KR100452853B1

KR100452853B1 - 저온유도성프로모터서열

Info

Publication number: KR100452853B1
Application number: KR1019970705863A
Authority: KR
Inventors: 토시키 미네; 아키오 오오야마; 토오루 히요시; 케이스케 카사오카
Original assignee: 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤
Priority date: 1995-12-27
Filing date: 1996-12-26
Publication date: 2005-01-27
Also published as: EP0812917B1; CA2213991C; EP0812917A4; WO1997024449A1; AU725727B2; KR19980702463A; DE69634875D1; US6084089A; ATE298368T1; ES2243954T3; CN1176661A; CA2213991A1; AU1208597A; DK0812917T3; DE69634875T2; JP3469902B2; CN1137997C; EP0812917A1

Abstract

본 발명은 갑자 과경중에서 저온하에서 유도되나, 괴경이외의 다른 기관 및 상온하에서는 거의 유도되지 않으며, 또 발현이 5개월 이상의 장기간에 걸쳐 지속하는 신규의 저온유도성 프로모터를 개시한다. 본 발명의 프로모터는 서열표의 서열번호 1로 나타내는 염기서열중 제1번째∼제3546번째의 염기로 이루어지는 서열 혹은 저온유도성 프로모터 활성을 가진 그 일부 또는 이들의 서열중 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환되거나 또는 이들의 서열에 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 삽입 혹은 부가된 저온유도성 프로모터 활성을 가진 DNA 서열, 및 서열표의 서열번호 2로 나타내는 염기서열중 제1번째~제4120번째의 염기로 이루어지는 서열 혹은 저온유도성 프로모터 활성을 가진 그 일부 또는 이들의 서열중 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환되거나 이들의 서열에 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 삽입 혹은 부가된 저온유도성 프로모터 활성을 가진 DNA 서열이다.

Description

저온유도성 프로모터 서열

많은 작물은 수확후 저온등의 처리에 의해 품질을 장시간 유지시키는 것이 필수이다. 그러나 감자괴경에서는 저온저장중에 저온당화(Low Temperature Sweetening)라 부르는 환원당 축적이 일어나, 그때 생성된 환원당이 프렌치프라이, 포테이토 칩등의 가공제품 제조시에 중색반응(메이라드 반응)을 일으켜 상품가치를 현저히 저하시키는 것이 널리 알려져 있다. 또 과실등에서는 에틸렌 생성에 의한 연화등이 알려져 있으며 이들의 문제점을 해결하기 위한 연구, 즉 수확후 생리(post-harvest physiology)는 현재 세계중에서 널리 행하여지고 있는 연구분야의 하나이다.

감자괴경에서 외래 유전자를 특이적으로 발현시킬 때는 저장 단백질인 파타틴 유전자의 프로모터가 세계적으로 널리 사용되어 왔다(EMBO J. 8(1) : 23-29, 1989, Plant Mol. Biol. 12: 41-50, 1989, Bio/Technology 12: 1101-1105, 1994등).

파타틴 유전자의 발현은 괴경의 생육 비대에 따라 증대하지만 괴경의 비대시에는 동시에 환원당에서 전분으로의 전환을 위시한 여러 가지의 대사계가 활성화 되어 있는 시기이기도 하다. 그 때문에 파타틴 프로모터에 연결되는 유전자의 종류에 따라서 대사계의 교란, 더 나아가서는 수량(收量)감소 등으로 이어질 염려가 있다. 이와 같은 문제를 피하고 저장시의 품질을 효율적으로 유지하기 위하여는 통상적인 조건하의 식물체 중에서는 발현량이 적고 저온저장 중의 괴경에서만 효율적인 발현을 가능하게 하는 프로모터를 분리, 이용하는 것이 필요하다고 생각된다.

저온유도성 유전자는 원핵, 진핵생물에 관계없이 수많은 종류가 분리되어 보고되어 있다(총설로서, 조직배양 19(10) : 357∼361, 1993 등이 있다). 또, 감자 괴경으로부터 분리예가 있다(Plant Physiol 104: 445∼452, 1994).

같은 솔라늄(Solanum)속 식물에서는 오스모틴 유사 유전자가 분리되어, 이것이 저온에서 유도되는 것이 보고되어 있다(Plant Mol. Biol. 21 : 729~735, 1993). 감자 괴경에서의 분리예는 상기의 보고 1건 뿐이다.

감자 괴경으로부터의 저온유도성 유전자(cDNA)는 5종류가 분리되어 있으며(Plant Physiol. 104 : 445~452, 1994). 그중 2종은 타종식물의 저분자 열충격 단백질(small heat-shock protein) 혹은 타종식물 저온 유도 단백질, ABA 유도 단백질등의 유전자와 유사성이 발견되어 있다. 다른 3종에 대하여는 분석되어 있지 않다.

이들 cDNA의 핵유전자(프로모터를 포함)는 보고되어 있지 않다. 이들은 어느것이나 저온에 대한 반응이 빠른 (1주간 이내에 반응한다) 유전자라 생각된다.

상기 기존의 공지된 유전자의 프로모터를 저온저장할 필요가 있는 작물(감자 등)에 응용하는 것은 물론 가능하다. 그러나 이들 프로모터(Plant Physiol. 104 : 445~452, 1994 등)가 목적으로 하는 기관(器官)에만 고발현을 유도하는지는 명확하지 않다(저온시에 다른 기관에서도 유도될 가능성이 있다). 또, 상온하에서도 어느 정도 발현할 가능성이 있다. 즉, 이들 기존의 공지된 유전자 프로모터가 저온조건하의 감자 괴경등 저장을 목적으로 하는 기관에서만 효율적인 유전자 발현을 할 수 있는지는 명확하지 않다. 또 감자 괴경의 저장기간은 수개월 간의 장기간이기 때문에 그동안 상기 프로모터가 기능하는지의 여부는 불분명하다(Plant Physiol. 104 : 445~452, 1994). 이 문헌에서는 1개월 정도밖에 조사하지 않았다.

