KR101038900B1

KR101038900B1 - 크리포넥트리아 파라시티카 유래의 신규한 프로모터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101038900B1
Application number: KR1020080120857A
Authority: KR
Inventors: 김대혁; 양문식; 장용석; 박승문
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2008-12-02
Publication date: 2011-06-03
Also published as: KR20100062291A

Abstract

본 발명은 크리포넥트리아 파라시티카 유래의 신규한 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 크리포넥트리아 파라시티카 (Cryphonectria parasitica) 유래의 크리파린(cryparin) 유전자의 전사개시점으로부터 83bp 단편과 전사체의 5'-비해독 영역 105bp 단편으로 이루어진 프로모터; 상기 프로모터와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물; 및 상기 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.

크리포넥트리아 파라시티카, 크리파린, 프로모터, 목적 단백질, 형질전환, 진균

Description

크리포넥트리아 파라시티카 유래의 신규한 프로모터 및 이의 용도{Novel promoter orginated from Cryphonectria parasitica and uses thereof}

본 발명은 크리포넥트리아 파라시티카 유래의 신규한 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 미생물을 이용한 외래유전자의 고도 발현을 위해 본 발명의 크리포넥트리아 파라시티카의 크리파린 프로모터를 이용함으로써 재조합 단백질 분비 발현 시스템을 이용하여 목적단백질의 대규모 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr)는 밤나무에 줄기마름병을 유발하여 치명적인 손상을 야기하는 강력한 식물병원성 진균으로, 북미대륙에서는 밤나무 산림의 멸종을 야기한 바 있고, 국내 밤나무의 경우도 크리포넥트리아 파라시티카에 의해 심각한 수준으로 감염되어 있으며, 수령의 노화와 함께 병균에 의한 피해가 심각한 수준에 있는 것으로 보고되고 있다. 그러나 세포질 전달이 가능한 이중 가닥 RNA로 된 마이코바이러스 (mycovirus)인 크리포넥트리아 하이포바이러스 (Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1))를 지니는 균주는 병원성이 저하되는 '저병원성화(hypovirulence)'를 보임과 동시에 포자 형성, 라카아제(laccase) 생성, 수산염 축적, 색소체 형성의 감소와 같은 저병원성과 연관된 형 태적 및 생화학적 변화를 보인다(Anagnostakis SL (1982) Science 215:466-471). 생물적 방제에 사용시, 이 바이러스에 감염된 이병균주인 저병원성 균주는 그 세포질내의 하이포바이러스(hypovirus)를 균사 융합을 통하여 바이러스에 감염되지 않은 건전 균주에 전달함으로써 건전 균주는 병원성이 약화된 저병원성 균주로 된다. 결국 이중 가닥 RNA 바이러스가 없는 야생형 계통에 이중 가닥 RNA 바이러스를 지닌 계통을 접종 시 두 계통 간에 균사 융합이 일어나, 이 바이러스를 획득한 야생형이 저병원성으로 변하므로 줄기마름병의 확산이 지연되거나 멈추게 된다. 따라서 크리포넥트리아 파라시티카 (C. parasitica)는 마이코바이러스(mycovirus)에 의해 조절되는 생물방제제일 뿐 아니라 진균성 병인을 이해하는데 좋은 모델 시스템이기도 하다.

식물 병원균으로서의 상당히 유해한 점 및 숙주-바이러스 상호관계 연구를 위한 모델 시스템이라는 점 외에, 크리포넥트리아 파라시티카(C. parasitica)는 식품첨가안전물질(GRAS)로 아스파르트산 단백질분해효소인 엔도티아펩신(endothiapepsin EAP, EC 3.4.23.6)을 분비하므로 치즈 제조 공정에 사용되고 있으며, 20년 이상 공인된 공업용 응유효소로 사용되어 왔다 (Jara et al., (1995) J Biotechnol 40:111-120).

바이러스 감염으로 생긴 증상들은 저병원성 균주에 있어 다수의 특정 유전자들의 비정상적인 발현의 결과로 보이며, 바이러스에 의하여 조절되는 몇 진균 유전자들이 확인된 바 있으며, 그 중 하나가 크리파린(Crp)이다. 진균성 하이드로포빈(hydrophobins)은 사상균에 널리 있으며 세포벽에 소수성을 부여하는데, 이는 포 자형성, 자실체 발달 및 감염구조물 형성을 포함한 많은 형태형성 과정에 연관되어 있다(Wessels JGH (1997) Adv Microb Physiol 38:1-45). 크리파린(Crp)은 class II 하이드로포빈에 속하며, 크리포넥트리아 파라시티카(C. parasitica)에서 과량 발현되는 것으로, 액체배양 2일 후에 총 mRNA의 22%가 cryparin(크리파린) 전사체에 달하는 가장 풍부하게 발현되는 균류 유전자 중의 하나일 것이다 (Zhang et al., (1994) Gene 139:59-64). 그러나 크리파린(Crp)의 발현은 마이코바이러스 (mycovirus)에 의해 엄격하게 조절된다. 즉, 크리포넥트리아 파라시티카 (C. parasitica)가 CHV1으로 감염되면 크리파린 mRNA 축적량에 극적인 변화가 생기며, 크리파린 발현은 건전 균주(EP155/2)에 비하여 감염된 균주에서 (UEP1) 50% 내지 70%까지 전사 수준이 떨어진다.

