CN101139385A

CN101139385A - 一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN101139385A
Application number: CNA2007101197695A
Authority: CN
Inventors: 种康; 刘开茂; 徐云远; 王雷; 马启彬
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2007-07-31
Publication date: 2008-03-12
Anticipated expiration: 2027-07-31
Also published as: CN101139385B

Abstract

本发明公开了一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用。该植物抗逆性相关蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。该植物抗逆性相关蛋白及其编码基因可用于培育抗逆植物，特别是抗干旱和/或抗高盐和/或耐低温的水稻。

Description

一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及该蛋白及其基因在培育抗逆植物中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa)不仅是重要的谷类作物，也是一种模式植物。水稻对低温非常敏感，低温可对其幼苗造成不同程度的伤害，导致其在孕穗期败育，最终不结实(Wen et al.，Plant Physiol，129：1880-1891)。但适当的非冻低温作用能诱导水稻中的冷冻响应基因表达，从而使其抗寒性增强。这些冷冻响应基因的启动子元件中有失水响应元件(DRE)或者C-重复元件(CRT)，部分还有ABA-响应元件(ABRE)(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki，plantCell，6：251-264；Stockinger et al.，Nat Acad Sci USA，94：1035-1040)。

现已报道的水稻中与低温有关的转录因子类基因有NAC家族、MYB家族、CBF家族、WRKY家族、lip19、OsBierf1-4、OsZFP、ABF3、OsLti6、OsDhn1、AP2/EREBP、OsbHLH1。与低温有关的酶类基因有OsP5CS、OsADC1、CDPKs(OsCDPK7、OsCDPK13)、MAPKs(OsMAPK5、OsMSRMK3、OsWJUMK1、OsICT、OsMEK1、OsMAP1)、OsTPST、OsGPX1、OsSAMDC、OsSAC9、OsSPDS2、OSISAP1、OsGS2、OsTPP1、OsAdh1、CIPKs。

冷冻响应基因的表达主要是通过转录因子CBF(DRE/CRT binding factor)的过量表达完成的(Stockinger et al.，Nat Acad Sci USA，94：1035-1040)。这些调节元件的超表达不仅提高了植物的抗冻性，而且提高了其抗盐性(Liu etal.，Plant Cell，10：1391-1406)。李(Lee et al.，Genes Dev，15：912-924)对拟南芥的HOS1(high expression of osmotically responsive genes)基因的座位进行了遗传学分析，发现在冷冻逆境中HOS1基因发生突变，进而引起CBF2、CBF3及相应冷冻基因的大量表达。HOS1基因是一个COR基因的负调节因子，通过修饰CBFs的表达水平而起作用(Chinnusamy et al.，Gene Dev，17：1043-1054)。HOS1基因编码一个环状的指环蛋白，在冷冻条件下10min时已表达。ICEI(inducer of CBFexpression1)被证明是一个CBF3的正调控因子(Chinnusamy et al.，GeneDev，17：1043-1054)，它特别识别CBF3启动子中的MYC序列。在正常生长条件时CBF3在转ICE1的超表达植株中不表达，但在低温条件下CBF3、RD29和COR15在转ICE1的超表达植株中都有较高的表达量。表明低温引起的ICE1的修饰对它在植物中作为CBF3的一个正调节因子是十分必要的。转录因子(CBF1、CBF2、CBF3)不仅是冷冻响应的，而且能结合DRE/CRT元件，并能激活不同类型的冷冻响应基因的转录。

Kim从大豆中分离到一种对冷冻和ABA响应的新型转录因子(Kim et al.，MolCells，12：204-208)，把它命名为SCOF-1(Soybean zinc finger protein)，然而这个转录因子对干旱和盐不响应。SCOF-1是一个锌指类蛋白，却不与DRE/CRT或ABRE元件直接连接。利用酵母双杂交发现，SCOF-1与SGBF-1(Soybean G-box bindingbZIP transcription factor)强烈地相互作用，在体外SGBF-1与ABRE元件的DNA结合活性因有SCOF-1存在而大大提高。由此可见，蛋白质的相互作用对ABRE介导的冷冻响应基因表达非常重要(Kim et al.，Mol Cells，12：204-208)。

转录因子DREB2A和DREB2B在脱水时表达，进而激活下游基因，维持细胞内的渗透平衡，提高对逆境的耐性(Liu et al.，Plant Cell，10：1391-1406)。

转基因水稻植株的成功(Raineri et al.，Biotechnology，8：33-38)和水稻基因组测序工作的完成(Sasaki and Burr，Curr Opin PlantBiol，3：138-141；Barry，Plant Physiol，125：1164-1165；Feng etal.，Nature，420：316-320；Goff et al.，Science，296：92-100；Sasaki etal.，Tanpakushitu Kakusan Koso，47：1512-1527；Sasaki etal.，Nature，420：312-316；Yu et al.，Science，296：79-92；Delseny，MedSci(Paris)，19：504-507，Curr Opin Plant Biol，6：101-105；Sasaki et al.，PlantCell Physiol，46：3-13)为研究发现新的抗逆境基因提供了有利条件。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的植物抗逆性相关蛋白，名称为OsCOIN(cold-inducible gene inrice)，来源于水稻(Oryza sativa L.)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由363个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸。自氨基末端(N端)第72-106位氨基酸残基为指环蛋白家族保守结构域(图1b)。自氨基末端(N端)第60-63，65-68，183-186，353-356位氨基酸残基为糖基化位点，第78-83和245-250位氨基酸残基为十四烷基化位点，第261-275和294-308位氨基酸残基为酪氨酸硫酸脂化位点。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的上述指环蛋白家族保守结构域、糖基化位点、十四烷基化位点和酪氨酸硫酸脂化位点外进行取代和/或缺失和/或添加。

所述植物抗逆性具体可为对非生物胁迫的抗性，如对低温和/或干旱和/或高盐的抗性。

为了使(a)中的OsCOIN便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
标签	残基	序列	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poiv-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poiv-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的OsCOIN可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsCOIN的编码基因可通过将序列表中序列1的自5′端第143至1234位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述植物抗逆性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因，具体可为如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中的序列1的自5’末端第143至1234位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述植物抗逆性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件是，在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列1由1593个脱氧核糖核苷酸组成，自5’末端的第143至1234位核苷酸为OsCOIN的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第143至145位核苷酸为OsCOIN的起始密码子ATG，自5’端的第1232至1234位核苷酸为OsCOIN的终止密码子TGA(图1a、序列1和序列2)。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有OsCOIN基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用OsCOIN构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在pUN1301的BamHI和KpnI位点间插入自序列表中序列1的自5’末端的第143-1231位脱氧核苷酸得到的pUN1301-OsCOIN；所述pUN1301按照如下方法得到：在pCAMBIA1301的EcoRI和HindIII位点间插入玉米泛素启动子和Noster poly A。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆植物的方法。

