KR101993478B1 - 배추 유래의 조직 특이적 및 고발현 활성을 갖는 신규 프로모터 - Google Patents

배추 유래의 조직 특이적 및 고발현 활성을 갖는 신규 프로모터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배추 유래의 조직 특이적 프로모터에 관한 것으로, 상세하게는 식물체의 조직 특이적 발현을 유도할 수 있는 배추 유래의 프로모터를 개시하고, 이를 이용하여 목적 유전자를 식물체에 조직 특이적으로 발현시키기 위한 것이다. 본 발명에 따른 조직 특이적 프로모터는 조직 특이적으로 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있기 때문에 고부가가치 유용성분을 대량으로 생산할 수 있는 형질전환 식물의 개발에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

배추 유래의 조직 특이적 및 고발현 활성을 갖는 신규 프로모터{Novel promoter having tissue specific and high level expression in plant from Brasscia rapa}
본 발명은 배추로부터 유래된 조직 특이적 및 고발현 활성을 갖는 신규 프로모터에 관한 것이다.
최근 들어 유전공학 기술이 발달함에 따라 식물의 형질을 개량시키고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체로부터 얻고자 하는 기술들에 대해 많은 관심이 대두되고 있는데 이러한 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체에서 발현시키고자 할 때 유전자 발현을 조절하는 프로모터(promoter)가 요구된다.
일반적으로 프로모터란 유전자가 언제 어디서 얼마나 발현할 것인가를 결정하는 작용을 하는 염기서열, 즉, 유전자의 발현을 조절하는 기능을 갖는 조절영역의 일종으로써, 그동안 끊임없는 연구들을 통해 여러 종류의 프로모터들이 밝혀진 바 있다. 종래 보고된 프로모터들은 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 등 그 특징 및 기능에 따라 구분 되어질 수 있는데, 보다 구체적으로 살펴보면, 첫째로 발현 양을 최대화 할 수 있는 강한 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현 양을 최대화하는데 이용되는 프로모터로써 형질전환체 연구 초기에 많이 이용되었으며, 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S RNA 유전자의 프로모터(CaMV 35S) 및 벼의 액틴(actin) 유전자 프로모터가 대표적이다. 이들은 식물의 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제 저항성 유전자, 식물의 병충해 억제 유전자 또는 식물을 이용한 물질 생산 등의 목적으로 주로 사용되고 있다.
둘째로, 발현 시기를 제한하는 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물 발달 단계 중 특별한 시기에만 국한시키는 프로모터로써 다양한 특성을 가진 것들이 보고되어 있다. 예를 들어, 개화에 관련된 유전자들의 프로모터는 개화기에만 유전자를 발현시키며, 각종 생물학적(biotic) 또는 비생물학적(abiotic) 스트레스에 의하여 발현되는 유전자들의 프로모터들도 시기를 조절하는 프로모터에 포함시킬 수 있다.
셋째로, 발현 조직을 제한하는 조직 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물체의 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 프로모터들이다. 이러한 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 사용하고자 하는 다양한 목적에 따라 식물체의 각 조직에 대하여 활발히 연구되고 있다.
특히, 상기와 같이 기능 및 특징에 따라 구분되어진 프로모터들 중 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 식물체 내에서 발현되는 조직에 따라 다시 다음과 같이 분류되고 있다. 첫째로, 전신발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물체 전신에서 발현을 유도하는 프로모터로는 발현 양을 최대화하는데 이용되는 프로모터이기도 한 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍자엽 식물용 프로모터로 사용되고 있으며, 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자의 프로모터들이 주로 이용되고 있고, 최근에는 벼 시토크롬 C 유전자(OsOc1)의 프로모터가 개발된 바 있다. 이들도 상기 발현 양을 최대화하는 프로모터와 동일하게 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하는 목적으로 사용되고 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.
둘째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로는 벼 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재까지 단자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시키는 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 및 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터가 있다.
셋째로, 뿌리 특이 발현 프로모터로서 이는 아직까지 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근에는 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS) 및 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이적으로 발현을 유도하며, 당근 및 무에서는 뿌리 특이적으로 일시적 발현을 유도한다는 내용이 보고된 바 있다.
넷째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있는데, 이와 관련된 프로모터로는 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼 및 옥수수 유래의 알비씨에스(rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스(PDS: phytoene synthase) 프로모터 및 배추 꽃의 화분 특이적인 배추 유래의 올레오신(oleosin) 프로모터 등이 있다.