발명의 개시

본 발명의 목적은 감자 괴경 중에서 저온하에서 유전자 발현이 유도되나, 괴경 이외의 다른 기관 및 상온하에서는 거의 유도되지 않으며, 또 발현이 5개월 이상의 장기간에 걸쳐 지속하는 신규의 저온유도성 프로모터를 제공하는 것이다.

또, 본 발명은 감자 혹은 다른 식물중에 존재하는 새로운 저온유도성 프로모터를 발견하기 위한 프로우브로서 유용한 DNA단편(斷片)을 제공하는 것도 목적으로 한다.

본 발명자들은 예의 연구의 결과, 감자 괴경 중에서 저온하에서 유전자 발현이 유도되지만, 괴경이외의 다른 기관 기관 및 상온하에서는 거의 유도되지 않으며, 또 발현이 5개월 이상의 장기간에 걸쳐 지속하는 신규의 저온유도성 프로모터서열을 발견하고, 또 그 염기 서열을 결정하는 것에 성공하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 서열표의 서열번호 1로 나타내는 염기 서열 중 제1번째~제3546번째의 염기로 이루어지는 서열 또는 저온유도성 프로모터 활성을 가진 그 일부 또는 이들의 서열중 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실(缺失), 치환되거나 또는 이들의 서열에 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 삽입 혹은 부가된 저온유도성 프로모터 활성을 가진 DNA 서열을 제공한다.

또 본 발명은 서열표의 서열번호 2로 나타내는 서열중 제1번째∼제4120번째의 염기로 이루어지는 서열 혹은 저온유도성 프로모터 활성을 가진 그 일부 또는 이들의 서열중 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환되거나 또는 이들의 서열에 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 삽입 혹은 부가된 저온유도성 프로모터 활성을 가진 DNA 서열을 제공한다.

본 발명에 의해 감자 괴경에서 저온하에서 유전자 발현이 유도되나, 괴경이외의 다른 기관 및 상온하에서는 거의 유도되지 않으며, 또 발현이 5개월 이상의 장기간에 걸쳐 지속하는 신규의 저온유도성 프로모터 서열이 제공되었다. 본 발명의 프로모터 서열을 이용하므로써, 저온 저장중의 감자 괴경 중의 환원당량의 억제, 감자 괴경의 발아 억제 및 식물에의 저온내성의 부여 등이 가능하게 되었다.

본 발명은 저온에서 유전자 발현을 유도하는 성질을 가진 프로모터 서열에 관한 것이다. 본 발명의 저온유도성 프로모터 서열은 저온저장중의 감지(바레이쇼) 괴경중의 환원당량의 억제, 감자괴경의 발아 억제 및 식물에의 저온내성(低溫耐性)의 부여등에 유용하다.

제1도는 LCIP2-10 프로모터 도입을 위한 구조체(construct) 제작 순서를 나타낸 설명도이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 저온유도성 프로모터 서열은 서열표의 서열번호 1로 나타내는 염기서열중 제1번째∼제3546번째의 염기로 이루어지는 서열, 또는 서열번호 2로 나타내는 염기서열 중 제1번째~제4120번째의 염기로 이루어지는 서열중에 포함된다. 이들의 서열은 그 전체에서도 저온유도성 프로모터 활성을 발휘하지만 이들의 서열중의 일부라도 저온유도성 프로모터 활성을 발휘하는 것, 예를들면, 서열표의 서열번호 1에 나타내는 염기서열중 제2418번째~제3541번째의 염기로 이루어지는 서열 등은 본 발명의 범위에 포함된다. 또 이 서열번호 1의 서열중의 제2418번째∼제3541번째의 염기로 이루어지는 서열을 포함하는 서열로서 저온유도성 프로모터 활성을 가지는 것도 본 발명의 범위에 포함되는 것이다.

또, 서열표의 서열번호 1의 제3547번째∼제3549번째 또는 서열번호 2의 제4121번째∼4123번째의 『ATG』는 번역개시 코돈이다. 또, 서열번호 1로 나타내는 서열의 제3503번째 이후의 mRNA(cDNA) 서열이, 이것이 암호하는 추정 아미노산 서열과 함께 서열번호 3에 나타나 있다.

본 명세서에서 『저온유도성』이란, 프로모터에 의한 유전자의 발현이 6℃이하의 온도에서 유도되며, 또 온도를 6℃이하로 유지하면 그 발현이 5개월 이상 유지되는 것을 의미한다.

일반적으로 생리활성을 가진 DNA 염기서열이 조금 변경될 경우, 즉 염기 서열 중의 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 치환 혹은 결실하거나 또는 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 부가 혹은 삽입된 경우라도 그 DNA의 생리활성이 유지되는경우가 있다는 것은 주지의 사실이다. 따라서 상기한 본 발명의 저온유도성 프로모터 서열에 이와 같이 수식(修飾)이 가하여지며, 또 저온유도성-프로모터 활성을 가진 DNA 서열도 본 발명의 범위내에 포함된다. 즉 서열표의 서열번호 1로 나타내는 염기서열중, 제1번째~제3546번째의 염기로 이루어지는 서열 혹은 저온유도성 프로모터 활성을 가진 그 일부뿐 아니라, 이들의 서열중 소수의 뉴클레오티드가 결실, 치환되거나 또는 이들의 서열에 소수의 뉴클레오티드가 삽입 혹은 부가된 저온유도성 프로모터 활성을 가진 DNA 서열도 본 발명의 범위에 포함된다. 또 이 서열의 일부인 제 2417번째∼제3541번째의 염기로 이루어지는 서열 혹은 저온유도성 프로모터 활성을 가진 그 일부뿐 아니라, 이들의 서열중 소수의 뉴클레오티드가 결실, 치환되거나 또는 이들의 서열에 소수의 뉴클레오티드가 삽입 혹은 부가된 저온유도성 프로모터 활성을 가진 DNA 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.