本发明所提供的培育抗逆植物的方法，是将上述任一种重组表达载体导入植物细胞中，得到抗逆植物。

携带有本发明OsCOIN基因的重组植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻等单子叶植物，也可以是拟南芥等双子叶植物。

本发明的方法可用于培育抗干旱和/或抗高盐和/或耐低温的植物，特别是抗干旱和/或抗高盐和/或耐低温的水稻。

实验结果表明，相同条件下低温处理60、72、84小时，转入OsCOIN基因的超表达株系的成活率分别为76.2％、71.4％和50％，野生型分别是52.4％、22.2％和14.8％(图9b)；相同条件下的ABA处理时，野生型有60％的萌发率，而转入OsCOIN基因的超表达株系仅有15％的萌发率(图10b)；相同条件下高盐处理时，转入OsCOIN基因的超表达株系萌发率为35％，而野生型的萌发率仅为18％(图11b)；相同条件下用20％的PEG6000溶液处理24h时，92％的野生型叶片出现萎蔫，而仅8％的转入OsCOIN基因的超表达株系的叶片出现萎蔫(图12b)。用10％的PEG6000的溶液分别处理12h和24h时，转入OsCOIN基因的超表达株系的存活率为85％和60％，野生型的存活率为40％和7.5％(图13b)。说明OsCOIN基因的超表达提高了水稻植株耐寒、耐盐和耐旱的能力。本发明中的OsCOIN蛋白及其编码基因为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物(特别是水稻)中发挥重要的作用。

附图说明

图1为OsCOIN的核酸序列、氨基酸序列、OsCOTN蛋白质的指环结构保守域。

图2为OsCOIN基因的内含子和外显子分析。

图3为氨基酸序列比对和进化树分析结果。

(a)为OsCOIN、gi30694045(拟南芥)、gi21207099(西红柿)和gi47104584(玉米)的蛋白序列比对。

(b)为进化树分析，OsCOIN基因与其它生物中的同源基因的同源性分析。

图4为RT-PCR检测OsCOIN基因在野生型水稻(WT)不同组织中的表达丰度的结果。

其中，se：幼苗；yr：幼根；st：茎；la：叶片；ls：叶鞘；yp：幼穗；mp：成穗；sp：茎节；pe：叶枕；sl：茎节叶。

图5为OsCOIN蛋白的亚细胞定位。

Bars：50μm。CaMV35S启动子启动GFP蛋白或GFP-OsCOIN融合蛋白表达。

(b)和(d)分别为GFP蛋白和GFP-OsCOIN融合蛋白在洋葱表皮细胞中的表达。

(a)和(c)分别代表它们的明场。

图6为RT-PCR检测低温、ABA、NaCl、干旱(PEG6000)诱导OsCOIN基因在野生型水稻(WT)不同组织中的表达丰度的结果。

(a)对WT进行不同时间的4℃低温处理时，RT-PCR检测OsCOIN的表达量。

(b)不同浓度的ABA处理野生型(WT)时RT-PCR检测OsCOIN的表达量。

(c)50μM ABA处理野生型时OsCOIN的时间表达模式。

(d)不同浓度的NaCl处理2周龄野生型幼苗6h时OsCOIN的表达量。

(e)1OOmM NaCl处理2周龄野生型幼苗后OsCOIN的时间表达模式。

(f)用不同百分比的PEG6000对两周龄的野生型水稻幼苗进行6h的干旱处理后，OsCOIN的表达量。

(g)用10％的PEG6000对两周龄的野生型水稻幼苗进行不同时间的干旱处理后，OsCOIN的表达量。

在RT-PCR分析中，Tubulin为对照。

图7为用Ubiquitin启动子改建pUN1301后，构建的转水稻OsCOIN超表达载体pUN1301-OsCOIN简易图。

图8为转基因植株分子鉴定。

(a)经EcoRI和HindIII酶切消化水稻基因组后的Southern分析。用α-³²P-dCTP标记的GUS为探针进行Southern杂交。

(b)在转基因水稻中OsCOIN的表达水平。以野生型(WT)的表达量为100％，OsCOIN在三个超表达株系中的相对表达量。

L1、L2、L3代表三个独立的超表达株系，WT代表野生型。

图9为低温(4℃)处理后恢复生长两周时的表型和恢复生长两周时的成活率统计。

(a)在4℃生化培养箱中处理60h、72h、84h后，幼苗在温室中恢复生长两周时的表型。

(b)恢复生长两周时的成活率统计(n＝20)。

WT：野生型(上面四张图片)；OE line 3：超表达植株的3号株系(L3)(下面四张图片)。

图10为ABA处理对转OsCOIN基因水稻种子萌发生长的影响。

(a)10μM ABA从种子萌发开始处理到生长20d时的表型。

(b)10μM ABA处理萌发生长的种子20d时的萌发率(％)(n＝50)。OE line3：超表达株系3；WT：野生型。

图11为NaCl处理对转OsCOIN基因水稻种子萌发生长的影响。

(a)250mM NaCl从种子萌发开始处理到生长20d时的表型。

(b)250mM NaCl处理萌发生长的种子20d时的萌发率(％)(n＝50)。OE L3：超表达株系3；WT：野生型。

图12为干旱(20％的PEG6000)处理24h时植株的表型。

(a)用20％的PEG6000处理两周的水稻幼苗24h时，野生型和OsCOIN超表达型的表型。

(b)统计结果(n＝50)。92％的野生型叶片萎蔫，而OsCOIN的超表达植株仅有8％的叶片萎蔫。OE L3：超表达株系3；WT：野生型。

图13为用10％的PEG6000进行不同时间的干旱处理后恢复两周时的表型和统计。

(a)用10％的PEG6000进行不同时间的干旱处理后恢复两周时的表型。

(b)恢复两周时的统计结果(n＝50)。OE line 3：超表达株系L3(下面三张图片)；WT：野生型(上面三张图片)。

图14为四个低温响应基因在野生型和超表达株系L3中的半定量RT-PCR分析和脯氨酸含量。

(a)每个报告基因在低温处理24h和没有低温处理24h时的表达量。在RT-PCR分析中Tubulin为对照。OE L3：超表达株系L3；WT：野生型。

(b)脯氨酸含量。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、植物抗逆性相关蛋白OsCOIN及其编码基因的获得

