CN102154289B - 玉米干旱诱导型基因启动子及活性分析 - Google Patents

玉米干旱诱导型基因启动子及活性分析 Download PDF

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Abstract

玉米干旱诱导型基因启动子及活性分析属生物工程技术领域,本发明提供了一种获得的玉米干旱诱导型启动子序列,同时提供了用于玉米转化的干旱诱导型的植物表达载体、用植物表达载体转化的转基因植物和适于扩增包含SEQ ID NO:1序列DNA片段的PCR引物。本发明可用于启动抗旱基因的高效表达,应用于耐旱的转基因植物中,对于解决干旱地区粮食危机、生态恶化等问题都有积极意义。

Description

玉米干旱诱导型基因启动子及活性分析

技术领域[0001] 本发明属生物工程技术领域,具体涉及玉米干旱诱导型基因(ZmCIPKie)启动子克隆。

背景技术

[0002] 干旱生态危机已严重影响到人类的可持续发展,因此在农业生产中,急须耐旱、水分胁迫环境下生长良好的粮食作物和植被。随着现代基因工程技术的迅速发展,植物耐旱已从传统的植物生理研究转向分子方面的研究。作物分子育种技术使得以基因水平替代原先的染色体组水平来精细地调节育种的作用成为可能。

[0003] 高等植物基因的表达调控已成为分子生物学研究领域的热点,启动子是基因表达调控的重要元件。深入研究启动子的结构和功能,建立可用于植物转基因表达的时、空、量三维调控系统,可为功能基因组学研究及通过基因工程技术精确地调节植物代谢提供全新的思路。

[0004] 选择适宜的启动子来驱动目的基因在转基因植物中表达,已成为植物基因工程研究的热点问题之一。针对不同的目的基因,人们选用不同的启动子,从而使靶基因在特定组织或条件下选择性表达,以利于转基因植物的正常生长发育(赵恢武等,2000 ;刘强等,2000)。对植物在干旱逆境下大量表达的耐旱基因启动子研究表明,不同耐旱基因的启动子往往含有相同的顺式作用元件,并受相同的反式作用因子的调控。这为我们提供了另外一条研究植物耐旱机制的途径。

[0005] 国内外科学家利用一些耐旱相关的特异性启动子(如RD29A)、特异性蛋白(如脱水素)、耐旱相关的特异性酶(如TPS)基因进行植物遗传转化并获得了成功,得到一些耐旱品质明显提高的转基因植株。清华大学的刘强等(2002)将来自拟南芥的干旱诱导型基因RD29A的两个转录调控因子转入拟南芥后发现拟南芥的干旱耐受性能有很大提高。高世庆(2006)通过基因枪介导转化小麦幼胚愈伤组织,经过分子生物学检测及在PEG胁迫下的⑶S组织化学染色证实了 RD29A启动子在小麦愈伤组织中能够诱导⑶S基因的表达。也有科研工作者直接利用干旱诱导型启动子启动某些耐旱有关的蛋白表达进行植物耐旱机理的研究。如:利用特异性的启动子启动与耐旱有关的基因(如:脱水素基因等)或特异性的渗透调节物合成酶基因在烟草、拟南芥等模式植物体内表达获得耐旱植株;通常情况下在双子叶植物中常用的组成型启动子CaM35S启动海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)在烟草和拟南芥中均获得耐旱植株,而用诱导型启动子RD29启动TSP (海藻糖-6-磷酸合酶)在烟草中表达,获得了较为明显的耐旱烟草植株。单子叶植物的Ubi quit in-promo ter有两部分组成:exon和intron,其中intron具有增强子的功能。目的基因在其启动下能够大量稳定的在单子叶植物体内表达。浙江大学郝中娜等(2005)对水稻0sWRKY19及0sWRKY89基因的启动子进行功能研究,表明这两个基因的启动子是组织特异性表达的诱导型启动子。Brown等(2010)首次发现冬小麦bltlOl基因启动子内存在高度保守的TCA-Iike元件与诱导目的基因在低温胁迫下高效表达密切相关。Takumi (2003)等分离了小麦低温应答基因家族基因Wcorl5上游的启动子序列证实该启动子受低温和光诱导。[0006] 利用干旱诱导型启动子驱动抗旱基因的高效表达,从而改良作物的耐旱性成为目前研究的热点。然而,目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此,对于新的抗旱相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用,以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。

