KR101452405B1 - 국내 고구마 잎말림병 감염 ｄｎａ 바이러스의 양방향성프로모터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 국내에서 최초로 분리된 제미니바이러스인 고구마 잎말림 바이러스(Sweet potato leaf curl virus)의 유전자간 영역(intergenic region)으로부터 분리한 프로모터로서 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로모터에 관한 것이다.
상기와 같은 프로모터는 식물 형질전환시 문제점으로 대두되고 있는 식물 자체의 발현 안정성 문제를 극복함으로써 가능한 다양한 식물 형질전환체 생산에 기여할 수 있다. 따라서, 식물 형질전환 벡터 시스템으로써 개발하여 식물형질전환 관련된 분자생물학 및 분자육종 관련 산업에서 벡터 상품으로써 시장을 형성할 것으로 기대되고 고효율 품종 육종의 기업화를 기대할 수 있다.
고구마, 잎말림병, 프로모터, 형질전환
Description
본 발명은 국내에서 최초로 분리된 제미니바이러스인 고구마 잎말림 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV)의 유전자간 영역(intergenic region)으로부터 분리한 프로모터로서 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 프로모터에 관한 것이다.
작물분자육종은 모든 종(種)의 유전자를 재료로 사용할 수 있으며 기존의 게놈 단위로만 가능하던 육종기술을 유전자 단위로 끌어내려 무한대의 육종 효과를 미세하게 조절할 수 있다는 측면에서 차세대 농업을 이끌어 갈 핵심적인 기술이다.
이러한 작물분자육종은 기술의 효과를 극대화시키려면 여러 가지 식물의 유전자를 대표할 수 있는 많은 유전자 데이터의 축적이 선행되어야 하며, 다양한 작물의 형질전환 시스템이 구축되어야 하고, 외부에서 삽입된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 다양한 프로모터의 개발이 선행되어져야 한다.
고구마에 잎말림 증상을 유발시키는 제미니바이러스(geminivirus)는 제미니 바이러스과(Geminiviridae)에 속하며, 이는 네 개의 속(genus)으로 나뉘며, 이 중 하위그룹(subgroup) Ⅲ에 해당하는 베고모바이러스(begomovirus)는 가루이(whitefly)[Bemisia tabaci (Gennadius)]에 의해 매개되는 특성을 갖고 있다. 따라서, 제미니바이러스에 관련한 보고는 가루이가 서식하기 알맞은 열대나 아열대 기후 지역에서 이루어진 것이 많다. 아시아 지역에서는 1960년대에 중국의 토마토 재배 지역에서 제미니바이러스가 관찰된다는 보고가 있었으나 일부 지역에 국한되어 있고 피해 정도가 경미해 연구가 이루어지지 않았다. 그러나, 최근 10년 사이에는 아시아 지역 주요 국가의 대부분의 토마토 재배 지역에서 가루이가 관찰되고 이 후 제미니바이러스가 검정된다는 보고가 급증하였다.
중국, 대만, 일본, 인도 등 아시아 지역에서 보고되는 베고모바이러스는 ToLCV(Tomato leaf curl virus), TYLCV(Tomato yellow leaf curl virus), TbLCV(Tobacco leaf curl virus), HYVMV(Honeysuckle yellow vein mosaic virus) 등이 주를 이루고 있다. 이들은 일반적으로 두 개의 개놈을 갖는 다른 베고모바이러스와 달리 단 한 개의 게놈을 갖기 때문에 매우 특수한 바이러스로 분류가 된다. 또한, 복제를 완성하기 위해 부수 DNA(satellite DNA)를 필요로 한다는 공통적인 특징을 지니고 있다. 현재까지의 문헌과 보고에 따르면 아프리카, 아시아를 포함하는 구대륙에는 한 개의 게놈을 갖는 것이, 신대륙에는 두 개의 게놈을 갖는 것이 분포하고 있는 것으로 되어 있다. 이러한 현상이 나타나는 이유로는 한 개의 게놈을 갖는 바이러스에서 두 개의 게놈을 갖는 바이러스로 진화하고 있기 때문으로 해석되고 있다.
