12
<211>3833
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>NAT1-CRE序列
<400>12
ggatctgttt  agcttgcctc  gtccccgccg  ggtcacccgg  ccagcgacat  ggaggcccag    60
aataccctcc  ttgacagtct  tgacgtgcgc  agctcagggg  catgatgtga  ctgtcgcccg    120
tacatttagc  ccatacatcc  ccatgtataa  tcatttgcat  ccatacattt  tgatggccgc    180
acggcgcgaa  gcaaaaatta  cggctcctcg  ctgcagacct  gcgagcaggg  aaacgctccc    240
ctcacagacg  cgttgaattg  tccccacgcc  gcgcccctgt  agagaaatat  aaaaggttag    300
gatttgccac  tgaggttctt  ctttcatata  cttcctttta  aaatcttgct  aggatacagt    360
tctcacatca  catccgaaca  taaacaacca  tgaccactct  tgacgacacg  gcttaccggt    420
accgcaccag  tgtcccgggg  gacgccgagg  ccatcgaggc  actggatggg  tccttcacca    480
ccgacaccgt  cttccgcgtc  accgccaccg  gggacggctt  caccctgcgg  gaggtgccgg    540
tggacccgcc  cctgaccaag  gtgttccccg  acgacgaatc  ggacgacgaa  tcggacgccg    600
gggaggacgg  cgacccggac  tcccggacgt  tcgtcgcgta  cggggacgac  ggcgacctgg    660
cgggcttcgt  ggtcgtctcg  tactccggct  ggaaccgccg  gctgaccgtc  gaggacatcg    720
aggtcgcccc  ggagcaccgg  gggcacgggg  tcgggcgcgc  gttgatgggg  ctcgcgacgg    780
agttcgcccg  cgagcggggc  gccgggcacc  tctggctgga  ggtcaccaac  gtcaacgcac    840
cggcgatcca  cgcgtaccgg  cggatggggt  tcaccctctg  cggcctggac  accgccctgt    900
acgacggcac  cgcctcggac  ggcgagcagg  cgctctacat  gagcatgccc  tgcccctaat    960
cagtactgac  aataaaaaga  ttcttgtttt  caagaacttg  tcatttgtat  agttttttta    1020
tattgtagtt  gttctatttt  aatcaaatgt  tagcgtgatt  tatatttttt  ttcgcctcga    1080
catcatctgc  ccagatgcga  agttaagtgc  gcagaaagta  atatcatgcg  tcaatcgtat    1140
gtgaatgctg  gtcgctatac  tgctgtcgat  tcgatactaa  cgccgccatc  cagtgtcgaa    1200
aacgagctcg  aattcactgg  ccgtcgtttt  acaacgtcgt  gactgggaaa  accctggcgt    1260
tacccaactt  aatcgccttg  cagcacatcc  ccctttcgcc  agctggcacg  acaggtttcc    1320
cgactggaaa  gcgggcagtg  agcgcaacgc  aattaatgtg  agttacctca  ctcattaggc    1380
accccaggct  ttacacttta  tgcttccggc  tcctatgttg  tgtggaattg  tgagcggata    1440
acaatttcac  acaggaaaca  gctatgacca  tgattacgcc  aagcgcgcaa  ttaaccctca    1500
ctaaagggaa  caaaagctgg  agctctagta  cggattagaa  gccgccgagc  gggtgacagc    1560
cctccgaagg  aagactctcc  tccgtgcgtc  ctcgtcttca  ccggtcgcgt  tcctgaaacg    1620
cagatgtgcc  tcgcgccgca  ctgctccgaa  caataaagat  tctacaatac  tagcttttat    1680
ggttatgaag  aggaaaaatt  ggcagtaacc  tggccccaca  aaccttcaaa  tgaacgaatc    1740