이러한 종자, 뿌리 또는 잎 특이적 발현 프로모터들은 식량이나 식품, 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 사용이 기대되고 있는 실정이다.
그러나 상기 공지된 프로모터들, 특히 식물체의 전 조직에서 발현을 유도하는 프로모터들은 식물체의 잎과 세포분열이 활발한 조직을 제외한 다른 조직에서는 목적 유전자의 발현양이 적은 단점이 있으며, 또한 상기 프로모터에 의한 유독효과로 인하여 형질전환 식물체가 왜소하게 되거나 재생이 되지 않는 등의 문제점이 있다. 또한, 식물체에서 조직 특이적으로 발현을 유도하는 것으로 알려진 종래의 프로모터들은 조직 특이적으로 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 장점이 있으나, 그 발현 양이 미미한 단점이 있다. 따라서 식물체 내에서 목적 유전자의 발현을 조직 특이적이면서도 대량으로 발현시킬 수 있는 유용한 새로운 프로모터의 발굴이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은, 식물체에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시킬 수 있는 새로운 프로모터를 발굴하려고 노력하던 중, 배추에서 분리한 프로모터가 식물체의 조직 특이적으로 목적 유전자를 고발현 유도하는 활성이 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제0429335호
따라서 본 발명의 목적은 식물체의 조직 특이적 프로모터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 식물체의 조직 특이적 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 13으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 배추 유래의 조직 특이적 및 고발현 프로모터를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 염기서열로 이루어진 프로모터는 식물의 영양조직에서 목적 유전자를 특이적으로 고발현시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 7 내지 13으로 이루어진 군 중에서 선택되는 염기서열로 이루어진 프로모터는 식물의 생식조직에서 목적 유전자를 특이적으로 고발현시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생식조직은 암술 또는 수술일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 목적 유전자는 GUS일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 유전자의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형질전환체는 애기장대 또는 배추일 수 있다.
본 발명에 따른 조직 특이적 프로모터는 조직 특이적으로 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있기 때문에 고부가가치 유용성분을 대량으로 생산할 수 있는 형질전화 식물의 개발에 유용하게 이용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 애기장대와 배추의 프로필린 유전자를 비교하여 보여주는 계통수를 나타낸 것이다.
도 2는 배추에서 유식물, 꽃밥 및 암술 내에서 BrPRF의 RNA 발현 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 애기장대와 배추에서 PRF4의 프로모터 보존 서열을 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 애기장대와 배추에서 PRF5의 프로모터 보존 서열을 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 애기장대와 배추에서 PRF4 및 PRF5의 프로모터 보존 서열을 비교하여 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 식물체의 특정 조직에서 목적 유전자의 발현을 특이적으로 유도하는 신규한 조직 특이적 프로모터를 규명한 것에 그 특징이 있다.
본 발명자들은 식물체에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시킬 수 있는 새로운 프로모터를 발굴하기 위하여 Brassica 데이타 베이스에 공지된 배추(Brasscia rapa)의 게놈 염기서열에서 프로필린(profilin) 유전자의 프로모터 부위라고 예상되는 부분을 규명하였다. 즉, 본 발명자들은 배추의 게놈 염기서열에서 애기장대의 프로필린 유전자와 서열 유사도가 높은 13개의 유전자를 검색하였고, 이들 13개의 배추 프로필린 유전자의 프로모터 부위라고 예상되는 부분에 대한 특이적 프라이머를 선별한 후, 야생형 배추로부터 게놈 DNA를 추출하고 상기 제작한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 프로필린 유전자의 프로모터 부위라고 예상되는 DNA 단편을 수득하였으며, 이들 DNA의 염기서열을 분석한 후, 이들 염기서열을 서열번호 1 내지 13으로 기재하고, 이를 "BrPRF 프로모터"라고 명명하였다.
한편, 프로필린이란 액틴 결합 단백질로 알려져 있는데, 액틴 세포골격은 세포 극성, 분할면 결정, 세포 신장 및 세포벽 증착 등 식물의 발달과정 중 특히 동적 과정에 기여한다. 즉, 식물은 토양에서 나와 빛에 반응하면서 그 형태가 시시각각 변하게 되는데, 이는 세포골격의 변화에 따른 세포 수준에서의 변화로, 이 과정 중 액틴 결합 단백질로 잘 알려진 프로필린이 관여한다. 프로필린은 액틴의 중합과 격리에 중요한 역할을 한다고 알려져 있고, 광도에 따른 세포 및 기관에서 프로필린 발현의 조절은 식물 발달에 있어 매우 중요하다. 즉, 프로필린은 단량체 G-액틴과 결합하여 중합을 저해하거나, 단량체인 G-액틴에 결합한 ADP를 ATP로 교환시키는 촉매 작용을 함으로써 액틴 필라멘트의 중합을 활성화시키는 등 액틴 세포 골격을 역동적으로 조절한다.