우리나라에서 발견되는 제미니바이러스도 한 개의 게놈을 갖는 베고모바이러스일 가능성이 높을 것으로 사료된다. 그러나, 다른 바이러스일 가능성도 배제할 수 없으므로 다양한 종류의 베고모바이러스에 친화력이 있는 프라이머를 제작하여 PCR을 수행한 결과, 국내에서 분리한 제미니바이러스는 CP의 코어 부위(core region)는 비교적 높은 수준으로 유지되고 있었지만 이를 제외한 서열은 많은 변이가 일어나 있음을 알 수 있었다. 이러한 변이 때문에 전체 염기 서열을 획득하고 분석하는데 많은 어려움이 있다.
이는 현재까지 제미니바이러스에 의한 피해나 보고사례가 없었던 국내의 작물재배환경에서 TLCV와 비슷한 제미니바이러스가 확인됨에 의해 여러 가지 변이를 통해 국내 재배환경에 심각한 피해를 줄 수 있는 제미니바이러스의 유입이 가능하거나 혹은 이미 유입된 환경으로 바뀐 것을 암시한다. 또한, 현재로서는 제미니바이러스의 분리 상황이 미약한 수준임을 볼 때 제미니바이러스의 국내 분포가 아직은 유입 초기이며, 이들의 재조합율(recombination rate)과 전염성(infectivity)의 변화에 따라 머지않은 시점에 국내에도 제미니바이러스에 의한 피해 상황이 속출할 것으로 고려되어, 빠른 동정과 연구를 통해 이들 바이러스에 대한 대응책을 마련함이 시급한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 SPLCV를 검출하고, 바이러스의 지역별 균주가 가지는 고유한 특징을 이용하고, 이들의 전체 염기서열로부터 적용할 수 있는 분야로써 식물 형질전환용 벡터 시스템을 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 잎말림(leaf curl)병 증상을 나타내는 국내산 고구마 식물(Ipomoea batatas)로부터 PCR법으로 식물체내 단일 사슬 DNA 유전체를 가지는 바이러스의 부분 서열을 분리하였고, 또한 SPLCV의 유전자간 영역(intergenic region)을 분석하고, 이를 단편화하여 형질전환체를 만들고 리포터 단백질의 발현을 통해 발현차이를 확인하여, 기존에 사용되어 지고 있는 식물 형질전환 프로모터 보다 발현을 강화시키는 부위를 찾아냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 이를 통해 SPLCV 감염이 가능한 식물체내에서 외래 유전자를 발현시킬 때, 기존의 프로모터에 의한 식물체 자체의 피해를 극복하고, 안정적으로 목적 단백질을 발현시킬 수 있는 프로모터로서의 적용 및 양 방향으로 단백질을 생성할 수 있는 양방향성 프로모터의 응용하고자 한다.
본 발명은 국내에서 최초로 분리된 제미니바이러스인 고구마 잎말림병 감염 바이러스(Sweet potato leaf curl virus)의 유전자간 영역(intergenic region)으로부터 분리한 프로모터에 관한 것으로서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.
식물 형질전환시 문제점으로 대두되고 있는 식물 자체의 발현 안정성 문제를 극복함으로써 가능한 다양한 식물 형질전환체 생산에 기여할 수 있다. 따라서, 식물 형질전환 벡터 시스템으로써 개발하여 식물형질전환 관련된 분자생물학 및 분자육종 관련 산업에서 벡터 상품으로써 시장을 형성할 것으로 기대되고 고효율 품종 육종의 기업화를 기대할 수 있다.
본 발명의 SPLCV로부터 분리해낸 양방향성 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.
국내에서 최초로 분리된 제미니바이러스인 고구마 잎말림 바이러스의 유전자간 영역(intergenic region)으로부터 프로모터 활성을 가지는 지점을 분리하여, 컴퓨터를 이용하여 시스-작용(cis-acting) 조절 부위를 분석하였다. 이를 기준으로 프로모터 영역을 deletion set을 만들어 프로모터 분석용 식물 발현 벡터에 게이트웨이 클로닝 방법을 이용하여 재조합하고, 아그로박테리아 튜메파시엔스 균주 GV3101에 형질전환시킨 뒤에 애기장대(Arabidopsis thaliana)에 형질전환하여, 제초제 바스타에 저항성을 보이는 형질전환체를 선별하였다. 선별된 형질전환체의 T2 세대에서 프로모터 활성을 GUS 단백질의 발현을 통해 관찰한 바, 특정 서열을 중심으로 프로모터 활성이 더 강한 것을 확인할 수 있었다.
