CN102250900B - 盐芥COR15a基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及盐芥COR15a基因启动子及其应用，该启动子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本发明特别涉及该启动子序列中的2个低温应答特异性元件C-repeat/DRE。本发明从克隆盐芥COR15a基因启动子入手，通过对盐芥COR15a基因启动子结构和功能序列的分析，验证了盐芥COR15a基因启动子的低温诱导性。从盐芥中获得的该低温诱导型启动子，为植物抗逆基因工程研究提供了新的逆境胁迫诱导型启动子元件，也为下一步植物抗冻转基因研究奠定基础。

Description

盐芥COR15a基因启动子及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体地说，涉及一种盐芥COR15a基因启动子及其应用。

背景技术

盐芥(Thellungiella halophila)具有很强的抗冻能力。据报道，在4～5℃低温条件下，盐芥种子可以萌发，并且盐芥可以生长发育。盐芥的抗冻能力比拟南芥要强，表现在拟南芥在经过过冷处理之后才能够忍受零度以下低温，如忍受-10～-13℃的低温，而盐芥不仅在经过过冷处理后能够忍受低温，其本身就具有更强的抗冻能力。

越来越多的研究表明，植物抗冻过程中发生的生理生化变化是由低温诱导的特定基因表达而引发的，一些潜在的基因受低温调控而表达，进而诱导许多抗冻蛋白的合成。Thomashow等(1990)最早从拟南芥中分离鉴定得到抗冻响应的COR基因(cold regulated gene)。

C-repeat/DRE(c-repeat/drought responsive element)调节元件是COR基因启动子序列中的关键顺式作用元件(Yamaguchi-Shinozaki等，1994；Baker等，1994)。所有COR基因启动子序列中都有此调节元件存在。研究证明，C-repeat/DRE调节元件除了可响应低温诱导外，还可对干旱和高盐等作出响应而使COR基因表达。

COR15a基因启动子是植物体内低温调节的信号转导途径及转录调控网络中的重要组成部分。本发明首次克隆得到盐芥COR15a基因启动子的序列，为进一步研究植物的抗冻分子机制奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供盐芥COR15a基因启动子及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的盐芥COR15a基因启动子，其具有：i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该序列中含有2个低温应答特异性元件C-repeat/DRE；或ii)SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。如在不改变启动子功能的情况下，将第12位的A缺失，将第177位的A取代为G，在第211位后增加T。

本发明还提供含有上述启动子的载体以及含有该载体的宿主细胞。

本发明还提供含有上述启动子的转化植物细胞。

本发明还提供盐芥COR15a基因启动子在调控下游基因表达中的应用，优选下游基因为GFP基因。

本发明还提供盐芥COR15a基因启动子在提高植物抗逆性中的应用。其中，所述的植物抗逆性是指植物的抗冻、抗旱和抗盐等抗逆境胁迫的能力，特别是指植物的抗冻能力。

本发明从克隆盐芥COR15a基因启动子入手，通过对盐芥COR15a基因启动子结构和功能序列的分析，验证了盐芥COR15a基因启动子的低温诱导性。从盐芥中获得的该低温诱导型启动子，为植物抗逆基因工程研究提供了新的逆境胁迫诱导型启动子元件，也为下一步植物抗冻转基因研究奠定基础。

附图说明

图1为盐芥和拟南芥COR15a启动子中调节元件的分布图。其中，中间部分表示盐芥和拟南芥COR15a启动子共有的调节元件；左环表示盐芥COR15a启动子含有的元件；右环表示拟南芥COR15a启动子含有的元件。

图2为盐芥和拟南芥的COR15a启动子下游序列的比对。

图3为盐芥COR15a基因启动子表达载体、缺失载体及对照载体的构建。其中，+1示转录起始位点(TSS)；ATG示翻译起始密码子；A示ABRE；B示TC-rich repeats；C示GARE-motif；Control为以拟南芥COR15a基因启动子构建的表达载体作为对照；以GFP为报告基因的载体为pCAMBIA1300。

图4为不同温度处理下洋葱表皮细胞中不同启动子启动的GFP基因瞬时表达情况、其中，A、D、G是转化了35S启动子的洋葱表皮细胞分别在30℃、20℃和4℃条件下处理后，35S启动子启动的GFP瞬时表达情况；B、E、H是转化了拟南芥COR15a基因启动子At的洋葱表皮细胞分别在30℃、20℃和4℃条件下处理后，At启动子启动的GFP瞬时表达情况；C、F、I是转化了盐芥COR15a基因启动子Th的洋葱表皮细胞分别在30℃、20℃和4℃条件下处理后，Th启动子启动的GFP瞬时表达情况。其中35S启动子样品和拟南芥COR15a启动子At样品均为对照。Bar：10μm。