1)设计扩增引物

根据水稻cDNA芯片的杂交结果(Lan et al.，Plant Mol Biol，54：471-487)，设计引物：5’-GGGGATCC ATG AGC TCT CTA TGC CCC TTT GCC A-3’(F)(下划线是BamHI的酶切位点)，5’-GGGGTACC CTT GTC ATC CAA TTG TTT TTG TAG A-3’(R)(下划线是KpnI的酶切位点)。

2)总RNA的提取

收集在1/2 MS培养基上生长两周的野生型水稻中花10号(中国农科院水稻所)的幼苗100mg，立即置于液氮中研磨，加入1ml Trizol(Invitrogen)试剂，充分混匀后，室温放置5分钟；加入0.2ml氯仿，剧烈振摇15秒，室温温育3分钟；4℃，12000g离心15分钟；将上清液转移到一个新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇沉淀RNA；最后将RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗涤后溶于适量经DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。

3)第一链cDNA的合成

用SuperscriptTMII RT试剂盒(Invitrogen)并按试剂盒说明书进行操作：取1-5μg步骤2)获得的水稻总RNA，放入灭活了RNase的PCR管中，加入Oligo(dT)_12-18(500mg/mL)1μl和dNTP Mix(各10mM)1μl，用DEPC处理后的双蒸水补充至12μl，混匀后在65℃下加热5分钟，然后迅速置于冰上，1分钟。短暂离心后再加入5×第一链合成缓冲液4μl、0.1M DTT 2μl和RNaseOutTM(40u/μl)1μl，轻轻混匀后，42℃温育2分钟，然后加入SuperscriptTMII反转录酶(200u/μl)1μl，混匀，42℃温育50分钟，70℃加热15分钟使酶失活，得到第一链cDNA。

4)OsCOIN cDNA的合成及回收

a、取1μl步骤3)获得的反转录产物为模板，在5’端引物和3’端引物的引导下，用PCR的方法合成OsCOIN的cDNA。PCR反应体系为：LA Taq(TaKaRa)0.5μl、2×GC缓冲液(TaKaRa)25μl、dNTP 1μl、5’端引物(10μM)1μl、3’端引物(10μM)1μl、模板1μl、加双蒸水补充反应体系至50μl。PCR反应条件为：先94℃ 4m；再94℃45s，56℃ 45s，72℃ 2m，共35个循环；最后72℃ 10m。

b、反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1.0kb的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。

5)OsCOIN基因cDNA的克隆测序

将该回收片段与载体pGEM-T Easy(Promega)连接，连接体系为：T₄DNA连接酶(3u/μL)、2×连接酶缓冲液5μl、pGEM-T Easy(50ng/μL)0.5μl和回收PCR产物3.5μl，4℃反应12-24h。参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pTE-OsCOIN。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的OsCOIN基因具有1089个碱基组成，其开放阅读框(ORF)为自序列表中序列1的自5′末端第143至1231位脱氧核糖核苷酸，编码具有363个氨基酸的蛋白质。将含有自序列表中序列1的自5′末端第143-1231位脱氧核糖核苷酸的OsCOIN基因的重组载体命名为pTE-OsCOIN。

将该基因进行内含子和外显子分析，结果表明该基因的基因组DNA由7个外显子和6个内含子组成(图2)。

OsCOIN蛋白与拟南芥、西红柿和玉米中的同源蛋白相比，它们氨基酸序列的同源性高达60.56％(图3a)。在植物、动物、其它生物的同源基因的同源性分析中可见，OsCOIN、gi30694045(拟南芥)、gi21207099(玉米)和gi47104584(西红柿)同属于一个家族(图3b)。

实施例2、表达特征

一、OsCOIN基因在十种不同的组织中表达丰度的检测

提取野生型水稻中花10号(Oryzia sativaL，cv Zhonghua 10)的幼苗、幼根、茎、叶、小穗、成穗、叶鞘、茎结叶和叶枕等十种组织的总RNA，利用RT-PCR法，检测以上十种组织中OsCOIN基因的表达丰度。其中，PCR所用引物均为5’-ATG AGCTCT CTA TGC CCC TTT GCC A-3’(F)，5’-CTT GTC ATC CAA TTG TTT TTG TAG A-3’(R)。结果显示，OsCOIN基因在十种不同的组织中都有表达，但在幼苗、幼根和茎中的表达丰度要稍低于其它组织(图4)。

二、瞬时表达载体的构建和亚细胞定位

1、瞬时表达载体pGFP221-OsCOIN的构建：

1)pGFP221的构建

将pGFP-2质粒(TaKaRa)上的GFP基因用XbaI和SacI切下，用XbaI和SacI切下pBI221(Clontech)上的GUS基因，然后将切下的GFP片段连接到酶切后的pBI221质粒上，得到pGFP221。

2)pGFP221-OsCOIN载体构建

以实施例1中得到的pTE-OsCOIN为模板，用如下引物扩增OsCOIN基因阅读框架：5’-GCTCTAGA ATG AGC TCT CTA TGC CCC TTT GCC A-3’(F)(带有XbaI切位点)，5’-GGGGTACC CTT GTC ATC CAA TTG TTT TTG TAG A-3’(R)(带有KpnI切位点)。PCR产物经测序正确后，用XbaI和KpnI双酶切，然后与经过同样酶切消化的pGFP221连接，构建成pGFP221-OsCOIN载体。OsCOIN与GFP的N端融合，融合蛋白在CaMV35S启动子调控下表达。

2瞬时表达与鉴定

1)材料准备：用刀片切取洋葱表皮，再用镊子小心剥取内表皮(大小为2×2cm)。刀片和镊子都先用70％乙醇消毒以防污染。剥取的洋葱内表皮放在MS固体培养基上(MS无机盐、40g/L甘露醇和0.7％Agar)以备用。

2)基因枪微弹准备：按照Bio-Rad公司的产品说明书，具体操作如下。称取金粉4mg(供轰击20次用)，放入一支灭菌的1.5ml试管中，加入1ml无水乙醇，剧烈振荡1min，10 000g离心1min，去掉上清液，重复以上步骤3次；加入1ml无菌水，高强度振荡重新悬浮，静置1min，短暂离心，去上清，重复3次；加入1ml灭菌的50％的甘油，重新悬浮后，平均分装入5支500ml离心管(每管200ml，供4次用)，可以在室温保存2周；轰击用的子弹的制备方法如下：按照1μg质粒(pGFP221-OsCOIN)或pGFP221(对照)/轰击、50-80μg金粉/轰击的比例，加入10倍于DNA体积的2.5M CaCl₂，振荡5min后，4℃下静置沉降，弃上清，再加入1ml 70％的乙醇振荡悬浮，4℃下静置使金粉颗粒沉降，弃上清，反复洗涤3次，按照10μl轰击比例加入无水乙醇，悬浮后备用；用移液器取10μl微弹，均匀地涂在微弹载体的内圈上；在自然条件下让乙醇挥发。

