CN116676411B - 一种ZmPRX19基因突变检测引物及其在筛选体细胞再生能力强玉米自交系中的应用 - Google Patents

一种ZmPRX19基因突变检测引物及其在筛选体细胞再生能力强玉米自交系中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种ZmPRX19基因突变检测引物及其在筛选体细胞再生能力强玉米自交系中的应用，利用该特异性引物对玉米中ZmPRX19基因的目标片段进行扩增并测序，如果所得核酸序列相比野生型对照发生了移码突变或大片段碱基插入缺失，那么我们推测该自交系的体细胞再生能力较差，不能作为玉米遗传转化的直接受体。利用本发明可以从基因水平直接对核心自交系的体细胞再生情况进行预测，相比于对每个玉米材料分别进行组织培养，鉴定体细胞再生性状；更有利于快速筛选体细胞再生能力强、可用于遗传转化的玉米自交系。节省了开展植物组织培养实验的人力、物力和财力。

Description

一种ZmPRX19基因突变检测引物及其在筛选体细胞再生能力 强玉米自交系中的应用
技术领域
本发明涉及玉米生物育种技术领域，特别是一种ZmPRX19基因突变检测特异性引物及其在筛选体细胞再生能力强玉米自交系中的应用。
背景技术
利用生物技术手段改良玉米自交系，最经济、最实用的途径是直接把外源目的基因转入到核心自交系的基因组中。然而，由于人们对植物细胞全能性诱导的分子机理了解有限，玉米、小麦等作物缺乏高效的再生系统，已经成为对其进行遗传转化的瓶颈。自1975年Green和Philips率先使用玉米幼胚诱导愈伤组织并获得再生植株以来，大量研究发现多数玉米基因型的胚性愈伤诱导困难，致使核心自交系的体细胞几乎都不能再生，不能作为外源基因的直接受体。截至目前，玉米的遗传转化仍然只能围绕几个不具备育种价值的材料进行。若将这些材料转化后用于生产，还必须经过多代的回交转育，即便如此也常会引入非预期遗传重组，极大地降低了其应用价值。因此，亟需挖掘并鉴定控制玉米植株再生的关键基因及其检测引物，对推动我国高频体细胞再生自交系的分子育种，以至于最终打破转化顽拗型玉米的基因型限制至关重要。
前期我们以北方春玉米核心自交系和构建的分离群体为研究材料，采用全基因组重测序和基因芯片两种方法，联合GWAS和QTL定位两种手段共筛选出14个一致性稳定、主效候选基因，它们广泛参与到信号转导、胁迫响应、糖异生和离子转运等途径中，解释的表型贡献率在5.7％-24.39％之间。其中，过氧化物酶基因ZmPRX19是一个新的候选基因，在已有相关研究中从未得到报道。该基因在绿化愈伤率和绿苗再分化率两个体细胞再生性状中被检测到，解释的表型变异分别达到了14.54％和24.39％。利用qPCR技术对ZmPRX19进行表达模式分析，结果显示该基因在体细胞再生能力强自交系愈伤诱导各阶段的表达均高于再生能力差的自交系。当随着诱导时间的延长，ZmPRX19在再生能力差自交系的表达量趋近于零，而在再生能力强自交系中的表达显著提高，说明基因ZmPRX19对愈伤诱导培养的响应存在差异。2017年Zeng等研究发现超氧化物和H2O2之间的平衡通过拮抗调节WUS基因的表达，已经成为植物干细胞维持和分化的关键开关。抑制超氧化物歧化酶并激活过氧化物酶对建立干细胞中高超氧化物和低H2O2的分布模式十分必要。侧面说明基因ZmPRX19的编码产物也可能在决定玉米体细胞命运中发挥功能。
因此，明确过氧化物酶ZmPRX19对玉米自交系体细胞再生的功能，鉴定可用于筛选体细胞高频再生的分子标记，对选育可用于遗传转化的优良自交系，推动我国玉米生物育种的研发进程具有重要的实际意义。
发明内容
为了解决上述玉米遗传转化过程中存在的瓶颈，本发明提供了一种ZmPRX19基因突变检测引物及其在筛选体细胞再生能力强玉米自交系中的应用。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
本发明的第一个目的是要提供一种ZmPRX19基因突变检测引物，其是根据基因组中ZmPRX19基因的核酸序列设计的双靶点而设计的特异性引物，其中：双靶点序列如下表：
；所述ZmPRX19基因突变检测引物包括：
ZmPRX19-F:AAACAAGGCCCTCCTTTCCC；
ZmPRX19-R:AATCAGCACGAGGACACCAA。
本发明的第二个目的是要提供一种ZmPRX19基因突变检测引物在筛选体细胞再生能力强玉米自交系中的应用，包括以下步骤：
S1、选择体细胞再生能力强、广泛用于遗传转化的玉米自交系KN5585为受体，根据其基因组中ZmPRX19基因的核酸序列设计双靶点，构建目标基因的CRISPR/Cas9编辑载体；
