CN103361350B

CN103361350B - 一种同时具有低温诱导活性和马铃薯块茎特异表达活性的融合启动子pCLdb及其构建方法

Info

Publication number: CN103361350B
Application number: CN201310273659.XA
Authority: CN
Inventors: 柳俊; 李萌; 朱青; 谢从华; 宋波涛
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2013-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-07-02
Also published as: CN103361350A

Abstract

本发明公开了一种同时具有低温诱导活性和马铃薯块茎特异表达活性的融合启动子pCLdb，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还以融合启动子pCL和拟南芥另一低温诱导启动子cor15b基因启动子中CRT/DRE元件侧翼序列为基础，构建了融合启动子pCLdb。将pCLdb启动子构建入植物表达载体pBI121中，构建的载体命名为pCLdb-121，将构建的pCLdb-121转化马铃薯，采用GUS酶活检测评价启动子表达强度，GUS活性检测表明，与pCL 相比pCLdb表达强度显著增强，其表达强度也高于目前通用的启动子CaMV 35S，可用于马铃薯块茎与低温性状相关基因工程改良。

Description

一种同时具有低温诱导活性和马铃薯块茎特异表达活性的融合启动子pCLdb及其构建方法

技术领域

本发明属于真核基因表达调控技术研究领域，涉及一种同时具有低温诱导活性和马铃薯块茎特异表达活性的融合启动子及其构建方法。

背景技术

为了延长马铃薯块茎的加工时间和防止水分蒸发，收获后的块茎一般于低温条件贮藏，然而在贮藏过程中出现的“低温糖化”会导致块茎中还原糖积累而影响马铃薯加工品质。这一过程涉及到复杂的代谢网络，传统的杂交育种效率极低，因此，目前全世界适宜的加工的品种还不足10个。利用转基因技术对该性状的改良是主要的策略。但涉及低温糖化的基因大部分都是与植物生长发育有关的关键基因，如果采用组成型如CaMV 35S驱动目标基因常常会影响植株的正常发育与代谢。如果用一个受低温诱导且只在块茎中特异表达的启动子取代组成型启动子，就可以驱动外源基因仅在块茎中低温诱导表达，从而最大程度的消除了外源基因在其他部位或常温下过量表达所导致的“负面效应”。在我们前期的研究中，利用来自拟南芥受低温诱导的cor15a基因启动子和来自马铃薯块茎特异表达的patatin基因启动子的部分序列进行拼接，构建了一个同时具有低温诱导活性和块茎特异表达活性的启动子pCL（Genbank编号DQ494557）。但由于该启动子的低温诱导活性较低（仅为CaMV 35S启动子的约20%），不能满足马铃薯块茎抗低温糖化改良的实际应用需要。因此本发明着力于提高该启动子的低温诱导表达活性。

发明内容

在本发明中，我们使用了两步改造策略进行启动子序列改造，以提高启动子的低温诱导表达活性。首先以融合启动子pCL为基础，以定点突变的方法改变其中低温应答核心元件CRT/DRE两侧侧翼序列的碱基组成，碱基突变依据来源于另一个拟南芥已报道的低温诱导高度增强表达的cor15b基因启动子，构建的中间产物命名为pCLb。然后以pCLb为基础，在其CRT/DRE核心元件3’端插入另一个含侧翼序列的CRT/DRE元件，序列长度26bp，最后得到含两个CRT/DRE元件，且侧翼序列均与cor15b基因启动子一致的融合启动子pCLdb（具体操作见实施例1）。

将获得的融合启动子pCLdb装入pBI121质粒替代原质粒中的35S启动子，使pCLdb与GUS被告基因连接以驱动GUS基因表达，构建的由pCLdb驱动GUS报告基因的植物表达载体转化马铃薯，获得的转基因植株分别置于20℃和4℃处理后，通过检测不同的组织的GUS酶活评价pCLdb的启动子表达强度。结果显示融合启动子pCLdb具有低温诱导及块茎特异的特性，且启动子表达强度较pCL有大幅度的提高，在低温诱导的块茎中pCLdb表达强度可达pCL的20倍以上，最高活性达到了CaMV 35S的2倍以上。证明本发明中改造的融合启动子能有效提高低温诱导活性，同时并未影响融合启动子的块茎特异表达特性。因此，pCLdb是一个同时具有低温诱导和块茎特异表达功能的、可以用于马铃薯块茎低温特异性状改良的融合启动子。