마찬가지로, 서열표의 서열번호 2로 나타내는 염기서열중, 제1번째∼제4120번째의 염기로 이루어지는 서열 혹은 저온유도성 프로모터 활성을 가진 그 일부뿐 아니라, 이들의 서열중 소수의 뉴클레오티드가 결실, 치환되거나 또는 이들의 서열에 소수의 뉴클레오티드가 삽입 혹은 부가된 저온유도성 프로모터 활성을 가진 DNA 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.

뉴클레오티드의 부가, 삽입, 결실 또는 치환은, 예를 들면, 주지기술인 부위특이적 변이유발(예를 들면 Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20, p6487∼6500, 1982)에 의해 실시할 수가 있으며, 본 명세서에서 『하나 또는 복수의 뉴클레오티드』란 부위특이적 변이유발법에 의해 부가, 삽입, 결실 또는 치환할수 있는 정도의 수의 뉴클레오티드를 의미한다.

부위특이적 변이유발은 예를 들면 소망으 변위인 특정의 불일치 부위 이외에는 변이를 받아야할 한가닥의 파지 DNA에 상보적인 합성 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 다음과 같이 할 수 있다. 즉 파라이머로서 상기 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 파지에 상보적인 체인을 합성시켜, 얻어진 2중체인 DNA로 파지 담지성 숙주세균을 형질전환한다. 형질전환된 세균의 배양물을 한천에 플레이트하여 파지를 함유하는 단일세포에서 반점을 형성시킨다. 그렇게 하면 이론적으로는 50%의 새로운 콜로니가 단일 가닥으로서 변이를 가진 파지를 함유하며, 나머지 50%가 본래의 서열을 가진다. 얻어진 반점을, 상기 소망의 변이를 갖는 DNA와 완전히 일치하는 것과는 하이브리드를 형성하지만, 본래의 체인을 가진 불일치되는 것과는 하이브리드를 형성하지 않는 온도에서, 키나제처리된 합성 프로우브와 하이브리드 형성시킨다. 다음에 그 프로우브와 하이브리드를 형성하는 반점을 골라내어 배양하고, DNA를 회수한다.

또 프로모터 서열에 저온유도성 프로모터 활성을 상실케하지 않는 하나 또는 복수의 뉴클레오티드를 치환, 결실, 부가 또는 삽입하는 방법으로서는 상기의 부위특이적 변이유발 외에도 유전자를 변이원(變異原)으로 처리하는 방법 및 유전자를 선택적으로 개열(開熱)한 다음에 선택된 뉴클레오티드를 제거, 부가 또는 치환하여 연결하는 방법도 있다.

하기 실시예에서 상세히 기술하는 것과 같이 서열번호 1 및 2에 나타내는 염가서열은 다음과 같은 과정을 밟아 결정된 것이다.

(1) 장기간 4℃에서 보존한 괴경 유래의 cDNA 라이브러리를 제작하여 생육중인 다양한 감자조긱(잎, 줄기, 뿌리, 가골, 생육중의 괴경)의 mRNA와는 하이브리드화 하지 않고(엄밀하지는 않다), 저온 저장중의 괴경 mRNA와 하이브리드화 하는 cDNA 클론(clone)을 분리하여 염기서열을 결정 및 해석하였다.

(2) 상기(1)에서 사용한 RNA를 사용하여 노던 분석을 하여 통상의 조건하에서 생육중의 감자 식물체에서는 거의 발현이 확인되지 않는 것을 재차 확인하였다.

(3) 수확후의 괴경을 여러 온도(3, 6, 9, 12, 15, 20℃)에서 장기간(5∼6개월정도) 저장하여, 이들 괴경에서 추출한 RNA를 사용하여 저온에서 유도되는지, 어느 온도 이하로 하면 유도되는지 어느정도의 기간에 발현되는지, 저온에서 상온으로 되돌리므로써 발현이 해제되는지 등을 노던법에 의해 체크하였다. 그 결과, 6℃ 이하의 저온에서 유도되며, 발현은 장기간(적어도 5~6개월) 지속하며, 저온에서 상온으로 되돌리므로써 발현이 해제되는 것 등을 확인하였다.

(4) 저온하에서 괴경이외의 조직에서도 발현이 유도되는지의 여부를 감자 시험관내 식물체를 사용하여 체크하였다. 그 결과, 유도는 괴경 이외에서도 일어날 가능성이 있으나 거의 문제가 되지 않는 수준이라 생각되었다(저온 처리 괴경에 비하여 현저히 변화가 적다).

(5) 서던 분석에 의해 단일 복사체 유전자인 것을 확인하였다. 또, 벼, 옥수수, 담배 등에서는 밴드가 검출되지 않으며, 다른 식물로서는 토마토에서 검출되었다.