图5为4℃条件处理下洋葱表皮细胞中缺失启动子启动的GFP基因瞬时表达情况。图中从左至右依次为转化了35S启动子、盐芥COR15a基因启动子Th、盐芥COR15a基因缺失启动子Th2的洋葱表皮细胞在4℃条件下处理后，3种启动子启动的GFP基因瞬时表达情况。其中，35S启动子样品为对照。Bar：10μm。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行或按照制造生产厂商的使用说明。

实施例1盐芥COR15a基因启动子的克隆

1材料和方法

1.1材料

1.1.1植物材料  Shandong生态型盐芥(Thellungiella halophila)；哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsis Columbia)。

1.1.2菌株和载体  大肠杆菌菌株E.coli DH5α、农杆菌GV3101均为市售商品；载体pMD 18-T Vector、pMD 18-T simple Vector购自TaKaRa公司；表达载体pCAMBIA1300购自CAMBIA公司。

1.1.3酶和化学试剂  限制性内切酶BamHI、HindIII、SmaI、PstI、T4 DNA Ligase购自TaKaRa公司；DNA Marker购自广州东盛生物公司；抗生素购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1盐芥COR15a基因启动子的克隆

用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取盐芥基因组并进行DNA浓度及纯度的检测。登录NCBI生物信息数据库，检索获得盐芥(Thellungiella salsuginea)COR15a基因的cds全长序列(518bp)。以此cds片段为依据，设计三个特异性引物SP1(5′-TCTGCAAACTCAGCCGCTTTGTTTC-3′)、SP2(5′-CCATCTTTCAACGCCTCCTTTGTCT-3′)和SP3(5′-AGCGACAACGACGAGCTCAGTTTTC-3′)。用TaKaRa GenomeWalking Kit进行第一次巢式PCR反应。以第一次染色体步移后测序得到的扩增序列为已知序列，设计三个特异性引物SP1′(5′-GTCGGCCATCAAAGTTGTGGTTTAC-3′)、SP2′(5′-GCCAACAAGTTGGGCTATTATCGCC-3′)和SP3′(5′-GGCAACTCCTCCACCTTCTCTATGA-3′)，仍采用TaKaRaGenome Walking Kit继续扩增盐芥COR15a基因启动子序列。

1.2.2盐芥COR15a基因启动子的生物信息学分析及同源比对

用PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant-care/html/)对启动子的顺式作用元件进行预测和分析。利用DNAMAN软件比对盐芥和拟南芥COR15a基因启动子序列。

1.2.3盐芥COR15a基因启动子及缺失启动子的重组载体的构建

为研究盐芥COR15a基因启动子中的顺式作用元件的功能，根据PLANTCARE对启动子的顺式作用元件的预测，将克隆出来的盐芥COR15a基因启动子序列分为4个(Th、Th2、Th1、Th0)不同长度的片段，并以拟南芥COR15a基因启动子片段为对照，和上述4个不同启动子片段分别插入到质粒pCAMBIA1300的CaMV 35S启动子位置，构建成由盐芥(拟南芥)COR15a不同长度启动子片段启动的GFP基因表达载体。

1.2.4盐芥COR15a基因启动子的活性分析

利用北京维格拉斯质粒大量提取试剂盒进行提取并检测。制备基因枪转化法所需的微载体，DNA分子包埋微载体，装弹轰击洋葱表皮细胞。轰击结束后，在装有洋葱样品的培养皿中加入MS液体培养基。将转化了不同质粒载体的洋葱样品分别放在不同的温度条件(4℃、20℃、30℃)下进行暗培养。暗培养24h后制片，使用蔡司(Zeiss)正置荧光显微镜及成像系统对洋葱表皮细胞样片进行观察，使用AxioVision Rel.4.6软件进行照相。

2结果

2.1盐芥COR15a基因启动子的克隆

第一次染色体步移共扩增得到930bp长的启动子序列，利用NCBIBlast 2 Sequences将测序结果与盐芥COR15a cds序列(518bp)比对后发现，测序结果的3′端的125bp序列与cds序列5’端的125bp序列完全重合。第二次染色体步移共扩增得到553bp长的启动子序列。将两次染色体步移的达到的结果进行拼接，最后得到1313bp长的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)。

