JP2000069975A - プロモーター遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 シイタケのグリセルアルデヒド-3-リン酸デ
ヒドロゲナーゼ(GPD)遺伝子プロモーターを含む発現ベ
クターの提供。 【解決手段】 シイタケのグリセルアルデヒド-3-リン
酸デヒドロゲナーゼ(GPD)遺伝子の転写開始を指令する
プロモーター、シイタケGPD遺伝子の転写終結を指令す
るターミネーター、並びに該プロモーター及び／又は該
ターミネーターを含む組換えベクター、該組換えベクタ
ーを含む形質転換体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、シイタケのグリセ
ルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GPD)遺伝子の
転写開始を指令するプロモーター、シイタケGPD遺伝子
の転写終結を指令するターミネーター、並びに該プロモ
ーター及び／又は該ターミネーターを含む組換えベクタ
ー、該組換えベクターを含む形質転換体、該形質転換体
を用いるポリペプチドの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年の組換えDNA技術の進歩により、大
腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、糸状菌、動物細胞、植物
細胞などの様々な細胞を宿主として用いる異種遺伝子発
現用宿主ベクター系の開発が行われている。例えば、現
在までに、大腸菌の宿主ベクター系を用いて、インシュ
リン、成長ホルモン、インターフェロンなどの様々な有
用物質が生産されている。また植物育種においては、従
来の古典的な交配法では不可能であった種を越えての異
種生物由来の遺伝子の導入が、アグロバクテリウム・チ
ュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)とTiプ
ラスミドの系などの宿主ベクター系を用いることにより
行われ、所望の性質を有するトランスジェニック植物が
作出されている。

【０００３】上記の宿主ベクターのうち、現在までに最
も多く実用化されているのは、大腸菌の宿主ベクター系
である。しかし大腸菌を宿主として用い、ヒトなどの高
等動物由来のポリペプチドを生産させた場合、生産され
たポリペプチドに糖鎖が付加されないことやポリペプチ
ド鎖が本来の高次構造にフォールディング(folding)さ
れないことなどが原因で、元来の生理活性を示さないこ
とが多い。さらに、大腸菌は、目的ポリペプチドの生産
過程において、該ポリペプチド以外にも様々な毒性物質
を産生するため、多段階の精製工程を必要とする等の問
題点がある。

【０００４】そこでそれらの問題を解決するため、糖鎖
付加機能及び適正なフォールディング機能を有する宿主
として、酵母細胞(例えばサッカロマイセス・セレビシ
エ(Saccharomyces cerevisiae)など)や動物細胞(例えば
COS細胞、CHO細胞など)等の真核細胞を用いる宿主ベク
ター系の開発が行われてきた。しかし、酵母細胞を用い
てヒトなどの高等動物由来のポリペプチドを生産させた
場合、ヒト由来のものとは異なる高マンノース型の糖鎖
が付加される場合があること、あるいは目的ポリペプチ
ドの生産量が低いことなどの問題点がある。一方、動物
細胞を用いた場合であっても、目的産物の収量が極めて
少ないことや高価な培地を必要とすることなど問題点が
多い。そのような観点から、高等動物細胞と同様の糖鎖
が付加されかつ安価に培養でき、そして安全性の高いな
どの要件を満たす宿主ベクター系が求められていた。と
ころで、担子菌は、一般に酵母よりも動物に近縁である
ため[T.L.Smith：Proc.Natl.Acad.Sci. USA,86:7063(19
89)]、適正な糖鎖付加機能及び適正なフォールディング
機能を有していると思われる。特に、シイタケ(Lentinu
s edodes)は、長年食用に用いられてきた実績もあり、
安全性に優れている。

【０００５】シイタケの属する食用担子菌の遺伝子工学
的な処方による形質転換の技術開発は、これまで、Mira
nda D.らがエレクトロポレーション法によるマッシュル
ームの形質転換[Miranda D. van de Rhee, et al., Mo
l. Gen. Genet., 250 252-258(1996)]、Ming Pengらが
エレクトロポレーション法によるヒラタケの形質転換[P
eng, M., et al., Curr. Genet.,22,53-59(1992)]、Yan
aiらがポリエチレングリコール法によるヒラタケの形質
転換[Yanai, K. et al., Biosci. Biotech. Biochem.,6
0,472-475(1996)]、No10ёlらがポリエチレングリコー
ル法によりフミヅキタケによる形質転換[No10ёl,T. an
d Labarere, J., Curr. Genet.,25:432-437(1994)；No1
0ёl,T. et al., Theor. Appl. Genet.,90:1019-1027(1
995)]について報告している。

【０００６】しかし、シイタケの宿主ベクター系は有効
なものが確立されていないのが現状で、その理由のひと
つとして、シイタケにおいて効率的に異種遺伝子を発現
させうる発現用組換えベクターが存在しないことが挙げ
られる。シイタケ宿主用発現用組換えベクターとして
は、シイタケras遺伝子のプロモーター及びPriA遺伝子
のターミネーターを利用したpLC1ベクター[Yanai et a
l.：Biosci. Biotech. Biochem.,60：472-475(1996);特
開平6-319547]が現在までに唯一知られている [矢内
ら：日本農芸化学会1995年度大会講演要旨集、ｐ230]
が、このベクターを用いてシイタケの形質転換を行った
場合、その形質転換効率は低く、汎用されるには至って
いない。

【０００７】一般に、より高い発現量をもたらす発現ベ
クターを構築するためには、mRNAへの転写効率が高いプ
ロモーターを用いることが必要である。解糖系のキーエ
ンザイムであるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロ
ゲナーゼ(GPD)は発現量が高く、酵母や高等真核生物に
おいて、GPDタンパク質は細胞の全タンパク質量の約５
％を占めている[Krebs et al., J. Biol. Chem., 200,4
79-492(1953)；Piechaczyk et al., Nucleic Acids Re
s., 12,6951-6953(1984)]。また、酵母においてpoly(A)
⁺RNAの２〜５％がGPDmRNAであることが報告されており
[Holland and Holland,Biochem., 17:4900-4907(197
8)；Edens et al., Cell, 37:629-633(1984)]、一般的
に、解糖系を有する生物においてはGPD遺伝子の転写効
率が高いことが示唆されている。これらのことから、酵
母[Bitter and Egan, Gene, 32,263-274(1984)]や他の
糸状菌類[Hondel and Punt, In Applied molecular gen
etics of fungi, ed. Peberby et al., Cambridge Univ
ersity Press, England,pp1-28(1991)；Frank and Wess
els, Curr Genet,26:179-183(1994)]において、GPD遺伝
子のプロモーターが発現ベクター用のプロモーターとし
て利用されている。しかし、現在までにシイタケ由来の
GDP遺伝子のプロモーター及び該プロモーターを含む組
換えベクターは知られていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、シイタケの
グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GPD)遺
伝子の転写開始を指令するプロモーター、シイタケGPD
遺伝子の転写終結を指令するターミネーター、並びに該
プロモーター及び／又は該ターミネーターを含む組換え
ベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該形質
転換体を用いるポリペプチドの製造方法を提供すること
を目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため、鋭意研究を行った結果、シイタケ菌糸
から調製したcDNA及びゲノムDNAライブラリーからGPD遺
伝子を単離し、さらにそのプロモーター領域及びターミ
ネーター領域を単離することに成功し、本発明を完成す
るに至った。すなわち、本発明は、以下の(a)又は(b)の
DNAを含むプロモーター遺伝子である。

【００１０】(a) 配列番号１で表される塩基配列からな
るDNA (b）配列番号１で表される塩基配列において少なくとも
１個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からな
り、かつプロモーター活性を有するDNA さらに、本発明は、前記の遺伝子とストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有
するDNAを含むプロモーター遺伝子である。

【００１１】さらに、本発明は、以下の(c)又は(d)のDN
Aを含むターミネーター遺伝子である。 (c) 配列番号２で表される塩基配列からなるDNA (d) 配列番号２で表される塩基配列において少なくとも
１個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からな
り、かつターミネーター活性を有するDNA さらに、本発明は、前記の遺伝子とストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、かつターミネーター活性を
有するDNAを含むターミネーター遺伝子である。

【００１２】さらに、本発明は、前記のプロモーター遺
伝子及び／又は前記のターミネーター遺伝子を含有する
発現用組換えベクターである。さらに、本発明は、前記
の発現用組換えベクターに任意のポリペプチドをコード
する遺伝子が組み込まれた組換えベクターである。

【００１３】さらに、本発明は、前記の発現用組換えベ
クター又は組換えベクターを含む形質転換体である。さ
らに、本発明は、前記の形質転換体を培養又は栽培し、
得られる培養物又は栽培物からポリペプチドを採取する
ことを特徴とする前記ポリペプチドの製造方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明のプロモーター遺伝子は、
シイタケGPD遺伝子の5'上流域から単離したものであ
り、ターミネーター遺伝子は、シイタケGPD遺伝子の3'
下流域から単離したものである。そして本発明の発現用
組換えベクターは、従来のシイタケ用発現ベクターとは
異なり、上記のGPD遺伝子プロモーター及び／又はGPD遺
伝子ターミネーターを組み込んだ発現ベクターである。
本発明のプロモーター及びターミネーター遺伝子は以下
のようにして単離することができる。

【００１５】１．シイタケGPD遺伝子のプロモーター領
域及びターミネーター領域の単離 (1) シイタケのmRNA及びcDNAライブラリーの調製 mRNAの供給源は、シイタケの傘、菌褶、菌輪、菌柄、脚
苞、菌糸など子実体の一部でもよく、子実体全体でも良
い。また、胞子又は一次菌糸若しくは二次菌糸を0.25×
MYPG培地、SMY培地、グルコース・ペプトン培地などの
固体培地で培養後、菌糸を液体培地に接種し生育した菌
体も用いることができる。

【００１６】mRNAの調製は、通常行われる手法により行
うことができる。例えば、液体培地により得られた菌糸
を、濾過によって回収後、液体窒素で凍結する。次いで
凍結した菌糸を摩砕後、ISOGEN(ニッポンジーン社製)な
どを加えて核酸を抽出する。抽出した核酸を、クロロホ
ルムやフェノール試薬等で処理して全RNAを得た後、オ
リゴdT-セルロースやセファロース2Bを担体とするポリU
-セファロース等を用いたアフィニティーカラム法若し
くはStraight A's^TMmRNA Isolation System(Novagen社
製)などのキットを用いてmRNA(ポリ(A)⁺RNA)を調製する
ことができる。