3)基因枪转化操作步骤及荧光显微镜观察：打开超净台，用70％的乙醇擦拭超净台内部和基因枪的表面及内部，打开紫外灯灭菌20min；按前述步骤准备微弹；对载体膜、可裂膜、阻拦网等灭菌(置于70％乙醇中1-2h，放在灭菌滤纸上自然风干)，打开气瓶，调节压力至1 300psi；安装微弹载体和微弹：将可裂膜、阻挡网和微弹载体放入固定装置中，射击参数为：微弹载体飞行距离10mm，微弹飞行距离12cm，压力1 100-1 300psi，真空度28mm Hg；使洋葱内表皮材料集中在托盘中间的圆圈内，将托盘插入倒数第二档；打开基因枪电源和真空泵，关闭基因枪气室门，按下抽真空键(Vac)，到真空读数为28mm Hg时，将按键置于“保持(Hold)档”，按下射击按钮(Fire)，直至射击结束，再按下放气键，使真空读数归零；打开基因枪气室门，整理培养皿；基因枪转化后的材料在培养基中于室温条件下暗培养24-48h，然后进行荧光观察；用Confocal激光共聚焦荧光显微镜(ZEISS，Germany)进行观察并采集图像，激发光波长为525nm。

结果显示，OsCOIN在细胞质和细胞核中都有分布(图5)。

三、4℃低温、ABA、NaCl、干旱(PEG6000)是否诱导OsCOIN基因表达的检测

下述步骤中，RT-PCR所用引物均为5’-ATG AGC TCT CTA TGC CCC TTT GCCA-3’(F)，5’-CTT GTC ATC CAA TTG TTT TTG TAG A-3’(R)。

1)将两周苗龄的野生型水稻中花10号幼苗，在4℃低温处理不同时间，提取总RNA，用RT-PCR检测OsCOIN的表达丰度。在4℃低温处理0.5h时，OsCOIN基因已较强地表达，持续较强地表达到48h，到72h时减弱到未处理的水平(图6a)。

2)用不同浓度的ABA处理发芽生长14天的野生型水稻中花10号幼苗6h，收集材料、提取幼苗的总RNA、反转录进行PCR。RT-PCR的结果显示，50μM ABA诱导OsCOIN基因的表达最强，100μM的ABA次之(图6b)。用50μM ABA对14天龄野生型幼苗进行不同时间的处理，RT-PCR结果显示，1h时，ABA已较强地诱导了OsCOIN的表达，持续较强地表达到72h，96h时OsCOIN的表达量又恢复到未诱导时的水平(图6c)。

3)用不同浓度的NaCl处理发芽生长14天的野生型水稻中花10号幼苗6h，收集材料、提取总RNA后反转录进行PCR。RT-PCR结果显示，NaCl能诱导OsCOIN基因的表达，100mM NaCl处理野生型幼苗6小时，OsCOIN的表达量最强(图6d)。用100mM NaCl对14天苗龄的野生型幼苗进行不同时间的处理，RT-PCR的结果显示，处理1h时，OsCOIN的表达量已比未处理的增强了，从3h到48h间NaCl诱导OsCOIN持续较强地表达，72h时开始下降，96h时表达量恢复到未诱导时的水平(图6e)。

4)将14天苗龄的野生型水稻中花10号幼苗放在不同质量百分比浓度的PEG6000中处理6h。RT-PCR分析显示，OsCOIN在10％的PEG6000中处理6h表达最强(图6f)。用10％的PEG6000对14天苗龄的野生型幼苗进行不同时间的处理，RT-PCR结果显示，处理1h时，OsCOIN已较强地表达，直到72h，处理96h时OsCOIN的表达量再次恢复到未处理的水平(图6g)。

实施例3、培育抗干旱、抗高盐和耐低温的水稻

1、OsCOIN超表达水稻植株的获得

1)OsCOIN超表达载体pUN1301-OsCOIN的构建

<1>玉米泛素启动子的获得

a、玉米基因组DNA的提取：剪取约0.2g玉米幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800μl新配制的提取缓冲液(含0.1M Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1％SDS和1％β-巯基乙醇)，剧烈振荡使其全部悬浮；65℃水浴30分钟，每5分钟颠倒混匀一次；然后加入250μl预冷的5M乙酸钾，立即颠倒混匀，冰浴5分钟；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm离心5分钟；收集上清，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置40分钟；4℃ 12000rpm离心15分钟，弃上清；沉淀用70％、100％乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μl含100μg/mL RNase的ddH₂O中，得到玉米基因组DNA。

b、PCR扩增玉米泛素启动子：取2μl步骤a获得的玉米基因组DNA溶液作为模板，在带有HindIII识别位点的5′引物(GGAAGCTT CTG CAG TGC AGC GTG ACC CGG)和带有BamHI识别位点的3′引物(CGGGATCC AAG TAA CAC CAA ACA ACA GGG)的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃ 3min；再94℃ 45s，62℃ 45s，72℃2min，共35个循环，最后72℃ 10min。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到长度约为2kb的扩增片段，与预期结果相符。回收该目的片段，用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切后回收，得到带有粘性末端的玉米泛素启动子(UbiPro)，备用。

<2>、Noster poly A终止序列的获得及pUC19-Noster的制备

用限制性内切酶SacI和EcoRI将Noster poly A终止序列从质粒载体pBI221(Clontech)上切下，连接到载体pUC19(TaKaRa)的相应位点中，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。

<3>、pUN19的制备

用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19-Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化的载体大片段，并将该回收片段与步骤<1>获得的带有粘性末端的玉米泛素启动子(UbiPro)相连，得到重组载体，命名为pUN19。

<4>、pUN1301的制备

用限制性内切酶EcoRI部分酶切和HindIII完全酶切步骤<3>构建的重组载体pUN19，切下包含UbiPro和Noster的长度约为2.3kb的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriclture，www.cambia.org)多克隆位点的EcoRI和HindIII位点间，得到重组载体，命名为pUN1301。