(6) 게놈클론을 2종 분리하였다. 하나는 개시 ATG 전후의 서열이 cDNA 서열과 완전히 일치한다. 또 하나는 완전히 일치하지는 않으나 높은 상동성(相同性)을 가지며, 같은 기능을 가진 다른 좌위(locus)의 유전자를 암호하는 것이라 생각되었다. 역전사 PCR에 의해 해석한 결과, 2종의 유전자의 발현 패턴은 거의 같다고 생각되었다.

(7) 게놈클론의 ATG 상류영역의 염기서열 해석의 결과, 저온유도싱 단백질에서 잘 나타나는 ABA유도(반응) 모티브는 발견되지 않았으며, GA반응 모티브가 어느 클론에서나 나타났다. 분리한 2종의 게놈클론은 ATG 상류 약 500bp 까지에서는 서로 높은 상동성(80.3%)을 가지고 있으나, 그 다음부터의 상류에서는 높은 상동성을 나타내는 영역을 발견하지 못하였다.

(8) 분리한 게놈클론 2종중 1종의 프로모터 서열의 일부를 루시퍼라제 유전자(Science 234 : 856~859, 1986)를 리포터로 하여 감자에 도입하였다.

얻어진 형질전환체에서 만들어낸 마이크로 튜버의 저온저장 시험을 하여 프로모터의 저온유도성을 확인하였다. 또 형질전환체의 잎에 있어서도 조금이지만 저온유도성이 발견되었다.

본 발명의 프로모터 서열은 (1)∼(8)의 과정으로 이루어지는 하기 실시예에서 상술한 방법에 의해 얻을 수가 있다. 또 본 발명에 의해 그 프로모터 서열의 염기서열이 명확하게 되었으므로, 그 프로모터 서열을 포함하는 DNA는 감자의 게놈을 주형(鑄型)으로 하는 PCR법 등에 의해 용이하게 얻을 수가 있다.

서열번호 1 내지 2에 기재되어 있는 서열은 공지의 감자 괴경 유래의 저온 유도성 유전자와는 상동성이 없다. 따라서 본 발명의 프로모터 서열은 공지의 것과는 다른 타입의 신규의 프로모터 서열이라고 생각된다.

또 본 발명의 저온유도성 프로모터 서열은 상온(20℃)에서 생육중의 잎, 뿌리, 줄기, 괴경에서는 유전자 발현이 대단히 약하다. 수확한 괴경을 저온(6℃이하)에 놓아두므로써 발현이 유도된다. 저온처리에 의해 괴경이외의 기관(잎, 줄기, 뿌리)에서도 유도되지만, 조금이다. 다만 저온저장한 괴경으로 부터의 발아는 제법 유도된다. 한편, 이전의 보고(Plant Physiol. 104 : 445~452, 1994)에서는 괴경이외의 기관에 대한 발현까지는 언급되어 있지 않다. 본 발명의 유전자는 엄밀한 의미에서의 저온저장 괴경 특이적 유전자라고는 할 수 없지만 그것에 가까운 것이라 생각되어 수확후의 품질 유지등에 효과적인 유전자(프로모터)라 할 수 있다.

본 발명의 저온유도성 프로모터 서열은 저온에서 유전자 발현이 유도되고 상온으로 되돌리면 발현이 해제된다. 문헌(Plant Physiol 104 : 445∼452, 1994)의 분류에 의하면 본 유전자는 저온에 대한 반응이 느린 그룹에 속하는 것이라 생각된다(저온처리 1주간 정도에서는 발현이 플레이트에 나타나지 않는다. Van Berkel 등(Plant Physiol. 104 : 445∼452, 1994)은 이 그룹에 속하는 유전자의 분리에는 성공하지 못했다). 따라서, 온도에 의한 발현제어가 가능하다.

본 발명의 저온유도성 프로모터 서열은 저온저장시에 장기간 발현을 유도(적어도 5개월) 한다. 한편, 기존의 보고(Plant Physiol. 104 : 445∼452, 1994)의 유전자에서는 확인되어 있지 않다. 본 발명의 프로모터 서열을 사용하므로써 장기간의 유전자 제어가 가능하게 된다.

다른 식물인 벼, 옥수수, 담배에서는 본 발명의 유전자와 상동성이 높은 유전자는 볼 수 없었다. 토마토에는 존재한다. 따라서 벼, 옥수수, 담배 등에의 유전자 도입에 본 발명의 프로모터를 사용하므로써, 유전자 사이렌싱(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 : 1770~1774, 1991)이 적은 유전자 발현을 행할 수 있는 가능성이 있다.

이상의 내용으로부터 본 발명의 저온유도성 프로모터 서열은 하기의 용도에 사용하는 것이 가능하다.

(ⅰ) 감자 저온저장 괴경중의 환원당량의 제어(환원당량의 억제)

본 발명의 프로모터 서열의 하류에, 예를 들면 산성 인베르타제 억제제(Ovalle et al., Plant Science 108(1995) 133∼141) 유전자, 액포형 산성 인베르타제(EMBL Data Library accession number X76946) 안티센스유전자, PFK(EC 2. 7. 1. 11, 국제공개번호 : WO 95/05457) 유전자, 전분 포스포릴라제(Brisson et al., Plant Cell 1 (1989) 559∼566 : Mori et al., J. Biochem. 266 (1991) 18446~18453, Sonwald et al., Plant Mol. Biol. 27 (1995) 567∼576) 안티센스 유전자, β- 혹은 α-아밀라제(Kreiberg and Gaushing, 12th Triennial Conerence of the European Association for Potato Research, Abstracts (1993) 334~335) 안티센스 유전자, ADP 글루코스 피로포스포릴라제(Stark et al., Science 258 (1992) 287∼292) 유전자등을 연결하므로써 감자 괴경을 저온 저장한 경우의 괴경중의 환원당량을 억제할 수가 있다. 이것에 의해 프렌치프라이나 포테이토프라이로 가공할 때의 착색을 방지할 수 있다.