本发明的优点在于，在保证启动子块茎特异和低温诱导表达活性的前提下，通过尽可能少的修饰以提高其低温诱导的表达活性。本发明中获得了一个在马铃薯中具有更高活性的低温诱导及块茎特异表达的融合启动子，与pCL相比，其序列差异较小，在未改变融合模式的基础上增强了启动子的活性。因此在本发明中，也建立了一种通过定点突变提高启动子活性的方法。

附图说明

图1：融合启动子pCLdb的核苷酸序列示意图。

图2：pCL和pCLdb启动子的结构示意图。

图3：用作对照的E3和p35S-7转基因株系在马铃薯不同组织中的GUS活性测定。

图4：融合启动子pCL在马铃薯转基因株系不同组织中的GUS活性测定。

图5：融合启动子pCLdb在马铃薯转基因株系不同组织中的GUS活性测定。

图6：对照E3，p35S-7，pCL和pCLdb转基因株系GUS染色结果。

具体实施方式

实施例1 融合启动子pCLdb的构建

本发明获得融合启动子pCLdb的具体方法如下：

以pCL启动子为基础，在其中引入CRT/DRE侧翼序列的碱基突变和CRT/DRE元件的重复，通过在引物中引入重叠延伸序列，将所需的碱基修饰引入pCL中，重叠延伸PCR过程中所使用的引物如下：

表1　所用PCR引物的序列

名称	序列
		ZL01L	TCCAAGCTTATTGAGAACGACCCT
M1bR	AGAGGTCGGCCATCAAGTGATCG
		M1bF	GATCACTTGATGGCCGACCTCTTTTTT
M2bR	AAGAGGTCGGCCATCAAGTGATCGAAGAAGAA
		M2bF	GATCACTTGATGGCCGACCTCTTTTTCTGAAAACC
ZC01R	CGCGGATCCATTTTGTTGGTGCTT

首先利用Pyrobest酶从pCL启动子中扩出b1L和b1R两个片段，所用的PCR引物对分别为ZL01L/M1bR 和M1bF/ZC01R。然后，将b1L和b1R两个片段进行重叠延伸PCR，所用引物为ZLO1L/ZC01R，PCR体系见表2，回收的PCR产物命名为pCLb。然后已获得的pCLb为基础，利用pyrobest酶从其中扩出b2L和b2R两个片段，所用的PCR引物对分别为ZL01L/M2bR和M2bF/ZC01R。然后，将b2L和b2R两个片段进行重叠延伸PCR，所用引物为ZLO1L/ZC01R，PCR体系见表2，回收665bp的PCR产物测序，序列命名为pCLdb（图1）。图2 是pCL和改建后的pCLdb启动子的一些关键元件和突变位点对比图。CCGAC为低温响应元件核心序列，其两侧序列中用显示大字号和黑体的部分为本发明突变后的碱基。图中下划线部分为插入的1个低温响应元件重复单元。

表2　重叠延伸PCR的反应体系和程序

本发明的突变型融合启动子具有如图1所示的序列：

1、序列特征：

1）长度：665碱基对

2）类型：核酸

3）链型：双链型

4）拓扑结构：线性

5）来自拟南芥cor15a基因启动子（-297至-42）的片段，含低温响应核心元件CRT/DRE，在融合启动子中位于-632~-317部分。其中-521~-495部分为突变片段，其序列与cor15b基因启动子相应序列一致，-482~-453部分为插入片段，其序列与cor15b基因启动子相应序列一致，数目：1个。

6）来自拟南芥cor15a基因启动子（-297至-42）的片段，含低温响应核心元件CRT/DRE，在融合启动子中位于-632~-317部分。在其中-521~-495部分引入定点突变，-482~-456部分为插入片段，其序列与-521~-495部分相应序列一致，方向：正向。