aaattaacaa  ccataggatg  ataatgcgat  tagtttttta  gccttatttc  tggggtaatt    1800
aatcagcgaa  gcgatgattt  ttgatctatt  aacagatata  taaatgcaaa  aactgcataa    1860
ccactttaac  taatactttc  aacattttcg  gtttgtatta  cttcttattc  aaatgtaata    1920
aaagtatcaa  caaaaaattg  ttaatatacc  tctatacttt  aacgtcaagg  agaaaaaacc    1980
ccggattcta  gaactagtgg  atcccccggg  ctgcaggaat  tcgatatcaa  gcttatcgat    2040
accgtcgagg  ggcagagccg  atcctgtaca  ctttacttaa  aaccattatc  tgagtgttaa    2100
atgtccaatt  tactgaccgt  acaccaaaat  ttgcctgcat  taccggtcga  tgcaacgagt    2160
gatgaggttc  gcaagaacct  gatggacatg  ttcagggatc  gccaggcgtt  ttctgagcat    2220
acctggaaaa  tgcttctgtc  cgtttgccgg  tcgtgggcgg  catggtgcaa  gttgaataac    2280
cggaaatggt  ttcccgcaga  acctgaagat  gttcgcgatt  atcttctata  tcttcaggcg    2340
cgcggtctgg  cagtaaaaac  tatccagcaa  catttgggcc  agctaaacat  gcttcatcgt    2400
cggtccgggc  tgccacgacc  aagtgacagc  aatgctgttt  cactggttat  gcggcggatc    2460
cgaaaagaaa  acgttgatgc  cggtgaacgt  gcaaaacagg  ctctagcgtt  cgaacgcact    2520
gatttcgacc  aggttcgttc  actcatggaa  aatagcgatc  gctgccagga  tatacgtaat    2580
ctggcatttc  tggggattgc  ttataacacc  ctgttacgta  tagccgaaat  tgccaggatc    2640
agggttaaag  atatctcacg  tactgacggt  gggagaatgt  taatccatat  tggcagaacg    2700
aaaacgctgg  ttagcaccgc  aggtgtagag  aaggcactta  gcctgggggt  aactaaactg    2760
gtcgagcgat  ggatttccgt  ctctggtgta  gctgatgatc  cgaataacta  cctgttttgc    2820
cgggtcagaa  aaaatggtgt  tgccgcgcca  tctgccacca  gccagctatc  aactcgcgcc    2880
ctggaaggga  tttttgaagc  aactcatcga  ttgatttacg  gcgctaagga  tgactctggt    2940
cagagatacc  tggcctggtc  tggacacagt  gcccgtgtcg  gagccgcgcg  agatatggcc    3000
cgcgctggag  tttcaatacc  ggagatcatg  caagctggtg  gctggaccaa  tgtaaatatt    3060
gtcatgaact  atatccgtac  cctggatagt  gaaacagggg  caatggtgcg  cctgctggaa    3120
gatggcgatt  agccattaac  gcgtaaatga  ttgctataat  tatttgatat  ttatggtgac    3180
atatgagaaa  ggatttcaac  atcgacggaa  aatatgtagt  gctgtctgta  agcactaata    3240
ttcagtcgcc  agccgtcatt  gtcactgtaa  agctgagcga  tagaatgcct  gatattgact    3300
caatatccgt  tgcgtttcct  gtcaaaagta  tgcgtagtgc  tgaacatttc  gtgatgaatg    3360
ccaccgagga  agaagcacgg  cgcggttttg  ctaaagtgat  gtctgagttt  ggcgaactct    3420
tgggtaaggt  tggaattgtc  gacctcgagt  catgtaatta  gttatgtcac  gcttacattc    3480
acgccctccc  cccacatccg  ctctaaccga  aaaggaagga  gttagacaac  ctgaagtcta    3540
ggtccctatt  tattttttta  tagttatgtt  agtattaaga  acgttattta  tatttcaaat    3600