최근 이종성 유전자 발현과 외래 단백질 생산을 위한 숙주로서 사상균에 대한 관심이 집중되고 있다. 외래 DNA 분자가 발현되는 것을 확인하기 위해 발현 시스템은 진균성 프로모터 위주로 개발되어 왔고, 프로모터가 이 발현 시스템의 핵심 요소이다 (Cullen et al., (1987) Gene 57:21-26). 그러나 진균의 핵심 프로모터에 관하여 명확하게 밝혀지지 않은 부분이 많으며, 진균 발현 시스템의 개발을 위해서는 보다 많은 프로모터들의 특성 분석이 필요하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 크리포넥트리아 파라시티카 유래의 크리파린 (cryparin) 유전자 프로모터의 해독개시 코돈으로부터 업 스트림 (upstream)에 있는 188bp 프로모터 부분은 바이러스에 의한 저병원성과 상관없이 강력한 프로모터 활성을 일으킬 수 있는 최저 크기인 것을 확인하였고, 이에 본 발명자들은 이 프로모터를 이용한 재조합 단백질 발현 시스템 구축을 위한 효과적인 방법을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 크리포넥트리아 파라시티카 (Cryphonectria parasitica) 유래의 크리파린(cryparin) 유전자의 전사개시점으로부터 83bp 단편과 전사체의 5'-비해독 영역 105bp 단편으로 이루어진 프로모터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프로모터와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 크리포넥트리아 파라시티카 유래의 크리파린 유전자의 프로모터를 이용하면 크리포넥트리아 파라시티카를 포함한 미생물에서 특별한 처리 없이 원하는 외래 유전자 산물을 높은 수준으로 발현시킬 수 있는 장점이 있다.

상기 균은 식물 병원균이긴 하나 GRAS로서 엔도티아펩신의 산업적 생산 공정에 오랫동안 사용되어 왔고, 대규모 발효와 생성물 회수에 사용되어 왔으므로 균류 발현 숙주로서 사용이 가능한데, 강력한 프로모터와 숙주균주로서의 조작 용이성을 조합하여 외래유전자 발현을 위한 강력한 발현계 개발을 위해 상기 균의 효용가치가 크다.

다른 종의 사상균류에서도 상기 프로모터의 활성이 있으므로 이종성 유전자 발현에도 사용할 수 있다. 또한 상기 188 염기쌍의 작은 크기로도 프로모터로서 충분하므로 크로닝 과정에 여타 필요한 유전자의 크기 제한의 문제를 해소하는데 도움이 되므로 활용가치가 크다.

본 발명은 사상성 진균의 유전자발현 및 조절에 관련된 분야로, 산업적으로 활용이 많은 진균을 통한 유용물질 생산을 극대화 할 수 있는 유전자 발현정보를 확보한 것이다. 따라서 이차대사 산물 또는 재조합 단백질 생산에 필요한 숙주로써의 진균의 이용가치를 더욱 높일 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 크리포넥트리아 파라시티카 (Cryphonectria parasitica) 유래의 크리파린(cryparin) 유전자의 전사개시점으로부터 83bp 단편과 전사체의 5'-비해독 영역 105bp 단편으로 이루어진 프로모터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열이다.

본 발명에 따른 프로모터 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 최근의 여러 가지 연구기법, 예를 들어 방향성 진화법(directed evolution) 또는 부위특이 돌연 변이 기술(site-directed mutagenesis) 등의 방법을 통해 일정 정도 변형이 가능하다. 본 기술분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70% 이상의 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 유전자 발현을 위한 프로모터 활성을 보유하는 한, 본 발명의 염기서열로부터 유래된, 그와 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.

따라서, 본 발명의 크리파린(cryparin) 유전자 프로모터 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상의 상동성(homology)을 가진 뉴클레오타이드 서열을 포함하다.

본 발명에서 사용된 용어 "상동성"은 야생형 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 크리파린(cryparin) 유전자 프로모터의 핵산 서열과 바람직하게는 75%이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90%이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일할 수 있는 DNA 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

또한, 본 발명의 크리파린(cryparin) 유전자 프로모터 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 상보적인(complementary) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명에 사용된 용어, "상보적인"은 뉴클레오타이드 또는 핵산, 예를 들어 이중가닥 DNA 분자의 2개의 스트랜드간 또는 올리고 뉴클레오타이드 프라이머와 서열 분석되거나 증폭될 단일 스트랜드 핵산상의 프라이머 결합 부위간의 하이브리드 화 또는 염기 짝지음을 의미한다.

또한, 본 발명의 크리파린(cryparin) 유전자 프로모터 핵산 분자는 상기한 크리파린(cryparin) 유전자 프로모터 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 수행하는 이의 작용성 등가물을 포함한다. 상기한 기능적 등가물에는 작용성 단편을 포함하여, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이된 변이체를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "프로모터"는 유전자의 전사가 개시되기 위해 RNA 폴리머라제(RNA polymerase)가 결합하는 DNA 부위로서, mRNA 전사 개시 부위의 5' 측에 위치한다.

본 발명의 크리파린(cryparin) 유전자 프로모터 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 적절한 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 통해 분리할 수 있다. 또한, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성 기술을 이용하여 제조할 수도 있다.

본 발명은 또한 상기 프로모터와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 벡터는 진균용인 것으로, 도 1의 pCHPH1, pCLAC3, pCGO 또는 pCARGB1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA의 발현을 실시할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질 전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 일부 경우엔 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

용어 "작동 가능하게 연결된"은 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되는 것을 말한다.

본 발명은 또한 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 미생물은 진균이며, 상기 진균은 크리포넥트리아 파라시티카 (Cryphonectria parasitica), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 지베렐라 제아에 (Gibberella zeae) 또는 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

본 발명은 또한 상기 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 미생물은 진균인 것을 특징으로 한다.

상기한 바와 같은 형질전환된 숙주세포(형질전환체)의 배양은 당 분야의 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있다.