상기 프로모터 영역은 서열번호 2의 염기서열에서 2682번부터 131번염기까지 순방향으로의 278bp에 해당하고, 이는 양방향성을 가진다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
[
실시예
]
1. 국내
SPLCV
유전자 분리 및 서열분석
농촌진흥청 작물과학원 바이러스과로부터 의뢰받은 잎말림 증상이 심한 고구마로부터 Dellaporta 방법을 이용하여 게놈 DNA를 추출하고, 이를 고안된 프라이머 서열을 이용하여, 95 ℃ 3분, [94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 2분]-30회 반복, 72 ℃ 10분의 PCR 반응 조건으로 하여 고구마 게놈 DNA 2 마이크로리터, 5'-프라이머와 3'-프라이머 각각 0.25 pmol, 1X PCR buffer, 0.125 mM dNTPs가 되도록 하여 최종 20 마이크로리터 반응액을 조성하고 PCR을 통해 SPLCV의 SP1과 SP2의 서열을 증폭하고, 증폭된 서열을 전기영동하여 나타난 밴드(도 1)를 RBC 겔 추출 킷트(gel extraction kit)를 이용하여, 겔로부터 DNA를 회수하고, 이를 Promega의 pGEM-T easy vector ligation kit을 이용 T-벡터 내에 삽입하였다. 박테리아 E. coli DH5alpha 균주에 라이게이션(ligation) 반응액을 첨가하여 42 ℃에서 45초간 열 쇼크(heat shock)를 주어 형질전환을 유도한 후 이를 37 ℃에서 LB/amp 고체배지에 12시간 배양하여, 생성된 박테리아 콜로니를 LB/amp 액체배지에 접종하고 37 ℃에 서 12시간 진탕 배양하여 이들로부터 플라스미드를 분리하고, 기술된 시퀀싱 프라이머를 이용하여 시퀀싱 반응을 진행하였다. 세 번 반복된 시퀀싱 결과를 확인한 후, 최종 서열을 결정하고, 이를 NCBI BLAST 서치를 통해 최종 SPLCV 서열로 확인하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 예상되어진 크기의 SP1 (1632 bp), SP2 (2138 bp) 단편이 DNA 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭되어졌다.
| 클론 | 프라이머 | 서열 (5’→ 3’) |
| SP1 | SPF1 ( forward ) | ctc gtg cag ttc tct tgc ta (서열번호 3) |
| SPR1 ( reverse ) | gca act ggg att cca caa ga (서열번호 4) | |
| SP2 | SPF2 ( forward ) | gtg tat cag acc ctg cgt tg (서열번호 5) |
| SPR2 (reverse) | ata cgg tgc ccg cct ttt gg (서열번호 6) | |
| SPR3 (reverse) | cct tca aaa gtg ggc ccc aca (서열번호 7) | |
| SPR4 ( reverse ) | atg aca ggg cga atg cgc gtt (서열번호 8) |
SPLCV의 경우 도 2와 표 1의 프라이머를 이용해 증폭된 유전자 서열은 각각 pGEM-T easy vector에 클로닝되었으며, SP1과 SP2 클론으로부터 EcoRV digestion에 의해 1.2 mer에 해당하는 바이러스의 전체 서열을 포함하는 클론을 제작하였다. SPLCV의 경우는 1 kb 이상의 크기를 단편 2개만이 클로닝 되어 전체서열을 결정하는 데 무리가 있었다. 따라서, SPLCV 전체서열을 확인하기 위한 프라이머를 다음 표 2와 도 3과 같이 고안하여 시퀀싱 반응을 시행하고 전체서열을 결정하였다.