ttttcttttt  tttctgtaca  gacgcgtgta  cgcatgtaac  attatactga  aaaccttgct    3660
tgagaaggtt  ttgggacgct  cgaaggcttt  aatttgcggc  cggtacccaa  ttcgccctat    3720
agtgagtcgt  attacgcgcg  ctcactggcc  gtcgttttac  aacgtcgtga  ctgggaaaac    3780
cctggcgtta  cccaacttaa  tcgccttgca  gcacatcccc  ctttcgccag  ctg           3833
<210>13
<211>2715
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>表达系统
<400>13
gaattccagc  tgtgcttcgg  ttacttctaa  ggaagtccac  acaaatcaag  atccgttaga    60
cgtttcagct  tccaaaacag  aagaatgtga  gaaggcttcc  actaaggcta  actctcaaca    120
gacaacaaca  cctgcttcat  ctgctgttcc  agagaaccgt  cgacaaccct  taatataact    180
tcgtataatg  tatgctatac  gaagttatta  ggtctagaga  tctgtttagc  ttgcctcgtc    240
cccgccgggt  cacccggcca  gcgacatgga  ggcccagaat  accctccttg  acagtcttga    300
cgtgcgcagc  tcaggggcat  gatgtgactg  tcgcccgtac  atttagccca  tacatcccca    360
tgtataatca  tttgcatcca  tacattttga  tggccgcacg  gcgcgaagca  aaaattacgg    420
ctcctcgctg  cagacctgcg  agcagggaaa  cgctcccctc  acagacgcgt  tgaattgtcc    480
ccacgccgcg  cccctgtaga  gaaatataaa  aggttaggat  ttgccactga  ggttcttctt    540
tcatatactt  ccttttaaaa  tcttgctagg  atacagttct  cacatcacat  ccgaacataa    600
acaaccatgg  gtaaggaaaa  gactcacgtt  tcgaggccgc  gattaaattc  caacatggat    660
gctgatttat  atgggtataa  atgggctcgc  gataatgtcg  ggcaatcagg  tgcgacaatc    720
tatcgattgt  atgggaagcc  cgatgcgcca  gagttgtttc  tgaaacatgg  caaaggtagc    780
gttgccaatg  atgttacaga  tgagatggtc  agactaaact  ggctgacgga  atttatgcct    840
cttccgacca  tcaagcattt  tatccgtact  cctgatgatg  catggttact  caccactgcg    900
atccccggca  aaacagcatt  ccaggtatta  gaagaatatc  ctgattcagg  tgaaaatatt    960
gttgatgcgc  tggcagtgtt  cctgcgccgg  ttgcattcga  ttcctgtttg  taattgtcct    1020
tttaacagcg  atcgcgtatt  tcgtctcgct  caggcgcaat  cacgaatgaa  taacggtttg    1080
gttgatgcga  gtgattttga  tgacgagcgt  aatggctggc  ctgttgaaca  agtctggaaa    1140
gaaatgcata  agcttttgcc  attctcaccg  gattcagtcg  tcactcatgg  tgatttctca    1200
cttgataacc  ttatttttga  cgaggggaaa  ttaataggtt  gtattgatgt  tggacgagtc    1260
ggaatcgcag  accgatacca  ggatcttgcc  atcctatgga  actgcctcgg  tgagttttct    1320
ccttcattac  agaaacggct  ttttcaaaaa  tatggtattg  ataatcctga  tatgaataaa    1380
ttgcagtttc  atttgatgct  cgatgagttt  ttctaatcag  tactgacaat  aaaaagattc    1440
ttgttttcaa  gaacttgtca  tttgtatagt  ttttttatat  tgtagttgtt  ctattttaat    1500