【００１７】このようにして得られたmRNAを鋳型とし
て、市販のキット(例えばZAP Express^TM cDNA Synthesi
s Kit(Stratagene社製))を用い、オリゴdT₂₀及び逆転写
酵素によって一本鎖cDNAを合成した後、該一本鎖cDNAか
ら二本鎖cDNAを合成する。次いで、得られた二本鎖cDNA
にEcoRIアダプターなどの適切なアダプターを付加後、U
ni-ZAP XR Vector(Stratagene社製)やλgt10(Amersham
社製)などの適当なクローニングベクターに組み込ん
で、組換えベクターを作製する。

【００１８】クローニングベクターとしてプラスミドベ
クターを用いた場合には、得られた組換えベクターを大
腸菌に形質転換する。ここで、大腸菌の形質転換は、Ha
nahanの方法[Hanahan,D.：J. Mol. Biol. 166：557-580
(1983)]、すなわち塩化カルシウム、塩化マグネシウム
又は塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント
細胞に、組換えベクターを加える方法等により行うこと
ができる。なお、ここで用いたプラスミドベクターに
は、プレート上でのコロニーの選択用にテトラサイクリ
ン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子が含有されている
ことが必要である。次いで二本鎖cDNAを含むプラスミド
ベクターにより大腸菌を形質転換後、テトラサイクリン
耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択
することにより、cDNAライブラリーを得ることができ
る。

【００１９】一方、クローニングベクターとしてファー
ジベクターを用いた場合には、得られた組換えベクター
を、Giga Pack III Gold Packaging Extract(Stragtage
ne社製)などのキットを用いてin vitroパッケージング
後、形成されたファージを大腸菌に感染させる。これを
LBアガーなどの寒天培地を用いて培養し、プラークを形
成させることによりcDNAライブラリーを得ることができ
る。

【００２０】(2)シイタケのゲノムDNA及びゲノムDNAラ
イブラリーの調製 ゲノムDNAの供給源は、上記(1)と同様に、シイタケの
傘、菌褶、菌輪、菌柄、脚苞、菌糸など子実体の一部で
もよく、子実体全体でもよい。また、胞子又は一次菌糸
若しくは二次菌糸を0.25×MYPG培地、SMY培地、グルコ
ース・ペプトン培地などの固体培地で培養後、菌糸を液
体培地に接種し生育した菌体も用いることができる。

【００２１】ゲノムDNAの調製は、通常行われる手法に
より行うことができる。例えば、液体培養したシイタケ
の菌体を濾過や遠心分離などにより集菌後、菌体を液体
窒素などで凍結し、凍結菌体を乳鉢を用いて摩砕する。
摩砕した菌体にDNA抽出用緩衝液を加え、クロロホルム
を加え激しく攪拌する。クロロホルムを除去後、水層部
分にエタノールを徐々に添加しDNAが析出したところ
で、ゲノムDNAを巻取り、TE緩衝液に溶解することによ
り、ゲノムDNA溶液を得ることができる。あるいは、摩
砕した菌体から、市販のキット(例えばISOPLANT(ニッポ
ンジーン社製))を用いてゲノムDNAを得ることもでき
る。

【００２２】ゲノムDNAライブラリーの作製は、ゲノムD
NAを制限酵素Sau3AIなどの制限酵素で消化し、クロロホ
ルム処理後、エタノール沈殿により断片を回収し、次い
で市販のキット(例えばLambda EMBL3/BamHI Vector Kit
(Stratagene社製))を用い、該断片を、例えばλ EMBL3-
BamHIアームにT4DNAリガーゼを用いて連結し、得られた
ファージDNAを大腸菌に感染させることにより作製する
ことができる。

【００２３】(3) GPD遺伝子の単離 GPD遺伝子は、cDNAライブラリー又はゲノムDNAライブラ
リーから通常の方法(例えばPCR法、プラークハイブリダ
イゼーション法など)によりスクリーニングすることが
できる。すなわち、既知の担子菌類のGPDのアミノ酸配
列[Harmsen et al.：Curr.Genet.,22:447-454(1992)]を
もとに、縮重センスプライマー及び縮重アンチセンスプ
ライマーを合成する。そしてこれらを用いて縮重ポリメ
ラーゼ連鎖反応(縮重PCRともいう)を行う。次いで得ら
れた断片をプローブとして、シイタケcDNAライブラリー
からスクリーニングする方法等が挙げられる。

【００２４】縮重PCRに用いられる鋳型DNAとしては、上
記(2)で調製したゲノムDNAが挙げられる。またプライマ
ーとしては、例えば、センス鎖については、Arg Ile Gl
y Arg Ile Val Leu Arg Asn Ala(配列番号12)に基づい
て合成したGPD 上流プライマー(U1)5'-GKATCGGMCGYMTYG
TCYTCMGHAATGC-3'(配列番号６)を、アンチセンス鎖につ
いてはアミノ酸配列Ser Asn Ala Ser Cys Thr Thr Asn
Cys Leu(配列番号13)に基づいて合成したGPD下流プライ
マー(L1)5'-ARGCARTTGGTHGTGCAHGAAGCRTTYG-3'(配列番
号７)を用いることができる。但し、本発明において
は、これらのプライマーに限定されるものではない。

【００２５】このようにして得られたDNA増幅断片の塩
基配列を決定し、担子菌のGPD遺伝子とホモロジーが高
いことを確認した後、その断片をペルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼなどによる酵素直接標識又は
³²P、³⁵Sなどによる放射性標識後、プローブとして用
い、これらをファージライブラリーのDNAを変性固定し
たニトロセルロースフィルターやナイロンフィルターと
ハイブリダイズさせる。そして得られたポジティブ株を
検索し、シイタケのGPD遺伝子をクローニングすること
ができる。

【００２６】(4) 塩基配列の決定 スクーリーニングにより得られたクローンは、pBlueScr
iptSK(+) (Stratagene社製)、pCR2.1(Invitrogen社製)
等の市販されている適切なプラスミドベクターにサブク
ローニングし、例えばサイクルシークエンス法などで塩
基配列の解析を行うことができる。塩基配列の決定は、
自動塩基配列決定機（例えばPerkin Elmer社製ABI PRIS
M 310 Genetic Analyzer）を用いて行われる。

【００２７】(5) GPD遺伝子のプロモーター領域及びタ
ーミネーター領域の単離 GPD遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域
の単離は、該領域をそれぞれ含むGPD遺伝子の上流約１k
bpの領域及び下流約１kbpの領域を、上記(4)において決
定された塩基配列に基いて合成したプライマーを用い
て、ゲノムDNAライブラリーからクローニングしたゲノ
ムGPD遺伝子、シイタケ染色体DNAなどを鋳型として、PC
Rによって増幅することにより行うことができる。ここ
で、プロモーター領域単離のためのPCRに用いることが
できるプライマーとして、例えば、5'-CGAAGTTTGAGGTGG
TTGCGAATACG-3'(配列番号８)の塩基配列で表される５'
センスプライマー及び5'-ATTCAAGCAGTCAATGGATTGGAGGG-
3' (配列番号９)の塩基配列で表される３'アンチセンス
プライマーが挙げられる。また、ターミネーター領域単
離のためのPCRに用いることができるプライマーとし
て、例えば、5'-GAAAGGGCTGTGCATCTCGAAACT -3'(配列番
号10)の塩基配列で表される５'センスプライマー及び5'
-TCATCATACCCCCTACCGACATCT-3'(配列番号11)の塩基配列
で表される３'アンチセンスプライマーが挙げられる。
但し、本発明においては、これらのプライマーに限定さ
れるものではない。

【００２８】配列番号１に本発明のプロモーター活性を
有するDNA断片の塩基配列、配列番号２に本発明のター
ミネーター活性を有するDNA断片の塩基配列を例示する
が、前者の場合であればプロモーター活性、後者の場合
であればターミネーター活性を有する限り、当該塩基配
列において少なくとも１個の塩基に欠失、置換、付加等
の変異が生じてもよい。ここで欠失、置換、付加とは、
１〜10個の短い欠失、置換、付加のみならず、10〜50塩
基、さらには50〜100塩基の長い欠失、置換、付加も含
む。

【００２９】また、上記プロモーター遺伝子又はターミ
ネーター遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし、かつプロモーター活性を有するDNAも本発明
のプロモーター遺伝子又はターミネーター遺伝子に含ま
れる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウ
ム濃度が、10〜300mM、好ましくは20〜100mMであり、温
度が25〜70℃、好ましくは42℃〜55℃での条件をいう。

【００３０】なお、DNAに変異を導入するには、Kunkel
法や Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる
方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変
異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K
(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用い
て、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesi
sシリーズキットを用いて変異を導入することができ
る。一旦、本発明のDNA断片の塩基配列が確定される
と、その後は化学合成によって、又は本発明のDNA断片
を含むcDNAないしゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、
あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとして
ハイブリダイズさせることにより、本発明のDNA断片を
得ることができる。

【００３１】２．本発明の発現用組換えベクターの構築 上記１．において得られたGPD遺伝子のプロモーター領
域及びターミネーター領域を適当なプラスミドベクター
(例えばpUC19、pCHベクターなど)に連結することにより
本発明の発現用組換えベクターを構築することができ
る。発現用組換えベクターには、外来遺伝子の導入を実
際に確認する上で有効なマーカー遺伝子を併用して使用
することが望ましい。そのため本発明の発現用組換えベ
クターには、GPDプロモーター領域の下流に、例えば抗
生物質ハイグロマイシンＢに対する抵抗性を付与するハ
イグロマイシン Bホスホトランスフェラーゼ(hph)遺伝
子[Gritz and Davis, Gene, 25:179-188(1983)]、除草
剤ビアラフォスに対する抵抗性を付与するホスフィノト
リシンアセチルトランスフェラーゼ(bar)遺伝子[Muraka
mi et al.:Mol. Gen. Genet.,205:42-50(1986)]を連結
するとよい。こうして作出した発現用組換えベクターを
PEG法、エレクトロポレーション法、REMI法などの様々
な遺伝子導入法でシイタケに導入し、その薬剤に対する
抵抗性を指標として形質転換体を得ることができる。