| 프라이머 | 서열 (5'→3') |
| 5 SpLCV2ndSeq | GAT GTG TGG GTC CCT GTA AG (서열번호 9) |
| 5 SpLCV2Seq _ Rc | CTT ACA GGG ACC CAC ACA TC (서열번호 10) |
| 5 SpLCV3rdSeq | AGT AAT CCT GTG TAT CAG AC (서열번호 11) |
| 5 SpLCV4thSeq | CTG TGC GTG AAT CCA TGC TG (서열번호 12) |
| 5 SpLCV5thSeq | CCT ATT CTG CTT GGG CCT TC (서열번호 13) |
| 5 SpLCVlastSeq | AAA GGC GGG CAC CGT ATT AA (서열번호 14) |
10 ㎍의 분리된 게놈 DNA를 0.8% 아가로즈 겔에 전기영동 한 뒤, 나일론 멤브레인(Amersham사 Hybond-N+)으로 16 시간 동안 전이시킨 뒤, 감염 가능한 클론으로부터 만들어진 탐침 DNA 단편을 P32-labelled dCTP를 이용하여 방사능 표지한 뒤, 혼성화 반응을 수행하였다. 확인된 제미니바이러스의 게놈 서열을 바탕으로 바이러스의 ORF를 확인하고, 확인된 ORF는 GenBank에 기보고된 서열들의 상동성 검색 [BLAST]을 통해서 서열 정렬하였다.
2.
SPLCV
로부터 프로모터의 확보
프로모터 위치라고 생각되어지는 유전자 부위에 대한 연구는 In silico 분석을 통해 시스-요소(cis-element)를 확인하고, 이를 기반으로 하여 시스-작용 영역(cis-acting region)의 유무를 판별하여 진행된다. 따라서 In silico 분석을 통해 SPLCV의 유전자간 영역(intergenic region)내에 예상되는 시스-작용 요소(cis-acting element)를 확인하고, 유전자간 영역의 바깥쪽 부위를 임의로 첨가하여 deletion set를 만들고 프로모터의 활성에 어떤 영향을 주는지 확인하고자 하였다.
제미니바이러스의 프로모터 영역에 해당하는 유전자간 영역(intergenic region, IR)을 단일가닥 DNA 바이러스의 양방향적 원점으로 분석하기 위하여, 다음과 같이 방향에 따라 최종 바이러스 당 8개의 deletion set을 디자인하였다 (도 6, 센스 방향 4개, 안티센스 방향 4개). 즉 유전자간 영역의 바깥쪽 유전자 프레임을 더 추가하여, IR을 포함한 부위를 전체적으로 네 개의 부분으로 단편을 만들고, 이를 방향성에 따라 전체 8개로 디자인 한다.
| C-sense | V-sense |
| SIR131-2682 | SIR2682-131 |
| SIR262-2682 | SIR2682-262 |
| SIR131-2557 | SIR2557-131 |
| SIR262-2557 | SIR2557-262 |
염기서열이 결정된 SPLCV 로부터 유전자간 영역의 8개의 디자인된 영역을 게이트웨이 클로닝을 위한 프라이머 사용을 통해 PCR 방법으로 일차적으로 증폭하여 분리해내었다.