(ⅱ) 감자 괴경의 발아억제

본 발명의 프로모터는 저온에서 발현을 유도하고, 상온으로 되돌리면 발현을 중단하는 성질을 갖는다. 따라서 효모 인베르타제 유전자(Sonnewald et al. Plant J. 1 (1991) 95∼100). 대장균 무기 피로포스파타제 유전자(Sonnewald, Plant J. 2 (1992) 571∼581 : Jelitto et al. Planta 188 (1992) 238~244), 엔트-코렌 합성효소(ent-kaurene synthetase) (자베렐린 생합성계 유전자, Sun et al. Plant Cell 4 (1992) 119∼128) 안티센스 유전자등을 연결하여 감자, 양파등의 식물에 도입하므로써 저온하에서 유전자 발현(발아하지 않는다), 상온하에서 발현 해제(발아한다) 등의 생육억제를 행하는 것이 가능하다.

(ⅲ) 식물에의 저온내성의 부여

저온하에서, 예를들면 글리세롤-3-인산 아실트랜스퍼라제 (Murata et al. Nature 356 (1992) 710∼718) 유전자, Flaveria brownii 유래의 피루베이트, 오르소포스페이트 디키나제 (PPDK, Usami et al. Plant Mol. Biol. 27 (1995) 969-980) 유전자 등의 발현에 의해 식물에 저온내성을 부여하는 것이 가능하다.

다음에 본 발명의 다른 측면인 저온유도성 프로모터 검색용 프로우브에 대하여 설명한다.

본 발명의 프로우브는 서열표의 서열번호 3의 서열중 제45번째∼제839번째의 염기서열중, 혹은 그것들에 상보적인 염기서열중의 적어도 연속하는 15염기의 서열을 갖는 DNA 단편으로 이루어진 것이다. 상술한 서열번호 3중의 제45번째∼제839번째 까지의 서열 혹은 이 서열과 상동성이 높은 서열은 저온유도성 프로모터 서열의 하류에 존재할 가능성이 높다. 따라서, 이 서열 혹은 그 일부의 서열을 프로우브로서 사용하여 식물 게놈 DNA를 검색하므로써 감자 혹은 다른 식물중에 존재하는 새로운 저온유도성 프로모터를 발견하는 것이 가능하게 된다.

프로우브는 상기 서열에 의거하여 설계되는 것이며, 그 길이는 적어도 연속하는 15염기 이상인 것이 바람직하며, 15염기 이상이면 상기 서열의 전체길이까지의 어느 길이라도 된다. 프로우브는 단일가닥이나 이중가닥이라도 되지만 적어도 사용할 때에는 단일가닥으로 된다. 또 상술한 서열에서 선정된 DNA 단편 프로우부를 상기 서열 혹은 이것과 상동성이 높은 서열에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈 하는 성질을 잃어버리지 않도록 부가, 결실, 삽입 혹은 치환한 서열도 본 발명에 포함된다. 이 염기 서열의 부가, 결실, 삽입 혹은 치환의 방법은 상술한 본 발명의 저온유도성 프로모터에서 사용하는 방법과 같은 방법으로 행하는 것이 가능하다.

본 발명의 프로우브는 후술하는 실시예에서 상술하는 방법에 의해 얻어지는 서열표의 서열번호 3에 기재된 DNA 단편을 적당한 제한효소에 의하여 절단하므로써 조제할 수 있다. 또 이 서열을 포함하는 시료를 사용하여 PCR 반응을 행함으로써 조제하는 것도 가능하다. 혹은 시판의 DNA 합성기(예를들면, 파킨엘머사제)를 이용하여 관용된 방법에 의하여 프로우브가 되는 단일가닥 DNA를 합성하는 것도 가능하다.

본 발명의 프로우브는 관용된 방법에 의해, 예를들면 방사선 동위원소, 검출가능한 효소등에 의해 표지할 수 있다. 예를 들면³²P를 사용하는 경우, 일반적으로서열표 3에 기재된 DNA 단편을 사용하는 경우에는 랜덤 프라이딩 라벨에 의해 표지하며, 합성 프라이머를 사용하는 경우에는 인산화효소에 의해 5' 말단표지를 하면 편리하다.

본 발명의 프로우브를 사용할 때의 하이브리다이제이션은 관용된 방법에 의해 행할 수가 있다. 일반적으로는 중간 정도의 하이브리다이제이션 강도(42℃∼50℃에서 하이브리다이제이션을 행하여 0.1×SSC로 세정)에 의하여 행한다.

본 발명의 프로우브를 대상식물의 게놈 라이브러리에 대하여 사용하여, 하이브리다이제이션이 검출된 경우에는 이 유전자상의 상류영역을 특정하므로써 새로운 저온유도성 프로모터를 얻을 수가 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

디프렌셜(differential) 스크리닝 (상기(1)의 과정)

7개월간 4℃에서 저장한 감자 괴경(품종 토요시로)에서 전체 RNA를 SDS/페놀법에 의해 추출하여 Dynabeads(Dynal사)에 의해 polyA RNA를 정제하였다. 이것을 재료로 하여 cDNA를 합성하여 λgt10벡터에 연결하여 라이브러리를 제작하였다(Amersham λgt10 cloning Kit, Amersham Japan). 라이브러리의 제작에 사용한 polyA-RNA 및 비대한 괴경에서 추출한 polyA-RNA를³²P에 의해 표지하고 디퍼렌셜 스크리닝을 하였다.