S2、利用农杆菌介导法将构建的重组载体转入受体自交系中，获ZmPRX19基因纯合突变的玉米突变体，分别命名为Zmprx19-1、Zmprx19-2和Zmprx19-3；
S3、将突变体Zmprx19-1、Zmprx19-2、Zmprx19-3及其野生型对照种植在温室。当达到开花期时进行自交授粉，在授粉后约13天从每个材料随机摘取10个果穗带回实验室，在无菌操作台上从每个果穗分别剥取50个幼胚用于组织培养，鉴定胚性愈伤诱导率，绿化愈伤率和绿苗再分化率三个体细胞再生性状；同时，利用上述特异性引物，分别对突变体及其野生型对照的ZmPRX19基因的靶点区段进行核酸扩增并测序，通过序列比对，明确突变体靶点区域的突变类型(点突变、移码突变等)；
S4、根据步骤S3所得的数据，对不同突变类型材料及其野生型对照的表型进行方差分析，明确ZmPRX19靶点区域的移码突变或大片段碱基插入缺失会导致玉米的体细胞再生能力降低。因此，利用所设计的特异性引物对玉米中ZmPRX19的靶点区域进行分析，能够初步筛选体细胞再生能力强，可用于遗传转化的玉米自交系。
与现有技术相比，本发明利用特异性引物对玉米ZmPRX19基因的靶点区域进行扩增，如果该基因在目标片段相比野生型对照发生了移码突变或大片段碱基插入缺失，那么我们推测该自交系的体细胞再生能力较差，不能作为玉米转基因的直接受体。利用本发明可以从基因水平直接对核心自交系的体细胞再生情况进行预测，相比于对每个玉米材料分别进行组织培养，鉴定体细胞再生性状；更有利于快速得到体细胞再生能力强、可用于遗传转化的玉米自交系。节省了开展植物组培实验的人力、物力和财力。
附图说明
图1为野生型自交系KN5585和三个突变体在ZmPRX19基因编辑靶点处的核酸序列比对结果。
图2为Zmprx19纯合突变体及其野生型在愈伤诱导培养4周时的表型对比：图中a为野生型对照，图b为Zmprx19纯合突变体。
图3为Zmprx19纯合突变体及其野生型在胚性愈伤再分化2周时的表型对比：图中a为野生型对照，图b为Zmprx19纯合突变体。
图4为Zmprx19纯合突变体及其野生型胚性愈伤再分化的动态发育过程。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
实施例1
选择体细胞再生能力强、广泛用于遗传转化的玉米自交系KN5585为受体，根据其基因组中ZmPRX19基因的核酸序列设计双靶点，靶点序列信息如下：
野生型自交系KN5585中基因ZmPRX19的核酸序列全长为3253bp，具体如下(序列中加下划线部分分别为靶点1(前)和靶点2(后))：
ATCGCCCCGCTTCCGCCCGCTGGCCGCTGTCCGTCAGCTCTCGCGCTACCGGCTGCGGGATAAGGCAAGCTTGTCGCTCGCCTTGGTGGTGTGCTTCCAGTTCCAGCCACCAGCGCTAGCTTCCTCTGCGTTGCACGTCGGAAATGGATTCCTCTAGCAGAGGCATCCGCTTCCTCGTCCACCGCCGCGCGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGTCGCGTCGTCGTCCCTCGTCGGCACATCGCGTGGCAGGGAGGCGCAGCCGCTGCCCGCGGCGGCGGCCACGGCCCTCGGCAGCAGG CGGTCGCCGGAGCGGCACGGCCTGGCGCTGGACTTCTACGCCAGGACGTGCCCCGCTGTCGACCAGATCGTCGCCAACGTCACCGCCGCCCAGTACAGGGACTTCCCCGCCGCCGGACCCGCCGTGCTCCGCCTCTTCCACCACGACTGCTTCGTGGAAGTACGTAACCGCCCGGAGCTAGCTAGTTACAAGCAAGAGCTGAGCAACTGTTTGTGAATTAGTGCATTGCGTTGCGGTCGTTGGTGTCCTCGTGCTGATTTTGATGTGAAATGCACACGCACGCAGGGGTGTGACGCGTCCATTTTGATCGCGCCGACGGCCGACGCGGCCGCGCCCGCGCGCCCGCCGCCACCCAGGGTGGAGCGCGACATGGAGGAGAACAGGAACCTGCCGCAGGAGGCGTTCGACACGGTGGAGCTCGCCAAGGCTGCCGTGGAGAGCAAGTGCCCCGGGATCGTCTCCTGCGCCGACGTCCTCGCCCTCGCCGCCCGAGACTACGTCCAGCTGGTACGTACGTACCTTTACCTACGCACGCAACGCAAGCTGTCTAGCCCATTCATCTCTCTGGCTTGATTCACGCGGAATAAAAAAAAACGCGGGGGGAGTTTAGCGGTGCGATCAGAGAAGACGGAGCTGGGCCGAAACCGTCTGACCACGTACAGCATTATGCAACCGAAGGCACGAGCAGAGCCTTGGGTTCCGGCGAGAGAGAGAGAGCGCGCGCGATGTGACTCTAGTGCATCACCGGCTCACCGCGTTTGCAACTGAAACCCAACTGACGACAGTTAAAGTTGGTAGGGGTCCAGGTACACTACACTGGCAAGTTAGGACCAAAGCGGCGCGAGGCGGCCGGGGACGGGGAAGAAAAGGTTTACCTGCTTTAATCTGGACTGCTTTTGCACCGCATGTGGAAAAAAAGGCGCAACCGCACATCGTGCCCATGGCCGGGCATGTGTACGTCGTTAGGGACAGGGCTGCGTTTCGCTGTTGGCTTAGCTGCCTAAGCAGGCCAAGCGTCAGGGGCGGTGATGATGATTACGTGACCGTGAAGGGAAACGAAACCATGCTATCCTTGCCGGACCTGGAATTCAATCGCTGTATCGGTGGTCGGTGATCTGCTCAGCGAACTGCTTCTGCTAATTATGGCGCGTCAGTGTGGCTGCAAAGCCTGCAACCGTGGCCGCCCATCATGTTGCATATACGAGTAGGAGTAGTAGTAGCCAGTAGGTTTTAATTTGATTTGCTTAAACGTTTGCTTCGATCTGAGACGAATTAGCACCATCGTCCATCAGTCGCTTTTACGTAACGGCAATTTTGCCTGAACCGTTTCTGCCTTTCCGAATTATAGTGTCTGTACGATTTCCTAATATAGCTAGCTAGGAAGACAAAGTGACAGCCTCAACGTCTAATATCAGTTGAGTTAGGCCTTATTCGTTTCTCCAAAAATACACCATGAATCGTTCTAGGTGATCAAAATTTATACAAACTAAAGAAATAATCCAAGCTAGGAACGGTTATGTCCACCGTTCTGGGAAAACCGAACGGCCCCTTAAGCTAATCTAATCTTGGGATTCGGCACTCCTTGTCCTGGCTTGGATCTTATGGCCACGAGGCACCACAACTGAAGGCCAGCTGATTTGGTGCTGCAATGAGAGTAATTTAGGGCCACATGGGCGTGTTTTATAAGTGCGTCAGGTGACACTTGACATGTGGTCGTCTATGACATGACAGCCTCTGAGCGAGTCAAGTGTCGTGTTCTTCCCTCCCCCAGCAATAGTCAAGCGTCCAACCTGGCGCTGCCTTTGTTGCCTAGTACCACGGTCGCCCATCCTTCTCCTCTCCTGCATCTTTCTGGACCACGCTGGCTGGCTGGCTTGCTAGAAACGGCCGAAAGTCTACGGCTCATAATTTTTTCTTTTAAACTTTTAGGACAACTTTATCCATTCATGCTTTCTTTCTTTCTTTTTTTATTACTTTCAGCCTATATAAGCATTCGGCTGAGAAACTCTCAAATGGCCCTAATGGGATCGGGCCCAGCCCAACAGTAGTGGCCCATCACATGCAACTTTTTGACCTTTTTCTGTTTGCGCAGGTGGGTGGGCCGTACTACGCGGTGAAGAAGGGCCGGAAGGACAGCAAGGTGTCCCTGGCGGGGAAGGTCCGCGGCAGCCTGCCGCGGGCCAACTCGACGGTGGACGAGCTCCTGCGCGTGTTCGCGGGCAAGGGCCTGGGCGCGGCGGACCTGGTGGCGCTCTCCGGCGCGCACACCGTCGGGTTCGCGCACTGCGTCCACGTGCTGGGCCGCATCTACGACTTCCGCGGCACGCGGCGGCCGGACCCGGTCATGGACGCCCGCCTCGTGAAGGCGCTCCGCATGTCGTGCCCGTCGTCGGGCGGCAGCGCCCGCGTCGTGGTGCCCTTCGACGTCAGCACGCCCTTCCAGTTCGACCACGCCTACTACGCCAACCTGCAGGCCAGGCTGGGCCTGCTGGCCTCCGACCAGGCGCTGTTCCTGGACGCGCGCACCAGGCCGCTCGTGCAGGACCTCGCCGCCAACAAGACCCGCTTCTTCCAGGCGTTCGTGGCCAGCATGGACCGGATGGGCTCCATCCGGATCAAGAAGGGGAGGAAAGGAGAGGTCAGGAAAGTCTGTAGCCAGCACCTGTTTTCAGCCTGATCTGCGTCTGCATTCAGCAGCATGCGTCCGTACGTCGTCGTCGGTGTCAGCTCATCAGCGTGCCAGCACCAGCATACACACGGGACTAGCTCGTTCGTGGTTACTACGTTTGGGGCCTCGCGTTGCGTGATTAGAGCTATCTTTGATGCATGTGACGGCAGTTTAGTTTAGAGAGGAGTAGCTTGGCCATTGGTTTTAGGGTCGCGTGTGTTTGTGCAAGAAAATGTGTAATTGTGTATGCATGCAACTATGCAAGTACAGTGTTCTGTTGTGTGTTTTT。
根据如上双靶点序列信息构建目标基因的CRISPR/Cas9表达载体。扩增靶点区域的特异性引物设计如下：
ZmPRX19-F:AAACAAGGCCCTCCTTTCCC；
ZmPRX19-R:AATCAGCACGAGGACACCAA。
利用农杆菌介导法将构建的编辑载体转入受体自交系KN5585基因组中，获ZmPRX19基因纯合突变的玉米突变体，分别命名为Zmprx19-1、Zmprx19-和Zmprx19-3；采用特异性引物对三个突变体及其野生型的编辑靶点区段进行扩增并测序可知：突变体Zmprx19-1相比于野生型在靶点1和靶点2之间删除了80个碱基；突变体Zmprx19-2在靶点2插入了一个碱基T；突变体Zmprx19-3在靶点1和靶点2之间删除了79个碱基。具体如图1所示。
进一步将突变体Zmprx19-1、Zmprx19-2、Zmprx19-3及其野生型对照KN5585分别种植在温室。当达到开花期时进行自交授粉，在授粉后约13天从每个材料随机摘取10个果穗带回实验室，在无菌操作台上从每个果穗分别剥取50个幼胚用于组织培养，鉴定胚性愈伤诱导率，绿化愈伤率和绿苗再分化率三个体细胞再生性状；各材料的体细胞再生表型数据见表1所示。
表1
材料 果穗样本数 取胚总数 胚性愈伤诱导率(％) 绿化愈伤率(％) 绿苗再分化率(％)
KN5585(WT) 10 576 97.66±4.52 93.46±4.67 65.22±17.16
Zmprx19-1 10 496 83.22±11.52 65.09±12.08 12.82±9.55
Zmprx19-2 10 552 84.78±6.14 70.51±9.31 20.04±11.20
Zmprx19-3 10 533 88.26±7.60 82.85±9.07 44.65±14.48
由表1可知：突变体Zmprx19-1、Zmprx19-2和Zmprx19-3的胚性愈伤诱导率、绿化愈伤率和绿苗再分化率三个性状均显著低于野生型对照(P<0.01)。其中突变体的绿苗再分化率最低仅为12.82％，显著低于受体自交系的65.22％，说明基因ZmPRX19的功能缺失抑制了自交系的体细胞再生。图2是Zmprx19纯合突变体及其野生型在愈伤诱导培养4周时的表型对比，从中我们可以看出突变体的愈伤体积明显小于野生型，且愈伤更加紧实，表面颗粒较少。进一步对上述胚性愈伤进行分化培养2周，我们发现各突变体的胚性愈伤虽有所生长，但几乎都不能再生绿苗，而野生型的胚性愈伤再生的绿苗较多且生长旺盛(图3)。突变体及其野生型胚性愈伤再分化的动态发育过程见图4。
以三个Zmprx19纯合突变体及其野生型自交系KN5585为实验对象，采用上述方法实验，其实验结果如图2、图3和图4所示。其中图2为纯合突变体及其野生型在愈伤诱导培养4周时的表型对比；图3为纯合突变体及其野生型胚性愈伤于再分化2周时的表型对比；图4为纯合突变体及其野生型胚性愈伤再分化的动态发育过程。
由图2和图4可知：玉米幼胚在诱导培养4周时，突变体Zmprx19的愈伤体积明显小于野生型，且愈伤更加紧实，表面颗粒较少。
由图2和图3可知：进一步对上述胚性愈伤进行分化培养2周，突变体Zmprx19的胚性愈伤虽有所生长，但几乎都不能再生绿苗，而野生型的胚性愈伤再生的绿苗较多且生长旺盛；说明基因ZmPRX19的功能缺失抑制了玉米自交系的体细胞再生。