发明内容

[0007] I. 一种获得的玉米干旱诱导型启动子序列,其特征在于所述启动子序列包含相对于SEQID NO :1的转录起始位点的-Ibp至-1773bp区的DNA核苷酸序列。

[0008] 2.根据权利要求I所述的获得的玉米干旱诱导型启动子序列,其特征在于所述启动子序列源自玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)。

[0009] 3.根据权利要求2所述的获得的玉米干旱诱导型启动子序列,其特征在于一种克隆得到的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的5’非翻译区,5’非翻译区包含相对于SEQ ID NO : I的转录起始位点的+Ibp至+230bp区的DNA核苷酸序列。

[0010] 4. 一种用于玉米转化的干旱诱导型的植物表达载体,其特征在于所述植物表达载体包含权利要求I的玉米干旱诱导型启动子序列和权利要求3的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)5非翻译区。

[0011] 5. 一种用植物表达载体转化的转基因植物,其特征在于所述转基因植物包含权利要求I的玉米干旱诱导型启动子序列和权利要求3的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)5’ 非翻译区。

[0012] 6. SEQ ID NO :2和3的PCR引物,其特征在于所述引物适于扩增包含SEQ ID NO :I的序列DNA片段。

[0013] 本发明的一个目的是提供一种干旱诱导型启动子序列,该启动子序列能够诱导目标基因高水平表达,而且该启动子来源于玉米calcineurin B-Iike (CBL)相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)。

[0014] 本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的干旱诱导型启动子载体,该载体指导高水平表达目标基因ZmCIPKie的干旱诱导型启动子序列和5’非翻译区。

[0015] 本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因植物。该转基因植物能反映启动子诱导活性的高低。

[0016] 为实现上述目的,本发明克隆了玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的干旱诱导型启动子区,并构建了用于植物转化的载体,所述载体包含带有ZmCIPKie基因的5非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米胚中诱导表达,并观察到该启动子与干旱诱导性相关的高水平活性。

[0017] 本发明提供一种获得的玉米干旱诱导型启动子序列,其特征在于所述启动子序列包含相对于SEQ ID NO :1的转录起始位点的-Ibp至-1773bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列,干旱可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。

[0018] 获得的玉米干旱诱导型启动子序列源自玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)。

[0019] 一种克隆得到的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)的5’非翻译区,5’非翻译区包含相对于SEQ ID NO :1的转录起始位点的+Ibp至+230bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列,本发明所述的非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力,而诱导目标基因的闻水平表达。

[0020] 为实现另一个目的,本发明提供一种用于玉米转化的干旱诱导型的植物表达载体,所述植物表达载体包含玉米干旱诱导型启动子序列和玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)5’非翻译区。

[0021] 上述用于玉米转化的干旱诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含T-DNA (转移DNA)的RB (右边界序列)和LB (左边界序列),能够在根癌农杆菌(Agroba terium tumefaciens) Ti质粒存在下转化植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体,例如PCAMBIA1301载体、PBI121 载体。

[0022] 一种用植物表达载体转化的转基因植物,包含玉米干旱诱导型启动子序列和玉米 CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)5’非翻译区。

[0023] 本发明提供SEQ ID NO :2和3的PCR引物,适于扩增包含SEQ ID NO :1的序列DNA片段。

[0024] 关于本发明所述的用于植物的诱导型载体(pCAMBIA1301),所述的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)的启动子和5’非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的启动子和5’非翻译区至含有GUS报告基因的载体中而构建的PCAMBIA1301。但是,所述GUS报告基因是外源基因,并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。