하이브리다이제이션, 세정 등은 문헌(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 1991~1995, 1984)의 방법에 따라 행하고, 상기 2종의 프로우브에 의해 얻어진 오토라디오 그래프를 비교하였다. 저장중에 시그널이 증대한다고 생각되는 cDNA 클론을 이쑤시개로 플레이팅하여 이식한 후 다시 하이브리다이제이션을 하였다. 얻어진 오토라디오그래프의 시그널을 덴시토미터(densitometer)에 의해 시그널의 증대가 현저한 것을 먼저 선발하고, 또, 괴경이외의 기관(잎, 줄기, 뿌리, 가골)의 mRNA와 강하게 하이브리다이즈하지 않은 클론(CIP353)을 분리하였다.

실시예 2

여러 가지의 감자조직(품종 토요시로의 괴경, 잎, 줄기, 뿌리 및 품종 케네벡의 배양세포)에서 총 RNA를 SDS-페놀법으로 추출하여 글리옥살겔 전기영동(Molecular Cloning : A Laboratory Manual/ Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)에 의해 분리후 (3 ㎍/1ane), Gene-Screen Plus 막(Du Pont사)에 전사하였다. 프로우브로서는 멀티프라임표지 (Molecular cloning : A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)한 cDNA (CIP353)의 EcoRI 단편 (완전길이)을 사용하였다. 막에의 전사, 하이브리다이제이션, 세정등은 Gene-Screen막에 첨부된 매뉴얼(Du Pont사)대로 하였다. 결과를 표 1에서 표 3에 정리한다.

표에서 명확한 바와 같이, 통상 육성중의 감자의 괴경, 잎, 줄기, 뿌리 및 배양세포에서는 상기 프로우브는 거의 하이브리다이즈 하지 않았다.

또, 여러 가지의 온도에서 5∼6개월간 저장한 감자 괴경에 있어서 6℃이하에서 저장한 것에 대하여는 명확한 하이브리다이제이션이 확인되었으나, 9℃ 이상에서 저장한 것에 대하여는 거의 확인할 수 없었다.

실시예 3

조직특성의 확인(상기 (4)의 과정)

Linsmaier and Skoog (Physiol. Plant, 18:100∼127, 1965)의 한천배지상에서 20℃, 3000Lux, 낮에 16시간 3~4주간 배양한 무균슈트를 재료로 사용하였다.

이것을 3℃ 혹은 20℃하에서 16시간동안 낮에 3000Lux로 4주간 배양하고, 배양 후 0, 2, 4주간후에 샘플링(잎, 줄기, 뿌리로 나눈다)하여 RNA를 추출하였다. 노던분석은 상기와 같이 하였다. 결과를 표 4 및 표 5에 정리한다.

표에서 명확한 바와 같이, 3℃로 보존한 잎, 줄기 및 뿌리에서는 하이브리다이제이션이 조금 확인되지만 동일 온도에서 보존한 괴경에 비하면 휠씬 적었다.

실시예 4

서던 블롯 분석 (상기 (5)의 과정)

DNA는 감자 품종 토요시로, 토마토 품종 하우스오도리코, 담배품종 F104, 옥수수품종 A188, 벼 품종 아사노히까리 등의 미숙한 잎에서 핫페놀법에 의해 조제하였다. 각 품종에서 추출한 DNA(10㎍)는 제한효소 Eco Ri 혹은 Hind Ⅲ으로 소화(감자 게놈 중의 복사체수 검정에 있어서는 이외에 BamHI, Bal Ⅱ, EcoR V, Xba I을 사용하였다. 제한효소는 모두 Takara사의 것을 사용)하고, 아가로스겔 전기연동을 행하여 Hybond N-막(Amersham Japna)에 전사하였다(Molecular cloning: A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). 멀티프라임 표지(Molecular cloning: A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)한 cDNA(CIP353)의 EcoRI 단편 (완전길이)을 프로우브로하여 실시예 1과 같이 하이브리다이제이션을 하였다.

그 결과 유전자는 싱글복사체 유전자인 것이 확인되었다. 또 벼, 옥수수, 담배에서는 밴드가 검출되지 않았고, 토마토에서는 검출되었다.

실시예 5

게놈클론의 분리(상기 (6)의 과정)

감자품종 토요시로의 미숙한 잎에서 DNA를 핫페놀법에 의해 추출하고, 100㎍의 DNA를 0.0078 혹은 0.0156 unit의 제한효소 Sau 31 (Takara사)로 1시간 부분소화하였다(반응 buffer는 buffer는 Takara사 첨부의 것을 사용). 반응은 최종농도 40mM의 EDTA로 정지시켜 페놀/클로로포름추출, 에탄올 침전후 150㎕의 TE에 소화한 DNA를 용해시켰다. DNA는 65℃에서 10분간 처리후 10∼40% 자당밀도구배(20mM Tris, pH8.0, 1mM EDTA, 200mM NaCl로 이루어지는 buffer에 최종농도 40, 32.5, 25, 17.5, 10%의 자당을 용해한 것을 순차적으로 쌓아서 제작)에 겹겹으로 층을 이루었다.

Hitachi SRP 28SA 로터를 사용하여 20,000rpm. 20℃에서 17시간이상 원심분리 후 0.5㎖씩 분획하여 0.5% 아가로스겔로 분석하였다.

15Kb 이상의 단편을 포함하는 분획은 하나로 합친후, 에탄올 침전에 따라 농축하여, 그중 0.4㎍를 λDASHII/BamHI(Stratagene 사) 1㎍과 리게이션시켜 GigapackII Gold(Stratagene 사)를 사용하여 패키징 하였다.