caaatgttag  cgtgatttat  attttttttc  gcctcgacat  catctgccca  gatgcgaagt    1560
taagtgcgca  gaaagtaata  tcatgcgtca  atcgtatgtg  aatgctggtc  gctatactgc    1620
tgtcgattcg  atactaacgc  cgccatccag  tgtcgaaaac  gagctcaacc  cttaatataa    1680
cttcgtataa  tgtatgctat  acgaagttat  taggtcaaaa  aactagtctt  ttaattctgc    1740
tgtaacccgt  acatgcccaa  aatagggggc  gggttacaca  gaatatataa  catcgtaggt    1800
gtctgggtga  acagtttatt  cctggcatcc  actaaatata  atggagcccg  ctttttaagc    1860
tggcatccag  aaaaaaaaag  aatcccagca  ccaaaatatt  gttttcttca  ccaaccatca    1920
gttcataggt  ccattctctt  agcgcaacta  cagagaacag  gggcacaaac  aggcaaaaaa    1980
cgggcacaac  ctcaatggag  tgatgcaacc  tgcctggagt  aaatgatgac  acaaggcaat    2040
tcacccacgc  atgtatctat  ctcattttct  tacaccttct  attaccttct  gctctctctg    2100
atttggaaaa  agctgaaaaa  aaaggttgaa  accagttccc  tgaaattatt  cccctacttg    2160
actaataagt  atataaagac  ggtaggtatt  gattgtaatt  ctgtaaatct  atttcttaaa    2220
cttcttaaat  tctactttta  tagttagtct  tttttttagt  tttaaaacac  caagaactta    2280
gtttcgaata  aacacacata  aacaaacaaa  atgagcggcc  gcggatccca  attgcgactc    2340
gagtaataaa  caggcccctt  ttcctttgtc  gatctcatgt  aattagttat  gtcacgctta    2400
cattcacgcc  ctcctcccac  atccgctcta  accgaaaagg  aaggagttag  acaacctgaa    2460
gtctaggtcc  ctatttattt  tttttaatag  ttatgttagt  attaagaacg  ttatttatat    2520
ttcaaatttt  tctttttttt  ctgtacaaac  gcgacctgat  acaagaactt  aacaagaaac    2580
caattattaa  aggcttactt  actgatagta  gatcaacgat  cagtataatt  aagtctacaa    2640
atgaagagaa  atttagaaac  agattttttg  gcacaaaggc  aatgagactt  agagatgaag    2700
tatcagctgc  tgcag                                                         2715
<210>14
<211>1225
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列表达系统
<400>14
gaattccagc  tgtgcttcgg  ttacttctaa  ggaagtccac  acaaatcaag  atccgttaga    60
cgtttcagct  tccaaaacag  aagaatgtga  gaaggcttcc  actaaggcta  actctcaaca    120
gacaacaaca  cctgcttcat  ctgctgttcc  agagaaccgt  cgacgatatc  gagctcaacc    180
cttaatataa  cttcgtataa  tgtatgctat  acgaagttat  taggtcaaaa  aactagtctt    240
ttaattctgc  tgtaacccgt  acatgcccaa  aatagggggc  gggttacaca  gaatatataa    300
catcgtaggt  gtctgggtga  acagtttatt  cctggcatcc  actaaatata  atggagcccg    360
ctttttaagc  tggcatccag  aaaaaaaaag  aatcccagca  ccaaaatatt  gttttcttca    420
ccaaccatca  gttcataggt  ccattctctt  agcgcaacta  cagagaacag  gggcacaaac    480
aggcaaaaaa  cgggcacaac  ctcaatggag  tgatgcaacc  tgcctggagt  aaatgatgac    540