【００３２】３．本発明の発現用組換えベクターを用い
るポリペプチドの生産 本発明の発現用組換えベクターを用いて、シイタケにお
いて目的のポリペプチドを遺伝子工学的に得ることがで
きる。上記２．の発現用組換えベクターに、目的のポリ
ペプチド(例えば、インシュリン、成長ホルモン、ラッ
カーゼ、ペルオキシダーゼなどの有用タンパク質)をコ
ードする遺伝子を連結(挿入)することにより組換えベク
ターを作製することができる。すなわち、本発明のベク
ターに目的のポリペプチドをコードする遺伝子を挿入す
るには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断
し、本発明のベクターの制限酵素部位又はマルチクロー
ニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが
採用される。

【００３３】得られた組換えベクターをシイタケに、PE
G法、エレクトロポレーション法、REMI法などの方法に
より導入することにより、形質転換体を得ることができ
る。次いで、得られた形質転換体を培養し、その培養物
から採取することにより、目的のポリペプチドを得るこ
とができる。本発明の形質転換体の菌糸を培養する方法
は、シイタケの培養に用いられる通常の方法に従って行
われる。

【００３４】シイタケを宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、シイタケが資化し得る炭素
源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を
効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のい
ずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フ
ラクトース、スクロース、デンプン、マルトース、デキ
ストリン等の炭水化物が用いられる。窒素源としては、
アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩類若し
くは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物
のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカ
ー、カザミノ酸、NZアミン等が用いられる。

【００３５】無機物としては、リン酸第１カリウム、リ
ン酸第２カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウ
ム、炭酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、塩化マン
ガン、炭酸カルシウム等が用いられる。菌糸の培養は、
液体培地での振盪培養、通気攪拌培養、固体培地での静
置培養など好気〜微好気条件下、25℃で数日間〜２カ月
程度行う。継代は生育した菌糸の一部を新たな培地に接
種することにより行う。

【００３６】培養中は、必要に応じてハイグロマイシン
やビアラフォス等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、目的のポリペプチドが菌体内に生産される場合
には菌体を破砕する。一方、目的のポリペプチドが菌体
外に生産される場合には、培養液をそのまま使用する
か、遠心分離等により菌体を除去し、上清を得る。そし
て、ポリペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化
学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わ
せて用いることにより、上記培養物中から目的のポリペ
プチドを単離精製することができる。

【００３７】

【実施例】以下に、本発明の実施例を示して具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 〔実施例１〕シイタケGPD遺伝子のプロモーター領域及
びターミネーター領域の単離 (1) シイタケ菌糸の調製 北研産業から入手したシイタケ菌株北研-57の二核菌糸
を0.25×MYPG寒天培地(0.25％麦芽エキス、0.1％酵母エ
キス、0.1％ペプトン、0.5％グルコース、1.5％寒天)に
接種し、約２週間、25℃で培養した。生育した菌糸を寒
天培地から掻き取り、100mlの0.25×MYPG液体培地の入
った200ml容三角フラスコに接種した。接種後、25℃
で、約２〜４週間、振盪培養し、菌糸をペレット状に生
育させた。

【００３８】(2) シイタケ菌糸cDNAライブラリーの調製 実施例１により得られた液体培養液を、ガラスフィルタ
ーで濾過することにより、菌糸を回収した。水分をペー
パータオルで十分に除去した後、湿重量約１ｇの菌糸を
液体窒素存在下で、乳鉢及び乳棒を用いて、パウダー状
になるまで摩砕した。液体窒素を除くため2分間放置し
た後、摩砕した菌糸をポリプロピレン製の遠心チューブ
に移し、10mlのISOGEN(ニッポンジーン社製)を加えて激
しく攪拌後、さらに２mlのクロロホルムを加えて、室温
で１分間激しく攪拌した。摩砕液を、10,000×ｇ、４℃
で５分間遠心し、水層を回収した。再度、タンパク質や
DNAを取り除くため、回収した水層に５mlのISOGEN及び
１mlのクロロホルムを加えて、激しく攪拌した。10,000
×ｇ、４℃で５分間遠心後、水層を回収しフェノール・
クロロホルム処理及びイソプロパノール沈殿を行った。

【００３９】得られた沈殿物を１mlのDEPC処理水(滅菌
水にジエチルピロカーボネートを0.1％になるように溶
解し、オートクレーブしたもの)に溶解後、250μlの10M
塩化リチウム溶液を加え、−80℃で１時間冷却した。次
いで、12,000×ｇ、４℃で、15分間遠心した。上清を除
去した後、ペレットを70％エタノールで洗浄後、200μl
のDEPC処理水に溶解した。10,000×ｇ、４℃で５分間遠
心し、上清を回収し、次いでエタノール沈殿を行うこと
により全RNAを得た。得られた全RNAを200μlのDEPC処理
水に溶解し、吸光度測定法及びホルムアルデヒド変性ア
ガロースゲル電気泳動法により、良質の全RNAが調製さ
れたことを確認した。

【００４０】次いで、全RNAからStraight A's^TM mRNA I
solation System (Novagen社製)を用いて、ポリ(A)⁺RNA
を精製した。得られたRNAの量をUV分光器により測定し
たところ、20μgであった。得られたポリ(A)⁺RNAを鋳型
として、ZAP Express^TM cDNA Synthesis Kit(Stratagen
e社製)を用いて二本鎖cDNAの合成を行った。すなわち、
まず以下の組成で一本鎖cDNAを合成した。

【００４１】 ポリ(A)⁺RNA 5.0μl(５μg) 10×第１鎖合成反応用緩衝液 5.0μl 第1鎖用dNTP混合液 3.0μl (10mM dATP、dGTP、dTTP,5mM5-Methyl-dCTP) 1.4μg/μlリンカープライマー 2.0μl 40U/μl RNaseブロックリボヌクレアーゼインヒビター 1.0μl DEPC処理水 30.5μl 全量 46.5μl 上記溶液に、逆転写酵素(MMLV-RTase)3.5μl(20U/μl)
を添加して、37℃で１時間インキュベートすることによ
り一本鎖cDNAを合成した。インキュベート後、反応液を
氷中で冷却した。次に、得られた一本鎖cDNAの反応液
に、以下の試薬を順に加えた。

【００４２】 一本鎖cDNA反応液 45.0μl 第２鎖合成用緩衝液 20.0μl 第２鎖用dNTP緩衝液 8.0μl (10mM dATP,dGTP,dTTP,26mM dCTP) 0.9U/μl大腸菌RNase H 3.5μl 10U/μl大腸菌DNAポリメラーゼI 10μl 滅菌水 113.5μl 全量 200μl 上記反応液を、16℃で2.5時間インキュベートすること
により第２鎖cDNAを合成した。インキュベート後、反応
液を氷中で冷却した。

【００４３】合成した二本鎖cDNAに２μlの2.5U/μlク
ローン化Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene社製)を加
え、72℃で30分間インキュベートすることで末端を平滑
化した。次いで、フェノール・クロロホルム抽出及びエ
タノール沈殿を行った後、9.0μlのEcoRIアダプター溶
液に沈殿を溶解して、二本鎖cDNA溶液を得た。合成した
二本鎖cDNAのサイズは、二本鎖cDNA溶液９μlのうち１
μlを1.0％アガロースゲル電気泳動に供試することによ
り確認した。

【００４４】次に、8.0μlのEcoRIアダプター溶液に溶
解した二本鎖cDNAに、1.0μl の10×リガーゼ緩衝液、
1.0μlの10mM ATP、１μlのT4DNAリガーゼ(4U/μl)を加
え、８℃で一晩インキュベートすることにより、二本鎖
cDNAにアダプターを付加した。アダプターを付加後、反
応液を70℃で30分間熱処理し、リガーゼを失活させた。
次いで、ベクターとのライゲーションを行うために、二
本鎖cDNAのEcoRI末端のリン酸化を行った。

【００４５】 EcoRIアダプター付加二本鎖cDNA 11.0μl 10×リガーゼ緩衝液 1.0μl 10mM ATP 2.0 μl 10U/μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ 6.0μl 全量 21.0μl 上記反応液を、37℃で30分間インキュベートすることで
二本鎖cDNAの末端のリン酸化を行った。反応後、反応液
を70℃で30分間熱処理し、キナーゼを失活させた。二本
鎖cDNAがベクターにセンス方向に組み込まれるように、
上記二本鎖cDNAをXhoIで消化し、５'末端にEcoRIサイ
ト、３'末端にXhoIサイトが生じるように、以下の反応
組成で処理を行った。

【００４６】 EcoRIアダプター付加二本鎖cDNA 20.0μl XhoI用緩衝液 28.0μl 40U/μl XhoI 3.0μl 全量 52.0μl 上記反応液を、37℃で90分間反応させることにより、Ec
oRIアダプター付加二本鎖cDNAをXhoIで消化し、３'末端
にXhoIサイトを生じさせた。反応後、反応液を室温にま
で冷却し、５μlの10×STE緩衝液を加えた。上記溶液
を、１×STE緩衝液で平衡化したSephacryl S-500カラム
(Pharmacia社製)に供して、未付加のアダプターとXhoI
消化産物を除去した。次いで、カラムの溶出画分にフェ
ノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、得
られた沈殿を５μlの滅菌水に溶解した。得られたcDNA
溶液の濃度は吸光度測定法により定量した。

【００４７】上記のようにして得られた、５'末端にEco
RIサイト、３'末端にXhoIサイトを有するcDNA(100ng)
を、クローニングベクターであるZAP発現ベクターアー
ム(Stratagene社製)に２単位(U)のT4 DNAリガーゼを用
いて挿入した。反応は12℃で14時間行った。このライゲ
ーション反応液５μlのうち２μlを、Giga Pack III Go
ld Packaging Extract(Stratagene社製)を用いて、in v
itroパッケージングに供した。

【００４８】パッケージングされた組換えバクテリオフ
ァージを含むパッケージング溶液30μlに、10mM MgCl₂
でOD₆₀₀=0.5に調製した大腸菌XL1-blue MRF'株を600μl
加え、37℃で15分間培養した。これを48℃に保温した6.
5mlのNZYトップアガー(0.5％塩化ナトリウム、0.2％硫
酸マグネシウム７水和物、0.5％酵母エキス、１％NZア
ミン、0.7％アガー、pH 7.5)に加え、90mm×130mmの角
型シャーレを用いたNZYプレート(0.5％塩化ナトリウ
ム、0.2％硫酸マグネシウム７水和物、0.5％酵母エキ
ス、１％NZアミン、1.5％アガー、pH 7.5)上に、１枚当
り約５万個のプラークが形成されるように、計15枚のプ
レートに播き、合計75万個のプラークからなるライブラ
リーを作製した。