또한, 프로필린은 대부분의 균류, 동물, 원생생물, 효모, 인간 및 딕티오스텔리움(Dictyostelium)에서 오직 하나 또는 두 개의 유전자에 의해 암호화되어 있다고 알려져 있으나, 애기장대와 옥수수 등의 식물에서는 수 개의 유전자를 암호화하고 있다고 보고되었다. 특히, 애기장대에서 분석된 바에 따르면 애기장대의 프로필린은 그 서열 유사도 및 발현 양상에 따라 크게 3 그룹으로 구분할 수 있는데, 주로 생장 조직에서 발현되는 생장 유형(vegetative type)으로 PRF1과 PRF2가 있고, 주로 화분에서 발현되는 생식 유형(reproductive type)으로는 PRF4와 PRF5가 있으며, 서열 유사도 및 발현이 생장 유형과 어느 정도 유사하나 발현량이 PRF1 또는 PRF2보다 상대적으로 작고, 서열의 변화가 많아 생장 유형과 다른 기능을 가지거나, 그 기능을 상실하고 있는 것으로 생각되는 프로필린 유사 유형(profilin-like type)으로 PRF3이 있다.
이에 본 발명자들은 배추 유래의 프로필린 프로모터가 식물체 내에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시키는지 확인하기 위하여, 상기 본 발명의 프로필린 프로모터에 발현 추적용 GUS 유전자를 융합시켜 애기장대 내에서 GUS 유전자의 발현 양상을 확인하였다.
그 결과, 서열번호 1 내지 4는 생장조직 즉, 유목에서 GUS 유전자가 특이적으로 발현되고, 서열번호 8 내지 13은 생식조직, 즉 꽃가루에서 GUS 유전자가 특이적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
반면, 서열번호 1 내지 4 및 7은 생식조직에서 그 발현량이 미비하였고, 서열번호 8 내지 13은 생장조직에서 GUS 유전자가 전혀 발현되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명자들은 상기 결과로부터 본 발명의 프로필린 프로모터가 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시키는 것을 확인할 수 있었다.
또한 본 발명자들은 배추 유래 PRF 유전자 발현이 애기장대와의 유전자 서열비교에서 예측된 것과 잘 일치하는 것으로 나타났는데, BrPRF1a, b, 및 c의 경우, 유식물에서 강한 발현을 보인 반면, 암술과 꽃밥에서는 비교적 약한 발현을 보였다. 또한 BrPRF2는 생장 유형 중에서 가장 강한 발현을 보이는 것으로 나타났고, BrPRF3a 및 b는 유전자 발현이 거의 되지 않았으나, BrPRF3c는 BrPRF1들 유사한 수준의 발현을 보였다. 또한, 애기장대 프로필린 중 생식 유형의 경우, 이들의 발현은 주로 화분에서 나타나는 것으로 알려져 있는데, BrPRF4 와 BrPRF5에 속하는 모든 유전자는 꽃밥에서만 발현을 보였다(도 2 참조).
이와 같은 사실을 통해 본 발명자들은 애기장대와 배추에 존재하는 PRF 유전자들의 서열 및 발현이 매우 잘 보존되어 있다는 것을 알 수 있었고, 배추 유래의 본 발명의 프로모터를 이용하는 경우, 식물체 내에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 고발현시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.
따라서 본 발명의 프로모터를 이용하면 외부에서 유래한 목적 단백질을 식물체의 조직 특이적으로 고발현시킬 수 있는 재조합 발현 벡터를 제조할 수 있다.
따라서 본 발명은 식물체의 조직 특이적 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 유전자의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
상기 프로모터는 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 흔히 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 또한, 이러한 프로모터 중에는 모든 조직에서 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터가 있으며, 특히, 본 발명에 따른 프로모터는 식물체의 생장조직 또는 생식조직에서만 특이적으로 발현을 유도한다.