본 발명의 크리파린(cryparin) 유전자 프로모터 핵산 분자는 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자의 고발현을 유도할 수 있어, 목적 단백질의 대량 생산에 유용하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실험방법>

1. 진균 균주 및 배지

본 발명에서는 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica) 균주 EP155/2 (ATCC 38755)를 형질전환 실험에서 수용자로서 사용하였으며, 상기 균주를 25℃에서 일정한 낮은 수준의 광하에서 L-메티오닌 (100 mg L^-1) 및 바이오틴 (1 mg L^-1)을 함유하는 감자 덱스트로스 아가 (PDAmb)에서 유지하였다 (Kim DH, Martyn RD (1995) Mol Cells 5:658-667). 단백질 추출을 위해, 전술한 조건에 따라(Choi et al., (2005) Microbiol. 151:1349-1358) PDAmb를 덮은 셀로판 막에서 배양하였다. 액체 균사체는 EP 완전 배지 (Puhalla and Anagnostakis 1971)에서 배양하였다. 액 체 배양을 위한 일차 접종물의 제조 방법 및 배양 조건은 전술한 바에 따랐다(Kim DH, Martyn RD (1995) Mol Cells 5:658-667).

포도당 산화효소 (GO) 활성을 생성하기 위해, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) (ATCC 2119)를 완전 배지 (Pontercorvo et al.,(1953) Adv Genet 5:141-238)에서 유지하였다. 액체 배양 방법 및 배양 조건은 전술한 바에 따랐다(Kim et al., (2000) J Microbiol Biotechnol 10:287-292).

다른 진균에서 프로모터 활성을 조사하기 위해, 지베렐라 제아에(Gibberella zeae) Z03643 균주 (Dr. Robert L. Bowden, US Department of Agriculture, Manhattan, KS, U.S.A. 제공) 및 아르기닌 결핍 아스퍼질러스 니둘란스(A. nidulans) RMOS11 균주 (Stringer et al., (1991) Genes & Development 5:1161-1171)를 Han et al. (Han et al., (2004) Curr Genet 46:205-212)과 Han et al. (Han et al., (2001) Mol Microbiol 41:299-309)에 각각 기술된 바에 따라 수용 균주로서 사용하였다.

2. 프로모터 분석을 위한 벡터 제작

크리파린(cryparin) 프로모터 (Crp)의 188bp 단편을 사용하는 일련의 융합 구축물은 다양한 제한효소를 사용한 절단과 PCR 증폭으로 제작하였다 (도 1). 크라파린 유전자의 해독개시 코돈에서 업스트림 (upstream) 뉴클레오타이드 188까지 188bp 프로모터 영역은 pCEB7 (Kim et al.,(2008) Mol Cells 26: In press)에서 취하여, pCHPH1 벡터 제작을 위해 오버랩 연장 PCR법 (Ge L, Rudolph P (1997) Biotechniques 22:28-30)으로 pDH25 (Cullen et al., (1987) Gene 57:21-26) 유래의 세균 하이그로마이신 B 인산전달효소 유전자(hph)와 융합하였다. 프로모터의 성능 비교를 위하여, (뉴클레오타이드 427까지의) 크리파린 프로모터 427bp 영역은 pCEB6 (Kim et al.,(2008) Mol Cells 26: In press)에서 취하여, 발현 벡터 pCHPH4 제작을 위해 hph 유전자에 융합하였다. 내재하는 유도성 C. parasitica 유전자를 얻기 위해, 탄닌산 유도 라케이즈-3-유전자 (lac3)를 오버랩 연장 PCR법으로 188bp 단편에 융합하여, 발현 벡터 pCLAC3을 제조하였다. 188bp 단편의 조절 하에 다른 진균 유전자들의 발현을 조사하기 위해, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)의 GO 유전자 (GO)를 188bp 단편에 융합하여 만든 발현 벡터 pCGO1를 형질전환에 사용하였다.

다른 진균에서의 188bp 단편의 프로모터 활성을 평가하기 위하여, 188bp와 hph를 융합하여 만든 pCHPH1을 사용하여 지베렐라 제아에(Gibberella zeae)와 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)를 형질전환하였으며, 형질전환체는 하이그로마이신(hygromycin) B-저항성 유무로 선발하였다.

아스퍼질러스 니둘란스(A. nidulans)의 형질전환을 위해서는 188bp 단편을 오버랩 연장 PCR 증폭으로 pILJ16 (Johnstone et al., (1985) EMBO J 4:1307-1311)의 오르니틴 카바모일트랜스퍼라아제 유전자(ornithine carbamoyltransferase gene, argB)에 융합하였다. 이렇게 만들어진 발현 벡터 pCARGB1는 아스퍼질러스 니둘란스 (A. nidulans) RMOS11 균주 (Stringer et al., (1991) Genes & Development 5:1161-1171)의 아르기닌(arginine) 결핍 돌연변이체 형질전환에 사용하였다. 각각 의 프라이머에 대한 서열 정보는 표 1에 있다.

표 1. 본 발명에 사용된 프라이머(하기 Primers 옆에 표기된 괄호안의 숫자는 순서대로 서열번호 2부터 21을 나타낸다.)

3. 진균 형질전환

크리포넥트리아 파라시티카 (C. parasitica)의 형질전환은 Churchill et al. (Churchill et al., (1990) Curr Genet 17:25-31)에 따라 수행하였다. 지베렐라 제아에 (Gibberella zeae)의 형질전환은 Han et al. (Han et al., (2004) Curr Genet 46:205-212)에 따라 수행하였다. 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger)와 아스퍼질러스 니둘란스 (A. nidulans)의 형질전환은 각각 Kim et al. (Kim et al., (2000) J Microbiol Biotechnol 10:287-292) 과 Stringer et al. (Stringer et al., (1991) Genes & Development 5:1161-1171)의 방법에 따라 수행하였다. 모든 형질전환체는 단포자분리를 하여 추가 분석에 이용하였다.