【００４９】(3) シイタケのゲノムライブラリーの調製 液体培養により生育させた菌糸をガラスフィルターで回
収し、ペーパータオルで菌糸の水分を可能な限り搾り取
った。回収した菌糸約１ｇを乳鉢に入れ、液体窒素を適
量加えて摩砕した。摩砕した菌糸を50ml容のポリプロピ
レンチューブに移し、20mlのTESS緩衝液(0.73Mスクロー
ス、10mMTris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA(pH 8.0)、１％SD
S)を加えて、65℃で１時間インキュベートした。これに
終濃度が１Mとなるように５M NaClを加えて、8,000×ｇ
で20分間遠心し上清を回収した。回収した上清に等量の
フェノール・クレゾール試薬(100gのフェノールに4.7ml
のm-クレゾールを加え50℃で溶解させ、そこに8-キノリ
ノールを0.05％となるように加えた後、さらに等量の1M
NaClを加えて平衡化させたもの)を加え、1,300×ｇで
５分間遠心して、上清(水層)を回収した。さらに、クロ
ロホルム処理、エタノール沈殿を行って、１mlのTE緩衝
液に溶解した。その溶液をRNaseA及びProteinaseKで処
理し、フェノール・クロロホルム処理とエタール沈殿を
行って、適当量のTE緩衝液に溶解し、染色体DNA試料と
した。

【００５０】得られたDNA試料を制限酵素Sau3AIで消化
し、フェノール・クロロホルム処理後、エタノール沈殿
を行って、適当量のTE緩衝液に溶解した。得られたDNA
断片を用い、Lambda EMBL3/BamHI Vector Kit(Stratage
ne社製)によりゲノムDNAライブラリーを作製した。

【００５１】(4)縮重プライマーの作製 担子菌類由来の公知のGPD遺伝子からの推定アミノ酸配
列(Harmsen et al., Curr. Genet.,22,447-454,1992)間
で、良く保存されている部分をもとに、縮重プライマー
を合成した。すなわち、５'縮重プライマーとして、ア
ミノ酸配列Arg Ile Gly Arg Ile Val Leu Arg Asn Ala
(配列番号12)に基づいて、GPD 上流プライマー(U1)5'-G
KATCGGMCGYMTYGTCYTCMGHAATGC-3'(配列番号６)を、３'
縮重アンチセンスプライマーとして、アミノ酸配列Ser
Asn Ala Ser Cys Thr Thr Asn Cys Leu(配列番号13)に
基づいて、GPD下流プライマー(L1)5'-ARGCARTTGGTHGTGC
AHGAAGCRTTYG-3'(配列番号７)を合成した。なお、合成
オリゴヌクレオチドの合成は、日本製粉(株)中央研究所
カスタムサービスに委託した。

【００５２】(5) 縮重プライマーを用いたPCR 上記(3)において得られたシイタケゲノムDNAを鋳型に、
上記(4)において調製したプライマーを用いて、PCRを行
った。PCRの反応液の組成は以下の通りである。 ゲノムDNA溶液 1.0 μl(10ng) 10×PCR緩衝液 5.0μl 25mM MgCl₂ 5.0μl 2mM dNTP ミックス 4.0μl 100μMプライマー(センス) 1.0μl 100μMプライマー(アンチセンス) 1.0μl 5U/μl Taqポリメラーゼ 0.25μl 滅菌水 32.75μl 全量 50μl

【００５３】PCRは、96℃で30秒間の熱変性、50℃で30
秒間のアニーリング、72℃で１分間の伸長反応の条件を
１サイクルとして、30サイクル行った。反応終了後、反
応液を新しいマイクロチューブに移し、そのうち５μl
を１％アガロースゲルによる電気泳動に供し、増幅断片
の確認を行った。次いで、残りの反応液にフェノール・
クロロホルム処理とエタノール沈殿を行い、ペレット化
したPCR産物を20μlのTE緩衝液に溶解した。得られたPC
R産物を１％低融点アガロースゲル電気泳動に供し、約7
50bpの断片を切り出し、QIAEX II(QIAGEN社製)を用いて
ゲルからDNAを抽出し、PCR産物を回収した。

【００５４】次いで、このPCR産物を、TA Cloning Kit
(Invitrogen社製)を用いてpCR2.1ベクターにサブクロー
ニングした後、蛍光自動DNAシーケンサー(Perkin Elmer
社製、ABI PRISM310型)により塩基配列を解析した(配列
番号14)。その結果、得られたPCR産物は公知のGPD遺伝
子と高いホモロジーを有していることが示された。そこ
でプロモーター及びターミネーター領域を含むGPD遺伝
子の全長配列をクローニングするために、このPCR産物
を、シイタケ菌糸cDNAライブラリー及びシイタケゲノム
ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとし
て用いた。

【００５５】(6) 菌糸cDNAライブラリーからのGPD遺伝
子の単離 GPD遺伝子のスクリーニングにおいて、プラークアッセ
イ及びライブラリーの増幅はZAP Express cDNA synthes
is Kit(Stratagene社製)のマニュアルに基づいて行っ
た。すなわち、上記(2)において得られたcDNAライブラ
リーから合計50万個のプラークをスクリーニングするた
め、１×10⁷pfu/mlのファージ溶液５μlを10本用意し、
それぞれに10mM MgSO₄でOD₆₀₀=0.5に調製した大腸菌XL1
-Blue MRF'株600μlを加えて、37℃で15分間インキュベ
ートした。次いで、6.5mlのNZYトップアガーを加えて、
90mm×130mmの角型NZYプレートに重層し、37℃で６〜８
時間インキュベートし、プラークを形成させた。プラー
クが形成されたプレートは４℃で保存した。

【００５６】予め大きさを合わせて切断したHybond N+
ナイロンメンブレン(90mm×130mm、Amersham Life Scie
nce社製)をプレートに重ね、２分間放置し、ファージDN
Aをメンブレンにトランスファーした。次いでメンブレ
ンをアルカリ変性溶液(0.25M NaOH、 1.5M NaCl)で20分
間処理し、DNAをアルカリ変性させた。変性後、メンブ
レンを中和液(0.5M Tris-HCl(pH 8.0)、 1.5M NaCl)に浸
して、室温で５分間振盪し、続いて、リンス溶液(0.2M
Tris-HCl(pH 7.5)、2×SSC)中で30秒間メンブレンを洗
浄後、ペーパータオルにメンブレンを挟んで、80℃で２
時間加温することで、DNAをメンブレンに完全に固定し
た。

【００５７】次いで、プラークハイブリダイゼーション
及びそのシグナル検出を、ECL direct nucleic acid la
belling and detection system(Amersham Life Science
社製)を用いて行った。すなわち、固定したメンブレン
をハイブリバック(コスモバイオ社製)に入れ、キット付
属のハイブリダイゼーション緩衝液を適量加えて、密閉
し、42℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行っ
た。次いで溶液を除去し、そこに上記(5)において調製
したプローブをペルオキシダーゼ標識したもの50ngを含
む５mlのハイブリダイゼーショ緩衝液を加え、42℃で４
時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼ
ーション完了後、メンブレンを0.4％SDS及び36％尿素を
含む0.5×SSCを用い、42℃で20分間の洗浄を２回行っ
た。さらに２×SSCを用い、室温で５分間の洗浄を２回
行った。

【００５８】このメンブレンを１mlのECL検出試薬で１
分間処理後ラップで包み、フィルムカセットに入れ、生
じたシグナルをHyperfilm-ECL(Amersham Life Science
社製)に感光させた。フィルムを現像したところ、16個
の陽性シグナルが得られた。得られたシグナルに対する
プラークをピペットで吸い取り、それを１mlのSM緩衝液
(100mM NaCl, 100mM MgSO4, 50mM Tris-HCl(pH7.5), 0.
01％ゼラチン)に懸濁し、20μlのクロロホルムを加えて
攪拌した。このファージ懸濁液を適当に希釈して、プレ
ーティングし、上記と同様にスクリーニングを行い、最
終的に３個の陽性プラークを得た。

【００５９】スクリーニング後、ファージミド形成はZA
P Express cDNA synthesis kit(Stratagene社製)のマニ
ュアルに基づいて行った。すなわち、１mlのSM緩衝液に
懸濁した陽性組換えファージ250μlに、10mM MgSO₄でOD
₆₁₀=1.0に調製した大腸菌XL-1Blue MRF'株200μlと、EX
assistヘルパーファージを加えて、37℃で15分間イン
キュベートした。そこへ、３mlのNZY brothを加えて、
さらに37℃で2.5時間インキュベートした。インキュベ
ート後、70℃で20分間加温し、1,000×ｇで15分間遠心
して、上清を回収し、ファージミド溶液を得た。次に、
ファージミドを大腸菌に組み込むため、ファージミド溶
液100μl又は10μlに、10mM MgSO₄でOD₆₀₀=1.0に調整し
た大腸菌XLOLR株200μlを加えて、37℃で15分間インキ
ュベートした。培養液200μlを50μg/mlのカナマイシン
を含むLBプレートに播種し、37℃で一晩インキュベート
し、生じたコロニーからファージミドを調製した。

【００６０】ファージミドの調製はRPM Kit(BIO 101社
製)を用いて行った。すなわち、上記で得られたコロニ
ーを50μg/mlのカナマイシンを含む３mlのLB液体培地に
接種し、37℃で一晩インキュベートした。培養液をマイ
クロチューブに取り、10,000×ｇで１分間遠心して、集
菌した。回収した菌体にPre-Lysis緩衝液50μlを加え
て、激しく攪拌し、菌体を懸濁した。さらに、100μlの
アルカリLysis緩衝液を加えて、穏やかに攪拌し、菌体
を完全に溶解させた。次に、100μlの中和溶液を加えて
激しく攪拌し、10,000×ｇで２分間遠心して、上清を回
収した。キット付属のSPIN FIRTERによく混ぜたGlass M
ilkを250μl加えて、そこへ回収した上清加えてよく攪
拌し、マイクロチューブにSPIN FIRTERをのせた。10,00
0×ｇで１分間遠心し、さらにWash緩衝液350μlを加え
て同様に遠心した後、新しいマイクロチューブにSPIN F
IRTERをのせ、TEを50μl加えて10,000×ｇで30秒間遠心
し、Glass Milkからファージミドを溶出させた。エタノ
ール沈殿後、得られた沈殿を20μlのTEに溶解し、塩基
配列の決定に供した。