상기 "발현 벡터"라는 용어는 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 식물체의 지상부 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
상기 본 발명에 따른 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로는 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드가 있고, 식물 바이러스 벡터가 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용할 수 있다. 그러나 당업자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 상기 목적 단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물체의 조직 특이적으로 발현되길 원하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현된 단백질을 말한다. 또한, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다.
본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 유전자의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 숙주 세포내로 도입할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터를 숙주 세포내로 도입하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘(CaCl2) 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 유전자의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터 로 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포로는 세균(bacteria)이 바람직하며, 그 일실시예로 Agrobacterium tumefaciens GV3101을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 식물체 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법을 사용할 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 유전자의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물체 내로 도입함으로써 형질전환된 식물을 제공한다.
상기 본 발명에 따른 형질전환된 식물은 당업계의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 식물은 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환 한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 본 발명에 따른 형질전환된 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체 뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.
< 실시예 1>
배추로부터 프로필린 유전자의 프로모터 부위 규명
본 발명자들은 배추 유래의 조직 특이적 프로모터를 확보하기 위하여 애기장대 프로필린(profilin) 유전자와 상동성이 있는 염기서열을 BLAST를 이용하여 검색하였고, 그 결과 배추 프로필린 유전자로 예상되는 상동성이 높은 13개의 유전자를 발견하였다(표 1 참조). 본 발명자들은 상기 유전자들의 상위 1.5 ~ 2 kb 부분에 대한 특이적인 프라이머를 제작하였다(표2 참조).
Gene name Bra ID Closest Arabidopsis homolog gene name (Arabidopsis)
BrPRF1a Bra039018 AT2G19760 PRF1 (PROFILIN 1)
BrPRF1b Bra036707 AT2G19760 PRF1 (PROFILIN 1)
BrPRF1c Bra031097 AT2G19760 PRF1 (PROFILIN 1)
BrPRF2 Bra011099 AT2G19760 PRF1 (PROFILIN 1)
BrPRF3a Bra006865 AT5G56600 PRF3 (PROFILIN 3)
BrPRF3b Bra014545 AT5G56600 PRF3 (PROFILIN 3)
BrPRF3c Bra002804 AT5G56600 PRF3 (PROFILIN 3)
BrPRF4a Bra010331 AT4G29340 PRF4 (PROFILIN 4)
BrPRF4b Bra024148 AT4G29340 PRF4 (PROFILIN 4)
BrPRF4c Bra011098 AT4G29340 PRF4 (PROFILIN 4)
BrPRF5a Bra036705 AT2G19770 PRF5 (PROFILIN 5)
BrPRF5b Bra031101 AT2G19770 PRF5 (PROFILIN 5)
BrPRF5c Bra039019 AT2G19770 PRF5 (PROFILIN 5)
프라이머 서열 목표 프로모터
Bra036707-F ATG TGT ATC TTC CAC TTC CCT AC BrPRF1b
Bra036707-R TTC CAT TGA TTT CTT CAG TCT TCA A BrPRF1b
Bra011099-F CTT GTG ATG TTG AGA AGA TAA GTG BrPRF2
Bra011099-R TTC CCT CTA TCT CAG CAG GCT TTA A BrPRF2
Bra002804-F CCA CGA CCA GCC TTG CAA TGG AC BrPRF3c
Bra002804-R TGC CAC TGA TTT CCT CAG GCT TCA A BrPRF3c
Bra006865-F GCA ATT GGG TAC AGG ATT CTC GTG BrPRF3a
Bra006865-R CTT CGT CTG CTT AGC TCT GCT TC BrPRF3a
Bra010331-F CCA ATT AGA AGA ACA CAT CAC CTC BrPRF4a
Bra010331-R CTT CTT CTT CTC TCC TAA CGT TTT C BrPRF4a
Bra024148-F TTC TTT ACC CAC ATG ACC GTG CAG BrPRF4b
Bra024148-R CGT TAT ATG TTA TGA GCA GCG TTG BrPRF4b
Bra011098-F CCA ACA TCA GCC TCT ACG GTC TTG BrPRF4c
Bra011098-R GTT ATC TTA TGT TAT GTG CAG CGT G BrPRF4c
Bra036705-F CCC AAA TGA AGG TGA GTC TTG ATG BrPRF5a
Bra036705-R TCT CGA TCT CTT TCT TGT TCT TCC BrPRF5a
Bra031101-F TTG AGT CAG AGG CTT TGC TGT TAC BrPRF5b
Bra031101-R TAA TAT TCC AGG ACG CTC GTT TG BrPRF5b
Bra039019-F CCA CTG ACC CAT CGA TCC GGT AAG BrPRF5c
Bra039019-R CGA TTT CTT TCT TGT TCT TCC TGG BrPRF5c
이후 배추로부터 게놈 DNA를 추출한 후, PCR을 수행하였다. 이때, 상기 PCR 조건은 95℃에서 10분간 변성 후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 68℃에서 2분간 반응을 1 사이클로 하여 30회 실시한 다음, 68℃에서 10분간 반응하였다. 이후 상기 PCR 반응에서 수득한 DNA의 염기서열을 분석하였다.