<5>、pUN1301-OsCOIN的制备

对重组质粒载体pTE-OsCOIN和pUN1301分别用限制性内切酶BamHI和KpnI进行双酶切，酶切体系为：质粒5μl、10×酶切缓冲液2.5μl、KpnI 1μl、BamHI 0.8μl，加ddH20补充反应体系至50μl，37℃酶切8小时。用琼脂糖电泳对酶切产物进行分离，回收1.0kb的OsCOIN片段和15kb的载体pUN1301大片段，分别溶解于45μlddH20中。再按以下反应体系将两者进行连接：T₄DNA连接酶2μl、10×连接酶缓冲液2μl、回收的OsCOIN 10μl、pUN1301 6μl，16℃连接16小时。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经卡那霉素(100μg/mL)平板筛选得到阳性菌株，提取质粒进行测序，将测序结果表明含有序列表中序列1的自5′端第143位-1231位脱氧核糖核苷酸的重组质粒命名为pUN1301-OsCOIN(图7)。在该质粒中采用Ubiquitin组成型启动子启动目的基因OsCOIN在植物中超表达。

2)OsCOIN超表达载体pUN1301-OsCOIN的转化及转OsCOIN基因的水稻植株的获得

<1>转化农杆菌

a、感受态细胞的制备

参照Sambrook等(A Laboratory Manual.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)的方法。挑取根癌农杆菌EHA105单菌落于10ml YEB(5g/L蛋白胨，1g/L酵母提取物，5g/L牛肉浸膏，5g/L蔗糖，2mM MgSO₄，pH7.0)中，28℃振荡培养至对数晚期；取0.5ml菌液加入50ml新鲜YEB液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀≈0.5；转移至50ml离心管中，冰浴20min；4℃，4000rpm离心10min，收集菌体；沉淀用20ml预冷的10％甘油重悬；4℃，4000rpm离心10min，迅速倒出上清；用甘油重悬，按每管50μl体积分装至1.5ml的离心管中，分装后于-70℃保存待用。

b、农杆菌电击转化

取50μl感受态细胞，加入0.5μg质粒，轻轻混匀，冰上放置；2500V电击5s，立刻加入800μl YEB培养基；28℃，150rpm，恢复培养45min；涂布细胞于筛选培养基平板上，超净台吹干表层液体；28℃培养两天。从转化后的平板挑取单菌落接种至2ml YEB液体培养基(含抗生素：终浓度为125μg/mL的利福平，100μg/mL的卡那霉素)中，28℃振荡过夜，碱裂解法抽提质粒，分别进行PCR和酶切鉴定。

<2>根癌农杆菌介导的水稻转化

A、幼胚愈伤组织的诱导

取水稻中花10号开花后12-15天的种子，70％乙醇消毒1分钟，无菌水冲洗2-3遍；再用2％有效氯的次氯酸钠溶液振荡消毒60分钟以上，无菌水冲洗4-5遍，然后在无菌条件下分离出幼胚，接在N6D2(N6盐分和维生素，500g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2，4-D，2.5g/L固化剂(gelrite)，pH5.8)培养基上，于28℃暗培养4天。

B、根瘤农杆菌的培养

从YEB固体培养基上挑取根癌农杆菌单克隆接种至20ml含卡那霉素50mg/L的YEB液体培养基中，28℃摇菌培养至对数生长晚期；再从中取0.5ml转接至50ml同样的YEB培养基中，同样条件下培养至OD₆₀₀为0.5左右。

C、共培养及转化、筛选、分化

将分化好的根癌农杆菌4000g离心10分钟后，沉淀用等体积的AAM-AS(AA盐分和氨基酸，MS维生素，100mM乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，pH5.2)培养基重悬；将预培养4天的来源于水稻中花10号幼胚的愈伤组织浸入此AAM-AS菌液中侵染20分钟，用无菌滤纸吸干后转移到N6D2C(N6D2，10g/L葡萄糖，100mM乙酰丁香酮，pH5.2)培养基上(在培养基表面铺一张无菌滤纸)，25℃暗培养3天。

将愈伤组织用含300mg/L的头孢霉素(cef)的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至N6D2S1(N6D2，25mg/L潮霉素(Hygromycine)，600mg/L头孢霉素(cefotaxime)，pH5.8)培养基上，筛选一代；两周后，转移至N6D2S2(N6D2，50mg/L潮霉素，300mg/L头孢霉素，pH5.8)培养基上筛第二代(2周/代)。

取出经过两次筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基(MS盐分和维生素，300g/L水解酪蛋白，50mg/L潮霉素，3g/L 6-BA，2.5mg/L KT，0.2mg/LZT，2.5g/L固化剂(gelrite)，pH5.8)上，在分化培养箱(12小时光照/12小时黑暗，白天28℃，夜晚25℃)中培养7天；然后移至分化培养基上，在分化培养箱中培养至产生再生苗；再生的植株在生根壮苗培养基(1/4MS盐分，MS维生素，1mg/L多效唑，0.5mg/L NAA，6.5g/L琼脂粉，pH5.8)上生根壮苗；待小苗长至10cm左右时打开容器封口膜，炼苗2-3天，最后对分化的幼苗进行GUS染色，然后将阳性小苗移至人工气候室栽培。

含有表达载体的农杆菌浸泡转化的植株所结种子以及由该种子长成的植株用T0代表，T1代表示TO代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株。

2、转OsCOIN基因的水稻植株鉴定

将转化得到的水稻置于人工气候室中生长(光照28℃/黑暗25℃，光照16h/黑暗8h)，观察其表型。对T2代转化植株进行如下三方面的鉴定分析：(1)GUS染色；(2)Southern鉴定；(3)RT-PCR分析。

<1>转OsCOIN基因的水稻阳性苗的GUS染色鉴定

GUS染色液：100mM磷酸盐pH7.0，0.1％Triton X-100，10mM EDTA，0.5mM铁氰化钾，X-Gluc 1mg/mL。

Edwards提取缓冲液：200mM Tris-Cl pH7.5，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS。

取生长2周的步骤1筛选的T2代水稻阳性幼苗叶片尖部2-3mm材料进行GUS染色。37℃温育3小时，再用75％酒精脱色，叶片呈蓝色的为阳性植株。结果表明，得到300株GUS染色呈蓝色的阳性植株(即转入pUN1301-OsCOIN的植株)。

<2>转基因植株的Southern鉴定

a、基因组DNA的提取

参照Sambrook等(A Laboratory Manual.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)的方法进行。取50-100mg材料，液氮中研磨；加入800μl新配制的提取液，剧烈振荡使其全部悬浮；65℃水中温育20min，每5min颠倒混匀一次；加入250μ1预冷的5M乙酸钾，立即颠倒混匀，冰上5min；取上清，用等量酚/氯仿抽提一次，12000rpm离心5min；上清加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA；4℃，12000rpm离心15min，去上清；沉淀用70％乙醇洗涤；干燥后，溶于20μl含100μg/mL RNase的超纯水中。

