CN102399782B - 玉米低温干旱诱导型启动子及活性分析 - Google Patents

Abstract

玉米低温干旱诱导型启动子及活性分析属生物工程技术领域，本发明提供了一种获得的玉米低温干旱诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1645bp区的DNA核苷酸序列；同时提供：用于玉米转化的低温干旱诱导型的植物表达载体，包含玉米低温干旱诱导型启动子序列和玉米锌指蛋白基因ZmZFP基因的5’非翻译区；用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的PCR引物适于扩增包含SEQ IDNO：1的序列DNA片段；本发明可用于启动抗低温、干旱基因的高效表达，应用于不耐低温、干旱的转基因植物中使植株获得抗低温、干旱的性状，对于解决低温、干旱地区粮食危机问题有积极意义。

Description

玉米低温干旱诱导型启动子及活性分析

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及一段DNA序列，在低温和干旱胁迫下它可以作为启动子调控基因的表达。具体涉及一种来源于玉米锌指蛋白基因ZmZFP并在植物中高度表达的低温、干旱诱导型启动子序列。

背景技术

中国是一个人口众多的农业大国，粮食安全生产事关国计民生与社会稳定。低温、干旱等逆境是影响植物生长发育的主要非生物胁迫因子。近年来，由于全球气候变化导致干旱、洪涝、冰冻、热浪等极端气候事件频繁发生，给我国的农业生产造成了不利的影响。如去年冬季至今年早春的这段时间，我国北方大部分地区持续干旱，长期无雨和少雨形成的土壤干旱使作物根系不能从土壤中吸收足够的水分以补偿蒸腾的消耗而受害，导致植物出现生理性生长不良，抑制了植物的正常生长发育，进而导致其抗病能力下降，严重影响产量；2008年初发生在我国南方大部分地区的雨雪冰冻及低温冷冻灾害造成的直接经济损失达11亿多元。目前，干旱、低温等气象逆境对农业生产造成的损失人们还没有太好的办法进行防御。对于干旱，人们只能选择种植一些相对耐旱的作物或者是采用滴灌等先进的灌溉技术，然而目前先进的灌溉技术成本高，很难大范围的应用，而耐旱作物虽然耐旱，但不一定适合当地的其它气候条件及当地的种植习惯；对于低温，人们只能利用温室栽培或者推迟种植的方式来抵御，但温室建设增加了成本且不利于小麦等需要大面积种植的粮食作物的使用，而推迟种植时间也很难避开突发性的低温天气，更有可能错过作物的种植时间。这些都导致了人们对于干旱和低温等气象逆境的无奈。因此，科学研究者只能转而培育抗低温的品种。

自转基因技术成熟以来，科学家们已经得到了很多转基因品种。然而，由于转入的基因大多数是由组成型启动子驱动表达的，组成型启动子具有高效表达、且在植物整个生长期都表达的特点，这使得大部分的转基因作物都具有植株矮小的特点，不利于植物的正常生长。而诱导型启动子在某些特定的物理或化学信号的刺激下，能够快速有效地诱导基因的转录，来抵御不良环境的影响。诱导型启动子独特的优点是它能根据自身的需求在特定的组织器官、环境下诱导基因转录，解决组成型启动子面对的问题。迄今为止，从玉米中分离的逆境诱导型的启动子很少。

目前，分离和鉴定的低温、干旱诱导型启动子并不多，同时抗低温和干旱的启动子更少，一般为转录因子类蛋白基因的启动子，如DREB类、WRKY类、bZIP等。Shinozaki等(1994)从拟南芥干旱和低温诱导表达的rd29A基因上游分离到该基因的启动子，该启动子能够被干旱、低温和高盐等非生物胁迫因素诱导驱动下游基因的表达，命名为rd29A启动子，同时识别出对启动子活性起关键作用的DRE元件：TACCGACAT。rd29A启动子是目前抗逆植物基因工程中应用最广泛的诱导型启动子，被连接到许多转录因子基因的上游并转化入植物中，用以研究这些基因逆境胁迫诱导表达的方式。

利用低温、干旱诱导型启动子驱动抗低温、干旱基因的高效表达，从而改良作物的耐低温、干旱性成为目前研究的热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的抗低温、干旱相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种低温、干旱诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目的基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米锌指蛋白基因ZmZFP。

本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的低温、干旱诱导型启动子真核表达载体，该载体指导高水平表达目的基因ZmZFP的低温、干旱诱导型启动子序列和5’非翻译区。

本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因玉米成熟胚。该转基因玉米胚能反映启动子诱导活性的高低。

