CN102399783B - 玉米低温诱导型启动子及活性分析 - Google Patents

Abstract

玉米低温诱导型启动子及活性分析属生物工程技术领域，本发明提供了一种获得的玉米低温诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1151bp区的DNA核苷酸序列；同时提供：用于玉米转化的低温诱导型的植物表达载体，包含玉米低温诱导型启动子序列和玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻译区；用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的PCR引物适于扩增包含SEQ ID NO：1的序列DNA片段。本发明可用于启动抗低温基因的高效表达，应用于不耐低温的植物中使植物获得抗低温的性状，对于解决低温地区粮食危机有积极意义。

Description

玉米低温诱导型启动子及活性分析

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及一段DNA序列，在低温胁迫下它可以作为启动子调控基因的表达，具体涉及一种来源于玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3并在植物中高度表达的低温诱导型启动子序列。

背景技术

中国是一个人口众多的农业大国，粮食安全生产事关国计民生与社会稳定。低温伤害(包括冷害和冻害)是影响我国大部分地区的严重气象灾害，尤其是东北和黄淮海地区，如东北地区在1969年、1972年和1976年发生了3次严重的低温冷害，每次均使粮食减产50亿千克以上。由于我国幅员辽阔，地形多样，低温冷冻害发生范围非常广，从亚热带、暖温带、中温带一直到寒温带都有冷冻害发生，如2008年初发生在我国南方大部分地区的雨雪冰冻及低温冷冻灾害造成的直接经济损失达11亿多元。目前，冷冻害对农业生产造成的损失人们还没有太好的办法。对于蔬菜等相对小规模的农业生产，人们采用了温室栽培，可以一定程度上抵御冷冻害对生产造成的损失，但温室的建设无疑增加了生产成本，用过的塑料等也容易造成污染。而对于小麦等需要大面积种植的粮食作物，利用温室栽培显然不现实，人们只能根据气象专家对气候的预测来避开低温时期，但由于气候的多变性，预测的准确性很低，对生产指导意义不大。因此，科学研究者只能转而培育抗低温的品种。

自转基因技术成熟以来，科学家们已经得到了很多转基因品种。然而，由于转入的基因大多数是由组成型启动子驱动表达的，组成型启动子具有高效表达、且在植物整个生长期都表达的特点，这使得大部分的转基因作物都具有植株矮小的特点，不利于植物的正常生长。而诱导型启动子在某些特定的物理或化学信号的刺激下，能够快速有效地诱导基因的转录，来抵御不良环境的影响。诱导型启动子独特的优点是它能根据自身的需求在特定的组织器官、环境下诱导基因转录，解决组成型启动子面对的问题。，解决组成型启动子面对的问题。迄今为止，从玉米中分离的逆境诱导型的启动子很少。

目前，分离和鉴定的低温诱导型启动子并不多，主要有油菜的bn115、拟南芥rd29A、cor15a和adh、小麦wes 120和玉米mlip 15等基因启动子。其中拟南芥Columbia品种的基因组中分离得到cor15a基因的启动子，片段大小为900bp，并构建了与GUS基因融合表达载体，转入马铃薯，进行GUS活性检测。转基因马铃薯经过低温处理之后，可检测GUS的活性，反之，则检测不到GUS的活性，说明该启动子受低温诱导。美国康涅狄格大学的Mariya K等构建了cor15a基因的启动子驱动FAD7基因的质粒，将其整合到烟草的基因组中，使烟草获得了抗低温的特性。

利用低温诱导型启动子驱动抗低温基因的高效表达，从而改良作物的耐低温性成为目前研究的热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的抗低温相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种低温诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目的基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3。

本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的低温诱导型启动子真核表达载体，该载体指导高水平表达目的基因ZmDBP3的低温诱导型启动子序列和5’非翻译区。

本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因玉米成熟胚，该转基因玉米胚能反映启动子诱导活性的高低。

为实现上述目的，本发明克隆了玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的低温诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体，所述载体包含带有ZmDBP3基因的5’非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米成熟胚中诱导表达，并观察到该启动子与低温诱导相关的高水平活性。

本发明提供一种获得的玉米低温诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1151bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，低温可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。

获得的玉米低温诱导型启动子序列源自玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3。

一种克隆得到的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻译区包含相对于SEQ IDNO：1的转录起始位点的+1bp至+255bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，本发明所述的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。

为实现另一个目的，本发明提供一种用于玉米转化的低温诱导型的植物表达载体，所述植物表达载体包含玉米低温诱导型启动子序列和玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻译区。

上述用于玉米转化的低温诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含T-DNA(转移DNA)的RB(右边界序列)和LB(左边界序列)，能够在根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)Ti质粒存在下转化植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体，例如pCAMBIA1301载体、pBI121载体。