| 이름 | 시작지점 | 시퀸스 | 복제방향 |
| 5SP2682Vs | 2682 | 5'-AAAAAGCAGGCT TTGGAGACACGCATAAGTTC-3' (서열번호 15) |
Virion |
| 5SP2557Vs | 2557 | 5'-AAAAAGCAGGCT TTTTTGTTGGTGGGTGTTTG-3' (서열번호 16) |
Virion |
| 3SP262Vs | 262 | 5'- AGAAAGCTGGGT AGCTCGAACCCTAAGGTTCC-3' (서열번호 17) |
Virion |
| 3SP131Vs | 131 | 5'- AGAAAGCTGGGT TCTTGGCGCCCAAGCACGGA-3' (서열번호 18) |
Virion |
| 5SP262Cs | 262 | 5'-AAAAAGCAGGCT AGCTCGAACCCTAAGGTTCC-3' (서열번호 19) |
Complementary |
| 5 SP131Cs | 131 | 5'-AAAAAGCAGGCT TCTTGGCGCCCAAGCACGGA-3' (서열번호 20) |
Complementary |
| 3 SP2557Cs | 2557 | 5'- AGAAAGCTGGGT TTTTTGTTGGTGGGTGTTTG-3' (서열번호 21) |
Complementary |
| 3 SP2682Cs | 2682 | 5'- AGAAAGCTGGGT TTGGAGACACGCATAAGTTC-3' (서열번호 22) |
Complementary |
| attB1adaptor | - | 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3' (서열번호 23) |
- |
| attB2adaptor | - | 5'-GGGGACCACTTTGTACA AGAAAGCTGGGT -3' (서열번호 24) |
- |
3. 형질전환용 플라스미드 제작
위에서 분리한 프로모터를 애기장대에 형질전환 시키기 위해 게이트웨이 운반체 pBGWFS7을 이용하여 프로모터 기능 분석용 운반체를 제작하였다. 증폭된 PCR 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아 측 특이 재조합 핵산서열 부위 전체를 포함하는 어댑터 프라이머 B1인 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'(서열번호:25)과 B2인5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'(서열번호:26)를 사용하여 각각 재 PCR되었다.(도 7) 2차로 PCR된 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산서열 부위를 포함하는 pDONR221 벡터(도 8)와 BP 재조합반응을 거쳐 중간 클로닝 벡터가 제작되었다. 서브 클로닝된 이 운반체는 최종 식물형질전환 운반체를 제작하기 위해 Egfp 와 GUS 유전자가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 pBGWFS7 벡터(도 9)와 다시 LR 재조합 반응을 거쳐 최종적인 운반체가 완성되었다. 이 때, 기본 운반체(binary vector)로 사용된 pBGWFS7는 미생물 선발을 위한 스펙티노마이신 (spectinomycin) 저항성 유전자를 가지며, 식물체 선발인자로 제초제 저항성 Bar유전자를 포함하고 있다.
도 8은 PCR 산물과 재조합되는 pDONR221 벡터의 유전자지도이고 도 9는 프로모터 분석에 사용되는 게이트웨이 운반체인 pBGWFS7 벡터의 유전자지도이다.
4. 애기장대 형질 변환
파종한 후 23℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4주간 생육된 애기장대 (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia-0) 식물체의 일차 추대를 제거하여 최소한 3-4개의 이차 추대를 유도한 후, 식물 형질전환 운반체가 보유된 아그로박테리아 배양액을 5% 수크로즈(sucrose)와 0.05% silwet77이 함유된 용액에 OD 0.8 정도로 희석한 현탁액을 꽃봉우리에 분사하여 아그로박테리아를 감염시킨다. 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 하룻밤동안 배양한 후 23℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 4～5일간 배양한 후 상기와 동일한 방법으로 배양·희석한 아그로박테리아를 재차 화기조직에 분사하고 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 하룻밤동안 배양한 후 23℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 꼬투리 조직(silique)이 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 3～5주간 생육시킨 후 채종하였다. 채종된 종자는 다시 파종하여 생육 2주째 일차, 3주째 이차로 0.3% 바스타를 살포함으로써T1세대의 형질전환체를 선발하였다. T1 형질전환 식물체는 23℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 꼬투리 조직(silique)이 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 2달간 생육시킨 후 T2 종자를 채종하였다.
5.
GUS
청색발색
반응 분석
형질전환 T2 종자를 발아시켜 청색발현 유전자(GUS)의 발현을 관찰하였다. 대조구로는 비형질전환 애기장대와 35S 프로모터를 가진 pBI121 벡터로 형질전환된 애기장대를 발아시켜 사용하였다. 청색발색 유전자의 발현여부를 관찰하기위해 유묘나 각종 조직을 GUS-assay buffer [X-gluc(cyclohexyl ammonium salt) 20mM, NaH2PO4 H2O 100mM, NaEDTA 10mM, Triton X-100 0.1%, pH7.5]에 침지하고 37℃에서 하룻밤 처리 후, 버퍼용액을 버리고 물로 닦아준후 70중량% 에탄올에 침지하고 37℃에서 1시간에 한번씩 클로로필 (chlorophyll)이 완전 제거될 때까지 반복하여 갈아주었다. 식물체는 입체현미경으로 관찰하였으며 도 10은 청색발색 유전자의 발현을 관찰한 것이다.