为实现上述目的，本发明克隆了玉米锌指蛋白基因ZmZFP的低温、干旱诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体，所述载体包含带有ZmZFP基因的5’非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米成熟胚中诱导表达，并观察到该启动子与低温、干旱诱导相关的高水平活性。

本发明提供一种获得的玉米低温干旱诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1645bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，低温、干旱可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。

获得的玉米低温干旱诱导型启动子序列源自玉米锌指蛋白基因ZmZFP。

一种克隆得到的玉米锌指蛋白基因ZmZFP的5’非翻译区包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的+1bp至+230bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，本发明所述的玉米锌指蛋白基因ZmZFP的5’非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。

为实现另一个目的，本发明提供一种用于玉米转化的低温、干旱诱导型的植物表达载体，所述植物表达载体包含玉米低温、干旱诱导型启动子序列和玉米锌指蛋白基因ZmZFP的5’非翻译区。

上述用于玉米转化的低温、干旱诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含T-DNA(转移DNA)的RB(右边界序列)和LB(左边界序列)，能够在根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)Ti质粒存在下转化植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体，例如pCAMBIA1301载体、pBI121载体。

一种用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚，包含玉米低温干旱诱导型启动子序列和玉米锌指蛋白基因ZmZFP的5’非翻译区。

本发明提供SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的PCR引物，适于扩增包含SEQ ID NO：1的序列DNA片段。

关于本发明所述的用于植物的诱导型载体(pCAMBIA1301)，所述的玉米锌指蛋白基因ZmZFP的启动子和5’非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米锌指蛋白基因ZmZFP的启动子和5’非翻译区至含有GUS报告基因的载体中而构建的pCAMBIA1301。但是，所述GUS报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。

本发明提供一种应用低温、干旱诱导型瞬时表达的玉米成熟胚。

植物能通过使用根癌农杆菌(An，G.1987，Plant Physiology)或粒子轰击方法(Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)将上述植物低温、干旱诱导型启动子二元载体进行转化。

本发明提供来自玉米锌指蛋白基因ZmZFP的低温、干旱诱导型启动子和5’非翻译区，根据本发明的启动子和5’非翻译区使得能够在植物中进行低温、干旱诱导表达。

本发明的有益效果在于可用于启动抗低温、干旱基因的高效表达，应用于不耐低温、干旱的植物中使植株获得抗低温、干旱的性状，对于解决低温、干旱地区粮食危机、生态恶化等问题都有积极意义。

附图说明

图1为玉米(B73)基因组电泳图

图2为ZmZFP-pro PCR电泳图

图3为ZmZFP-pro连T载酶切鉴定电泳图

图4为ZmZFP-pro连pCAMBIA-1301 PCR鉴定电泳图

图5为ZmZFP-pro连pCAMBIA-1301酶切鉴定电泳图

图6为pCAMBIA 1301::ZmZFP-Pro转农杆菌PCR鉴定电泳图

图7为植物表达载体构建示意图

图8为ZmZFP启动子的GUS检测(背面)照片

图9为ZmZFP启动子的GUS检测(正面)照片

图10为ZmZFP启动子的GUS检测(背面)照片

图11为ZmZFP启动子的GUS检测(正面)照片

图8和9中：ZmZFP(a)：4℃处理；ZmZFP(b)：未处理；35S

图10和11中：ZmZFP(a)：20％PEG处理；ZmZFP(b)：未处理；35S：应用最广泛的组成型启动子

具体实施方式

下面结合附图介绍具体实施步骤，将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。尽管已经结合本发明的优选的具体实施方式来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。

实施例1：玉米锌指蛋白基因ZmZFP的低温干旱诱导型启动子的克隆

玉米锌指蛋白基因ZmZFP的启动子(启动子序列包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1645bp区的DNA核苷酸序列)，在玉米ZmZFP基因的5’区序列中得到鉴定。

玉米锌指蛋白基因ZmZFP登录在NCBI GenBank(登录号：EU963900.1)，序列表显示本发明上述基因的植物低温、干旱诱导型启动子和5’非翻译区的DNA序列。在本文件的启动子序列表中，转录起始位点的碱基G用+1示出，ATG用红色下划线标注。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。启动子分析网站http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/。

以玉米基因组DNA(图1)为模板，扩增得到目的片段，经1％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出长度为1875bp的条带(图2)，并进行回收。回收片段与pMD18-T载体连接得到重组质粒pMD18-T::ZmZFPPro，提取质粒并进行酶切验证(图3)，并测序。

更具体地说，通过PCR扩增克隆的玉米锌指蛋白基因ZmZFP的启动子和230bp的5’非翻译区(见序列表)，上述PCR所用引物详细显示在表1中。对于PCR扩增，反应程序：95℃ 3min；95℃30S，58.5℃30S，72℃2min，32个循环；72℃10min；