4. 서던과 노던 블롯 분석

진균 균주들의 게놈 DNA (10㎍)를 제한효소로 절단하여 나일론 막(Hybond-N+, Amersham Biosciences, NJ, U.S.A.) 상에 옮기고 방사능으로 표지된 프로브와 혼성화하였다. RNA는 Kim et al. (Kim DH, Martyn RD (1995) Mol Cells 5:658-667)에 따라 액체 배양액으로부터 추출하였다. RNA는 또한 Park et al. (Park et al., (2004) Mol Microbiol 51:1267-1277)에 따라 셀로판 균사체 매트의 고체 배양체로부터도 추출하였다. 노던 블롯 분석은 Kim et al. (Kim DH, Martyn RD (1995) Mol Cells 5:658-667)에서와 같이 수행하였다. lac3 전사체의 수준은 크리포넥트리아 파라시티카(C. parasitica)에서의 유전자 발현에 대한 내부 대조군으로서 글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소 유전자를 프로브로 사용하여 평가하였다 (Choi GH, Nuss DL (1990) Nucleic Acids Res 18:5566).

5. 실시간 RT-PCR을 통한 프로모터의 강도 확인

프로모터의 강도를 확인하기 위하여 표적 유전자와 내부 대조군 유전자의 발현 수준은 Applied Biosystems GeneAmp 7500 sequence detection system (Foster City, CA, U.S.A.) 과 Applied Biosystems TaqMan RT kit로 정량적 역전사-PCR로 조사하였다. RQ1-처리된 RNA 1.0 ㎍을 역전사 위한 1회 순환 후, 역전사로 만들어진 cDNA 2.0 ㎕, 정방향 및 역방향 프라이머 각 900 nM, 프로브 250 nM로 실시간 PCR을 수행하였다. 각 유전자의 전사체 양은 TaqMan master mix reagents로 정량적 PCR하여 측정하였다. 측정된 각 주형에 대해 글리세르알데히르-3-인산염 탈수소효소(Gpd)를 표준화를 위해 측정하였다. 시료 내 Gpd 양에 대한 전사체의 비율은 Parsley et al.(Parsley et al., (2002) Eukaryot Cell 1:401-413)에 기재된 프라이머와 조건으로 comparative threshold cycle method (Johnson et al., (2000) Anal Biochem 278:175-184)으로 계산하였다. 액체 배양물로부터 RNA는 Kim et al. (Kim DH, Martyn RD (1995) Mol Cells 5:658-667)에 따라 추출하였다.

6. 포도당 산화효소 활성

포도당 산화효소 활성은 Park et al. (Park et al., (2000) J Biotechnol 81:35-44)에 따라 측정하였다. 시료 배양 여과액 100 ㎕를 0.21 mM o-디아니시딘(dianisidine) 2.4 mL, 10% β-D-글루코스 0.5 mL, 및 과산화수소 용액 (60 IU mL^-1) 0.1 mL를 포함하는 0.05 M 초산나트륨 완충액 (pH 5.1)에서 10분간 배양하였다. 4 N H₂SO₄, 0.3 mL을 첨가하여 반응을 중단시키고, 500 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 적어도 3번 수행하였다. 포도당 산화효소 활성은 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) 포도당 산화효소 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, U.S.A.)를 표준 물질로 사용하여 측정하였다.

7. 포도당 산화효소의 웨스턴 블롯 분석

웨스턴 블롯 분석은 Park et al. (Park et al., (2000) J Biotechnol 81:35-44)에 따라 수행하였다. 센트리콘(Centricon) 필터를 사용하여 농축한 배양 여과액을 SDS-PAGE로 분리하여 니트로셀룰로스 필터 상에 옮겼다. Blocking 후, 니트로셀룰로스 필터는 항-포도당 산화효소 항혈청에 이은 2차 항체로서 서양고추냉이 과산화효소에 접합된 항-마우스 IgG와 인큐베이션하였다. 서양고추냉이 과산화효소에 의한 비색 탐지를 위한 기질로 4-클로로-1-나프톨을 사용하였다.

<실시예 1. 188bp 단편의 염기서열 분석>

본 발명에서 188bp 단편의 서열분석은 이 단편이 전사개시점으로부터 83bp 단편과 전사체의 5'-비해독 영역 105bp 단편으로 이루어져 있음을 보여주었다. 진균의 코아 프로모터에 관하여 명확하게 밝혀지지 않은 부분이 많으나, 188bp 단편에는 전사개시점의 45 bp 업스트림에 정규 TATA box (TATAA) 및 13 bp과 11 bp의 두 CT-rich 영역을 포함하며; 13bp 및 11bp CT-rich 영역은 각각 전사개시점에 바로 붙어 그리고 28 bp 업스트림에 위치한다. 캡핑 시그날 (capping signal)로 여겨지는 CATCAT는 전사개시점 부근에 있다. 개시 코돈은 전사개시점으로부터 104 bp 다운스트림에 있으며, 해독개시점 ATG 주변의 컨센서스(consensus) 서열 A/GTCAA/CAATG는 잘 보존 되어 있다 (Gurr et al., (1987) ILR Press, Washington DC, pp 93-139).