리게이션, 패키징 반응은 Stratagene사 첨부의 프로토콜 대로 하였다.

약 80만 클론을 멀티프라임 표지(Molecular cloning: A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)한 cDNA (CIP353) EcoRI 단편을 프로우브로하여 실시예 1과 같이 스크리닝하여 2개의 양성 클론을 얻었다 (LCIP 2-10 및 LCIP 1-2). 파지에서의 DNA추출, 플라스미드 벡터에의 서브클로닝은 문헌(Molecular cloning: A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Habor Laboratory, 1989)에 기재된 대로 하였다.

실시예 6

역전사 PCR분석(상기 (6)의 과정)

2종류의 게놈클론의 DNA 서열해석의 결과, ATG 상류 비번역영역중에 수개의 염기가 다른 것이 발견되었다. 그래서 이 영역의 서열을 포함하는 합성 올리고 뉴클레오티드 12S (5'-GAAAAAGGAAATAAAAA-3', LCIP1-2 유래의 mRNA에 특이적임, Tm=43℃) 및 210S(5'-GAAAAAATTAAGAGTAAC-3', LCIP2-10 유래의 mRNA에 특이적임, Tm=45℃)를 제작, cDNA의 내부서열에 유래하는 3'측의 안티센스체인 프라이머-, 325aR(2종의 mRNA에 공통으로 사용, 5'-ATCACTAGCAACGGGCAT-3', Tm=54℃)과 함께 역전사 PCR을 행하였다.

역전사 PCR의 재료로서는 감자 품종 토요시로의 각 조직 유래의 총 RNA 10㎍을 사용하여, oligo-dT 500ng과 혼합후(물을 가하여 전량 55㎕로 한다), 70℃에서 10분간 처리하였다. 여기에 반응액(5xlst. strand buffer (BRL 사) 20㎕, 10mM dNTPs 5㎕, 100mM DTT 10㎕, RNase inhibitor(Pharmscia 사) 5㎕, Superscript RTase (BRL 사) 5㎕)을 혼합(총량 100㎕), 37℃에서 1시간 반응후, 95℃, 5분간 열처리하여 역전사 PCR의 주형 단일가닥 cDNA로 하였다(이 용액중의 cDNA 농도는 100ng/㎕로 가정).

합성된 cDNA 1-100ng를 주형으로 하여 PCR 반응(cDNA 1-100ng, Primer 10pmolx2, 2.5mM dNTPs 1.5㎕, 10xPCR buffer(Takara 사) 2㎕, rTaq(Takara 사) 0.2㎕, 총량 20㎕)을 행하였다. 상기 12S 및 325aR 프라이머를 사용할 때의 반응조건은 94℃ 30초, 45℃ 30초, 72℃ 60초, 30 사이클로 하고, 210S 및 325aR 프라이머를 사용할 때에는 94℃ 30초, 47℃ 30초, 72℃ 60초, 30 사이클로 하였다. PCR 산물은 아가로스겔 전기영동에 의하여 분석하였다. 결과를 표 6에 정리한다. 표중의 LCIP 2-10은 후술하는 서열표의 서열번호 1에 기재된 서열에 대응하며, LCIP 1-2는 서열번호 2에 대응한다. 표에서 명확한 바와 같이, 어느 게놈클론 유래의 mRNA에 있어서도, 저온장시간 저장한 괴경에서만 현저한 발현이 확인되었다. 이것으로 서열번호 1 및 2의 양서열 모두 저온유도성 프로모터 활성을 가지는 것을 알 수 있다.

실시예 7

DNA 염기서열의 결정, 해석(상기 (1), (7)의 과정)

서열 반응, 서열의 결정은 플라스미드 DNA를 주형으로 한 디데옥시법(ABI사, Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit) 및 DNA 시퀀서(ABI 사, 373A)에 의하여 행하였다. 서열의 해석은 GENETYX (소프트웨어 개발주식회사) 소프트를 통하여 행하였다.

그 결과 상기 두 개의 게놈클론 중의 하나에서 서열번호 1에 나타내는 서열이, 또 다른쪽의 클론에서는 서열번호 2에 나타내는 서열이 얻어졌다.

실시예 8

형질전환용 벡터의 제작 및 형질전환법애 의한 프로모터의 저온유도성의 확인(상기(8)의 과정)