表1：引物

上游引物	5’TGCACTGCAGCCTTCCACCAACGTATAAACC 3’	SEQ ID NO：2
			下游引物	5’GGAAGATCTTGCTCCATGGCTTCCTTAACT 3’	SEQ ID NO：3

实施例2：植物低温干旱诱导型载体的构建

将在实施例1中所克隆的玉米锌指蛋白基因ZmZFP的低温、干旱诱导型启动子和230bp的5’非翻译区ZmZFPPro(见序列表)插入到载体中，从而构建植物低温、干旱诱导型载体。

更具体地说，是将植物表达载体pCAMBIA 1301及重组质粒pMD18-T::ZmZFPPro用PstI和Bgl II分别进行酶切，然后将它们插入载体pCAMBIA1301的PstI和Bal II酶切位点。该载体被称作pCAMBIA 1301::ZmZFPPro，用于驱动GUS基因的表达，经PCR鉴定(图4)和酶切鉴定(图5)获得启动子与载体的重组质粒。

在图7中，以编码β-葡糖酸醛酶的基因GUS为报告基因，选择标记为潮霉素抗性基因。此外35s-pro代表HPTII的启动子，而35s-ter代表HPTII的终止子，ZmZFPPro代表GUS的启动子，而Nos-ter代表GUS的终止子。

实施例3：鉴定玉米低温干旱诱导型启动子的活性

通过电激转化法，将在实施例2中构建的载体pCAMBIA 1301::ZmZFPPro转移到根癌农杆菌EHA105中，提取质粒并进行PCR鉴定(图6)。

为鉴定启动子的低温、干旱诱导活性，利用Jefferson等(EMBO J，1987)的方法将玉米的胚低温(4℃)、干旱处理再检测GUS的活性。

更具体地说，是将玉米种子浸泡催芽，然后将种子纵切成两半，分别4℃、20％PEG诱导培养24h，将玉米种子在GUS检测液中于37℃过夜，GUS检测液：1mg/ml X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)、50mM磷酸钠缓冲溶液(PH＝7.0)，10mM EDTA，0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、0.1％TritonX-100，20％甲醇。如图8和图9所示，经过4℃诱导的玉米胚显示出高水平的GUS活性，而未经诱导的玉米胚显示出低水平的GUS活性；如图10和图11所示，经过20％PEG诱导的玉米胚显示出高水平的GUS活性，而未经诱导的玉米胚显示出低水平的GUS活性。

工业实用性

如上所述，本发明提供玉米锌指蛋白基因ZmZFP的低温、干旱诱导型启动子和5’非翻译区。

本发明提供分别将玉米锌指蛋白基因ZmZFP的启动子和5’非翻译区插入至pCAMBIA1301而获得的植物表达载体。

经使用所述的植物表达载体进行鉴定，本发明所述的玉米锌指蛋白基因ZmZFP的启动子和5’非翻译区能够在低温、干旱诱导后启动下游基因的表达。因此，本发明可用于提高耐低温、干旱基因的启动活性，最终获得能用于生产的耐低温、干旱粮食作物或植被。

序列表

SEQ ID NO.1的序列(带功能元件标记)

(i)序列特征：(A)长度：-1bp至-1645bp；+1bp至+230bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