<실시예 2. 우성 선발 표지로서 p188::hph 유전자 카세트를 사용한 크리포넥트리아 파라시티카 (Cryphonectria parasitica)의 형질전환>

크리파린(cryparin) 프로모터의 188bp 단편의 프로모터 활성을 확인하기 위해, hph 발현 카세트 (Cullen et al., (1987) Gene 57:21-26)의 아스퍼질러스 니둘란스 trpC 유전자 프로모터를 188bp의 프로모터로 바꾼 화학적 융합 구축물로 크리포넥트리아 파라시티카를 형질전환하였으며, 형질전환체 선발 표지(marker)로서 하이그로마이신 B를 사용하여 저항성이 있는 형질전환체를 선발하였다. 선발 압력으로서 하이그로마이신 B를 함유하는 아가 (agar) 배지 상에 한 실험 당 수천 개의 형질전환 추정체가 보였다. 하이그로마이신 B 저항성의 안정성은 선택 배지와 일반 배지에 교대로 계대배양하여 추가 확인하였다 (Kim DH, Martyn RD (1995) Mol Cells 5:658-667). 선택 배지와 일반 배지에 교대로 6회의 계대배양으로 선정된 40개의 형질전환체 중 하나를 제외한 모두가 하이그로마이신 B에 대하여 안정된 저항 성을 유지하였다. 그리하여, 한 실험 당 형질전환체의 수는 10³에서 10⁴ 범위 내에 있으며, 이는 pDH25를 사용한 것 (Churchill et al., (1990) Curr Genet 17:25-31)에 필적하는 것이다. 한 형질전환체는 연속 계대 배양 후 선발 배지 상에서 생장감소를 보였는데 이는 형질전환용 벡터 부분의 변형이나 재배열에 기인한 것으로 보인다(Rodriguez RJ, Yoder OC (1987) Gene 54:73-81).

무작위로 선정한 형질전환체들의 게놈 DNA에 hph 유전자의 유무를 확인하기 위해 hph 오알에프(open reading frame, ORF)에 해당하는 DNA 단편을 PCR로 증폭하였다. 기대한 바와 같이, 모든 7개 형질전환체의 게놈 DNA로부터 1,023bp의 증폭 산물을 얻었다 (도 2a). 야생형 균주에서는 증폭 산물은 관찰되지 않았다. 제한효소처리하지 않은 형질전환체 DNA를 사용하고, hph ORF의 BamHI/BamHI 처리한 0.8kb 단편을 프로브로 사용한 서던 블롯 분석에서는 염색체 크기의 DNA 영역에서만 혼성화 신호가 보였으며, 야생형 균주의 DNA에서는 혼성화가 관찰되지 않았다. 이 결과로 형질전환체의 자손은 안정적인 integrative 형질전환체로 보이며, 188bp 단편은 hph 유전자의 발현을 유도하기 위하여 안정된 프로모터 활성을 지님을 알 수 있다. 더욱이, 프로브 내의 영역은 아니지만 플라스미드의 한 자리를 절단하는 제한 효소 SalI으로 처리한 DNA 를 hph ORF의 0.8kb BamHI/BamHI 단편을 프로브로 사용하였을 때 (도 2a), 3개의 형질전환체에서는 수 개의 혼성화 밴드가 보였는데 이는 형질전환 벡터가 여러 곳에 끼어 들어갔음을 나타내는 것이며, 이 현상은 크리포넥트리아 파라시티카 형질전환의 다른 연구에서 흔하지 않은 것은 아니다 (Churchill et al., (1990) Curr Genet 17:25-31).

우리의 이전 연구에서는 시스-액팅(cis-acting) 억제 요소의 존재로 인한 427bp 단편 (시작 코돈에서 427 뉴클레오타이드 업스트림 위치)의 감소된 프로모터 활성을 증명하였으므로 (Kim et al.,(2008) Mol Cells 26: In press), 우리는 다른 농도의 하이그로마이신 B가 함유된 선택 배지에서 형질전환체의 생장율을 비교함으로써 427bp 단편과 188bp 단편의 프로모터 강도를 비교하였다. 도 3에서 보는 바와 같이, 하이그로마이신 B 의 표준 선발 농도 (50 ㎍mL^-1) 에서 188bp 또는 427bp 단편을 사용한 형질전환체간에 생장율의 차이는 관찰되지 않았다. 그러나 형질전환체가 보다 고농도 (125 ㎍mL^-1)의 하이그로마이신 B를 함유한 PDAmb 배지에 배양 시 188bp 단편을 사용한 형질전환체의 생장율에 있어 큰 차이가 보이지 않은 반면, 427bp 단편을 사용한 형질전환체의 생장율은 감소되었다. 이 결과는 188bp 단편이 넓은 범위의 선발 압력하에 안정적이었고, 크리포넥트리아 파라시티카(C. parasitica)의 이종성 hph 유전자의 발현에 비교적 강력한 프로모터임을 제시한다.

프로모터 강도의 정량적인 분석은 Gpd 유전자를 내부 대조군으로 표준화(normalize)하여 hph의 상대적 전사체 양을 측정하기 위해 실시간 RT-PCR을 하였다. 적어도 5개의 형질전환체를 선정하였고 일반 배지에서 3 번 계대배양하여, 비교를 위해 총 RNA를 추출하였다. Gpd에 대한 hph의 상대적인 전사체 양은 0.7에서 2.5였다. Gpd의 프로모터는 오랫동안 강력한 구성적 프로모터로서 인식되어 왔으며, 다른 진균뿐만 아니라 크리포넥트리아 파라시티카에서 이종성 단백질의 발현 을 위하여 사용되어 왔다 (Choi GH, Nuss DL (1992) EMBO J 11:473-477). 따라서 Gpd 프로모터에 비하여 188bp 단편의 보다 높은 수준의 발현은 188bp 단편의 프로모터 활성이 진균에서 이종성 발현의 추후 적용에 충분히 강력함을 제시한다. 프로모터의 크기를 고려하면, 188bp 단편은 전사 개시점의 45 bp 업스트림에 위치한 추정적인 TATA box인 TATAAA보다 32bp만을 더 지닌다 (Zhang et al., (1994) Gene 139:59-64). 그러므로 이 188bp 단편은 이 진균에 있어 최소 크기이나 강력한 코아 프로모터이거나 이에 가까운 것으로 보인다.