[0025] 本发明提供一种应用干旱诱导型二元载体的转基因植物,以及一种应用本发明所述进行瞬时表达的玉米成熟胚。

[0026] 植物能通过使用例如根癌农杆菌(An, G. 1987, Plant Physiology)或粒子轰击方法(Lacorte等,1997, Plant Cell Reports)由上述植物干旱诱导型启动子二元载体进行转化。在本发明中,例如烟草可以用叶盘转化法进行转化。

[0027] 本发明提供来自玉米的CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的干旱诱导型启动子和5’非翻译区,根据本发明的启动子和5’非翻译区使得能够在植物中进行干旱诱导型表达。

[0028] 本发明有益效果在于可用于启动抗旱基因的高效表达,应用于耐旱的转基因植物中,对于解决干旱地区粮食危机、生态恶化等问题都有积极意义。

附图说明

[0029] 图I为玉米(B73)基因组电泳图

[0030]图 2 为 ZmCIPK16_pro PCR 电泳图

[0031] 图3为ZmCIPK16_pro回收电泳图

[0032] 图4为ZmCIPK16_pro连T载质粒提取电泳图

[0033] 图5为ZmCIPK16_pro连T载酶切鉴定电泳图

[0034]图 6 为 ZmCIPK16-pro 及 pCAMBIA-1301 酶切回收电泳图

[0035]图 7 为 pCAMBIA 1301: :ZmCIPK16Pro 酶切鉴定电泳图[0036] 图8为植物表达载体构建示意图

[0037] 图9为pCAMBIA 1301: :ZmCIPK16Pro转农杆菌质粒提取电泳图

[0038] 图10为pCAMBIA 1301: :ZmCIPK16Pro转农杆菌酶切鉴定电泳图

[0039] 图11为ZmCIPK16启动子的⑶S检测(背面)照片

[0040] 图12为ZmCIPK16启动子的⑶S检测(正面)照片

[0041] 图13为烟草无菌苗照片

[0042] 图14为烟草预培养照片

[0043] 图15为烟草筛选照片

[0044] 图16为烟草愈伤⑶S检测照片

[0045]图 11、12 和 16 中:ZmCIPK16(a):未用 20% PEG 处理 ZmCIPK16 (b):用 20 % 的 PEG处理24h

具体实施方式

[0046] 下面结合附图介绍具体实施例:的实施将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。尽管已经结合本发明的优选的具体实施方式来对本发明进行了描述,但是以下描述的目的是示例性的,而不是限制本发明的范围。本发明的其它方面对于本发明有关领域的技术人员来说是显而易见的。

[0047] 实施例I :玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)的干旱诱导型启动子的克隆

[0048] 玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)的启动子(启动子序列包含相对于SEQ IDNO :1的转录起始位点的-Ibp至-1773bp区的DNA核苷酸序列),在玉米ZmCIPK16基因的5’区序列中得到鉴定。

[0049] 玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)登录在NCBI GenBank(登录号:EU907939. I),序列表显示本发明上述基因的植物干旱诱导型启动子和5’非翻译区的DNA序列。在图I中,蛋白合成的起始密码子ATG带有下划线,而且转录起始位点的碱基A用+1示出。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。启动子分析网站http://www. dna.affrc. go. jp/PLACE/signalscan. html。

[0050] 以玉米基因组DNA (图I)为模板,扩增得到目的片段,经I %琼脂糖凝胶电泳分析,扩增出长度为2002bp的特异条带(图2),并进行回收(图3)。电泳后回收目的片段,与pMD 18-T载体连接得到重组质粒pMD 18-T: :ZmCIPK16Pro,提取质粒并进行琼脂糖凝胶电泳检测(图4),酶切验证(图5),并测序。

[0051] 更具体地说,通过PCR扩增克隆的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)的启动子和216bp的5’非翻译区(见序列表),上述PCR所用引物详细显示在表I中。对于PCR扩增,反应程序:95V 3min ;95°C 30S,58. 5°C 30S,72°C 2min,34个循环;72°C IOmin ;

[0052] 表I引物

[0053]

Figure CN102154289BD00061

[0054] 实施例2 :植物干旱诱导型载体的构建

[0055] 将在实施例I中所克隆的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)的启动子和216bp的5’非翻译区ZmCIPK16Pro (见序列表)插入到载体中,从而构建植物干旱诱导型载体。