비형질전환 애기장대의 경우 청색발색은 관찰되지 않았으나, SIR131-2682 라인과 SIR2682-131 라인에 의해 형질전환된 애기장대의 경우에는 청색발색이 관찰되므로 SPLCV 프로모터에 의해 GUS 단백질이 발현됨을 볼 수 있다. (도 10)
도 1은 SPLCV 중합효소 연쇄반응 검정 및 전체 서열 결정을 위한 부분 유전자 서열의 증폭 결과 전기영동 사진을 나타낸 것이다. 예상되어진 크기의 SP1 (1632 bp), SP2 (2138 bp) 단편이 DNA 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭되어졌다.
도 2는 전체 서열 결정을 위한 프라이머 디자인을 나타낸 것으로, 프라이머 서열이 SPLCV상에 어떤 위치에 존재하는지를 보여주는 프라이머 디자인 모식도로써 증폭된 지역 중 겹치는 부분을 이용하여 바이러스 전체 염기서열을 확보하였다.
도 3은 SPLCV 서열 확인을 위한 시퀀싱 프라이머의 디자인을 나타낸 것이다
도 4는 SPLCV의 2828 bp 길이에 해당하는 전체 염기서열이다[물결무늬 표시: 각각의 해당 제한효소인식 서열].
도 5는 국내산 고구마로부터 순수 분리된 SPLCV의 유전체 지도를 나타낸 것이다[화살표는 각각의 유전자(상보적인 유전자 가닥; C1, C2, C3, C4, 바이러스 유전자 가닥; V1, V2)를 의미한다].
도 6은, SPLCV 의 유전자간 영역의 양방향성 프로모터 활성을 확인하기 위한 프로모터 영역의 deletion set과 리포터 유전자의 융합 방법에 대한 개념도이다.
도 7은, 1,2차 PCR을 통해 상동 재조합 싸이트를 양 말단에 가진 프로모터 deletion set의 증폭을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 8은, PCR 산물과 재조합되는 pDONR221 벡터의 유전자지도이다.
도 9는, 프로모터 분석에 사용되는 게이트웨이 운반체인 pBGWFS7 벡터의 유전자지도이다.
도 10은, 형질 전환된 애기장대에서 청색발색 유전자(GUS)의 발현을 관찰한 사진이다. (A: 형질전환 되지 않은 애기장대, B: SIR2682-262 line으로부터 확인된 GUS 발현 C: 35s promoter를 가진 pBI121 vector의 형질전환체, D: SIR131-2682 line으로부터 확인된 GUS 발현 , E: SIR2682-131 line으로부터 확인된 GUS 발현)
<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION
<120> The bidirectional promoter using Sweet potato leaf curl virus
Korean isolate
<160> 24
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 278
<212> DNA
<213> Sweet Potato Leaf Curl Virus Korean isolate
<400> 1
ttggagacac gcataagttc aaatgaattg gagactggag acaatatata gtatgtctcc 60
aaatggcatt ctggtaattt agaagatcct tttagcttta attcaaattc cgacaactct 120
gggtccacca aaaggcgggc accgtattaa tattaccggt gcccgccgcg ccctttaata 180
gtgggcccca caagggacca cgcgtctttt ccgtactgtc tttaatgatt actttgcttt 240
ataaggacca atcaggtttc cgtgcttggg cgccaaga 278
<210> 2
<211> 2828
<212> DNA
<213> Sweet Potato Leaf Curl Virus Korean isolate
<400> 2
taatattacc ggtgcccgcc gcgcccttta atagtgggcc ccacaaggga ccacgcgtct 60
tttccgtact gtctttaatg attactttgc tttataagga ccaatcaggt ttccgtgctt 120
gggcgccaag aatggagcag ttgtgggacc ctttgcagaa cccactcccg gatactttat 180
acggttttag gtgtatgcta tccgtaaaat acttgcagag tattttgaag aaatacgagc 240
caggaacctt agggttcgag ctctgttcgg agttaatccg tatattcagg gtcaggcagt 300
atgacagggc gaattcccgt ttcgcggaga tttcatccat atggggggag accggtaaga 360
cggaggctga acttcgagac agctatcgtg ccctacactg ggaatgctgt cccaattgct 420
gcccgaagct atgtcccggt ttcaagaggc gtccggatga agagaaagag gggtgaccgc 480
atcccgaagg gatgtgttgg tccctgtaag gtccaggact atgagttcaa gatggacgtt 540
ccccacacgg gaacgtttgt ctgtgtctcg gattttacta ggggaactgg gcttactcat 600
cgcctgggta agcgtgtttg tgtgaagtcc atgggtatag atgggaaggt ctggatggat 660
gacaatgtgg ccaagagaga tcacaccaat atcatcacgt attggttgat tcgtgacaga 720
aggcccaata aggatccgct gaactttggc caagtcttca ctatgtatga caatgagccc 780
actactgcta agatccgaat ggatctgagg gatagaatgc aggtattgaa gaagttctct 840
gttacagttt caggaggtcc atacagccac aaggagcagg ccttaattag gaagtttttt 900