一种用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚，包含玉米低温诱导型启动子序列和玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻译区。

本发明提供SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的PCR引物，适于扩增包含SEQ ID NO：1的序列DNA片段。

关于本发明所述的用于植物的诱导型载体(pCAMBIA1301)，所述的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的启动子和5’非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的启动子和5’非翻译区至含有GUS报告基因的载体中而构建的pCAMBIA1301。但是，所述GUS报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。

本发明提供一种应用低温诱导型瞬时表达的玉米成熟胚。

植物能通过使用根癌农杆菌(An，G.1987，Plant Physiology)或粒子轰击方法(Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)将上述植物低温诱导型启动子二元载体进行转化。

本发明提供来自玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的低温诱导型启动子和5’非翻译区，根据本发明的启动子和5’非翻译区使得能够在植物中进行低温诱导表达。

本发明的有益效果在于可用于启动抗低温基因的高效表达，应用于不耐低温的植物中使植株获得抗低温的性状，对于解决低温地区粮食危机、生态恶化等问题都有积极意义。

附图说明

图1为玉米(B73)基因组电泳图

图2为ZmDBP3-pro PCR电泳图

图3为ZmDBP3-pro连T载酶切鉴定电泳图

图4为ZmDBP3-pro连pCAMBIA-1301PCR鉴定电泳图

图5为ZmDBP3-pro连pCAMBIA-1301酶切鉴定电泳图

图6为pCAMBIA 1301::ZmDBP3-Pro转农杆菌PCR鉴定电泳图

图1至图6中：Maker从大到小依次为1849bp；1470bp；1090bp；738bp；424bp；280bp

图7为植物表达载体构建示意图

图8为ZmDBP3启动子的GUS检测(背面)照片

图9为ZmDBP3启动子的GUS检测(正面)照片

图8和9中：ZmDBP3(a)：4℃处理；ZmDBP3(b)：未处理；35S：应用最广泛的组成型启动子

具体实施方式

下面结合附图介绍具体实施步骤，将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。尽管已经结合本发明的优选的具体实施方式来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。

实施例1：玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的低温诱导型启动子的克隆

玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的启动子(启动子序列包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1151bp区的DNA核苷酸序列)，在玉米ZmDBP3基因的5’区序列中得到鉴定。

玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3登录在NCBI GenBank(登录号：FJ805751.1)，序列表显示本发明上述基因的植物低温诱导型启动子和5’非翻译区的DNA序列。在本文件的启动子序列表中，转录起始位点的碱基C用+1示出。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。

启动子分析网站http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/。

以玉米基因组DNA(图1)为模板，扩增得到目的片段，经1％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出长度为1406bp的条带(图2)，并进行回收。回收片段与pMD18-T载体连接得到重组质粒pMD18-T::ZmDBP3Pro，提取质粒并进行酶切验证(图3)，并测序。

更具体地说，通过PCR扩增克隆的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的启动子和255bp的5’非翻译区(见序列表)，上述PCR所用引物详细显示在表1中。对于PCR扩增，反应程序：95℃3min；95℃30S，58.5℃30S，72℃2min，32个循环；72℃10min；

表1：引物

上游引物	5’CCGGAATTCCTGTTCAAAAGCGGCGTTT 3’	SEQ ID NO：2
			下游引物	5’CATGCCATGGCTTTGTTCTGGATCACCTGT 3’	SEQ ID NO：3

实施例2：植物低温诱导型载体的构建

将在实施例1中所克隆的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的低温诱导型启动子和255bp的5’非翻译区ZmDBP3Pro(见序列表)插入到载体中，从而构建植物低温诱导型载体。

更具体地说，是将植物表达载体pCAMBIA 1301及重组质粒pMD18-T::ZmDBP3Pro用EcoRI和NcoI分别进行酶切，然后将它们插入载体pCAMBIA1301的EcoRI和NcoI酶切位点。该载体被称作pCAMBIA 1301::ZmDBP3Pro，用于驱动GUS基因的表达，经PCR鉴定(图4)和酶切鉴定(图5)获得启动子与载体的重组质粒。

在图7中，以编码β-葡糖酸醛酶的基因GUS为报告基因，选择标记为潮霉素抗性基因，此外35s-pro代表HPTII的启动子，而35s-ter代表HPTII的终止子，ZmDBP3Pro代表GUS的启动子，而Nos-ter代表GUS的终止子。