【００６１】(7) ゲノムライブラリーからのGPD遺伝子
の単離 上記(3)において作製したゲノムライブラリーから、上
記(6)とほぼ同様の手順でGPD遺伝子を単離した。プラー
クの形成及びライブラリーの増幅は、大腸菌XL1-blue M
RA株を使用して、Lambda EMBL3/Bam HI vector kit(Str
atagene社製)のマニュアルに基づいて行い、プラークハ
イブリダイゼーション及びシグナルの検出は、cDNAライ
ブラリーからのGPDの単離と同じ手順で行った。そし
て、得られたシグナル付近のプラークを掻き取り、それ
をSM緩衝液(100mM NaCl、100mM MgSO₄、50mM Tris-HC
l、pH 7.5、0.01%ゼラチンを含む)に懸濁した。このフ
ァージ懸濁液を適度に希釈してプレーティングし、上記
と同様のスクリーニングを行い、ゲノムのGPD遺伝子を
含む組換え体ファージを得た。クローン化したファージ
をそれぞれプレーティングし、37℃、６〜８時間インキ
ュベートしてプラークを形成させた。プラークが形成し
たプレートに10mlのSM緩衝液を重層し、４℃で12時間以
上振盪培養して、ファージをSM緩衝液中に遊離させた。
ファージを含むSM緩衝液を15mlのプロピレンチューブに
回収し、クロロホルムを終濃度５％となるように加え
て、室温15分間放置し、それを1,500×ｇで10分間遠心
し、上清を回収した。次いで、Wizard Lambda Preps DN
A Purification System(Promega社製)を用いてファージ
DNAを精製し塩基配列の決定に供した。

【００６２】(8) 塩基配列の決定 上記(6)及び(7)において得られた陽性クローンの塩基配
列を、ABI PRISM DyeTerminator Cycle Sequencing Rea
dy Reaction Kit, FS(Perkin Elmer社製)を用いて決定
した。PCR反応はそのマニュアルに基づいて行い、得ら
れたPCR産物はABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Perkin
Elmer社製)によって解析した。決定した全塩基配列を
配列番号３及び配列番号５に示す。配列番号３はGPD遺
伝子を含むcDNAの塩基配列であり、配列番号５はGPD遺
伝子を含むゲノムDNAの塩基配列である。得られたcDNA
配列(配列番号３)中には、337個のアミノ酸からなるGPD
タンパク質をコードすると考えられるオープンリーディ
ングフレームを見出した。これらの配列の比較から、解
析したGPD遺伝子は、図１のように、８つのイントロン
(直線部分)を有する９つのエキソン(四角部分)に分断さ
れて、ゲノム上に存在することを見出した。

【００６３】〔実施例２〕pLG-hphベクターの構築 (1) GPDのプロモーター領域の単離 単離したGPD遺伝子の翻訳開始コドンを含む5'側上流域
約１kbの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。この領
域には、各種プロモーターに見出される特定塩基配列(T
ATAbox、CAATboxなど)が存在していた。そこで、翻訳開
始コドンから上流約１kbをプロモーター領域とみなし、
ゲノムGPD遺伝子を鋳型としてPCRを行い、GPDのプロモ
ーター領域を大量に調製した。

【００６４】５'センスプライマー(pG-Uプライマーとも
いう)として、翻訳開始点から−1051〜−1026bpの位置
に存在する配列5'-CGAAGTTTGAGGTGGTTGCGAATACG-3'(配
列番号８)を有するものを用い、３'アンチセンスプライ
マー(pG-L2プライマーともいう)として、翻訳開始点か
ら−30〜−５bpの位置に存在する配列5'-ATTCAAGCAGTCA
ATGGATTGGAGGG-3'(配列番号９)を有するものを用いた。
PCRの反応液の組成は以下の通りである。

【００６５】 ゲノムDNA溶液 1.0μl(10ng) 10 ×PCR緩衝液 5.0μl 25mM MgCl₂ 5.0μl ２mM dNTPミックス 4.0μl 20μMプライマー(センス) 0.5μl 20μMプライマー(アンチセンス) 0.5μl ５U/μl Taqポリメラーゼ 0.25μl 滅菌水 33.75μl 全量 50μl

【００６６】PCRは、96℃で30秒間の熱変性、60℃で30
秒間のアニーリング、72℃で２分間の伸長反応の条件を
１サイクルとして、30サイクル行った。反応終了後、反
応液を新しいマイクロチューブに移し、そのうち５μl
を１％アガロースゲルによる電気泳動に供し、増幅断片
の確認を行った。次いで、残りの反応液にフェノール・
クロロホルム処理とエタノール沈殿を行い、ペレット化
したPCR産物を20μlのTE緩衝液に溶解した。得られたPC
R産物を１％低融点アガロースゲル電気泳動に供し、約
1,000bpの断片を切り出した。その断片をQIAEX II(QIAG
EN社製)を用いてゲルから抽出し、1,047bpのGPD遺伝子
プロモーターを精製した。

【００６７】(2) GPD遺伝子のターミネーター領域の単
離 単離したGPD遺伝子の翻訳終始コドンを含む3'側下流域
約１kbの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。この領
域をGPDターミネーター領域とみなし、ゲノムGPD遺伝子
を鋳型として、PCRを行った。５'センスプライマー(tG-
U2プライマーともいう)として、終止コドンから、３〜2
6bpの位置に存在する配列5'-GAAAGGGCTGTGCATCTCGAAACT
-3' (配列番号10)を有するものを用い、３'アンチセン
スプライマー(tG-Lプライマーともいう)として、終止コ
ドンから、969〜992bpの位置に存在する配列5'-TCATCAT
ACCCCCTACCGACATCT-3' (配列番号11)を用いた。PCR反応
はプロモーター単離の場合と同条件で行った。

【００６８】得られたPCR産物を１％低融点アガロース
ゲル電気泳動に供し、約1,000bpの断片を切り出した。
その断片をQIAEX II(QIAGEN社製)を用いてゲルから抽出
し、PCR産物を精製した。さらに、そのPCR産物を制限酵
素DraIで消化し、954bpのGPD遺伝子ターミネーターを調
製した。

【００６９】(3) 組換えベクターの構築 上記(1)及び(2)において単離したGPDのプロモーター領
域とターミネーター領域を利用し、異種生物由来の遺伝
子としては、大腸菌由来のハイグロマイシンＢ耐性遺伝
子(hygromycin B phosphotransferase, hph)[Gritz and
Davis, Gene,25,179-188,1983]を用い、シイタケを宿
主とする組換えベクターを構築した。

【００７０】すなわち、hph遺伝子をマーカー遺伝子と
して有するpCHベクター[Matsuki etal., Mol. Gen. Gen
et., 220,12-16,1989]を制限酵素BamHIで消化すること
によりhph遺伝子断片を切り出した。その断片をBamHIで
消化した大腸菌のプラスミドベクターpUC19[Yanisch-Pe
rron et al.,Gene,33,109-119,1985]に組込み、大腸菌T
op 10F'(Invitrogen社製)に導入して、hph遺伝子を含有
するpUC19プラスミドを大量に調製した。そのプラスミ
ドベクターを制限酵素XbaIで消化し、平滑末端化、脱リ
ン酸化を行った後、pT7Blue Perfectly Blunt Cloning
Kit(Novagen社製)を用いて単離したGPDのプロモーター
とライゲーションさせた。こうして作出されたプラスミ
ドのうち、転写方向的に正しく挿入されたものを選抜し
て、大量に調製した。このプラスミドベクターを制限酵
素SmaIで消化し、脱リン酸化を行った後、上記(2)で得
られたGPD遺伝子のターミネーターとライゲーションさ
せた。こうして作出したプラスミドのうち、転写方向的
に正しく挿入されたものを選抜して、大量に調製した。
得られたpLG-hphベクターの模式図を図２に示す。

【００７１】〔実施例３〕REMI法によるシイタケの形質
転換 (1) プロトプラストの調製 野生型のシイタケ菌株S-1の二核菌糸を、0.25×MYPG寒
天培地(0.25％麦芽エキス、0.1％酵母エキス、0.1％ペ
プトン、0.5％グルコース、1.5％寒天)で、25℃２週間
培養した。生育した菌糸を掻き取り、50mlの0.25×MYPG
液体培地で１週間培養した。得られた菌糸はガラスフィ
ルターで集菌し、50mlの0.25×MYPG液体培地に懸濁して
ポリトロンホモジナイザーで裁断し、100μmのナイロン
メッシュで濾過した濾過菌糸をさらに0.25×MYPG液体培
地中で25℃、５日間培養した。培養菌糸は100μmのナイ
ロンメッシュで集菌後、クエン酸緩衝液(0.6Mマンニト
ールを含む50mMクエン酸緩衝液、pH 5.6)で２回洗浄
し、菌糸１ｇ当り10mlの酵素溶液(2.5％セルラーゼ、0.
1％キチナーゼを含むクエン酸緩衝液)に菌糸を懸濁し、
28℃で３〜４時間インキュベートした。酵素処理した菌
糸を40μmのナイロンメッシュで濾過し、濾液を1,500×
ｇで10分間遠心分離して、プロトプラストを沈殿させ
た。上清を捨て、プロトプラストをSTC緩衝液(10mM塩化
カルシウム、1.2Mソルビトール、10mM Tris-HCl、pH7.
5)で洗浄後、再び１mlのSTC緩衝液にプロトプラストを
懸濁し、顕微鏡でプロトプラストの数を計測した。最終
的には、STC緩衝液100μlに0.5〜1.0×10⁷個のプロトプ
ラストとなるように調整して、形質転換用のプロトプラ
ストとした。

【００７２】(2) pLG-hphベクターの導入 形質転換は、pLG-hphベクターを３箇所で切断する制限
酵素DraI、又は１箇所で切断する制限酵素BglIIを用い
たREMI(Restriction Enzyme Mediated Integration)法
によって行った(特願平9-331611)。すなわち、2.5μgの
pLG-hphと50ユニットのDraI又はBglIIを含む150μlのST
C緩衝液に、上記のプロトプラスト懸濁液100μlを穏や
かに加え、氷中で20分間インキュベートした。これに、
62.5μlのPEG溶液(10mM塩化カルシウム、60％PEG4000、
10mM Tris-HCl、pH 7.5)を加え、氷中で20分間インキュ
ベートした。さらに3.125mlのPEG溶液を加えて、室温で
20分間インキュベートした。次に、10mlのSTC緩衝液を
加えて溶液全体を十分に懸濁し、1,500×ｇで10分間遠
心し、プロトプラストを沈殿させた。回収したプロトプ
ラストを４mlのMS液体培地(２％麦芽エキス、0.6Mスク
ロース)に懸濁し、25℃で３〜４日間静置培養した。