aagggtttgt ataatcatgt tacttacaat cataaggaag aagctaagta tgagaatcag 960
ttagaaaatg ctttgatgtt gtatagtgct agcagtcatg cgagtaatcc tgtgtatcag 1020
accctgcgtt gcaggtctta tttctatgat tcgcacaata attaataaaa ttatatttta 1080
ttaatacagt aatatcttta catcatcatt acaatctaca gtatctactt catctatcca 1140
agaacatact cttggaagat atctaataac aaaaactaaa ttaactaaac taaaaaaccc 1200
taaatttgct aattcattac atatacgcca tttaaggcgt tccaaaatac cagtccaact 1260
gtgaatagca ccagttagac gggtcgtcaa gatccggaat tggaggaaga tcttgtggaa 1320
tcccagttgc ctcctttccc tgtagttgac ccacatctgg aatttgagga tggttctccc 1380
ctgtgtgctc tcgtgggcat acataattct gagatggaac ggtgcagtcc gacccacaga 1440
catggggttg gtgtcgaatt cgagtgctct cgtagtctga gcatgactta gtgattcccc 1500
tgtgcgtgaa tccatgctga tacttgcagt ttggggtgat gaaggctgaa cagccgcaac 1560
ccttccacac tatccttgtc ctctgttcag gaactttcct cttggccttc ttcgcctctg 1620
cgtgcagtgg ctcctgaatg ggacacttcc tcttgattcc agaagggaga ttggacatcg 1680
cagaatatag cgtttgctgt tgcccaattc ttgagtgctc cttgctctgg tttgtccaac 1740
cagagtttaa atgaggagcc ctctcctgga ttgcagagga agatagtggg aattccacct 1800
ttaatttgaa ctggctttcc gtatttacag ttggattgcc agtccttctg ggcccccatg 1860
aattccttaa agtgctttag gtattggggg ttgacgtcat caatgacgtt ataccaagca 1920
ctgttgctgt atacttttgg gcttagatct aaatgcccac acaaataatt gtgagggccc 1980
aaagacctgg cccatactgt tttgcctatt ctgcttgggc cttcaataac aatggatatg 2040
ggtctatccg gccgcgcagc ggcatccatg acattttcag cggcccagtc gctgataatg 2100
tcaggaactg cattgaaaga agaagatgaa aaaggagaag aatatacaga aggaggagga 2160
gaaaaaatcc tatctaaatt actaactaaa ttgtgaaatt gaaacaaata tttttcaggg 2220
agtttctccc taattatttg caacgcagct tctttagaac ctgcgtttag agcctctgcg 2280
gctgcgtcat tagcagtctg ctggcctcct ctagcagatc tgccgtcgac ctggaattca 2340
ccccaggtga tggtatcccc gtccttgtca acgtaggact tgacatcgga cgaggattta 2400
gctccctgaa tgttggggtg aaagtgattc gatctgttcg gtgagaccag atcgaagaat 2460
ctgctatttg tgcagacgaa tttgccttcg aactgcacca gcacatggag gtgaggttcc 2520
ccatcctcgt gcagttctct tgctacgtgt atgtattttt tgttggtggg tgtttggata 2580
tttaggagtt gggctaggca gtcctctttt gagagagaac agcgtggata agtaataaaa 2640
taatttttgg cctgaatttt aaaacgtttt ggaggagcca tttggagaca cgcataagtt 2700
caaatgaatt ggagactgga gacaatatat agtatgtctc caaatggcat tctggtaatt 2760
tagaagatcc ttttagcttt aattcaaatt ccgacaactc tgggtccacc aaaaggcggg 2820
caccgtat 2828
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPF1 (forward)
<400> 3
ctcgtgcagt tctcttgcta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPR1 (reverse)
<400> 4
gcaactggga ttccacaaga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPF2 (forward)
<400> 5
gtgtatcaga ccctgcgttg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPR2 (reverse)
<400> 6
atacggtgcc cgccttttgg 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPR3 (reverse)
<400> 7
ccttcaaaag tgggccccac a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPR4 (reverse)
<400> 8
atgacagggc gaatgcgcgt t 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5SpLCV2ndSeq
<400> 9
gatgtgtggg tccctgtaag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5SpLCV2Seq_Rc
