CN102392020B - 玉米逆境胁迫诱导型启动子的克隆及功能分析 - Google Patents

Abstract

玉米逆境胁迫诱导型启动子的克隆及功能分析属生物工程技术领域，本发明提供一种获得的玉米逆境胁迫诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1150bp区的DNA核苷酸序列；同时提供：用于玉米转化的逆境胁迫诱导型的植物表达载体，包含玉米逆境胁迫诱导型启动子序列和玉米阴离子过氧化物酶基因的5′非翻译区；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的PCR引物适于扩增包含SEQ ID NO：1的序列DNA片段；本发明可用于启动抵抗逆境基因的高效表达，对于玉米抗逆品种转基因技术的研究，培育综合抗性强、优质、高产的转基因新品系具有积极意义。

Description

玉米逆境胁迫诱导型启动子的克隆及功能分析

技术领域

本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种源自于玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)，并可在玉米中高水平表达的诱导型启动子序列。 

背景技术

干旱生态危机已严重影响到人类的可持续发展，因此在农业生产中，急需耐旱、水分胁迫环境下生长良好的粮食作物和植被。随着现代基因工程技术的迅速发展，植物耐旱已从传统的植物生理研究转向分子方面的研究。作物分子育种技术使得以基因水平替代原先的染色体组水平来精细地调节育种的作用成为可能。 

高等植物基因的表达调控已成为分子生物学研究领域的热点，启动子是基因表达调控的重要元件。深入研究启动子的结构和功能，建立可用于植物转基因表达的时、空、量三维调控系统，可为功能基因组学研究及通过基因工程技术精确地调节植物代谢提供全新的思路。 

选择适宜的启动子来驱动目的基因在转基因植物中表达，已成为植物基因工程研究的热点问题之一。针对不同的目的基因，人们选用不同的启动子，从而使靶基因在特定组织或条件下选择性表达，以利于转基因植物的正常生长发育(赵恢武等，2000；刘强等，2000)。对植物在干旱逆境下大量表达的耐旱基因启动子研究表明，不同耐旱基因的启动子往往含有相同的顺式作用元件，并受相同的反式作用因子的调控。这为我们提供了另外一条研究植物耐旱机制的途径。 

国内外科学家利用一些耐旱相关的特异性启动子(如RD29A)、特异性蛋白(如脱水素)、耐旱相关的特异性酶(如TPS)基因进行植物遗传转化并获得了成功，得到一些耐旱品质明显提高的转基因植株。清华大学的刘强等(2002)将来自拟南芥的干旱诱导型基因RD29A的两个转录调控因子转入拟南芥后发现拟南芥的干旱耐受性能有很大提高。高世庆(2006)通过基因枪介导转化小麦幼胚愈伤组织，经过分子生物学检测及在PEG胁迫下的GUS组织化学染色证实了RD29A启动子在小麦愈伤组织中能够诱导GUS基因的表达。也有科研工作者直接利用干旱诱导型启动子启动某些耐旱有关的蛋白表达进行植物耐旱机理的研究。如：利用特异性的启动子启动与耐旱有关的基因(如：脱水素基因等)或特异性的渗透调节物合成酶基因在烟草、拟南芥等模式植物体内表达获得耐旱植株；通常情况下在双子叶植物中常用的组成型启动子CaM35S启动海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)在烟草和拟南芥中均获得耐旱植株，而用诱导型启动子RD29启动TSP(海藻糖-6-磷酸合酶)在烟草中表达，获得了较为明显的耐旱烟草植株。单子叶植物的Ubiquitin-promoter有两部分组成：exon和intron，其中intron具有增强子的功能。目的基因在其启动下能够大量稳定的在单子叶植物体内表达。浙江大学郝中娜等(2005)对水稻OsWRKY19及OsWRKY89基因的启动子进行功能研究，表明这两个基因的启动子是组织特异性表达的诱导型启动子。Brown等(2010)首次发现冬小麦blt101基 因启动子内存在高度保守的TCA-like元件与诱导目的基因在低温胁迫下高效表达密切相关。Takumi(2003)等分离了小麦低温应答基因家族基因Wcor15上游的启动子序列证实该启动子受低温和光诱导。 