2.2盐芥COR15a基因启动子的生物信息学分析及同源比对

2.2.1启动子的顺式作用元件分析将已克隆得到的盐芥COR15a基因启动子全长序列(1313bp)输入到PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)的Searchfor CARE中对启动子的顺式作用元件进行预测和分析，预测该序列中存在大量调控元件，如核心启动子元件TATA-box；多个启动子和增强子区常见元件CAAT-box；多个激素应答元件ABRE、GARE；多种光响应元件ACE-motif、G-box、Sp1-motif、MRE-motif。该序列中还存在多个胁迫应答元件，如C-repeat/DRE、MBS、TC-rich repeats。此外，该序列中还存在一个高水平转录调控因子5UTR Py-rich stretch。该序列的主要调控元件见表1。在这些调控元件中，胁迫应答元件，尤其是2个C-repeat/DRE元件在植物低温及干旱诱导过程中起重要作用。

表1盐芥COR15a基因启动子序列中主要的调控元件

采用PLANTCARE数据库对已克隆出的盐芥COR15a启动子序列进行生物信息学，预测到该序列中存在多种顺式作用元件，从生物信息学水平上也验证了已克隆出来的盐芥COR15a基因启动子序列具有启动子的基本特征，并且具有响应低温等逆境胁迫的能力，是低温诱导型启动子。盐芥和拟南芥COR15a启动子中调节元件的分布见图1。

2.2.2核酸相似性比对

将盐芥和拟南芥的COR15a启动子序列输入DNAMAN软件中进行比对，发现两序列中存在许多一致的序列片段，尤其是3′端下游的约500bp长的序列(图2)，图中方框所示的序列即为低温及干旱响应元件C-repeat/DRE。这在生物信息学水平上说明了盐芥COR15a启动子与拟南芥COR15a启动子在关键调控序列上相似度较高，盐芥COR15a启动子很可能具有低温诱导性。

实施例2盐芥COR15a基因启动子调控下游基因GFP的表达

1、盐芥COR15a基因启动子及缺失启动子的重组载体的构建

根据PLANTCARE对启动子顺式作用元件的预测，将已克隆得到的盐芥COR15a基因启动子1313bp序列按照含有的关键调控元件的不同，分为4个不同长度的启动子片段。4个启动子片段如下：①Th：-1168bp～+64bp，含有所有调控元件；②Th2：-627bp～+64bp，含有2个低温应答元件C-repeat/DRE；③Th1：-332bp～+64bp，含有1个C-repeat/DRE元件；④Th0：-178bp～+64bp，不含有C-repeat/DRE元件，只含有基本启动子元件(图3)。其中，Th2、Th1和Th0为缺失启动子片段。

2、盐芥COR15a基因启动子的活性分析

大量提质粒的DNA的浓度及纯度均达到进一步实验的要求，可以用作基因枪转化。瞬时转化洋葱表皮细胞，Axio Vision Rel.4.6成像软件进行照相结果如图4和图5所示。

从图4和图5中可以看出，盐芥COR15a基因启动子可以驱动GFP基因的瞬时表达，从实验水平上验证了该序列具有启动子的功能。并且本发明盐芥COR15a基因启动子在不同温度下启动GFP基因瞬时表达的情况有所不同，在4℃处理下GFP表达的荧光强度最亮，30℃处理下GFP表达的荧光强度最弱，这说明该启动子序列具有低温敏感性，在低温诱导下表达能力更强，从实验水平上验证了盐芥COR15a基因启动子是低温诱导型启动子。

盐芥COR15a基因启动子缺失片段响应低温诱导的能力的实验结果表明在2个C-repeat/DRE元件都存在的情况下盐芥COR15a基因启动子才能表达。

通过染色体步移、生物信息学分析、构建植物表达载体及缺失片段载体，初步阐明了盐芥COR15a启动子的诱导性及核心元件C-repeat/DRE的作用，为进一步研究盐芥COR15a启动子的作用奠定基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.盐芥COR15a基因启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.含有权利要求1所述启动子的载体。

3.含有权利要求2所述载体的宿主细胞。

4.含有权利要求1所述启动子的转化植物细胞；

其中，所述植物细胞为洋葱表皮细胞。

5.权利要求1所述的启动子在调控下游基因表达中的应用。

6.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，下游基因为GFP基因。

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