其中，提取液：1M Tris-HCl(pH8.0)，5.0ml；500mM EDTA(pH8.0)，5.0ml；4M NaCl，6.25ml；20％SDS，3.3ml；β-巯基乙醇(用前再加)，1.15ml；ddH2O，加至50ml。

b、Southern杂交

参照Sambrook等的方法进行(A Laboratory Manual.，Cold Spring HarborLaboratory Press)。30μg的植物基因组DNA用限制性内切酶FcoRI或HindIII(1μg/5unit)酶切过夜；取少量的酶切产物检测酶切效果，酶切彻底的DNA在0.8％的琼脂糖凝胶电泳上电泳2-3h；凝胶在1.5M NaCl和0.5M NaOH中变性45min；切去凝胶的多余部分，通过毛细作用将DNA转移至尼龙膜(Amersham Biosciences，UK)上，转移溶液为20×SSC；转膜结束后，用1.5M NaCl和Tris-HCl(pH7.4)中和溶液将膜中和45min；尼龙膜晾干后于80℃烘烤0.5-2h，真空保存；杂交前，将尼龙膜在6×SSC中浸透后，转入预杂交液中，65℃条件下预杂交1-2h。

用α-³²P-dCTP标记的GUS为探针进行Southern杂交。其中，PCR标记探针的模板为pUN1301质粒，制备GUS探针的引物为：5’-GCA GTG TAC GTC CTG TAG AAACCC-3’(F)，5’-CAA AGC CAG TAA AGT AGA ACG GT-3’(R)。PCR的反应体系如下所示，反应程序为：94℃ 5min，94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1min，72℃ 10min，35cycles。

模板 2μl

引物各1μl

LA 0.5μl

Tag(5u/μL)

10×Buffer 5μl

³²P-dCTP 5μl

dATP 1μl

dGTP 1μl

dTTP 1μl

ddH2O 至终体积

50μl

杂交反应前DNA探针热变性10min，冰浴迅速冷却。

预杂交结束后，加入³²P-dCTP标记的DNA探针，65℃条件下杂交16-20h；杂交结束后，分别用高盐洗膜溶液(2×SSC和0.1％SDS，65℃ 5min)和低盐洗膜溶液(1×SSC和0.1％SDS，65℃ 5min)各洗两次；晾干后，用X-光胶片进行放射自显影；-70℃曝光1-4天后，按常规洗片。

按照如上方法对野生型水稻中花10号(WT)和转基因水稻中花10号T2代的3个超表达株系(L1，L2，L3)进行了Southern杂交分析。经EcoRI和HindIII分别消化基因组后，以α-³²P-dCTP标记的GUS基因为探针的杂交结果表明，3个转基因的超表达株系都是单拷贝插入，说明，外源基因转入到水稻基因组中，而且转基因水稻来自独立的转化事件(图8a)。

c、RT-PCR分析

RT-PCR方法详见实施例1的RT-PCR扩增基因OsCOIN的具体步骤。用于扩增OsCOIN的引物：5’-CAG ACA ACA AAA CCA CCA TC-3’(F)，5’-ATT GCT TCC TCA AAACCC TC-3’(R)。用于扩增Tubulin的引物：5’-TCA GAT GCC CAG TGA CAG GA-3’(F)，5’-TTG GTG ATC TCG GCA ACA GA-3’(R)。

按照如上方法对野生型水稻中花10号(WT)和转基因水稻中花10号T2代的3个超表达株系(L1，L2，L3)进行了RT-PCR分析。RT-PCR结果显示，三个超表达株系明显高于野生型。多次RT-PCR一致的结果说明，超表达株系中增强了OsCOIN基因的表达(图8b)。

3、转OsCOIN基因水稻抗逆性检测

由于超表达株系3的分蘖数和OsCOINmRNA的表达量都位于另外两个超表达株系的中间，故低温处理和其它处理都把它作为研究材料。按照如下方法对野生型水稻中花10号(WT)和转基因水稻中花10号T2代的超表达株系L3(图中以“OE line3”或“OE L3”表示)进行抗逆性鉴定。

<1>低温处理

将在1/2 MS培养基上发芽两周的幼苗，洗去MS培养基。把幼苗放在有自来水的培养桶中，然后把培养桶和幼苗一起放在4℃生化培养箱(BTI100，LEAD TECH，USA)进行不同时间梯度的4℃低温处理。处理后的幼苗种在温室中，两周时观察其恢复生长的情况。实验设10次重复。每次重复，水稻中花10号(WT)和转基因水稻中花10号T2代的超表达株系L3各20株。

结果表明经低温处理60h、72h和84h后：超表达株系L3仍保持绿色的植株占处理总株数的比例分别为76.2％、71.4％和50％，WT仍保持绿色的植株占处理总株数的比例分别为52.4％、22.2％和14.8％(图9a)，即超表达株系L3的成活率分别为76.2％、71.4％和50％，野生型分别是52.4％、22.2％和14.8％(图9b)。图9a中，上面的四张图片为野生型植株照片，下面的四张图片为超表达株系L3植株照片。

<2>ABA处理

用0.1％的次氯酸钠消毒种子后，把消毒后的种子种在含有100μM的1/2 MS培养基上。用10μM ABA从种子萌发时开始处理(以旺根伸出时为萌发依据)，处理20天，统计照相。实验设5次重复。每次重复，水稻中花10号(WT)和转基因水稻中花10号T2代的超表达株系L3种子各50粒。

结果表明野生型和超表达型株系L3的种子都延迟萌发，但超表达株系L3的种子在萌发时受到了更严重的影响(图10a)；野生型的萌发率为60％，而超表达型株系L3的萌发率仅为15％(图10b)。

<3>高盐处理

用0.1％的次氯酸钠消毒种子后，把消毒后的种子种在含有250mM NaCl的1/2 MS培养基上，让其发芽并生长到20天时，统计萌发率后照相。同时设置对照(Control)：将未处理的种子种在1/2 MS培养基中，其它培养条件相同。其中，以主根伸出为萌发依据。实验设5次重复。每次重复，水稻中花10号(WT)和转基因水稻中花10号T2代的超表达株系L3种子各50粒。

结果表明超表达型和野生型株系的种子都延迟萌发(图11a)，但是超表达株系L3的种子萌发受影响的程度比野生型小，超表达株系L3萌发率为35％，而野生型的萌发率仅为18％(图11b)。