上述实验证明了过氧化物酶基因ZmPRX19在编辑靶点区域发生移码突变或大片段碱基插入缺失后，玉米自交系的体细胞再生受到了抑制。因此，根据这一发现，我们今后可利用以上特异性引物对未知体细胞再生表型玉米中ZmPRX19基因的靶点区段进行进行扩增并测序，通过与野生型基因ZmPRX19进行比对，即可快速初步筛选高频体细胞再生的玉米自交系。不仅省去了大批量植物组织培养的劳动密集型工作，而且不再受到玉米取胚的季节性限制，节省了人力、物力和财力。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种ZmPRX19基因突变检测引物在筛选体细胞再生能力强玉米自交系中的应用，包括以下步骤：
S1、选择体细胞再生能力强、广泛用于遗传转化的玉米自交系KN5585为受体，根据其基因组中ZmPRX19基因的核酸序列设计双靶点，构建目标基因的CRISPR/Cas9编辑载体；所述ZmPRX19基因突变检测引物包括：
ZmPRX19-F: AAACAAGGCCCTCCTTTCCC；
ZmPRX19-R: AATCAGCACGAGGACACCAA；
S2、利用农杆菌介导法将构建的重组载体转入受体自交系中，获ZmPRX19基因纯合突变的玉米突变体，分别命名为Zmprx19-1、Zmprx19-2和Zmprx19-3；
S3、将玉米突变体Zmprx19-1、Zmprx19-2、Zmprx19-3及其野生型对照种植在温室；当达到开花期时进行自交授粉，在授粉后13天从每个材料随机摘取10个果穗带回实验室，在无菌操作台上从每个果穗分别剥取50个幼胚用于组织培养，鉴定胚性愈伤诱导率，绿化愈伤率和绿苗再分化率三个体细胞再生性状；同时，利用上述特异性引物，分别对突变体及其野生型对照的ZmPRX19基因的靶点区段进行核酸扩增并测序，通过序列比对，明确突变体靶点区域的突变类型；
S4、根据步骤S3所得的数据，对不同突变类型材料及其野生型对照的表型进行方差分析，明确ZmPRX19靶点区域的移码突变或大片段碱基插入缺失会导致玉米的体细胞再生能力降低；快速初步筛选高频体细胞再生的玉米自交系。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101691573A (zh) * 2009-08-31 2010-04-07 吉林大学 一种腊梅分泌性过氧化物酶的基因、蛋白及其应用
CN102392020A (zh) * 2011-11-16 2012-03-28 吉林大学 玉米逆境胁迫诱导型启动子的克隆及功能分析
CN107987141A (zh) * 2018-01-30 2018-05-04 山东大学 一种玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用
CN109652585A (zh) * 2019-01-25 2019-04-19 河南农业大学 玉米Zm-APX基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用
CN109706158A (zh) * 2019-01-25 2019-05-03 河南农业大学 玉米Zm-Prx5克隆、克隆方法及表达方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101691573A (zh) * 2009-08-31 2010-04-07 吉林大学 一种腊梅分泌性过氧化物酶的基因、蛋白及其应用
CN102392020A (zh) * 2011-11-16 2012-03-28 吉林大学 玉米逆境胁迫诱导型启动子的克隆及功能分析
CN107987141A (zh) * 2018-01-30 2018-05-04 山东大学 一种玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用
CN109652585A (zh) * 2019-01-25 2019-04-19 河南农业大学 玉米Zm-APX基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用
CN109706158A (zh) * 2019-01-25 2019-05-03 河南农业大学 玉米Zm-Prx5克隆、克隆方法及表达方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
玉米单倍体胚性细胞无性系抗大、小斑病性与过氧化物酶活性关系的初步研究;刘国胜, 邹玉华, 黄梧芳, 母秋华;河北农业大学学报(04);79-81 *
玉米幼穗两种愈伤组织的比较研究;李效宇, 卢龙斗, 张根发;广西植物(01);15-19 *
登录号：XM_008677022.4;GenBank;GenBank;全文 *

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