[0056] 更具体地说,将植物表达载体pCAMBIA 1301及重组质粒pMD 18-T: :ZmCIPK16Pro用EcoRI和NcoRI分别进行酶切(图6),然后将它们插入载体pCAMBIA1301的EcoRI和NcoRI酶切位点。该载体被称作pCAMBIA 1301: :ZmCIPK16Pro,用于驱动⑶S基因的表达,经酶切鉴定(图7)获得了启动子片段,与预期结果相同。

[0057] 在图8中,以编码β -葡糖酸醛酶的基因GUS为报告基因,选择标记为潮霉素抗性基因。此外35s-pro代表HPTII的启动子,而35s_ter代表它的终止子,ZmCIPK16Pro代表⑶S的启动子,而Nos-ter代表它的终止子。

[0058] 实施例3 :鉴定本发明所述的玉米干旱诱导型启动子的活性

[0059] 通过电激转化法,将在实施例2中构建的载体pCAMBIA 1301: :ZmCIPK16Pro转移到根癌农杆菌EHA105中,提取质粒(图9)并进行酶切鉴定(图10)。

[0060] 为鉴定启动子的干旱诱导活性,利用Jefferson等(EMBO J,1987)的方法将玉米的胚干旱处理再检测⑶S的活性。

[0061] 更具体地说,将玉米种子浸泡催芽,然后将种子纵切,切成两半,用20%PEG诱导培养24h,将玉米种子在⑶S检测液中于37 °C过夜,⑶S检测液:lmg/mlX-gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-葡糖苷酸)、50mM磷酸钠缓冲溶液(PH = 7. O),IOmMEDTA,0. 5mM铁氰化钾、O. 5mM亚铁氰化钾、O. I % TritonX-100,20%甲醇。如图所示(图11,图12),经过PEG诱导的愈伤组织显示出高水平的⑶S活性,而未经诱导的愈伤组织显示出低水平的⑶S活性。

[0062] 实施例4 :烟草的叶盘转化

[0063] 4. I受体材料的准备

[0064] 将烟草种子(NC89)用10%的次氯酸钠消毒,用无菌水冲洗三次,接种在MS培养基上,得到无菌烟草苗(图13)。待幼叶长至2〜3cm时,将叶片取下用直径为7mm的打孔器制成叶盘,近轴面向下接种在分化培养基(MS+1. Omg/L 6-BA+O. lmg/L NAA, PH = 5. 8,O. 7%琼脂)上,预培养2〜3d。叶盘切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

[0065] 4. 2农杆菌菌液的制备

[0066] 将农杆菌ΕΗΑ105接种于YEP(50mg/L rif、50mg/L kan)固体培养基上,28°C暗培养,至长出单菌落。挑取单菌落,接种在5mL含有相应抗生素的YEP液体培养基中,于28°C,200r/min振荡培养。待菌液长至OD6tltl = O. 4〜O. 6时,将菌液按I : 10的比例进行二次活化。当OD6tltl = O. 4〜O. 6时,吸取菌液置于无菌离心管中,5000rpm离心5min,弃上清,用等体积的MS液体培养基重悬,备用。

[0067] 4. 3侵染取预培养2〜3d的外植体于无菌三角瓶中,加入适量活化好的农杆菌菌液,侵染5min左右。

[0068] 4. 4共培养将侵染过的外植体接种在分化培养基上,28°C暗培养共培养3〜4d,以肉眼可见菌落为准(图14)。

[0069] 4. 5除菌及筛选培养将经过共培养的外植体放入无菌三角瓶内,用无菌水冲洗3〜4次,然后用附加除菌剂的液体培养基振荡培养30min,用无菌滤纸吸干表面水分,再转移到附加选择压力的除菌晒选培养基上,28°C光照培养,每IOd继代一次(图15)。