그 결과, 배추로부터 조직 특이적 프로모터라고 예상되는 PCR 반응 산물을 획득할 수 있었고, 상기 PCR 반응에서 획득한 DNA 산물의 염기서열을 각각 서열번호 1 내지 13으로 나타내었으며, 이러한 DNA 산물 모두를 배추에서 유래된 프로필린 유전자라고 하여 "BrPRF 프로모터"로 명명하였다.
< 실시예 2>
배추의 PRF 유전자 발현 분석
배추의 PRF 유전자는 애기장대와 비슷하게 그 서열 유사도 및 발현 양상에 따라 3가지 그룹으로 분류되어 지는데, 도 1에 나타낸 바와 같이, PRF1 과 PRF2는 주로 생장조직에서 발현되는 생장유형이며, PRF4와 PRF5는 화분에서 주로 발현되어 생식 유형으로 분류할 수 있고, PRF3의 경우, 서열 유사도 및 발현이 생장 유형과 어느 정도 유사하나 발현이 PRF1 혹은 PRF2에 비해 상대적으로 약하고 서열의 변화가 많아 생장 유형과 기능이 다르거나, 기능을 상실하고 있는 것으로 생각되어, profilin-like으로 분류된다. 또한, 배추는 오래전에 3배수화 된 것으로 생각되는데, PRF2의 동위형을 제외한 나머지 배추의 PRF 유전자들은 각 애기장대 동위형에 대해 3개씩 존재하여, 애기장대의 PRF 유전자들은 배추와 애기장대가 분화하기 이전부터 있었던 것으로 예측하고 있다.
이에 본 발명자들은 배추의 PRF 유전자들은 서열 분석을 통해, BrPRF 들이 생장 유형, 생식 유형 및 proflin-like의 3 그룹으로 분류될 수 있음을 밝혔고, 각각 그룹의 경우, 유전자 발현이 특이적이라는 사실이 애기장대 PRF를 통해 확인하였는 바, BrPRF들도 애기장대와 유사한 발현 양상을 보일 것으로 예측하였다.
따라서 이를 확인하기 위해, 본 발명자들은 유식물(seedling), 암술(pistil) 및 꽃밥(anther)을 대상으로 각 유전자의 RNA 발현 양상을 살펴보았다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, BrPRF들의 유전자 발현은 유전자 서열에서 예측된 것과 잘 일치하는 것으로 나타났는데, BrPRF1a, b, 및 c의 경우, 유식물에서 강한 발현을 보인 반면, 암술과 꽃밥에서는 비교적 약한 발현을 보였다. 또한 BrPRF2는 생장 유형 중에서 가장 강한 발현을 보이는 것으로 나타났고, BrPRF3a 및 b는 유전자 발현이 거의 되지 않았으나, BrPRF3c는 BrPRF1들과 유사한 수준의 발현을 보였다. 또한, 애기장대 프로필린 중 생식 유형의 경우, 이들의 발현은 주로 화분에서 나타나는 것으로 알려져 있는데, BrPRF4 와 BrPRF5에 속하는 모든 유전자는 꽃밥에서만 발현을 보였다.
이와 같은 사실을 통해 본 발명자들은 애기장대와 배추에 존재하는 PRF 유전자들의 서열 및 발현이 보존되어 있다는 것을 알 수 있었고, 나아가 프로보터 부위도 일부 보존되어 있다는 것을 알 수 있었다.