利用干旱诱导型启动子驱动抗旱基因的高效表达，从而改良作物的耐旱性成为目前研究的热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的抗旱相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种逆境胁迫诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目标基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)。 

本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的逆境胁迫诱导型启动子载体，该载体指导高水平表达目标基因ZmapH的逆境胁迫诱导型启动子序列和5′非翻译区。 

本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因植物。该转基因植物能反映启动子诱导活性的高低。 

为实现上述目的，本发明克隆了玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)的逆境胁迫诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体，所述载体包含带有ZmapH基因的5′非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米中诱导表达，并观察到该启动子与逆境胁迫诱导性相关的高水平活性。 

本发明提供一种获得的玉米逆境胁迫诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1150bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，逆境环境可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。 

获得的玉米逆境胁迫诱导型启动子序列源自玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)。 

一种克隆得到的玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)的5′非翻译区，包含相对于SEQID NO：1的转录起始位点的+1bp至+543bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，本发明所述的非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。 

为实现另一个目的，本发明提供一种用于玉米转化的逆境胁迫诱导型的植物表达载体，所述植物表达载体包含玉米逆境胁迫诱导型启动子序列和玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)的5′非翻译区。 

上述用于玉米转化的逆境胁迫诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含T-DNA(转移DNA)的RB(右边界序列)和LB(左边界序列)，能够在根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)Ti质粒存在下转化植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体，例如pCAMBIA1301载体、pBI121载体。 

一种用植物表达载体转化的转基因植物，包含玉米逆境胁迫诱导型启动子序列和玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)的5′非翻译区。 

本发明提供SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的PCR引物，适于扩增包含SEQ ID NO：1的序 列DNA片段。 

关于本发明所述的用于植物的诱导型载体(pCAMBIA1301)，所述的玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)的启动子和5′非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)的启动子和5′非翻译区至含有GUS报告基因的载体中而构建的pCAMBIA1301。但是，所述GUS报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。 

本发明提供一种应用逆境诱导型二元载体的转基因植物，以及一种应用本发明所述进行瞬时表达的玉米成熟胚。 

植物能通过使用例如根癌农杆菌(An，G.1987，Plant Physiology)或粒子轰击方法(Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)由上述植物逆境胁迫诱导型启动子二元载体进行转化。在本发明中，例如烟草可以用叶盘转化法进行转化。 

本发明提供来自玉米阴离子过氧化物酶基因(zmapH)的逆境胁迫诱导型启动子和5′非翻译区，根据本发明的启动子和5′非翻译区使得能够在植物中进行逆境诱导型表达。 

本发明的有益效果在于：可用于启动抵抗逆境基因的高效表达，对于玉米抗逆品种转基因技术的研究，培育综合抗性强、优质、高产的转基因新品系具有积极意义。 

附图说明

图1为玉米(B73)基因组电泳图 

图2为ZmapH-pro PCR电泳图 

图3为ZmapH-pro连T载质粒提取电泳图 

图4为ZmapH-pro连T载酶切鉴定电泳图 

图5为pCAMBIA 1301::ZmapH Pro酶切鉴定电泳图 

图6为植物表达载体构建示意图 

图7为pCAMBIA 1301::ZmapH Pro转农杆菌质粒提取电泳图 

图8为pCAMBIA 1301::ZmapH Pro转农杆菌PCR鉴定电泳图 

图9为35s启动子的GUS检测(背面)照片 

图10为ZmapH启动子(未用20％PEG处理)的GUS检测(背面)照片 

图11为ZmapH启动子(用20％的PEG处理24h)的GUS检测(背面)照片 

具体实施方式

下面结合附图介绍具体实施例：以下实施将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。尽管已经结合本发明的优选的具体实施方式来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。 

实施例1：玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)的逆境胁迫诱导型启动子的克隆 

玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)的启动子(启动子序列包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1150bp区的DNA核苷酸序列)，在玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)的5′非翻译区序列中得到鉴定。 

玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)登录在NCBI GenBank(登录号：AF037033.1)，序列表显示本发明上述基因的植物逆境胁迫诱导型启动子和5′非翻译区的DNA序列。在图1中，蛋白合成的起始密码子ATG带有下划线，而且转录起始位点的碱基A用+1示出。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。启动子分析网站http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html。 

以玉米(B73)基因组DNA(图1)为模板，扩增得到目的片段，经1％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出长度为1694bp的特异条带(图2)。电泳后回收目的片段，与pMD 18-T载体连接得到重组质粒pMD 18-T::ZmapHPro，提取质粒并进行琼脂糖凝胶电泳检测(图3)，酶切验证(图4)，并测序。 

更具体地说，通过PCR扩增克隆的玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)的启动子和543bp的5′非翻译区(见序列表)，上述PCR所用引物详细显示在表1中。对于PCR扩增，反应程序：94℃4min；94℃40S，58℃40S，72℃2min，30个循环；72℃10min； 

表1：引物 

上游引物	5′CGGGATCCTGCCGTGATACCGACTTGA 3′	SEQ ID NO：2
			下游引物	5′CCCATGGTTCAGCTTGCTTGTTGCTTG 3′	SEQ ID NO：3

实施例2：植物逆境胁迫诱导型载体的构建 

将在实施例1中所克隆的玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)的启动子和543bp的5′非翻译区ZmapH Pro(见序列表)插入到载体中，从而构建植物逆境诱导型载体。 

具体地说，将植物表达载体pCAMBIA 1301及重组质粒pMD 18-T::ZmapH Pro用BamHI和NcoI分别进行酶切，然后将它们插入载体pCAMBIA1301的BamHI和NcoI酶切位点。该载体被称作pCAMBIA 1301::ZmapH Pro，用于驱动GUS基因的表达，经酶切鉴定(图5)获得了启动子片段，与预期结果相同。 

在图6中，以编码β-葡糖酸醛酶的基因GUS为报告基因，选择标记为潮霉素抗性基因。此外35s-pro代表HPTII的启动子，而35s-ter代表HPTII的终止子，ZmCIPK16Pro代表GUS的启动子，而Nos-ter代表GUS的终止子。 

实施例3：鉴定玉米逆境胁迫诱导型启动子的活性 

通过热激转化法，将在实施例2中构建的载体pCAMBIA 1301::ZmapH Pro转移到根癌农杆菌EHA105中，提取质粒(图7)并进行PCR鉴定(图8)。 

为鉴定启动子的逆境胁迫诱导活性，利用Jefferson等(EMBO J，1987)的方法将玉米的成熟胚逆境处理之一的干旱处理再检测GUS的活性。 

更具体地说，将玉米种子浸泡催芽，然后将种子纵切成两半，用20％PEG诱导培养24h，将玉米种子在GUS检测液中于37℃过夜，GUS检测液：1mg/ml X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)、50mM磷酸钠缓冲溶液(PH＝7.0)，10mM EDTA，0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、0.1％TritonX-100，20％甲醇。如图所示(图9、图10、图11)，经过PEG诱导的愈伤组织显示出高水平的GUS活性，而未经诱导的愈伤组织显示出低水平的GUS活性。 

序列表 

SEQ ID NO.1的序列(带功能元件标记) 

(i)序列特征：(A)长度：-1bp至-1150bp；+1bp至+543bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。 