<실시예 3. p188bp 프로모터를 통한 유도성 라카아제 유전자의 구성적 발현>

내재성 유전자의 발현을 조사하기 위하여, 탄닌산으로 유도되는 라카아제 유전자(lac3)의 ORF를 p188bp 프로모터와 글리세랄디하이드-3-인산염 탈수소효소(Gpd) 터미네이터 사이에 두었다. 이렇게 만든 융합 구축물을 크리포넥트리아 파라시티카(C. parasitica) 형질전환에 사용하였다. 도 4에서 보이는 바와 같이, 노던 블롯 분석에서 야생형 균주의 lac3 전사체는 크리포넥트리아 파라시티카가 탄닌산이 있는 곳에서 배양되었을 때에만 관찰된다는 것을 보여주었다. 그러나 융합 플라스미드를 포함하는 형질전환체들이 탄닌산 유도 없이 lac3 전사체를 상당량 축적하였음을 보여주었는데, 이는 188bp 단편이 구성적 프로모터로서 작동함을 나타낸다. 비록 잘 알려진 Gpd 와 lac3 전사체간의 발현 수준의 직접적인 비교는 시도하지 않았지만 매우 강한 lac3 혼성화 밴드는 lac3 유전자의 고도의 발현을 나타내며, 이는 hph 유전자의 실시간 PCR 결과와 일치한다. 더욱이 어떠한 유도 없이도 유도 가능한 내재 유전자의 고도의 발현은 이런 발현이 탄닌산 공급에 의해 야기된 생장조건 변화라기 보다는 내재적인 프로모터 강도에 기인함을 나타내므로, lac3 유전자의 유도가 오로지 프로모터 작용에 의존적임을 제시한다. 게다가 어떠한 형질전환 억제 (Choi et al., (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:305-309) 또는 내재 유전자의 중복 카피와 연관된 고도의 발현에 의해 야기되는 전사 후 사일런싱 (silencing)(Segers et al., (2006) Eukaryot Cell 5:896-904)도 이 프로모터 사용에서는 관찰되지 않았는데, 이는 이종성뿐 아니라 동종성 발현을 통한 이 균주의 분자육종을 위한 발현 카세트로서 이 프로모터의 가능성을 제시한다.

<실시예 4. p188bp 프로모터를 통한 포도당 산화효소 유전자의 발현>

이종성 단백질의 발현을 조사하기 위하여, 아스퍼질러스 나이거(ATCC2119)의 포도당 산화효소 유전자를 크리포넥트리아 파라시티카에서 발현시켰다. 아스퍼질러스 나이거 포도당 산화효소 유전자의 프로모터 (Kim et al., (2000) J Microbiol Biotechnol 10:287-292)를 188bp 단편으로 대체한 융합 구축물을 제작하였다. 이 플라스미드를 크리포넥트리아 파라시티카 형질전환에 사용하였고 형질전환체의 배양 여과액으로 효소 활성을 조사하였다. 무작위로 선정한 4개의 형질전환체를 포도당 산화효소의 활성에 대해 분석하였다. 야생형 균주의 배양 여과액에서는 효소 활성이 전혀 관찰되지 않은 반면, 4개의 모든 형질 전환체의 배양 여과액에서는 효소 활성이 관찰 되었다 (도 5a). 효소 활성 수준은 형질전환체들 간에 차이가 있었는데, 하나를 제외한 모든 형질전환체는 배양여과액의 mL 당 0.5에서 1.7 IU의 효소 활성을 보였는데, 이는 현재 포도당 산화효소 생산에 사용되는 아스퍼질러스 나이거의 mL 당 2.0 IU에 견줄만 하다. 흥미롭게도 하나의 형질전환체는 mL 당 6.0 IU의 극도로 높은 효소활성을 보였다. 포도당 산화효소 유전자의 단백질 산물의 존재는 배양 여과액과 포도당 산화효소 단백질에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 이 균주에서 보다 더 입증되었다 (도 5b). 웨스터 블롯 분석에서 Sigma Chemical Co.에서 구입한 표준 아스퍼질러스 나이거 포도당 산화효소를 사용했을 때 80kDa의 기대했던 크기의 면역특이 밴드를 보였다. 그러나 크리포넥트리아 파라시티카의 재조합 포도당 산화효소 단백질은 110kDa 이상의 다소 넓은 밴드를 형성하였는데, 이는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 재조합 포도당 산화효소 단백질에 특이적으로 나타나는 것으로 과당화(hyperglycosylation)으로 인하여 발현된 단백질 크기에 있어 마이크로헤테로제네티 (microheterogeneity) 때문이다. 따라서 웨스터 블롯 분석은 이 효소 활성이 배양 여과액에 발현된 포도당 산화효소 단백질이 확실하게 존재하기 때문이라는 것을 보여주며, 그러나 크리포넥트리아 파라시티카(C. parasitica)에서 발현된 재조합 단백질은 과당화된 것으로 보인다. 어떠한 감지할 수 있는 생장 장애 없이 포도당 산화효소의 높은 발현은 이 특정 균주가 포도당 산화효소 단백질의 높은 수준의 발현을 위한 발현 숙주로 응용될 수 있음을 보여준다. 이러한 결과들은 188bp 단편이 이종성 포도당 산화효소 유전자의 발현을 유도하기에 충분함을 나타낸다. 형질전환체들 간에 보여지는 발현수준의 차이는 무작위적으로 통합된 포도당 산화효소 유전자의 미지의 그리고 다면성 효과에 의해 야기된 형질전환체들의 생리적 상태의 변이에 기인한 것일 수 있다.