【００７３】(3) 形質転換体の選抜 プロトプラストから再生した菌糸を1,500×ｇで10分間
遠心することにより回収した。回収した菌糸を１mlのMS
液体培地に再懸濁し、５μg/mlハイグロマイシンＢを含
む最少寒天培地(２％グルコース、0.2％酒石酸アンモニ
ウム、0.05％硫酸マグネシウム、0.1％リン酸二水素カ
リウム、0.112％炭酸ナトリウム、0.132％フマル酸、10
ppm硫化鉄、8.8ppm硫化亜鉛、7.2ppm塩化マンガン、1.5
％寒天、pH 4.5)に播種し、25℃で５日間培養した。次
に、菌糸の生育した最少寒天培地上に、20μg/mlのハイ
グロマイシンＢを加えた0.25×MYPG寒天培地(調製した
培地成分を蒸気滅菌後、ハイグロマイシンＢを添加し約
50℃に冷却したもの)を重層した。25℃で約５日間培養
後、増殖してきた菌糸を分離し、20μg/mlのハイグロマ
イシンＢを含む新鮮なMYPG寒天培地に植え替えた。さら
に、約１週間培養し、増殖してきた菌糸を、さらに20μ
g/mlのハイグロマイシンＢを含む新鮮なMYPG寒天培地に
植え替えて培養し、ハイグロマイシン耐性を獲得した菌
糸を選抜した。形質転換体出現率の結果を表１に示す。
数値は３連の実験の平均値であり、pLG-hphベクターに
より形質転換されたハイグロマイシン耐性を獲得したシ
イタケ形質転換体が作出され、本発明の発現用組換えベ
クターが、シイタケを宿主とする異種遺伝子発現用ベク
ターとして有効であることを確認した。

【００７４】

【表１】

【００７５】

【発明の効果】本発明により、シイタケのグリセルアル
デヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GPD)遺伝子の転写開
始を指令するプロモーター、シイタケGPD遺伝子の転写
終結を指令するターミネーター、並びに該プロモーター
及び／又は該ターミネーターを含む組換えベクター、該
組換えベクターを含む形質転換体、該形質転換体を用い
るポリペプチドの製造方法が提供される。