(ii)分子类型：核苷酸 

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1 

-1150 TGCCGTGATA CCGACTTGAG TCCGAAGGTA CCTGCTCACA CATTATACTT CCAGAAATAC 

-1090 TGTTAAATCC TGTTTTTGAG GACAGCAAAT ATATTTAGAA CCGACCCGTC ACTATATTGT 

-1030 AGTAGTGATG TGGTCTGCAA TTTTTTTTTA TTTCTTCCAT TTTTTGCATA TAAACGTGCT 

-970  AGTGGTGTGG ACGTGTGGTA TGAATTTTTT GGTTGTACTG TGAATGAGAT TGGACCTGTC 

-910  GCTCAGTGCA ATGCGCTTAT ATATCCACTA AGATTGCTAT TAACTGGTAA TGCAGATCCA 

-850  ACTCACAGCA CCTACGCACA TCTACAATAG AAAACGTCAT  CCGAAACACT GTAGAGTCCA 

                                       TGACG-motif   LTR 

-790  GATCAATTTC CCCACGGTGC AAACATGGCA CTATTGCTAG CTGCATACTA CAGAATTGAA 

-730  TAGTACAGCA ACTATGATCC CATCTAGGAA TGACAGTGGT AAGGTATATG TAATTGGCGC 

-670  ACAATGTCAT ACCCATACAT ATTAGAGAAA AATGTCTCAC CCACTACATC GTGGATACAA 

        Skn-1_motif 

-610  AACTACGTCA TACTCATACC CACACCACCC ACCACGGGTA GTGGGTATCC ATCGAATACC 

         CGTCA-motif 

-550  CATATATAAC CACTAACATT ACAATAGACA CGATCAACAA CATTCAACAT TAAATAGCAA 

-490  CATCATACAA GC CATGCATG AGAGAGAACA AGCCCCTTAA TCTGGACTCA TATGTTATAT 

        GCN4_motif  RY-element 

-430  GTTAACGGGT CTCCCATCGA GTAGCGGGTA TTTGGCAAAA GAGAACATGC ACACATCCAT 

-370  CATACCCAAT GTATATAATA AATGACCCAA TAAAATACCT ATAGGTATAA AAAAACACCT 

-310  TATATACATG TGCACTAATA GGTTTTTTTA CCTATCAGAT ATCGGGTTTC AGGTATCCAC 

                       TC-richrepeats                           box II 

-250  GTTGCCACCC CTGATTCCCC ATCTGTGTGG CAGTTGTCTG CAAAACCCAA ATCCTGCACG 

-190  AAACTGCATG CATTTTAGGG TAATATCACA TGCATGCTTG CATTTCATTG GTTGGGTCTC 

-130  TCCACTGCCA CTCTCGACTC GTCGAGACAG AGAGCACTGG GAAGCATGCA CATGCTAAGT 

           CAT-box 

-70   GCAGCACCAT CAGTCCACAG CCCCCGGCAT CACATTAGTG ACTCCACGGA GCAAATAAAA 

                +1          GC-motif 

-10   GAGCCCTCGC CACTCGCCAG TGCTCCAATA GCCCAGTTGC CATCTCCC CCGAGTGGTGCA 

                                                    GC-motif 

+51   GGCCAATCAT TGTTTTTCAA AAAAAAAAAC TTTCTAACCG CCGGAGATTA GAGACCATTA 

           HD-Zip 2                 HSE 

+111  TTGCATGCTG TGCAGGCCGC AGCCGCCGGT CACCCACTAG CTATCGTCGC ACCGAATTAG 

+171  CCTAACCCGA GGTAGTATTA AGCTGTTTAG TATGAGGAAT GATCTAGTCC ATCATCTTTT 

+231  CACTCCTCAC TTTTTTTTGT TTGGTTTGTG GAATAAATTG AGTTGATCAA TCATCACCTC 

                              ARE 

+291  ATTCCTTATA GTTATTTAGT TAGTACTAAT ATGAGAAATG AGATCATCCC ACCAAATTTG 

+351  AGGAATGGAC CTATGATGCA CCACTATATT TTGGATAAAG TGATTCCTCAAACCAAACAA 

        AuxRR-core                                          ARE 

+411  CCCTATATTC CGCGACGGAC GATCGCTTTT TACCGTCTAT AAGAACAACG ATGCAAGAAA 

+471  CTGTGTGGAG TGTGCAAGCT CAATACAGGC ACAGTGGAGA TCGAGACAGC TAGCAAGCAA 

+531  CAAGCAAGCT GAAATG

Claims (3)

1.一种获得的玉米干旱诱导型启动子序列，其特征在于所述玉米干旱诱导型启动子序列如SEQ ID NO：1的-1150bp至+543bp所示。

2.一种用于玉米转化的干旱诱导型的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体包含权利要求1所述的玉米干旱诱导型启动子序列。

3.一种PCR引物对，其序列如SEQ ID NO：2和3所示，所述引物对适于扩增如权利要求1所述玉米干旱诱导型启动子序列。

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