게놈클론 LCIP 2-10을 제한효소 Asp 718(베링거 사)로 소화하여, 개시 ATG 상류영역 200bp를 포함하는 Asp 718 단편을 pUC19 플라스미드에 도입하여 재조립된 플라스미드 p210A8을 얻었다. 다음에 이 플라스미드(p210A8)를 주형으로 하여 M13 프라이머 RV(Takara 사) 및 210A 프라이머(5'-GTTACTCTTAATTTTTTC-3')를 사용하여 PCR(94℃ 20초, 55℃ 30초, 72℃ 60초, 25사이클)을 행하였다. 증폭부산물을 TA 클로닝벡터(Invitrogen 사)에 서브클론닝하여, 개시 ATG 상류 약 200bp 영역만 포함하는 벡터 p210Pro(200)를 제작하였다. 이 플라스미드에서 제한효소HindIII, XhoI(Takara 사) 소화에 의해 개시 ATG 상류영역 약 200bp를 포함하는 단편을 분리하여, pHSG399(Takara 사)의 HindIII, SalI 사이트에 삽입, 플라스미드pHSG210(200)을 얻었다. 이 플라스미드를 HindIII, BamHI (Takara 사) 소화하여 분리된 ATG 상류영역 200bp 단편을, pBI101벡터(clontech 사)의 베타글루크로니다제 유전자를 BamHI, SacI 사이트를 이용하여 루시퍼라제 유전자(Science234 : 856∼859, 1986)에 치환한 벡터(pLUC 101)의 5' 상류영역에 HindIII, BamHI 사이트를 이용하여 삽입, pLUC210(200)을 얻었다. 한편, 게놈클론 LCIP 2-10 유래의 개시 ATG 상류영역 약 1000bp를 포함하는 XbaI(Takara 사) 소화단편을 도입한 pUC18 벡터(p210X1)를 제작하여, 이 벡터로부터 제한효소 Asp718소화에 의해 분리한 800bp 단편 (ATG 상류 약 200∼-1000bp의 영역)을 pLUC210(200)의 Asp 718 사이트에 삽입하여 약 1kb의 프로모터 영역과 루시퍼라제 유전자를 연결한 형절전환용 벡터 pLUC210(1000)을 제작하였다. 형질전환용 벡터(pLUC101 및 pLUC210(1000))는 3계교잡법(三系交雜法)(식물유전자조작매뉴얼, 코오단 사, 1990)에 의해 세균 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 도입하여, 식물의 형질전환에 사용하였다.

감자의 형질전환은 문헌(특개평 6-133783호)에 준하여 행하였다. 재료로서 Linsmaier와 Skoog(Physiol. Plant. 18 : 100∼127, 1965)의 한천배지에서 무균증식한 품종 토요시로의 잎 및 줄기를 공시(供試)하였다. 이들의 조직을, 적당한 크기로 절단하여, Agrobacterium 균액중에서 2일간 공존배양후, 인돌초산 0.1mg/ℓ, 제아틴리보시드 1.0mg/ℓ, 카나마이신 100mg/ℓ, 세포탁심 250mg/ℓ를 함유하는 Linsmaier와 Skoog(Physiol. Plant. 18 : 100∼127, 1965)의 한천배지상에 두었다. 20℃, 16시간동안 낮에 배양한 후, 세분화된 식물체는 카나마이신 100mg/ℓ를 함유하는 Linsmaier와 Skoog(Physiol. Plant. 18 : 100~127, 1965)의 한천배지상에서 계대증식(繼代增殖) 하였다. 증식한 형질전환체는 단절(單節)마다 잘라내어 Linsmaier와 Skoog(Physiol. Plant. 18 : 100∼127, 1965)의 액체배지상에서 3∼4주간 배양하고(20℃, 16시간 낮에), 그후 배지를 자당 80g/ℓ를 함유하는Linsmaier와 Skoog(Physiol. Plant. 18 : 100∼127, 1965)의 액체배지로 교환하여, 20℃, 암흑하에서 4∼5주간이상 배양하였다. 형성된 마이크로 튜버는 수세하고 물기를 뺀 후, 샤레에 넣어 암흑하에서 20℃ 혹은 4℃에서 저장하였다. Linsmaier와 Skoog (Physiol. Plant. 18 : 100~127, 1965)의 한천배지에서 육성중인 식물체도 암흑하 20℃ 혹은 4℃의 저장시험에 공시하였다.

루시퍼라제 활성측정은 문헌(Science 234 : 856∼859, 1986)에 준하여 행하였다. 생중량(重量)당 3∼10배량의 추출완충액(100mM 인산칼륨 완충액(pH7.5), 1mM 디티오트레이톨)을 가하여 마쇄(磨碎)후, 원심(15000rpm, 5min)하여 상청(上淸)을 조추출액(組抽出液)으로 하엿다. 조추출액 50㎕와 활성측정용 완충액(36mM 글리실글리신 완충액(pH7.8), 1㎎/㎖ 소혈청 알부민, 20mM 염화마그네슘, 12mM ATP) 100㎕를 혼합 후, 0.4mM 루시페린을 100㎕ 첨가하여 루미노미터(모델 6100, 팟카드 사)로 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 결과는 표 7 및 표 8에 정리한다.

표에서 명확한 바와 같이, 저온(4℃)에서 4주간 저장한 마이크로튜버에서 현저한 활성 상승이 관찰되었다. 또. 활성은 마이크로튜버에 뒤떨어지지만, 잎에서도 저온하에서의 활성상승이 약간 확인되었다.

따라서, 서열번호 1에 기재된 서열중 제2418번째∼제3541번째의 염기로 이루어지는 DNA서열(프로모터 단편)은 저온하에서 유전자 발현을 유도하는 작용을 가진다는 깃이 명확하게 되었다.

Claims

서열표의 서열번호 1로 나타내는 염기서열중 제1번째∼제3546번째의 염기로 이루어지는 저온유도성 프로모터 활성을 가진 DNA 서열.
제1항에 있어서, 서열표의 서열번호 1로 나타내는 염기서열중 제1번째∼제3546번째의 염기로 이루어지는 DNA서열.
서열표의 서열번호 1로 나타내는 염기서열중 제2418번째∼제3541번째의 염기로 이루어지는 저온유도성 프로모터 활성을 가진 DNA서열.
서열표의 서열번호 1로 나타내는 염기서열중 제2418번째∼제3541번째의 염기로 이루어지는 저온유도성 프로모터 서열.
서열표의 서열번호 2로 나타내는 염기서열중 제1번째∼제4120번째의 염기로 이루어지는 저온유도성 프로모터 활성을 가진 DNA 서열.
제5항에 있어서, 서열표의 서열번호 2로 나타내는 염기서열중 제1번째~제4120번째의 염기로 이루어지는 DNA서열.