实施例3：鉴定玉米低温诱导型启动子的活性

通过电激转化法，将在实施例2中构建的载体pCAMBIA 1301::ZmDBP3Pro转移到根癌农杆菌EHA105中，提取质粒并进行PCR鉴定(图6)。

为鉴定启动子的低温诱导活性，利用Jefferson等(EMBO J，1987)的方法将玉米的胚低温(4℃)处理再检测GUS的活性。

更具体地说，是将玉米种子浸泡催芽，然后将种子纵切成两半，4℃诱导培养24h，将玉米种子在GUS检测液中于37℃过夜，GUS检测液：1mg/ml X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)、50mM磷酸钠缓冲溶液(PH＝7.0)，10mM EDTA，0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、0.1％TritonX-100，20％甲醇。如图8和图9所示，经过4℃诱导的玉米胚显示出高水平的GUS活性，而未经诱导的玉米胚显示出低水平的GUS活性。

工业实用性

如上所述，本发明提供玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的低温诱导型启动子和5’非翻译区。

本发明提供分别将玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的启动子和5’非翻译区插入至pCAMBIA1301而制得的植物表达载体。

经使用所述的植物表达载体进行鉴定，本发明所述的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的启动子和5’非翻译区能够在低温诱导后启动下游基因的表达。因此，本发明可用于提高耐低温基因的启动活性，最终获得能用于生产的耐低温粮食作物或植被。

SEQ ID NO.1的序列(带功能元件标记)

(i)序列特征：(A)长度：-1bp至-1151bp；+1bp至+255bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

-1151  CTGTTCAAAA GCGGCGTTTT GTCCGGTTGC CCGGGAACTC GGACTCGGTC

-1101  CGTAGCAAGC AAGCGGGCGT CCTCGTCGTT TTGGGCAGGAAGCG

                                                CAT-box

-1051  TCAAGCGCAA GTGGTATCGG GACACTGCGG CGACGCGTTC GCCGCACGCG

-1001  GTTCTGGTGC GGGAGCCTCC CAGCTGCTGC CCGCTCTGTG ATACCGATAC

-951   CGTGGG

CAGT

CGGCTCA

GCTGA

TCGCGAGC

              ARE            CAAT-box      CGTCA-motif

                 CAAT-box                      TATA-box

-801   CAG

AA

AGGTG

GCCCT AATCACTCTC AACTCTCTTG

           TATA-box

                                           Skn-1 motif

-751   CTTC

A AGACCTTTAG TTTGCCAAAC

GTA

C

C

                                         TATA-box

-651   TTCAGCAC

TGTC

ACACGA AACATGATAT CTACGGTAAT

-601   TGCATCTTT

AGATAGG TCGTGCCGCC ATTAGGACAA AACTTGCAGC

-551   CATCGTTGTA G

GCCAGGATA AGTCAGG

AGCGCC

                      ABRE                    GCN4-motif

-501   CTAGAGGGCG GGGCCGAGCG GTTGGTCGAT CTATGAGGGC GAGTTTGAAA

-451   ACTCACATCC TCTCCAGAGT TGGAGAGG

AGAGAA ATGAT

                                                     CAAT-box

-401   TTACTCCTCG ATCCCCTCAA CGAACTGGCA TCTTTCATAA

-351   AAGT

GTAAGT AGTTGAAAGT CAAAGGCAGA AGTAAGATAC

              HSE

-301   TAT

TT GTACTAGAAG AAAAGATGTT TTTGGTGA

GTA

        CAAT-box                             TATA-box

-251  TAAGT

C TTTATG

AC

CG

GAAAAA TCA

G

               CAAT-box                              ARE

-201   GT

AGA TTAACCAAAG AAGACCATGT

ACTGGTCCC

                                          TATA-box

-151   AACTCAGACA GTACATGTTC CAAGGATGTTACTG A

TTTT

-101   AACTTAA

TTATTGTA GAAAAATAG

ACGCAT CTTTAA

             CAAT-box               CAAT-box

-51    CACATTTT

AGGAAG TGCCATTTTT A

T AACAAGAGCG

                                           5UTR Py-rich stretch

+50    TAGCGGAAGC TTGTGGTTAC GCTTCCGCCA TA

AGC AT

TA

              ARE        CAAT-box                       02-site

+200

CACTCTA CTACTCGAGA GCTAAGAAAT CGTTCAACAG GTGATCCAGA

+250   ACAAAG

Claims (3)

1.一种获得的玉米低温诱导型启动子序列，其特征在于所述玉米低温诱导型启动子序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种用于玉米转化的低温诱导型的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体包含权利要求1所述玉米低温诱导型启动子序列。

3.一种用于扩增SEQ ID NO：1DNA序列的PCR引物对，其特征在于所述PCR引物对序列如SEQ ID NO：2和3所示。

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