【００７６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Iwate prefecture <120> Promoter Gene <160> 14 <210> 1 <211> 1070 <212> DNA <213> Lentinus edodes <400> 1 gaattcgaag tttgaggtgg ttgcgaatac gctcgtaagt tgcagcataa ctgatatatc 60 ttgtgacaag acatatcggg catatccccg gtcacatgac atcagttgca ctgaattttt 120 atgatttcgt cgagcggaat tttttctctt tccagagtga gatgcgactc ttgtcgtaca 180 tgtgcatagc ttagtgaaca atgaccaaga aagctcgtga agaggccggg tccggtcgcg 240 ctaatgtaca ggatggcctt agctggagta tagcaattaa ctcgggaggg agtgattata 300 catcggctga gaggtatttc gtttcaggcc ttgcctctaa tcccttgctc tgcatatgca 360 ccagataaat ccgttttgtc gtagatgcga gagttcaggt tttacgccaa accgaaaaga 420 gttgcatgag catcccttta tgctggttat ctgagcgggc ccgtatccta tcggcgttag 480 agtgcagtcg gagagccgca tgtatcacgg aaaggactcg aacagggagt tttatctatt 540 tatattggtc gatatcagtc agattgtcag tgcgtcaaag ttgcatccat aaggctacta 600 cggtgaaacc ggtgtatcct gggatatcat gaaatggttg tatgcagaag ataagaatga 660 gagtagttct agaacaacaa acccaggcca gggaggaaac tgtagcattt gcaagacttt 720 gcagggctct tcaaaggcac ttccatccaa agctcgagca cggttccagg caaccttagt 780 catggggcga tagaactgaa gaacgtttgc tgattggcag tccatcccaa aggactcggc 840 caataaatcc tatccaatcg caggtccgag gtactaaagt gttttagggt ctagactttt 900 agggctattg tcgaagtcac aacatcacgc aatcaagatt tgactgaagc gcgattatct 960 ataaaaggat cagttgtgtt tttcgtccgc atcttttcct tgttccacaa ccttcgattc 1020 taaataccct ccaatccatt gactgcttga attaaaatgg tatgtatatc 1070 <210> 2 <211> 997 <212> DNA <213> Lentinus edodes <400> 2 tctaagcgaa agggctgtgc atctcgaaac tgccacaatg tttaaaagtg tagacgatta 60 ctgtaaacct caagtatttt atagacgctt atcgatcagc tcatcgataa ggaggaaaaa 120 aagctcaaat cctgttgtac ttacctacat tattgttagc tctcaattgg aattccatgt 180 atataatttc aatatctgcc catgaggtca ctgcaacacg aatcagaatt gattattctg 240 gagtttagag atttcaacgg gcactctgga taagaacgca agctggagta gatcaaatat 300 atctaactcc ttgccaccac ttgtactccc attacaatac cccgattgtc aaacccctaa 360 ttgaaccatc aaactgttcc cagccagata ctgcctaccg acccgactcg gactggagaa 420 cactgaaatt ctctttgaat ttcgagcgca tgatgagggg tgatttaggg gacctaggat 480 tcctagtagg ttgcggagaa ggaggataat gcgttcgaga acttcgacca ttccgaacat 540 tggaattggg ttcgtacctg tgtccgccgt ctccctgata ctcagcaccg gtacgcccgt 600 cacgtccata cccattgtaa tcattatacc cattgtaacc attgtaccca tggtcatttt 660 tatacccata ctcctctcgt gtatgcagat acgggctacg agtagccttg ctactgggag 720 gtgggtaccg tgatcgagag aggtgtcgtg ttgaagacgg tgcagggatc acaatgttcg 780 tgtttatggg gtcagatgat gaattaggca gagtagccat gactgggatc acaggcgtgc 840 ttgtcgaaga ataagtgtaa ttgtcgtaac cgttgtaacc tgcccgtcta tgtgcagatc 900 tgtttgaccg atcacggcct ctgccccttc catctgaagg aggtatgatt tgaggatttt 960 ggggatgata tgaagatgtc ggtagggggt atgatga 997 <210> 3 <211> 1234 <212> DNA <213> Lentinus edodes <220> <221> CDS <222> (46)..(1059) <400> 3 cttcgattct aaataccctc caatccattg actgcttgaa ttaaa atg gcc gtc aaa 57 Met Ala Val Lys 1 gtc ggt atc aac ggt ttc ggt cgt atc ggc cgt atc gta ctc aga aat 105 Val Gly Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Ile Val Leu Arg Asn 5 10 15 20 gct ttg ttg aac cct gaa gtc aac gtt gtt gca gtc aac gac cct ttc 153 Ala Leu Leu Asn Pro Glu Val Asn Val Val Ala Val Asn Asp Pro Phe 25 30 35 att gct ctt gag tac atg gtc tac atg ttc aag tat gac tcc gtc cac 201 Ile Ala Leu Glu Tyr Met Val Tyr Met Phe Lys Tyr Asp Ser Val His 40 45 50 gga cgt ttc aaa ggc act gtc gag act aag ggc ggc aag ctc atc gtc 249 Gly Arg Phe Lys Gly Thr Val Glu Thr Lys Gly Gly Lys Leu Ile Val 55 60 65 gac gga aag gaa atc tcc gtc ttc ggt gag aag gat gct ggt gct att 297 Asp Gly Lys Glu Ile Ser Val Phe Gly Glu Lys Asp Ala Gly Ala Ile 70 75 80 cct tgg agc tct gtc ggt gca gag tac ata gtc gag tct acc ggt gtc 345 Pro Trp Ser Ser Val Gly Ala Glu Tyr Ile Val Glu Ser Thr Gly Val 85 90 95 100 ttc acc acg att gaa aag gcc tct gct cac ttg aag ggt ggt gcc aag 393 Phe Thr Thr Ile Glu Lys Ala Ser Ala His Leu Lys Gly Gly Ala Lys 105 110 115 aaa gtc atc atc tct gct cct tcc gct gat gca cct atg tac gtt tgc 441 Lys Val Ile Ile Ser Ala Pro Ser Ala Asp Ala Pro Met Tyr Val Cys 120 125 130 ggt gtc aat ctc gac tct tat gac tcg caa cat gct gtt atc tcc aat 489 Gly Val Asn Leu Asp Ser Tyr Asp Ser Gln His Ala Val Ile Ser Asn 135 140 145 gct tct tgc acg acg aac tgc ctc gca cct ctc gcc aag gtt atc cac 537 Ala Ser Cys Thr Thr Asn Cys Leu Ala Pro Leu Ala Lys Val Ile His 150 155 160 gac aaa ttc ggt atc gtt gag gct ctg atg act acc gtc cat gcc acc 585 Asp Lys Phe Gly Ile Val Glu Ala Leu Met Thr Thr Val His Ala Thr 165 170 175 180 acc gct acc cag aag act gtt gat ggt cct tcg aac aaa gat tgg cgt 633 Thr Ala Thr Gln Lys Thr Val Asp Gly Pro Ser Asn Lys Asp Trp Arg 185 190 195 gga ggt cgt tct gtc aac gga aac atc atc cct tct tca act ggt gct 681 Gly Gly Arg Ser Val Asn Gly Asn Ile Ile Pro Ser Ser Thr Gly Ala 200 205 210 gcc aag gct gtc gga aag gtt att cct tcg ctc aac gga aag ttg acc 729 Ala Lys Ala Val Gly Lys Val Ile Pro Ser Leu Asn Gly Lys Leu Thr 215 220 225 ggt ctt gcc ttc cgt gtt cct acc ctc gac gtt tcg gta gtc gac ctt 777 Gly Leu Ala Phe Arg Val Pro Thr Leu Asp Val Ser Val Val Asp Leu 230 235 240 gtt tgc cgt acc gaa aag agt gca acc tac gac gag atc aaa gct gct 825 Val Cys Arg Thr Glu Lys Ser Ala Thr Tyr Asp Glu Ile Lys Ala Ala 245 250 255 260 gtc aaa gaa gcc tcc aag ggt cct ctc aag ggt atc tta ggc tac act 873 Val Lys Glu Ala Ser Lys Gly Pro Leu Lys Gly Ile Leu Gly Tyr Thr 265 270 275 gag gac cat gtt gtt tcc acc gac ttc att ggg gac aac cac tct tcg 921 Glu Asp His Val Val Ser Thr Asp Phe Ile Gly Asp Asn His Ser Ser 280 285 290 atc ttc gat gct acc gcc gga atc cag ctc aac aag aac ttt gtc aag 969 Ile Phe Asp Ala Thr Ala Gly Ile Gln Leu Asn Lys Asn Phe Val Lys 295 300 305 ttg att gct tgg tac gac aac gag tgg ggt tac tct gga aga gtt gtt 1017 Leu Ile Ala Trp Tyr Asp Asn Glu Trp Gly Tyr Ser Gly Arg Val Val 310 315 320 gat ctc ttg gtg ttt gct gcc aag aag gat ggt gct ctc taa 1059 Asp Leu Leu Val Phe Ala Ala Lys Lys Asp Gly Ala Leu 325 330 335 gcgaaagggc tgtgcatctc gaaactgcca caatgtttaa aagtgtagac gattactgta 1119 aacctcaagt attttataga cgcttatcga tcagctcatc gataaggagg aaaaaaagct 1179 caaatcctgt tgtacttacc tacattatta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1234 <210> 4 <211> 337 <212> PRT <213> Lentinus edodes <400> 4 Met Ala Val Lys Val Gly Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Ile 1 5 10 15 Val Leu Arg Asn Ala Leu Leu Asn Pro Glu Val Asn Val Val Ala Val 20 25 30 Asn Asp Pro Phe Ile Ala Leu Glu Tyr Met Val Tyr Met Phe Lys Tyr 35 40 45 Asp Ser Val His Gly Arg Phe Lys Gly Thr Val Glu Thr Lys Gly Gly 50 55 60 Lys Leu Ile Val Asp Gly Lys Glu Ile Ser Val Phe Gly Glu Lys Asp 65 70 75 80 Ala Gly Ala Ile Pro Trp Ser Ser Val Gly Ala Glu Tyr Ile Val Glu 85 90 95 Ser Thr Gly Val Phe Thr Thr Ile Glu Lys Ala Ser Ala His Leu Lys 100 105 110 Gly Gly Ala Lys Lys Val Ile Ile Ser Ala Pro Ser Ala Asp Ala Pro 115 120 125 Met Tyr Val Cys Gly Val Asn Leu Asp Ser Tyr Asp Ser Gln His Ala 130 135 140 Val Ile Ser Asn Ala Ser Cys Thr Thr Asn Cys Leu Ala Pro Leu Ala 145 150 155 160 Lys Val Ile His Asp Lys Phe Gly Ile Val Glu Ala Leu Met Thr Thr 165 170 175 Val His Ala Thr Thr Ala Thr Gln Lys Thr Val Asp Gly Pro Ser Asn 180 185 190 Lys Asp Trp Arg Gly Gly Arg Ser Val Asn Gly Asn Ile Ile Pro Ser 195 200 205 Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ala Val Gly Lys Val Ile Pro Ser Leu Asn 210 215 220 Gly Lys Leu Thr Gly Leu Ala Phe Arg Val Pro Thr Leu Asp Val Ser 225 230 235 240 Val Val Asp Leu Val Cys Arg Thr Glu Lys Ser Ala Thr Tyr Asp Glu 245 250 255 Ile Lys Ala Ala Val Lys Glu Ala Ser Lys Gly Pro Leu Lys Gly Ile 260 265 270 Leu Gly Tyr Thr Glu Asp His Val Val Ser Thr Asp Phe Ile Gly Asp 275 280 285 Asn His Ser Ser Ile Phe Asp Ala Thr Ala Gly Ile Gln Leu Asn Lys 290 295 300 Asn Phe Val Lys Leu Ile Ala Trp Tyr Asp Asn Glu Trp Gly Tyr Ser 305 310 315 320 Gly Arg Val Val Asp Leu Leu Val Phe Ala Ala Lys Lys Asp Gly Ala 325 330 335 Leu <210> 5 <211> 4838 <212> DNA <213> Lentinus edodes <400> 5 gtcgtcgttg ctggtatcgg acttagtgtc atatcttctg tgaaggcagc ccctgtgagt 60 acattgctct ggtcatcttt tcaacgaagt gaataatgac cgatctccct ttgtatgtag 120 gtgccgacag tctttgtcaa gttccgtgaa ccttggggca tcgattccgg gacaccgagc 180 gcaccaaagg aggttaaagc tgaactgcaa aagcttgtag aatcttatgc ggaattcttg 240 acgattaaac ccagggactg ccccgtggtg cagttggaaa acacattcat aagtcaaagg 300 gcaaatggtc cacataatta tgaagtcgac ttccatggga tgggcgagtg caatgagaag 360 ggtgactgca ctgtaggttt tgtggggggt ctgccatcta ttaacaaggg gtaccacgtt 420 atattcccaa aacatctctt tgccagtggc acgtacgaac ccaacccgca cgcgatatgg 480 taatagatgg gaggatttct gattttcggt gctatttgta gctctataca ctgttgcacg 540 gttctttgaa ggaatttcat caatttttct tttgaaattt ttctagtgta tgatgaagat 600 ctcgaggaac gagcaggcac acatttggtc agaattttcg aaagccagtt ccatccataa 660 atctccaatt ctgtcgaaaa tctatttgaa tgaacaccta tctatgacag gacggataga 720 atactgcacg aaccaggttt ttgtacttgg tggcatatca cagcagtctc atggagaata 780 gtgaatagct tcaaagaaaa attgactttg ttgtgaccca agttgagatc tagagtgaaa 840 ccctttcggg ttcggggcct gcagcagcag gtagatccta cctatatacc tgaagattat 900 gaatgcagag agtggtgcaa ggtggtgcag ttccgttttt gctgattagt ccaggattag 960 tctggcgaat tgagacaact aatttgaccg tcgaggcggt cggccgcggt agaaacatta 1020 gtaagtcact tcggaaaggt ttcagatctc ttaacgcacg tgatttcttt gcagataatc 1080 gtcgatttcg tttcgaaacc ttcttgcagc gaattcgaag tttgaggtgg ttgcgaatac 1140 gctcgtaagt tgcagcataa ctgatatatc ttgtgacaag acatatcggg catatccccg 1200 gtcacatgac atcagttgca ctgaattttt atgatttcgt cgagcggaat tttttctctt 1260 tccagagtga gatgcgactc ttgtcgtaca tgtgcatagc ttagtgaaca atgaccaaga 1320 aagctcgtga agaggccggg tccggtcgcg ctaatgtaca ggatggcctt agctggagta 1380 tagcaattaa ctcgggaggg agtgattata catcggctga gaggtatttc gtttcaggcc 1440 ttgcctctaa tcccttgctc tgcatatgca ccagataaat ccgttttgtc gtagatgcga 1500 gagttcaggt tttacgccaa accgaaaaga gttgcatgag catcccttta tgctggttat 1560 ctgagcgggc ccgtatccta tcggcgttag agtgcagtcg gagagccgca tgtatcacgg 1620 aaaggactcg aacagggagt tttatctatt tatattggtc gatatcagtc agattgtcag 1680 tgcgtcaaag ttgcatccat aaggctacta cggtgaaacc ggtgtatcct gggatatcat 1740 gaaatggttg tatgcagaag ataagaatga gagtagttct agaacaacaa acccaggcca 1800 gggaggaaac tgtagcattt gcaagacttt gcagggctct tcaaaggcac ttccatccaa 1860 agctcgagca cggttccagg caaccttagt catggggcga tagaactgaa gaacgtttgc 1920 tgattggcag tccatcccaa aggactcggc caataaatcc tatccaatcg caggtccgag 1980 gtactaaagt gttttagggt ctagactttt agggctattg tcgaagtcac aacatcacgc 2040 aatcaagatt tgactgaagc gcgattatct ataaaaggat cagttgtgtt tttcgtccgc 2100 atcttttcct tgttccacaa ccttcgattc taaataccct ccaatccatt gactgcttga 2160 attaaaatgg tatgtatatc actacagaga attgcatcta tgctgtctgg ctcattccat 2220 gtcttttcag gccgtcaaag tcggtatcaa cgggtacgtc ctttggttcg aaagttttag 2280 agatggttcg cgattaaacg atttccgtgt cttttattct acgatgattg cagtttcggt 2340 aagcgaatga tcagtctctt ctgtctatct ttcctgagtc tcatctctta ggtcgtatcg 2400 gccgtatcgt actcagaaat gctttgttga accctgaagt caacgttgtt gcagtcaacg 2460 agtgcgtagt ttcatcatac taagcatcgt caaaggaatt cattttccac agccctttca 2520 ttgctcttga gtacatggtg cgggttgcat ccccaatctg atcgcatttt cgtactgaga 2580 gatgttttta ctgtggtgct acctaggtct acatgttcaa gtatgactcc gtccacggac 2640 gtttcaaagg cactgtcgag actaagggcg gcaagctcat cgtcgacgga aaggaaatct 2700 ccgtcttcgg tgagaaggat gctggtgcta ttccttggag ctctgtcggt gcagagtaca 2760 tagtcgagtc taccgtgcgt caactctgac ttcactttca tgatctggta atcacctgcc 2820 attttgtttc tccatctccc agggtgtctt caccacgatt gaaaaggcct ctgctcactt 2880 gaagggtggt gccaagaaag tcatcatctc tgctccttcc gctgatgcac ctatgtacgt 2940 ttgcggtgtc aatctcgact cttatgactc gcaacatgct gttgtaagta tgactggccc 3000 actctctttc tcgcaacgtt ctgaccatat cttagatctc caatgcttct tgcacgacga 3060 actgcctcgc acctctcgcc aaggttatcc acgacaaatt cggtatcgtt gaggctctga 3120 tgactaccgt ccatgccacc accgctaccc agaagactgt tgatggtcct tcgaacaaag 3180 attggcgtgg aggtcgttct gtcaacggaa acatcatccc ttcttcaact ggtgctgcca 3240 aggctgtcgg aaaggttatt ccttcgctca acggaaagtt gacgtgagtt gttctcagct 3300 atctaactaa tgacaccgct gatgtggcat tctttctatc ttttagcggt cttgccttcc 3360 gtgttcctac cctcgacgtt tcggtagtcg accttgtttg ccgtaccgaa aagagtgcaa 3420 cctacgacga gatcaaagct gctgtcaaag aagcctccaa gggtcctctc aagggtatct 3480 taggctacac tgaggaccat gttgtttcca ccgacttcat tggggacaac cactcttcga 3540 tcttcgatgc taccgccgga atccagctca acaagaactt tgtcaagttg attgcttggt 3600 acgacaacga gtggggttac tctggaagag ttgttgatct cttggtgttt gctgccaaga 3660 aggatggtgc tctctaagcg aaagggctgt gcatctcgaa actgccacaa tgtttaaaag 3720 tgtagacgat tactgtaaac ctcaagtatt ttatagacgc ttatcgatca gctcatcgat 3780 aaggaggaaa aaaagctcaa atcctgttgt acttacctac attattgtta gctctcaatt 3840 ggaattccat gtatataatt tcaatatctg cccatgaggt cactgcaaca cgaatcagaa 3900 ttgattattc tggagtttag agatttcaac gggcactctg gataagaacg caagctggag 3960 tagatcaaat atatctaact ccttgccacc acttgtactc ccattacaat accccgattg 4020 tcaaacccct aattgaacca tcaaactgtt cccagccaga tactgcctac cgacccgact 4080 cggactggag aacactgaaa ttctctttga atttcgagcg catgatgagg ggtgatttag 4140 gggacctagg attcctagta ggttgcggag aaggaggata atgcgttcga gaacttcgac 4200 cattccgaac attggaattg ggttcgtacc tgtgtccgcc gtctccctga tactcagcac 4260 cggtacgccc gtcacgtcca tacccattgt aatcattata cccattgtaa ccattgtacc 4320 catggtcatt tttataccca tactcctctc gtgtatgcag atacgggcta cgagtagcct 4380 tgctactggg aggtgggtac cgtgatcgag agaggtgtcg tgttgaagac ggtgcaggga 4440 tcacaatgtt cgtgtttatg gggtcagatg atgaattagg cagagtagcc atgactggga 4500 tcacaggcgt gcttgtcgaa gaataagtgt aattgtcgta accgttgtaa cctgcccgtc 4560 tatgtgcaga tctgtttgac cgatcacggc ctctgcccct tccatctgaa ggaggtatga 4620 tttgaggatt ttggggatga tatgaagatg tcggtagggg gtatgatgaa ggcgggggct 4680 gaccacgacg atagtctgga ttttgatcct gcggtgacct acccttttgc tctctcgctt 4740 ccctcctcct ttccatccgc tcagtaacga acggaagtac tggcggctgc aacggttcca 4800 agtcagcatt attgtcatat tcgtatttat gcccattc 4838 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on putative amino acid sequence of GPD gene. <400> 6 gkatcggmcg ymtygtcytc mghaatgc 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on putative amino acid sequence of GPD gene. <400> 7 argcarttgg thgtgcahga agcrttyg 28 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for PCR amplification of the promoter region of GPD gene. <400> 8 cgaagtttga ggtggttgcg aatacg 26 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for PCR amplification of the promoter region of GPD gene. <400> 9 attcaagcag tcaatggatt ggaggg 26 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for PCR amplification of the terminator region of GPD gene. <400> 10 gaaagggctg tgcatctcga aact 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for PCR amplification of the terminator region of GPD gene. <400> 11 tcatcatacc ccctaccgac atct 24 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Amino acid sequence used in the primer design. <400> 12 Arg Ile Gly Arg Ile Val Leu Arg Asn Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Amino acid sequence used in the primer design. <400>13 Ser Asn Ala Ser Cys Thr Thr Asn Cys Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 673 <212> DNA <213> Lentinus edodes ＜４００＞ １４ ｇｔａｔｃｇｇｃｃｇ ｔａｔｃｇｔａｃｔｃ ａｇａａａｔｇｃｔｔ ｔｇｔ
ｔｇａａｃｃｃ ｔｇａａｇｔｃａａｃ ｇｔｔｇｔｔｇｃａｇ ６０ ｔｃａａｃｇａｇｔｇ ｃｇｔａｇｔｔｔｃａ ｔｃａｔａｃｔａａｇ ｃａｔ
ｃｇｔｃａａａ ｇｇａａｔｔｃａｔｔ ｔｔｃｃａｃａｇｃｃ １２０ ｃｔｔｔｃａｔｔｇｃ ｔｃｔｔｇａｇｔａｃ ａｔｇｇｔｇｃｇｇｇ ｔｔｇ
ｃａｔｃｃｃｃ ａａｔｃｔｇａｔｃｇ ｃａｔｔｔｔｃｇｔａ １８０ ｃｔｇａｇａｇａｔｇ ｔｔｔｔｔａｃｔｇｔ ｇｇｔｇｃｔａｃｃｔ ａｇｇ
ｔｃｔａｃａｔ ｇｔｔｃａａｇｔａｔ ｇａｃｔｃｃｇｔｃｃ ２４０ ａｃｇｇａｃｇｔｔｔ ｃａａａｇｇｃａｃｔ ｇｔｃｇａｇａｃｔａ ａｇｇ
ｇｃｇｇｃａａ ｇｃｔｃａｔｃｇｔｃ ｇａｃｇｇａａａｇｇ ３００ ａａａｔｃｔｃｃｇｔ ｃｔｔｃｇｇｔｇａｇ ａａｇｇａｔｇｃｔｇ ｇｔｇ
ｃｔａｔｔｃｃ ｔｔｇｇａｇｃｔｃｔ ｇｔｃｇｇｔｇｃａｇ ３６０ ａｇｔａｃａｔａｇｔ ｃｇａｇｔｃｔａｃｃ ｇｔｇｃｇｔｃａａｃ ｔｃｔ
ｇａｃｔｔｃａ ｃｔｔｔｃａｔｇａｔ ｃｔｇｇｔａａｔｃａ ４２０ ｃｃｔｇｃｃａｔｔｔ ｔｇｔｔｔｃｔｃｃａ ｔｃｔｃｃｃａｇｇｇ ｔｇｔ
ｃｔｔｃａｃｃ ａｃｇａｔｔｇａａａ ａｇｇｃｃｔｃｔｇｃ ４８０ ｔｃａｃｔｔｇａａｇ ｇｇｔｇｇｔｇｃｃａ ａｇａａａｇｔｃａｔ ｃａｔ
ｃｔｃｔｇｃｔ ｃｃｔｔｃｃｇｃｔｇ ａｔｇｃａｃｃｔａｔ ５４０ ｇｔａｃｇｔｔｔｇｃ ｇｇｔｇｔｃａａｔｃ ｔｃｇａｃｔｃｔｔａ ｔｇａ
ｃｔｃｇｃａａ ｃａｔｇｃｔｇｔｔｇ ｔａａｇｔａｔｇａｃ ６００ ｔｇｇｃｃｃａｃｔｃ ｔｃｔｔｔｃｔｃｇｃ ａａｃｇｔｔｃｔｇａ ｃｃａ
ｔａｔｃｔｔａ ｇａｔｃｔｃｃａａｔ ｇｃｔｔｃｔｔｇｃａ ６６０ ｃｇａｃｇａａｃｔｇ ｃｃｔ
６７３