acaaggcaat  tcacccacgc  atgtatctat  ctcattttct  tacaccttct  attaccttct    600
gctctctctg  atttggaaaa  agctgaaaaa  aaaggttgaa  accagttccc  tgaaattatt    660
cccctacttg  actaataagt  atataaagac  ggtaggtatt  gattgtaatt  ctgtaaatct    720
atttcttaaa  cttcttaaat  tctactttta  tagttagtct  tttttttagt  tttaaaacac    780
caagaactta  gtttcgaata  aacacacata  aacaaacaaa  atgagcggcc  gcggatccca    840
attgcgactc  gagtaataaa  caggcccctt  ttcctttgtc  gatctcatgt  aattagttat    900
gtcacgctta  cattcacgcc  ctcctcccac  atccgctcta  accgaaaagg  aaggagttag    960
acaacctgaa  gtctaggtcc  ctatttattt  tttttaatag  ttatgttagt  attaagaacg    1020
ttatttatat  ttcaaatttt  tctttttttt  ctgtacaaac  gcgacctgat  acaagaactt    1080
aacaagaaac  caattattaa  aggcttactt  actgatagta  gatcaacgat  cagtataatt    1140
aagtctacaa  atgaagagaa  atttagaaac  agattttttg  gcacaaaggc  aatgagactt    1200
agagatgaag  tatcagctgc  tgcag                                             1225
<210>15
<211>1508
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>选择插入表达系统
<400>15
gtcgacaacc  cttaatataa  cttcgtataa  tgtatgctat  acgaagttat  taggtctaga    60
gatctgttta  gcttgcctcg  tccccgccgg  gtcacccggc  cagcgacatg  gaggcccaga    120
ataccctcct  tgacagtctt  gacgtgcgca  gctcaggggc  atgatgtgac  tgtcgcccgt    180
acatttagcc  catacatccc  catgtataat  catttgcatc  catacatttt  gatggccgca    240
cggcgcgaag  caaaaattac  ggctcctcgc  tgcagacctg  cgagcaggga  aacgctcccc    300
tcacagacgc  gttgaattgt  ccccacgccg  cgcccctgta  gagaaatata  aaaggttagg    360
atttgccact  gaggttcttc  tttcatatac  ttccttttaa  aatcttgcta  ggatacagtt    420
ctcacatcac  atccgaacat  aaacaaccat  gggtaaggaa  aagactcacg  tttcgaggcc    480
gcgattaaat  tccaacatgg  atgctgattt  atatgggtat  aaatgggctc  gcgataatgt    540
cgggcaatca  ggtgcgacaa  tctatcgatt  gtatgggaag  cccgatgcgc  cagagttgtt    600
tctgaaacat  ggcaaaggta  gcgttgccaa  tgatgttaca  gatgagatgg  tcagactaaa    660
ctggctgacg  gaatttatgc  ctcttccgac  catcaagcat  tttatccgta  ctcctgatga    720
tgcatggtta  ctcaccactg  cgatccccgg  caaaacagca  ttccaggtat  tagaagaata    780
tcctgattca  ggtgaaaata  ttgttgatgc  gctggcagtg  ttcctgcgcc  ggttgcattc    840
gattcctgtt  tgtaattgtc  cttttaacag  cgatcgcgta  tttcgtctcg  ctcaggcgca    900
atcacgaatg  aataacggtt  tggttgatgc  gagtgatttt  gatgacgagc  gtaatggctg    960
gcctgttgaa  caagtctgga  aagaaatgca  taagcttttg  ccattctcac  cggattcagt    1020