-1645    CCTTCCACCA ACGTATAAAC CCTATTGTAG TCTGAATTAT AAAGGGCATG

-1595    TTTGGTTCAG TTTTTTCTGA CCAGCTTTTC TAAGAACATG TCTGTAAAGA

                                                  ←

-154    5AATTTTGGTT GTAGAAAGAA TCTAAATATT ATGGGGATTA CGTGCGGAGG

                                                  ABRE

-1495    AAGATGAAAT GGTTCAAAGG ATCCAGGACC TAGAAAGCGA TGGATTTCTA

-1445    CTATCGTGAC GACTCGATCG ATATTATGTT CATGTTGTTT TTGGACGATT

             TGACG-motif

-1395    TTTACCAAAA TAATTCTTAT AAAAGTACTG AAAAGCTGTG GTGTTTGATG

-1345    ACAGTCTATA TCATCGTTTG GTGACGAGAA GCTAAAAAAG GTCCAAACAA

                O2-site      TGACG-motif

-1295    ACGTGACCAA AACAGCTTGG CCATAAAGTG CCTTTTTTTA CCATGATTCT

                           ←

-1245    GGTAACCTAA CGTTCTTTTA ACGTTCTTTT ACAAGCAGCT TCTATTGTTC

                        TATA-box                     CAAT-box

-1195    TCGATGTATC GGTTAAAACC AGATCACAAG TAAGAGACCG TTTGTAGCAA

         ←

-1145    AAGGATTGGA AGGATTGAAG AGGCTAAAAC CTCTTTATTA TTAAAGGGGA

         P-box

-1095    TTAAGGCTAA AATCTTTCTG CTATTTAAAA TTAAACATCT AGGGAATTTT

                                TATA-box

-1045    AGCTCGTTTA ATCCCTCAAA TGTTTACGAT GAAATTAATT TAACGAAAAT

                       CAAT-box  ←

-995     ATAAAATACC TATTTTTGTG TCACGTATCC GGTATCCCAA AGAGAAGTCC

                             ←ABRE       TATC-box

-945     AATACGTATG CTGCGAAAAC CAGATTAACA TTTCCCAGCT TATCACAAAA

                           ARE

-895     GAAGCAATGA TATTTCCACT CCCAAGGAAA AAAGAGAGAG AAAAAAAGGT

                                           5UTR Py-rich stretch

-845     AGTAGGCGGC AATCCAACGG CGGGGGCCTC CGCCCGCCTC CGGCATGGAA

               CAAT-box  CCAAT-box

-795     AAATCGCCGC GGGGGCCGGC GAGGGGGGCA GCTTCGTCAT TTCCGGCGCC

                 GC-motif                  CGTCA-motif

-745     CTCCTCCTTT CCTTTATCTC TCTCCCCACG CCCCCACGTT TCGCCCCCCA

-695    TTTCGAAGCC CACCGAATTC CCTGCGATTC CTCTCCCCTC GCCTCCTCGT

-645    CTCCCCCTAG GGTTAGCACC TCGCTGCCTC CGATTCAATC ATAATATGGT

                                                  TATA-box

-595    CTCTTCTCCC TTTGATCTGT AGATTTGGGG CTTTGGCTCC GCCTCGCGCG

                                                ←

-545    CCCGATCCGG GCCGTCCTCC TTTTTTCCCC TCTTATATTT GATCGGTTTC

                   A-box                       CAAT-box

-495   TTTGCGTCGT TCACGCAGGG ATCGTCGGAG AGGAATCGCA AAGAGGGCCG

           TGA-element

-445    TCTCATCCGA GGTTCGTGTA TCTGGCCACT CTGCATCCAA TTAATTTCCC

                             ←

-395    CGTTTTTTTA GTTGTCCGGG TCAAAAACTG TGAATTATAT ATATATTTTG

                            W box                TATA-box

-345    CGTGCTTGTT GAGTGGGTCG ATGCGGAACC AATTGAGCCG TTCCGATTTA

                                      CAAT-box

-295    CGCTGTACCT AACAGCGAAC AACAGCCAGA TAATTTTTTT TGGGGGGGTG

-245    GGGGTGGGGT AAGAGCGTTT ATCTGTTGTA AAGGCGAGTC CTTTCCACTT

                            GARE-motif

-195    ATTGGTTGGG TGTGTTGTTG CCTGCTTTGC CGAAAGTTAA TGAGCAGATA

                                       LTR

-145    TGGTTGCTAC TTTGTAGATT TGTTGCGTAA AGCGGCTAAA AGTTGGGCCA

                                          TATA-box TCA-element

-95     TCTTTTTAGA ATTGATTTCA CCCGTGGTGT GTTGCCGTTA GGTGATTCGG

               CAAT-box                                +1

-45     CTGTTAGCCA AATGATAGTG CAGGCTCTAT ATGATAGCAC CTTCAGTTGG

                                     TATA-box          MBS

+6      GCGCTTGACC AAGCTACAAT TACCCTTTTG ATAGCACCTT CAGTCTGGCA

           Box-W1       CAAT-box   P-box

+56      TTAGGTTGCA GCATGTCTTA CTGAATCAAG GCAGTACCAA CTTTCACTTA

+106     GATTTTATGA TTGTTTTTTT ACTACTAGTA GCAACTTTTG GGAAGCTGGT

                    TC-rich repeats

                                      ←                 ←

+156     GACACACTAT GTCGACTACT ATTCTGGTAT TGATCAGTTG TTTCGTATTA

                                    CAAT-box MBS      TATA-box

+206     TTCTAGTTAA GGAAGCC    ATG GAGCA

Claims (3)

1.一种获得的玉米低温干旱诱导型启动子序列，其特征在于所述的玉米低温干旱诱导型启动子序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种用于玉米转化的低温干旱诱导型的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体包含权利要求1所述的玉米低温干旱诱导型启动子序列。

3.一种PCR引物对，其序列如SEQ ID NO：2和3所示，所述引物对适于扩增如权利要求1所述的玉米低温干旱诱导型启动子序列。

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