<4>干旱处理

将在1/2 MS培养基上萌发生长14天的水稻中花10号(WT)和转基因水稻中花10号T2代的超表达株系L3幼苗，洗去MS培养基，然后转移到20％(20g/100mL)的PEG6000溶液中进行干旱胁迫处理24小时，观察其叶片萎蔫情况并照相。同时设置对照(Control)：培养液中不含PEG6000，其它培养条件相同。

实验设5次重复。每次重复，水稻中花10号(WT)和转基因水稻中花10号T2代的超表达株系L3各50株。

将在1/2 MS培养基上萌发生长14天的水稻中花10号(WT)和转基因水稻中花10号T2代的超表达株系L3幼苗，洗去MS培养基，然后转移到10％(10g/100mL)的PEG6000的溶液中进行干旱胁迫处理12和24小时后，种植在温室中，两周时观察其恢复生长的情况，统计成活率照相。实验设5次重复。每次重复，水稻中花10号(WT)和转基因水稻中花10号T2代的超表达株系L3各50株。

结果显示，用20％的PEG6000溶液处理处理24h时，92％的野生型叶片出现萎蔫，而仅8％的超表达株系L3植株的叶片出现萎蔫(图12)。用10％的PEG6000的溶液分别处理12h和24h时，超表达株系L3的成活率为85％和60％，野生型分别为40％和7.5％(图13)。图13a中，上面的三张图片为野生型植株照片，下面的三张图片为超表达株系L3植株照片。

实施例4、OsCOIN基因超表达耐胁迫机理的检测

a、为了解OsCOIN基因与低温抗性途径的关系，从报道的与低温相关的基因中选定了OsNAC6(Kikuchi et al.，Mol Gen Genet，262：1047-1051；Ohnishi et al.，Genes Genet Syst，80：135-139)、OsP5CS(Hur et al.，Plant Sci，167：417-426；Su and Wu，Plant Sci，166：941-948；Yamada et al.，JExp Bot，56：1975-1981)和OsLti6a/6b(Morsy et al.，Gene，344：171-180)。NAC基因家族的成员编码了植物特有的转录因子，广泛地存在于不同植物中。低温、干旱、盐、ABA、茉莉酸和创伤诱导OsNAC6的表达，OsNAC6对创伤的响应非常迅速和强烈，茉莉酸能激活植物的防御响应。因此，OsNAC6不但对调节植物适宜非生物逆境起作用，而且在非生物和生物逆境共同作用的整合信号中起作用(Kikuchi et al.，Mol Gen Genet，262：1047-1051；Ohnishi et al.，Genes Genet Syst，80：135-139)。P5CS是一个脯氨酸合成酶。OsP5CS2与P5CS相比，有很高的同源性。盐、4℃低温和0.5μM ABA诱导OsP5CS2的表达，敲出OsP5CS2后的植株对盐和低温更敏感。因此，OsP5CS2对植物抗盐和耐低温是必需的(Hur et al.，Plant Sci，167：417-426；Su and Wu，Plant Sci，166：941-948；Yamada et al.，J Exp Bot，56：1975-1981)。在种子萌发期，低温能诱导两个密切相关的基因(OsLti6a/6b)表达，这两个基因(OsLti6a/6b)与拟南芥的稀有冷诱导基因RCI2、大麦的低温诱导基因BLT101和酵母的PMP3密切相关。依据直接的生化和间接的生理区别及保守的蛋白结构域分析，水稻基因(OsLti6a/6b)属小分子量疏水性蛋白质类，在低温、脱水和盐胁迫时，维持细胞膜的完整性(Morsy et al.，Gene，344：171-180)。由于所选择的报道基因在低温处理24h时表达量都较高，故提取按照实施例3步骤3的方法4℃低温处理24h和未经低温处理的水稻中花10号(WT)和转基因水稻中花10号T2代的超表达株系L3幼苗的总RNA，RT-PCR检测七个报道基因在野生型和转OsCOIN超表达水稻中的表达丰度，Tubulin为对照。其中，RT-PCR扩增OsNAC6的引物为：5’-CAT GGC CGG TGA ACT TTG AC-3’(F)，5’-CTC GTC GTC 6TT CAG TCC A6-3’(R)；扩增OsP5CS的引物为：5’-AAG ATG GAA GAT TGG CTT TGG GCA G-3’(F)，5’-TCTCGT GTA GGT AGA GGA GGC ATG A-3’(R)；扩增OsLti6a的引物为：5’-AAT ACT GCGAGA GAA ATT AAT CA-3’(F)，5’-TAA GAG GGG AGC TTA TTC ACA C-3’(R)；扩增OsLti6b的引物为：5’-GCC TTA AAT TGG AGC TCA GTC-3’(F)，5’-GTG CAG AAG ATA AAC TGGAGA A-3’(R)；扩增OsCOIN的引物为：5’-ATG AGC TCT CTA TGC CCC TTT GCC A-3’(F)，5’-CTT GTC ATC CAA TTG TTT TTG TAG A-3’(R)；扩增Tubulin的引物为：5’-TCA GAT GCC CAG TGA CAG GA-3’(F)，5’-TTG GTG ATC TCG GCA ACA GA-3’(R)。

RT-PCR结果显示，未处理时，四个报道基因的表达量没有变化(图14a)。在4℃C处理24h时，OsNAC6、OsP5CS和OsLti6b基因的表达量上升，OsLti6a基因的表达量几乎不变(图14a)。所以，OsCOIN的超表达促进了OsNAC6、OsP5CS和OsLti6b基因的表达，对OsLti6a基因的表达没有影响。

b、低温胁迫下，OsCOIN超表达水稻幼苗的脯氨酸含量的检测

根据Bates等人的方法(Plant and soil，39：205-207)，检测未经低温处理和按照实施例3步骤3的方法4℃低温处理24h的两周龄野生型水稻中花10号(WT)和转基因水稻中花10号T2代的超表达株系L3幼苗(各20株)的脯氨酸含量。结果表明未经低温处理的野生型和转OsCOIN超表达株系水稻幼苗的脯氨酸含量分别为13.5±1.08和15.5±0.98nM g FW^-1(图14b)。经4℃低温处理24小时的野生型和转OsCOIN超表达水稻幼苗的脯氨酸含量分别为17.7±1.12和58.7±1.76nM g FW^-1(图14b)。说明在低温胁迫时转基因植株中的脯氨酸含量增加。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1593