실제 염기서열 분석을 통해서도 화분에서 특이적인 발현을 보이는 애기장대 PRF4와 BrPRF4들의 프로모터 영역의 서열을 비교한 결과, 전사시작점에서 -184와 -1 사이 구간에서 잘 보존된 구간이 확인되었다(도 3 참조). 이러한 보존된 부분은 PRF5와 BrPRF5 들에서도 발견되었으며(도 4 참조), 이 보존된 서열들은 PRF4와 PRF5에서 공통적으로 나타났다(도 5 참조). 그러나, 이러한 보존된 부위는 PRF1 혹은 PRF2 의 프로모터 부분에서 나타나지 않았다. 이러한 사실은 애기장대와 배추의 PRF4와 PRF5의 발현이 꽃밥(anther) 혹은 화분에서 나타나는 것으로 미루어 볼 때, 보존된 부분의 서열이 이들의 공통적인 발현에 관련되어 있을 가능성이 있음을 제시한다고 생각된다.
< 실시예 3>
BrPRF 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터의 제조
상기 실시예 1에서 분리한 BrPRF 프로모터를 애기장대에 형질전환하여 조직 특이적 프로모터로서의 사용 가능성을 확인하기 위하여, BrPRF 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하였다. PCR을 통해 증폭된 BrPRF 프로모터 부위는 pENTR dTOPO에 삽입되었으며, 이후 gateway reaction을 통해 GUS 유전자가 융합되는 형질 전환용 바이너리 벡터인 pMDC32로 클로닝되었다.
< 실시예 4>
BrPRF 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 애기장대의 제조
상기 실시예 3에서 제조한 재조합 발현 벡터를 이용하여 애기장대를 형질전환 시켰다. 즉, 상기 발현 벡터를 Agrobacterium tumefaciens GV3101 균주에 도입시킨 후, 이를 이용하여 야생형 애기장대 Col-0 (Arabidopsis thaliana ecotype Col-0)를 형질전환 시켰다. 또한 이때 본 발명의 프로모터 활성 비교를 위해 프로모터 유전자 이후에는 GUS 유전자가 오도록 재조합 벡터를 설계하였다. 구체적으로 먼저, 벡터로 형질 전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101 균주를 5ml의 LB배지에서 O.D가 1.8이 되도록 배양한 다음 상기 배양액을 4000rpm에서 10분 동안 원심 분리하였다. 이후, 5% sucrose 및 250 ppm 트윈 20(tween 20)을 포함하는 MS 액체배지로 침전된 세포들을 현탁시켜 아그로박테리움 배양액을 제조하였다. 형질 전환시킬 애기장대는 종자를 파종한 후 22℃ 배양기에서 16시간 낮 및 8시간의 밤 조건으로 약 4주간 생육한 후 식물체의 일차 추대를 제거하여 최소한 3-4개의 이차 추대를 유도한 후, 상기 제조한 아그로박테리움 배양액을 꽃봉우리에 분사하여 애기장대를 형질전환 시켰다. 이후, 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 하룻밤동안 배양한 다음 22℃ 배양기에서 16시간의 낮 및 8시간의 밤 조건에서 5일간 더 배양시키고 상기와 동일한 방법으로 반복한 후 22℃ 배양기에서 16시간 낮 및 8시간 밤 조건에서 약 3~5주간 생육 시킨 후 형질전환된 애기장대로부터 종자를 수확하였고, 상기 수확된 종자는 다시 파종하여 T1 세대의 형질전환체를 제조하였다.
< 실시예 5>
형질전환된 애기장대에서 BrPRF 프로모터에 의한 GUS 발현 분석 조사
본 발명자들은 본 발명의 BrPRF 프로모터가 식물체 내에서 유전자의 발현을 조직 특이적 및 고발현으로 유도하는지 확인하기 위하여 본 발명의 BrPRF 프로모터가 삽입된 상기 실시예 4에서 재조합 발현 벡터로 형질전환된 애기장대의 각 조직에서 GUS 유전자의 발현 양상을 분석하였다. 이때 대조군으로는 비형질전환된 애기장대를 사용하였다.