cgtcactcat  ggtgatttct  cacttgataa  ccttattttt  gacgagggga  aattaatagg    1080
ttgtattgat  gttggacgag  tcggaatcgc  agaccgatac  caggatcttg  ccatcctatg    1140
gaactgcctc  ggtgagtttt  ctccttcatt  acagaaacgg  ctttttcaaa  aatatggtat    1200
tgataatcct  gatatgaata  aattgcagtt  tcatttgatg  ctcgatgagt  ttttctaatc    1260
agtactgaca  ataaaaagat  tcttgttttc  aagaacttgt  catttgtata  gtttttttat    1320
attgtagttg  ttctatttta  atcaaatgtt  agcgtgattt  atattttttt  tcgcctcgac    1380
atcatctgcc  cagatgcgaa  gttaagtgcg  cagaaagtaa  tatcatgcgt  caatcgtatg    1440
tgaatgctgg  tcgctatact  gctgtcgatt  cgatactaac  gccgccatcc  agtgtcgaaa    1500
acgagctc                                                                  1508

Claims (21)

1.包括至少一个编码香草醇氧化酶的基因的酵母，所述香草醇氧化酶的序列与SEQ ID No.1编码的序列相同，所述酵母催化丁香酚生物转化为天然的阿魏酸和/或天然的松柏醇和/或天然的香草醛。
2.如权利要求1所述的酵母，其特征在于，编码香草醇氧化酶的基因包含在表达系统中，所述系统包括：
(1)将所述系统整合进所述酵母的基因组的装置，其包括选自TY序列的两个核苷酸序列，
(2)选择已经整合了所述系统的所述酵母的装置，其包括选择插入片段，该选择插入片段包括启动子、可选择标志物、终止子以及对应于序列SEQ ID NO.3的两个LoxP序列，所述两个LoxP序列作为所述启动子、所述可选择标志物以及所述终止子的边界，
(3)编码香草醇氧化酶的基因的表达盒，其包括允许所述基因表达的启动子、允许所述基因整合的至少一个克隆位点以及终止子。
3.如权利要求2所述的酵母，其特征在于，将所述表达系统整合进所述酵母的基因组的核苷酸序列为酿酒酵母的与序列SEQ ID No.4对应的TY1A序列和与序列SEQ ID No.5对应的TY1B序列。
4.如权利要求2或3所述的酵母，其特征在于，允许所述香草醇氧化酶表达的启动子是酿酒酵母TDH3基因的启动子，其序列为SEQ ID No.6，并且相关的终止子是对应于序列SEQ ID No.7的酿酒酵母CYC1基因的终止子。
5.如权利要求2所述的酵母，其特征在于，允许所述可选择标志物表达的启动子和终止子是棉蚜TEF1基因的对应于序列SEQ ID No.8的启动子和对应于序列SEQ ID No.9的终止子。
6.如权利要求2所述的酵母，其特征在于，所述可选择标志物为抗生素抗性基因，其选自包括抗遗传霉素基因、抗诺尔丝菌素基因、抗腐草霉素基因或抗zéocine基因，或抗野生型酵母敏感的支配抗生素的任何其它基因的组。
7.如权利要求2所述的酵母，其中含有香草醇氧化酶的表达系统的序列为核苷酸序列SEQ ID No.11。
8.如权利要求1所述的酵母，其特征在于，其属于能够将香草醛前体生物转化为香草醛的酵母的任何种。
9.如权利要求1所述的酵母，其特征在于，其属于酵母属或其杂种。
10.如权利要求9所述的酵母，其特征在于，它属于酿酒酵母菌株或其杂种。
11.包括表达系统的载体，所述表达系统如在权利要求2至7任一项中所定义的。
12.包括表达系统的质粒，所述表达系统如在权利要求2至7任一项中所定义的。
13.如权利要求12所述的质粒，所述质粒是pUC57。
14.包括如权利要求11所述的载体的酵母。
15.产生天然松柏醇和/或天然阿魏酸的方法，包括以下步骤：
a)将编码香草醇氧化酶的基因的核苷酸序列克隆至如权利要求2至7中任一项所述的表达系统，
b)用如此获得的表达系统转化酵母，
c)在允许所述香草醇氧化酶表达的条件下培养所述酵母，
d)使所述酵母与丁香酚接触。
16.如权利要求15所述的方法，包括在步骤b)之后且在步骤c)和步骤d)之前的以下步骤b1)、b2)及b3)：
b1)用如权利要求11所述的载体转化所述酵母，
b2)在允许CRE酶表达的条件下培养所述酵母，
b3)分离已丢失所述可选择标志物的酵母。
17.如权利要求16所述的方法，其中按照所需的所述表达系统的拷贝数，将步骤b)、步骤b1)、步骤b2)及步骤b3)重复许多次。
18.产生香草醛的方法，包括如权利要求15至17中任一项所述的步骤a)、b)、c)及d)，以及随后的将步骤d)中产生的阿魏酸和/或松柏醇转化为香草醛的步骤。
19.如权利要求18所述的产生香草醛的方法，其中将步骤d)中产生的阿魏酸和/或松柏醇转化为香草醛的步骤利用生物化学方法进行。
20.如权利要求19所述的产生香草醛的方法，其中将步骤d)中产生的阿魏酸和/或松柏醇转化为香草醛的步骤在酵母中进行。
21.如权利要求19所述的产生香草醛的方法，其中将步骤d)中产生的阿魏酸和/或松柏醇转化为香草醛的步骤利用酶法进行。
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