<400> 10
cttacaggga cccacacatc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5SpLCV3rdSeq
<400> 11
agtaatcctg tgtatcagac 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5SpLCV4thSeq
<400> 12
ctgtgcgtga atccatgctg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5SpLCV5thSeq
<400> 13
cctattctgc ttgggccttc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5SpLCVlastSeq
<400> 14
aaaggcgggc accgtattaa 20
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5SP2682Vs
<400> 15
aaaaagcagg ctttggagac acgcataagt tc 32
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5SP2557Vs
<400> 16
aaaaagcagg cttttttgtt ggtgggtgtt tg 32
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3SP262Vs
<400> 17
agaaagctgg gtagctcgaa ccctaaggtt cc 32
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3SP131Vs
<400> 18
agaaagctgg gttcttggcg cccaagcacg ga 32
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5SP262Cs
<400> 19
aaaaagcagg ctagctcgaa ccctaaggtt cc 32
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5SP131Cs
<400> 20
aaaaagcagg cttcttggcg cccaagcacg ga 32
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3SP2557Cs
<400> 21
agaaagctgg gttttttgtt ggtgggtgtt tg 32
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3SP2682Cs
<400> 22
agaaagctgg gtttggagac acgcataagt tc 32
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> attB1adaptor
<400> 23
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> attB2adaptor
<400> 24
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29
Claims (1)
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 국내 고구마 잎말림병 감염 DNA 바이러스의 양방향성 프로모터.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080038415A KR101452405B1 (ko) | 2008-04-24 | 2008-04-24 | 국내 고구마 잎말림병 감염 ｄｎａ 바이러스의 양방향성프로모터 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080038415A KR101452405B1 (ko) | 2008-04-24 | 2008-04-24 | 국내 고구마 잎말림병 감염 ｄｎａ 바이러스의 양방향성프로모터 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20090112492A KR20090112492A (ko) | 2009-10-28 |
| KR101452405B1 true KR101452405B1 (ko) | 2014-10-23 |
Family
ID=41553657
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020080038415A KR101452405B1 (ko) | 2008-04-24 | 2008-04-24 | 국내 고구마 잎말림병 감염 ｄｎａ 바이러스의 양방향성프로모터 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101452405B1 (ko) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103361350B (zh) * | 2013-07-02 | 2015-04-22 | 华中农业大学 | 一种同时具有低温诱导活性和马铃薯块茎特异表达活性的融合启动子pCLdb及其构建方法 |
| CN116445540B (zh) * | 2023-04-27 | 2024-05-10 | 中国科学院华南植物园 | 一种甘薯曲叶病毒侵染性克隆的构建方法及甘薯高效简易的侵染方法 |
-
2008
- 2008-04-24 KR KR1020080038415A patent/KR101452405B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| L. R. Krake 등. Molecular Plant-Microbe Interactions Journal. Vol. 11, No. 5, 페이지 413-417 (1998.) * |
| 국제공개공보 WO2004/101798(2004.11.25.) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20090112492A (ko) | 2009-10-28 |
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