<실시예 5. 다른 진균에 있어 188bp 단편의 프로모터 활성>

다른 진균 시스템에서 188bp 단편의 프로모터 활성을 조사하기 위하여, 지베렐라 제아에 (Gibberella zeae)와 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니둘란스 (A. nidulans)를 표지 유전자의 선별을 위한 프로모터로서 188bp 단편을 사용하여 형질전환하였다.

p188::hph 유전자 카세트를 지베렐라 제아에 형질전환에 사용하였고, 선발표지로서 하이그로마이신에 저항성을 보이는 형질전환된 후대 개체를 선발하였다. 하이그로마이신 B를 함유하는 각 재생배지에 평균 2 내지 3개 콜로니가 나타난 반면 (도 6a), 음성 대조군 플레이트에서는 콜로니가 전혀 나타나지 않았다. 선택배지와 일반배지를 교대로 계대배양한 후에도 모든 형질전환체들이 하이그로마이신 B에 대해 안정적인 저항성을 유지하였는데, 이는 형질전환의 세포분열 안정성을 나타낸다. 선택된 형질전환체들의 서던 블롯 분석은 모든 형질전환체들은 수용자 지베렐라 제아에 (Gibberella zeae) Z03643 균주의 진균 염색체내로 플라스미드 벡터가 무작위적으로 삽입되어 생김을 나타낸다 (도 6b). 게다가, HindIII 100 유니트로 선형화된 플라스미드 DNA를 사용하는 제한 효소-매개 삽입(REMI) 과정이 환상 플라스미드에 비하여 10배 (150 transformants/30㎍ DNA)까지 형질전환 빈도수를 증가시켰으며, 이는 다른 형질전환 벡터 사용 시에도 관찰되었다 (Han et al. 2004). 이러한 결과들은 크리포넥트리아 파라시티카(C. parasitica)의 188bp 단편이 지베 렐라 제아에(Gibberella zeae)와 같은, 다른 종에서 하이그로마이신 B 저항성 유전자 발현을 위한 프로모터로서 작용하는 것을 나타내는 것이다. 부가적으로는, 무작위적인 삽입(integration)과 REMI에 의한 빈도 증가를 포함하여 지베렐라 제아에 (Gibberella zeae) 형질전환의 특성은 188bp 단편 사용에서도 유지되었다.

p188::hph 유전자 카세트를 아스퍼질러스 나이거 형질전환에도 사용하였다. 형질전환 회당 10 개에서 50 개의 추정적인 형질전환체를 얻었다. 선정된 형질전환체의 계대 배양을 거친 하이그로마이신 B 저항성과 서던 블롯 분석은 추정적인 형질전환체가 형질전환용 벡터의 무작위적인 삽입에 기인한다는 것을 나타냈다 (데이타 미제시).

p188::argB 유전자 카세트는 아스퍼질러스 니둘란스(A. nidulans) argB 유전자 프로모터 (Upshall et al., (1986) Mol Gen Genet 204:349-354)를 188bp 단편으로 대체하여 만들었으며, 아스퍼질러스 니둘란스(A. nidulans) RMOS11 균주 (Stringer et al., (1991) Genes & Development 5:1161-1171)를 형질전환하기 위해 사용하였다. p188::argB 유전자 카세트를 사용하여 20에서 50개의 형질전환체를 얻었으며, 이 효율은 pILJ16 플라스미드 (Johnstone et al., (1985) EMBO J 4:1307-1311)를 사용한 것과 비슷하다. Arg^- 배지상에서의 계대배양을 통한 선발과 서던 블롯 분석은 모든 형질전환체가 안정적이며 완전한(integrative) 형질전환체임을 나타낸다 (도 7).

도 1은 다양한 리포터 유전자에 융합된 188bp의 프로모터를 포함하는 형질전환용 벡터의 모식도이다. pCHPH1과 pCHPH4에서, pDH25 (Cullen et al., 1988)의 하이그로마이신 B 저항성 카세트의 프로모터 영역은 크리파린(cryparin) 프로모터의 188bp와 427bp 단편으로 각각 대체되었다. pCLAC3, pCGO, 및 pCARGB1에서 라카아제 3, 포도당 산화효소, 오르니틴 카바모일트랜스퍼라아제 (ornithine carbamoyltransferase) 각각의 프로모터 영역은 크리파린(cryparin) 코아 프로모터의 188bp 단편으로 대체되었다. 박스는 유전자 또는 해당 기능성 도메인을 표시한다. hph^R, lac3, tGpd, GO, 및 argB는 각각 하이그로마이신 B 저항성 카세트, 라카아제 3, 글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소의 터미네이터, 포도당 산화효소, 및 오르니틴 카바모일트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자를 표시한다.

도 2는 (A) pCHPH1를 사용하여 선발된 형질전환체에서 hph ORF의 PCR 증폭, (B) pCHPH1를 사용한 형질전환체의 서던 블롯 분석이다. (A) hph 유전자의 PCR 증폭은 7개의 무작위로 선발한 형질전환체의 DNA를 주형으로 사용하였다. (B) 서던 분석을 위하여, DNA는 SalI으로 절단하여 hph ORF의 0.8kb BamHI/BamHI 단편 프로브로 혼성화시켰다. 왼쪽의 숫자는 kb로 나타낸 밴드들의 크기를 나타낸다. 레인 1 내지 7은 7개의 무작위로 선발된 형질전환체를 나타낸다. EP는 형질전환하지 않은 수용자 균주 EP155/2를 나타낸다.

도 3은 hph 유전자의 프로모터로서 188bp 또는 424bp 단편을 사용한 형질전 환체들의 콜로니 형태이다. 형질전환체들의 콜로니는 표준 수준 (50 ㎍ mL^-1 hygromycin B) (A)와 높은 수준(125 ㎍ mL^-1 hygromycin B) (B)의 선택배지에서 배양되었다. 프로모터로서 188bp 또는 424bp을 사용한 재조합 벡터 각각으로부터 무작위로 선발한 4개의 형질전환체를 선택 배지에서 배양하였다. 188bp 또는 424bp 단편을 사용하여 형질전환한 균주는 콜로니 상부에 숫자와 글자로 각각 표기하였다. 야생형 수용자 균주 (EP155/2)는 대조군으로 선택배지의 중앙에서 배양되었다.