즉, 상기 실시예 4의 형질전환된 애기장대를 대상으로 GUS 유전자의 발현여부의 관찰은 상기 발아시킨 유묘 및 상기 형질전환된 애기장대의 각 조직(암술 및 수술 포함)을 GUS-시험 버퍼(X-gluc(cyslohexyl ammonium salt) 20mM, NaH2PO4 H2O 100mM, NaEDTA 10mM, Triton-X-100 0.1%, pH7.5)에 침지하고 37℃에서 하룻밤 처리한 후, 상기 버퍼용액을 버리고 물로 세척한 후 70% 에탄올에 다시 침지하여 37℃에서 1시간에 한번씩 엽록소가 완전히 제거될 때까지 반복하여 갈아주었다. 이후 상기 식물체를 해부현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 앞서 실시한 실험 결과와 동일하게 배추의 PRF 유전자들은 BrPRF1, BrPRF2, BrPRF3 프로모터의 경우, 유식물체에서 강한 발현을 보이는 것으로 나타났고, BrPRF4 와 BrPRF5는 수술에서 강한 발현을 보이는 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 규명한 배추 유래의 신규 프로모터인 BrPRF 프로모터가 식물체 내에서 조직 특이적으로 고발현 유도할 수 있는 특징이 있다는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
BrPRF1a - 배추에서 발견된 애기장대 PRF1과 상동성 높은 유전자
BrPRF1b - 배추에서 발견된 애기장대 PRF1과 상동성 높은 다른 유전자
BrPRF1c - 배추에서 발견된 애기장대 PRF1과 상동성 높은 또 다른 유전자
BrPRF2 - 배추에서 발견된 애기장대 PRF2와 상동성 높은 유전자
BrPRF3a - 배추에서 발견된 애기장대 PRF3과 상동성 높은 유전자
BrPRF3b - 배추에서 발견된 애기장대 PRF3과 상동성 높은 다른 유전자
BrPRF3c - 배추에서 발견된 애기장대 PRF3과 상동성 높은 또 다른 유전자
BrPRF4a - 배추에서 발견된 애기장대 PRF4과 상동성 높은 유전자
BrPRF4b - 배추에서 발견된 애기장대 PRF4과 상동성 높은 다른 유전자
BrPRF4c - 배추에서 발견된 애기장대 PRF4과 상동성 높은 또 다른 유전자
BrPRF5a - 배추에서 발견된 애기장대 PRF5과 상동성 높은 유전자
BrPRF5b - 배추에서 발견된 애기장대 PRF5과 상동성 높은 다른 유전자
BrPRF5c - 배추에서 발견된 애기장대 PRF5과 상동성 높은 또 다른 유전자
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Novel promoter having tissue specific and high level expression in plant from Brassicia rapa <130> PN1209-461 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2320 <212> DNA <213> Brasscia rapa BrPRF1a promoter DNA sequence <400> 1 attttgatct ttagaatcta tatttgtgac ataaactttt ttagtgatat tataagtatt 60 tctttattga gttattagtg gttgaatcta tactatacta aaaggaggat aatctccaat 120 tctagcatgt ccacgtcagc ataaataatc attcaatcag aacatttcgt ttttgggctg 180 ggctttaaaa tttttctgaa ttaacttatg tgtgggtttc ttttgatttg ggattgggct 240 tttagatcat ctaataatta gatctaggtc tacgacgtgg agctgaagtc gcccgtgtct 300 cttctcgcct cctctaccac ttcatcttct ctcttctcct ctgccacttc gacttctccc 360 cgtagaccat ttcgactgag ttttaatcga tccatcaata ctacttcttt atggtttcac 420 tcaagctcct ttttttcctc tttctttata tactgctcca ttcctatttc ttctatcaat 480 tttctcttac actcctttaa ttttaattga tatgatcgtt ctgactcccc atgtctctcc 540 tcctatataa aaaccttttc cgacctccaa gctcattcaa caacatccat aaaatgtcct 600 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taattttaca aaatttgaaa 1020 tcttatccca aaacctcact tctcaactct aaaccctaaa acctaaactc taaaccctaa 1080 aacctaaact ctaaacccca ccccttgagt gctatgttta tgacttttga ccttgagtgc 1140 tagtttggga acaaaaactt gatttagtgc tatttttgtc tttttctcta ataattattc 1200 cggcggaatt taatcgttat aaatagggga atcgaggaca agaagaaagc taacgtggca 1260 gttaaggaaa taatgatgaa gctataacaa aggcgagacg tgggctaatt gaaattttaa 1320 tttcgaaaaa aattgagagg ttcggctgag aatgcgtcta tgtaattaag cggttgagaa 1380 tatcattgtt gccgagtttc tttatctctc ccctatttat ctgaaggaca aagtccccac 1440 gctgcacata acataagata ac 1462 <210> 11 <211> 704 <212> DNA <213> Brasscia rapa BrPRF5a promoter DNA sequence <400> 11 actttttcgc gaaaaacaca tatttcctca ataaccgcaa aaatattttc ggccaaaacc 60 gtaaaaatgc tatttttatg ccgaaacgta aaaaattata ttttagtcat tttattaaca 120 agtccaccta gatgcagatg