<212>DNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400>1

gatcccctct catccgctcg cggacacaga atctctcctc tccctctcgg cgcccaggtt 60

ctcgccgccg cccgcccctt ccttctcttc tcctcctacg tacgtaaata atccacctac 120

gatagatacg accaacccca ttatgagctc tctatgcccc tttgccaaac tcgcctccgc 180

tggcgccaca tgccccgtaa aatcatcatc agacaacaaa accaccatca atcacaccga 240

cgacgacgac gacgacaatg aaaaaactgg caatgctaac accgatcctc gtgtggtgcc 300

accaaagtgc ccctttggct atgactccaa caccttcaag cttggcccac tcagctgcat 360

ggtctgccac gctctgctac atcaaagcag caaatgcacc ccgtgctccc acaagttctg 420

caaggcatgc atattgcgct ttaaggactg tccattgtgt ggtgctgaca tccaagggat 480

cgagcccgat gatgagcttc aaggccttgt cgaccgcttc attgatggcc atgcccgaat 540

caagagatca catgctgcag gcgatgggga agccgcaagt gacaacaaga ccaaggtcat 600

ttacgaggat gtctccatgg agagaggggc ttttctggtc cagcaagcga tgagggcctt 660

tcgcgcacag aacattgaaa gtgcaaagtc aaggctcagt atgtgtgcac aagacatcag 720

ggaagaattg aaatctaaac aagacaacca agaactgtgt tctcaacttg gagctgtgtt 780

aggaatgctt ggggactgct gtcggacctt gggagatgct ccttcagcaa tcacttacta 840

tgaagaaagt gctgaattcc tctcgaaatt gcccaaaaaa gatctggagt tggtccatac 900

tctctcagtt tcactaaata aaattggaga tcttcgctat tatgatgggg acctccactc 960

agcaagaagc tattatgcgc gttcgttgga tgttcgcaga agtgcagcaa aagaacactc 1020

agctgtggct tcccaggtca ttgatgtagc aacttctctt gccaaagttg cggatgtcga 1080

tagaaatctt gggaacgaaa gcatggcagt tgagggtttt gaggaagcaa ttaaatgcct 1140

tgagaatttg aagctggaat ctggagaggc cagtcttgag cagcggcgtc tctcggttct 1200

cgactttcta caaaaacaat tggatgacaa gtgatatgca cggttctaat ttgaagagca 1260

cactcacagg atatatgcac tatccataat gaggatcagc tccagtacgt agtctctgtg 1320

atgcatatgg aagggagttg ctccagatcg aatgaatggt aactggtgtg tatttgaggt 1380

ttgctgcgac acagaataaa tactttcgag ttgtatatgt ttcttgtgtc tgccacgggt 1440

ggagacctct ttgagtccct gaggcaccac ggagacgaaa cttctcggaa gtactgattc 1500

cttgttgcct ctgccgtgtt atgtgaatgt tatcccactg tatatttatt gatgatataa 1560

tataagaaaa gaacagcaca gatgttttgt atc 1593

<210>2

<211>363

<212>PRT

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400>2

Met Ser Ser Leu Cys Pro Phe Ala Lys Leu Ala Ser Ala Gly Ala Thr

1 5 10 15

Cys Pro Val Lys Ser Ser Ser Asp Asn Lys Thr Thr Ile Asn His Thr

20 25 30

Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asn Glu Lys Thr Gly Asn Ala Asn Thr Asp

35 40 45

Pro Arg Val Val Pro Pro Lys Cys Pro Phe Gly Tyr Asp Ser Asn Thr

50 55 60

Phe Lys Leu Gly Pro Leu Ser Cys Met Val Cys His Ala Leu Leu His

65 70 75 80

Gln Ser Ser Lys Cys Thr Pro Cys Ser His Lys Phe Cys Lys Ala Cys

85 90 95

Ile Leu Arg Phe Lys Asp Cys Pro Leu Cys Gly Ala Asp Ile Gln Gly

100 105 110

Ile Glu Pro Asp Asp Glu Leu Gln Gly Leu Val Asp Arg Phe Ile Asp

115 120 125

Gly His Ala Arg Ile Lys Arg Ser His Ala Ala Gly Asp Gly Glu Ala

130 135 140

Ala Ser Asp Asn Lys Thr Lys Val Ile Tyr Glu Asp Val Ser Met Glu

145 150 155 160

Arg Gly Ala Phe Leu Val Gln Gln Ala Met Arg Ala Phe Arg Ala Gln

165 170 175

Asn Ile Glu Ser Ala Lys Ser Arg Leu Ser Met Cys Ala Gln Asp Ile

180 185 190

Arg Glu Glu Leu Lys Ser Lys Gln Asp Asn Gln Glu Leu Cys Ser Gln

195 200 205

Leu Gly Ala Val Leu Gly Met Leu Gly Asp Cys Cys Arg Thr Leu Gly

210 215 220

Asp Ala Pro Ser Ala Ile Thr Tyr Tyr Glu Glu Ser Ala Glu Phe Leu

225 230 235 240

Ser Lys Leu Pro Lys Lys Asp Leu Glu Leu Val His Thr Leu Ser Val

245 250 255

Ser Leu Asn Lys Ile Gly Asp Leu Arg Tyr Tyr Asp Gly Asp Leu His

260 265 270

Ser Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Arg Ser Leu Asp Val Arg Arg Ser Ala

275 280 285

Ala Lys Glu His Ser Ala Val Ala Ser Gln Val Ile Asp Val Ala Thr

290 295 300

Ser Leu Ala Lys Val Ala Asp Val Asp Arg Asn Leu Gly Asn Glu Ser

305 310 315 320

Met Ala Val Glu Gly Phe Glu Glu Ala Ile Lys Cys Leu Glu Asn Leu

325 330 335

Lys Leu Glu Ser Gly Glu Ala Ser Leu Glu Gln Arg Arg Leu Ser Val

340 345 350

Leu Asp Phe Leu Gln Lys Gln Leu Asp Asp Lys

355 360

Claims

1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的自氨基末端第72-106，60-63，65-68，183-186，353-356，78-83，245-250，261-275，294-308位氨基酸残基外进行取代和/或缺失和/或添加。

3.权利要求1或2所述蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述蛋白编码基因为如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5′末端第143-1234位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述基因的重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pUN1301的BamHI和KpnI位点间插入序列表中序列1的自5’末端的第143-1231位脱氧核苷酸得到的pUN1301-OsCOIN；所述pUN1301按照如下方法得到：在pCAMBIA1301的EcoRI和HindIII位点间插入玉米泛素启动子和Noster poly A。

7.含有权利要求3或4所述基因的转基因细胞系或重组菌。

8.一种培育抗逆植物的方法，是将权利要求5或6所述的重组表达载体导入植物细胞中，得到抗逆植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述抗逆植物是抗干旱和/或抗高盐和/或耐低温的植物。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述植物是单子叶植物，优选为水稻。