7）来自马铃薯patatin基因启动子，含块茎特异应答元件的片段（-340至+19），融合启动子中的位置为-316~+37，数目：1个。

8）来自马铃薯patatin基因启动子，含块茎特异应答元件的片段（-340至+19）融合启动子中的位置为-316~+37，方向：正向。

2、分子类型：DNA

3、假设：否

4、反义：否

5、最初来源：拟南芥（Arabidopsis thaliana）和马铃薯（Solanum tuberosum L）

实施例2：突变型融合启动子与植物表达载体的构建

pCLdb用HindIII和BamHI双酶切后，克隆到质粒pUC18的相应位点中得到重组质粒pCLdb-18。用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切质粒pCLdb-19并分别回收相应的启动子片段与HindIII和BamHI双酶切pBI121质粒回收的载体大片段连接。取连接产物10μL分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。待转化子长出菌落后，挑取单菌落小量制备质粒DNA，用HindIII和BamHI进行酶切鉴定，所得的重组质粒命名为pCLdb-121。将所获得的重组质粒采用直接法导入农杆菌LBA4404中用于植物转化。

实施例3：马铃薯转化与GUS表达活性的检测

马铃薯转化：将植物表达载体转化农杆菌LBA4404。用试管薯切片法转化马铃薯，在含有卡那霉素和头孢霉素的MS培养基（MS基本培养基+ 3%蔗糖 + 1 mg/L IAA + 0.2 mg/L GA3 + 0.5 mg/LBA + 2 mg/L ZT + 75 mg/L Km + 400 mg/L Cef，pH5.8）上筛选抗性植株；然后将其转移到生根培养基（MS基本培基 +50 mg/L Km + 200 mg/L Cef，pH5.8）上生根，然后通过组织培养方法繁殖；待植株长至30天左右时选取生长正常的植株叶片，用CTAB法抽提植物基因组DNA；以基因组DNA为模板，通过PCR方法检测外源基因的整合情况，PCR所用引物为启动子载体特异引物P-Hind3（ACCATGATTACGCCAAGCTT）和P-BamHI（GACTGACCACCCGGGGATCC），该对引物可以特异地扩增插入pBI121载体HindIII和BamHI位点之间的DNA片段。选取PCR检测为阳性的植株用于GUS表达活性的定量测定。

转基因植株繁殖与样本处理：将获得的转基因株系组织培养，植株在常规培养条件下（20℃）生长40天后，部分植株材料置于4℃条件下培养2天，然后同时取量个温度下的植株叶片，茎和根用于用于GUS检测。同时将培养3个月，已经形成试管薯的植株分别置于20℃和4℃培养2天，取直径0.5cm至1cm的试管薯用于GUS检测。

GUS表达活性的定量测定：将所取样本材料液氮速冻后在研钵中研磨成粉状，从中取出约0.5 g粉末加入1ml提取缓冲液，每份材料取三个重复。加入提取缓冲液后马上置于冰上2 h，然后离心收集上清液。在1ml预热的反应缓冲液中（提取液中加入1mmol/L MUG）加入100μl上清，然后分别于0 min，20 min，40 min，60 min时刻取出100μl加入到1.9ml反应终止液中终止反应，然后用岛津荧光分光光度计测定各样品Ex365/Em455比值，计算样品中4-MU的变化量，以代表GUS酶促反应速度，同时用Bradford法测定样品中总蛋白浓度，用4-MU的量与蛋白质浓度及反应时间的比值（nmol MU/min/mg 蛋白质）来表示GUS活性。不同的转基因株系各组织中的GUS活性测定结果分别显示于图3，图4和图5。

GUS组织化学染色：将需要染色观察的植物材料取样后立即使用90%丙酮完全浸泡，并于室温保持20min，然后用去离子水洗去丙酮，加入GUS染液（50mM磷酸盐缓冲液pH7.2，10% triton X-100，5mM亚铁氰化钾，5mM高铁氰化钾，2mM X-gluc），使之完全浸没材料，然后在黑暗条件下，37℃放置过夜。最后用95%乙醇多次浸泡洗涤，直至植物材料本底颜色消失。GUS组织化学染色结果如图6所示。

Claims

1.一种同时具有低温诱导活性和马铃薯块茎特异表达活性的融合启动子pCLdb，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.如权利要求1所述的融合启动子pCLdb的构建方法，其特征在于：首先以pCL为基础，以定点突变的方法改变其中低温应答核心元件CRT/DRE两侧侧翼序列的碱基组成，而突变后的碱基组成依据来源于另一个拟南芥的低温诱导cor15b基因启动子，构建的中间产物命名为pCLb；然后以pCLb为基础，在其CRT/DRE核心元件3’端相距20 bp的位置插入另一个含侧翼序列的CRT/DRE元件，最后得到了含两个重复的CRT/DRE元件及其侧翼序列单元的融合启动子pCLdb。