aaagttaaaa aatgacaagc aaacgaacat agttgcattc 180 agatgattca tttggatgca tgaacgaaat gaagaaacga acaacaccca gatggagcat 240 ctggataaga catctagatg gaccatctgg atgcatcttc cagatgtaca aacgaacagg 300 gcctaactca aaagtaaaac attctctatg tcaaattaat actcaaaaga ggttgttcaa 360 gagggcacta ttacaaaatc atggtcctaa tcgtttcctt aaatccttct tgttcgttat 420 aaataggagg aaattggcaa ggacacttgg cgtgaatgga gttaatgatt aacctagaac 480 aaaggcgaga cgtgagcaga attaattgaa attttattag gggctgagaa tatgtctttt 540 gagtctaacg gttcagattc atcttgcgac attcttgtta ggtccctatt tatcgagaga 600 ggacaaagtc ctctcagagt tgaattgcat tgcacgtaca tacgtaaaga ccttaaaaaa 660 acgaaccggg tagagaaaaa ggaagaacaa gaaagagatc gaga 704 <210> 12 <211> 1505 <212> DNA <213> Brasscia rapa BrPRF5b promoter DNA sequence <400> 12 ttgagtcaga ggctttgctg ttactgaaac tggggagtat aaataaagat ccatgaatgt 60 tgttgttggg ggaggatgat agagagttgt taggcaaatc agaggagtgt ctctgcattt 120 gaggcaagtt cagagaggtt gttctcagga tttgaaggac cttggcgtta gggttcatag 180 ccttctcgtc ttggtattgt tacgttttgt acgataagaa attagatcgt cttttacatc 240 ttagagtctt atcagctaca tacccacaaa agtacacgaa ctcgtcgtag atgatacagt 300 caatatcatt gccatgttgc agcaacaact gacctataca gtccttaaag cttgcctcac 360 tcgttttgtt 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tgtttaaatc cttcttgttc gttataatta ggaggaaatt 1260 ggcaaggaca cttggcgtgc atggagtcag tgattaagct agaagaaagg cgagacgtga 1320 gtataattaa ttgaatttta tgagcggctg agaatgtgtc tttagaatcc atcggttcag 1380 acttcatcta aagacatttt ggtagctcct taaatatcga gagagaagac aaagtcaccc 1440 gtcagagttg cattgcacat acatacgtag agagattaaa aacaaacgag cgtcctggaa 1500 tatta 1505 <210> 13 <211> 1457 <212> DNA <213> Brasscia rapa BrPRF5c promoter DNA sequence <400> 13 ccactgaccc atcgatccgg taagtccttt taacataatg agaaagaagg tttttggata 60 agctttaaga agtaagaaca tgctaacgtt tattatggtt gttaatgtca acattgtcac 120 attaaaagat acaaaagctg gcaataccac tccgaggttg acttaaataa taatcaaaat 180 tattttaaaa ttttgacaat atttacgatg atgctggtga atttttctga tcacttaata 240 aaaactttga attttctatt ttttataact tatagtatgt cgcccttatt tattagctat 300 tgataatata ataagtttga aacactcata tactgaagcc tatgaatttt cgatggagga 360 ttttctacac cgaattctat agaagaataa tgtatctttc aattaatgat tgcttaagat 420 atttattata tatttattta aaaaatgaag atgatcgcat taaatctaac tgattgtatc 480 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atttttgcta gctccctatt taacgagcga gagacgacga agtctcctca 1380 gagttgcatg cattgcacat acatacgtaa gaagattatt aaaaattaac aaaccaggaa 1440 gaacaagaaa gaaatcg 1457

Claims (8)

  1. 서열번호 8 내지 13으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 배추 유래의 생식조직 특이적 및 고발현 프로모터로서,
    상기 프로모터는 식물의 생식조직에서 목적 유전자를 특이적으로 고발현시키는 것인 배추 유래의 생식조직 특이적 및 고발현 프로모터.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 생식조직은 암술 또는 수술인 것을 특징으로 하는 프로모터.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 목적 유전자는 GUS인 것을 특징으로 하는 프로모터
  6. 제1항의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 유전자의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  7. 제6항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 형질전환체는 애기장대 또는 배추인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
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