[0070] 4. 6继代筛选培养筛选培养2〜3周后,外植体的转化细胞将分化出抗性芽,将抗性芽转入相应的筛选培养基中进行继代培养。

[0071 ] 4. 7生根培养待不定芽长到3〜4cm时,将其切下并插入生根培养基上进行生根培养,两周左右长出不定根。

[0072] 实施例5 :转化烟草的组织化学法染色

[0073] 将实施例4中的烟草愈伤组织在含有20% PEG的MS培养基中诱导24h,浸入⑶S检测液,于37°C保温过夜,将染色材料用70%的乙醇脱色除去叶绿素。⑶S检测液:lmg/mlX-gluc、50mM磷酸钠缓冲溶液(PH = 7.0),IOmM EDTA,0. 5mM铁氰化钾、O. 5mM亚铁氰化钾、 O. 1% TritonX-100,20%甲醇。如图16所示,经过PEG诱导的愈伤组织显示出高水平的⑶S活性,而未经诱导的愈伤组织显示出低水平的GUS活性。

[0074] 工业实用性

[0075] 如上所述,本发明提供玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的干旱诱导型启动子和5’非翻译区。

[0076] 本发明提供分别将启动子和5’非翻译区插入至pCAMBIA1301而制得的植物表达载体。

[0077] 经使用所述的植物表达载体进行鉴定,本发明所述的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的启动子和5’非翻译区使得能够进行干旱诱导型的表达。因此,本发明可用于提高耐旱基因的启动活性,最终获得能用于生产的耐旱粮食作物或植被。

[0078] 序列表

[0079] SEQ ID NO. I的序列(带功能元件标记)

[0080] (i)序列特征:(A)长度:-lbp 至 _1773bp ;+lbp 至 +230bp ; (B)类型:核苷酸;(C)

链性:单链。

[0081] (ii)分子类型:核苷酸

[0082] (iii)序列描述:SEQ ID NO. I

[0083] -1775 TATGACTGCT AAGGGAAACG TGTGACAATG AGAATTAAAT AAAATGTAGTAGTAGGGTAT

[0084] ABRELATERD1

[0085] -1715 ACAGATGTTT GTCATAGCTG CCTATTGACT TATAAACATT GTTGTTGTATCATTAGTTCA

[0086] -1655 TGGATTGAAT ATGCAAGCAA TGCACTCAAT GTAAACCAGA AACATAACTTTCATGACAGG

[0087] -1595 GTTGTACAAA ACATATCAAG GATACAAAAA AACAAGCAAT GCACTCCATGTAACCACAAA

[0088] -1535 CATAACTTAA ATGTGACGGT TGTAGAAAAC ATTGAAGGAT ACAAAAAACAAGCTATGTAA

[0089] TGACG-motif

[0090] -1475 TCCATGCAAG CACTAACATA ATGTACATAA TAAAGAACTG TGTGCTCATACN 102154289 B i^sdt7/8 XCCATAAGATG

〔0091〕 -1415 CTGTAGAAAA CAAAATGTTC ATGGTCAGAT ATTGTGAAAT ACGTGAGGGGTGTACACATT

〔0092U ABRELATERD1

〔0093〕 -1355 AGTACAAGAA AACATAAATT AGTTGTTGTA AGAATAAACA AACCTACTATATGAASTCO

I--10094U AEIbOX AACACOREOSGLUBI

〔0095〕 IGS >〇>>J>3J TGTATCCTCC AGTCGTATAC AAGGGTGACA AAAATATTTG

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Claims (3)

1. 一种获得的玉米干旱诱导型启动子序列,其特征在于所述玉米干旱诱导型启动子序列如SEQ ID NO: I所示,其中SEQ ID NO :1的-Ibp至_1773bp区为玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因ZmCIPK16启动子的DNA序列,SEQ ID NO :1的+Ibp至+230bp区为玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因ZmCIPK16的5’非翻译区的DNA序列。
2. 一种用于玉米转化的干旱诱导型的植物表达载体,其特征在于所述植物表达载体包含权利要求I所述玉米干旱诱导型启动子序列。
3. —种PCR引物对,其序列如SEQ ID NO :2和3所示,所述引物对用于扩增如权利要求I所述玉米干旱诱导型启动子序列。
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