【００７７】

【配列表フリーテキスト】

【００７８】

【配列番号６】GPD遺伝子の推定アミノ酸配列に基づい
て設計したオリゴヌクレオチド。

【００７９】

【配列番号７】GPD遺伝子の推定アミノ酸配列に基づい
て設計したオリゴヌクレオチド。

【００８０】

【配列番号８】GPD遺伝子のプロモーター領域のPCR増幅
用に設計したオリゴヌクレオチド。

【００８１】

【配列番号９】GPD遺伝子のプロモーター領域のPCR増幅
用に設計したオリゴヌクレオチド。

【００８２】

【配列番号10】GPD遺伝子のターミネーター領域のPCR増
幅用に設計したオリゴヌクレオチド。

【００８３】

【配列番号11】GPD遺伝子のターミネーター領域のPCR増
幅用に設計したオリゴヌクレオチド。

【００８４】

【配列番号12】プライマーの設計に用いたアミノ酸配
列。

【００８５】

【配列番号13】プライマーの設計に用いたアミノ酸配
列。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のプロモーター及びターミネーターなら
びにGPD遺伝子の構造を表わす模式図である。

【図２】本発明の遺伝子発現ベクターpLG-hphの構造を
表わす模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 大川 久美子 岩手県北上市村崎野18−84−１ グランド メゾンＢ208 (72)発明者 江井 仁 岩手県北上市新穀町１丁目６番地27 メル ベイユ北上１−304号 Ｆターム(参考） 2B030 AA05 AD08 CA06 CA17 CA19 CD03 CD07 CD09 CD10 4B024 AA20 BA08 CA03 CA04 DA11 EA04 FA02 FA07 GA14 HA01 4B064 AG01 CA05 CA19 CC24 4B065 AA89X AA89Y AB01 BA03 CA24

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)又は(b)のDNAを含むプロモー
   ター遺伝子。 (a) 配列番号１で表される塩基配列からなるDNA (b）配列番号１で表される塩基配列において少なくとも
   １個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からな
   り、かつプロモーター活性を有するDNA
2. 【請求項２】 請求項１記載の遺伝子とストリンジェン
   トな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性
   を有するDNAを含むプロモーター遺伝子。
3. 【請求項３】 以下の(c)又は(d)のDNAを含むターミネ
   ーター遺伝子。 (c) 配列番号２で表される塩基配列からなるDNA (d) 配列番号２で表される塩基配列において少なくとも
   １個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からな
   り、かつターミネーター活性を有するDNA
4. 【請求項４】 請求項３記載の遺伝子とストリンジェン
   トな条件下でハイブリダイズし、かつターミネーター活
   性を有するDNAを含むターミネーター遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項１若しくは請求項２記載のプロモ
   ーター遺伝子及び／又は請求項３若しくは４記載のター
   ミネーター遺伝子を含有する発現用組換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項５記載の発現用組換えベクターに
   任意のポリペプチドをコードする遺伝子が組み込まれた
   組換えベクター。
7. 【請求項７】 請求項５記載の発現用組換えベクター又
   は請求項６記載の組換えベクターを含む形質転換体。
8. 【請求項８】 請求項７記載の形質転換体を培養又は栽
   培し、得られる培養物又は栽培物からポリペプチドを採
   取することを特徴とする前記ポリペプチドの製造方法。