도 4는 lac3 발현의 노던 블롯 분석을 나타낸다. 총 RNA는 접종 3일 후 추출하였다. RNA 시료를 균일량 로딩했음은 내부 대조군으로서 Gpd 프로브로 혼성화된 아래쪽 패널 및 에티듐 브로마이드로 염색된 겔 (rRNA)에서 볼 수 있다. 형질전환된 균주들은 패널 위에 1-5까지의 숫자로 표기하였다. PC와 NC는 lac3 유전자의 전사에 요구되는 탄닌산을 함유한 그리고 함유하지 않은 배지 상에 자란 야생형 균주 EP155/2에서 추출한 RNA를 나타낸다.

도 5는 (A) 형질전환체들의 배양 여과액에서 포도당 산화효소의 활성. 포도당 산화효소의 활성은 3회 반복 실험하여 평균을 냈다. PC는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger, ATCC 균주 2119)의 배양 여과액의 효소 활성을 나타내며, 숫자는 형질전환된 균주의 것을 나타낸다. (B) 포도당 산화효소의 웨스턴 블롯 분석. 레인 1과 2에는 각각 시그마사의 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)의 포도당 산화효소 표준물질과 S. cerevisiae의 재조합 포도당 산화효소가 있다. 레인 3에는 형질전환체 #2의 배양 여과액이 있다. 오른쪽의 숫자는 kDa으로 측정된 크기를 나타낸다.

도 6은 지베렐라 제아에(Gibberella zeae)의 콜로니 형태(A)와 서던 블롯 분석(B)을 나타낸다. (A) 지베렐라 제아에(Gibberella zeae)의 추정적인 형질전환체의 콜로니는 하이그로마이신 B를 함유하는 재생 배지에서 관찰되었다. (B) 선발한 형질전환체의 게놈 DNA를 형질전환용 벡터를 절단하지 않는 제한효소 BglII로 절단하였으며, 벡터 DNA로 프로빙하였다. 레인 1 내지 4에는 선발된 형질전환체의 DNA가 있으며, 레인 5에는 수용균주 Z03643의 DNA가 있다. 오른쪽의 숫자는 kb로 나타낸 밴드들의 크기를 나타낸다.

도 7은 아스퍼길러스 니둘란스(A. nidulans)의 콜로니 형태와 서던 블롯 분석을 나타낸다. (A) 아스퍼질러스 니둘란스의 추정적인 형질전환체의 콜로니는 선택 배지에서 관찰되었다. (B) 선발된 형질변환체의 게놈 DNA를 형질전환용 벡터를 절단하지 않는 제한 효소 ScaI 으로 절단하여, 188bp 단편으로 프로빙하였다. 패널 상부에 표시한 사용 균주는 수용체 균주 (RMSO11), pILJ16 (TpILJ16)을 사용한 형질전환체, pCARGB1 (Tp188::argB-1-4)를 사용한 4개의 형질전환체이다. p188::argB로 표시한 형질전환용 플라스미드를 서던 블롯 분석에서 대조구로 사용하였으며, 왼쪽의 숫자는 kb로 나타낸 크기이다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Novel promoter orginated from Cryphonectria parasitica and uses thereof <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 188 <212> DNA <213> Cryphonectria parasitica <400> 1 ctcgagacag gaccagagaa gcggccaaaa agtataaaga gcggtctctt ctcccgtaat 60 gaaggtttta ctcctccttc ttcatcatcg acaacaagaa tcttcgcagc tacctttgct 120 acagtccatc ttctcaattc cgtaacttgc aaagtcttcg ggtcatttcc ctccaaactt 180 caatcaaa 188 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gggagctctc gagacaggac 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aggctttttc attttgattg aagt 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 acttcaatca aaatgaaaaa gcct 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggaagcttca accgcacctg t 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gggagctctc gagacaggac 20 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aaaggctcga agggccattt tgattgaagt ttggaggg 38 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccctccaaac ttcaatcaaa atggcccttc gagccttt 38 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ttgagctctt atatgcccga atcgtc 26 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gggcggccgc ctcgagacag g 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gagagtctgc attttgattg aagt 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 acttcaatca aaatgcagac tctc 24 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gcggatcctt gagagcgcgc a 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ctcgagacag gaccagagaa g 21 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ggagcgaagg gatgccattt tgattgaagt ttggaggga 39 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tccctccaaa cttcaatcaa aatggcatcc cttcgctcc 39 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gtcgacctac agccattgcg a 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gggagctcct gcagtctgaa c 21 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 aggctttttc attttgattg aagt 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 acttcaatca aaatgaaaaa gcct 24 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ggaagcttca accgcacctg t 21

Claims

크리포넥트리아 파라시티카 (Cryphonectria parasitica) 유래의 크리파린(cryparin) 유전자의 전사개시점으로부터 83bp 단편과 전사체의 5'-비해독 영역 105bp 단편으로 이루어진 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 프로모터.
삭제
제1항의 프로모터와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제3항에 있어서, 진균용인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제4항에 있어서, 상기 벡터는 도 1의 pCHPH1, pCLAC3, pCGO 또는 pCARGB1인 것을 특징으로 하는 벡터.
제3항의 재조합 벡터로 형질전환된 진균.
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제6항에 있어서, 상기 진균은 크리포넥트리아 파라시티카 (Cryphonectria parasitica), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 지베렐라 제아에 (Gibberella zeae) 또는 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans)인 것을 특징으로 하는 진균.
제6항의 진균을 배양하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법.
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