CN101130777B - 与水稻生长发育和抗病性相关的编码锌指蛋白的水稻新基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含有锌指结构的水稻cDNA，命名为OsLOL2，编码163个氨基酸，含有2个C₂/C₂型锌指结构域。对该基因的sense、antisense水稻转化系和sense烟草转化系进行表型观察和接种试验，结果表明，OsLOL2参与调控植物的株高和抗病性。OsLOL2与GFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白的绿色荧光显微镜观察表明，OsLOL2基因所表达的蛋白定位于细胞核内，推测其可能作为转录调控因子发挥作用。

Description

与水稻生长发育和抗病性相关的编码锌指蛋白的水稻新基因 

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体地，本发明涉及与水稻生长发育和抗病性相关的编码锌指蛋白的水稻新基因，包括该基因的重组质粒、宿主及其应用。 

背景技术

锌指蛋白参与植物抗病反应已有报道，WRKY蛋白是植物特有的一类锌指蛋白，其中的一个重要功能是参与植物抗病反应，芹菜WRKY蛋白含有C-X_4-5-C-X_22-23-H-X-H保守结构，通过结合到抗病相关基因(PR-10基因)启动子区的W盒上来激活这些基因的表达，从而提高植物对病原物的抗性(Eulgem T.等1999).AtWRKY18是拟南芥中受病原菌和水杨酸诱导的转录因子，它含有一个与芹菜WRKY锌指基元相同的结构域，功能与WRKY相似，在花椰菜花叶病毒35S启动子下高水平表达时，影响拟南芥的生长发育，使其生长相对较缓慢；在适当的水平下表达，拟南芥对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的抗性增强，抗性相关基因的表达水平提高，抗性增强不是由水杨酸合成增加引起的，而是与抗病调控蛋白NPR1/NIM1有关，AtWRKY18启动子区的顺式作用元件对AtWRKY18的表达起负调控作用，可以控制AtWRKY18的表达而不至于过量而导致对自身生长不利(Chen C.H.等2002)。WRKY70的表达受水杨酸的激活，甲基茉莉酸的抑制。在水杨酸参与的抗病信号传导途径中处于NPR1基因的下游。过量表达WRKY70基因，植物表现出对致病性病原菌软腐菌(necrotrophE.C.carotovora)和假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)的抗性增强和受水杨酸诱导的病原相关蛋白(PR)的组成性表达。WRKY70抑制甲基茉莉酸诱导的基因表达，负调控甲基茉莉酸介导的抗病信号传导(Li J.等2004)。拟南芥AtWRKY6基因敲除以后，植物叶片的衰老明显减弱， 说明该基因参与细胞死亡过程。且AtWRKY6基因正向调控PR-1基因的表达，说明AtWRKY6参与植物抗病反应(Robatzek S.等2002)。拟南芥的RAR基因调控抗病基因对各种细菌和卵菌产生抗性，突变分析显示，RAR基因在限制病原菌生长的程度，过敏性植物细胞死亡和氧化物的激发上起决定作用。抗性基因RPP4，RPP21，RPM1，RPS2，RPS4，RPS5发挥作用都需要RAR参与。(Muskett P.R.等2002)。拟南芥LSD1基因编码一个含有3个C₂/C₂型锌指的蛋白，它限制植物防御反应的起始和随后过敏性反应的产生，当此基因丧失功能时拟南芥对细胞死亡起始因子诱导细胞死亡过敏，而且不能抑制死亡的蔓延，同时表现为与病原菌或化学物质诱导相同的过敏性反应和系统获得性抗性，抗病相关基因PR-1的表达量明显提高(Dietrich R.A.等1997)。植物抗病信号传导的两个重要成分EDS1和PAD4在调控细胞程序性死亡的时候均受LSD1基因的控制(Rusterucci C.等2001)。Lsd1突变体在诱发细胞死亡的时候需要水杨酸和NIM1/NPR1基因的参与，转NahG(降解水杨酸)基因的Lsd1突变体和lsd1/nim1双突变体用水杨酸处理后叶片不出现坏死斑或者坏死斑出现的时间晚且不会蔓延至整个叶片，接种非致病性假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.tomatoDC3000)也不出现过敏性反应。接种致病性疫霉菌(Peronosporaparasitica)依然表现抗性，说明Lsd1突变体所表现的是对病原菌的基本抗性(Aviv D.H.等2002)。根据LSD1序列进行拟南芥基因组的搜索，得到4个同源性较高的基因，LOL1是其中之一，通过构建Lsd1/lol1双突变体并喷洒苯并噻二唑(BTH)诱导细胞死亡，结果发现Lsd1单突变体很快就产生坏死斑并迅速蔓延到整个叶片，而Lsd1/lol1双突变体没表现出明显的细胞死亡，说明LOL1在Lsd1突变体诱发细胞死亡的时候是必需的。拟南芥体内过量表达LOL1易诱发细胞死亡。由此可见LOL1是细胞程序性死亡的正调控因子，lsd1突变体所导致的细胞死亡需要LOL1基因的参与(Epple P等2003)。 

在植物的生长发育过程中锌指蛋白也发挥着重要的作用。拟南芥的矮化突变体shi是由于转座子插入SHI基因的上游非翻译区中转座子所携带的CAMV35S启动子发挥作用导致SHI基因过量表达所致。SHI基因编码一个新型锌指蛋白，过量表达该基因使拟南芥对外源赤霉素不敏感，植物体内 赤霉素大量积累，说明SHI可能作为赤霉素反应的一个负调节因子发挥作用(Fridborg I.等1999)。拟南芥的gai突变体是在GAI基因的N端缺失17个氨基酸导致该基因不能被GA激活，表现对赤霉素不敏感，矮化表型。进一步的研究分析表明GAI基因所表达的蛋白是作为一个转录调节因子起作用的，定位于细胞核内。用该突变基因和其自身的启动子转化菊花，结果菊花表现矮小表型(Petty L.M.等2003)。拟南芥的SERRATE基因是一个与子叶的起始与延伸，胚胎后器官发育相关的基因，编码一个C₂H₂型锌指蛋白。该基因的内源表达水平下降以后可导致拟南芥出现矮化(Prigge M.J.等2001)。拟南芥的SUPERMAN基因及其同源基因是一类与生长发育有关的基因，该类基因表达的蛋白也是锌指蛋白。SUPERMAN基因突变后导致雄蕊过多发育，心皮发育不良(Bowman J.L.等1992)。拟南芥体内过量表达AtZFP11(一个与SUPERMAN基因同源基因)导致不能得到转化苗，该基因在烟草中表达对烟草的生长发育的影响也很大，使得烟草生长矮小，叶片发育不正常，开花提前，且多不育(Dinkins R.D.等2003)。 

水稻的OsLOL2基因是作为一个与拟南芥LSD1基因同源的基因来开展的研究，鉴于LSD1基因在细胞程序性死亡和抗病性反应中所发挥的重要作用，以及在植物细胞程序性死亡和抗病信号传导研究中的重要价值，从水稻中寻找与LSD1同源基因并研究其功能显得有重要意义。通过序列比对发现水稻基因组中有6个基因含有与LSD1基因锌指结构同源锌指基元，说明含有此种结构的锌指蛋白可以构成一类，且所表现的功能有可能比较丰富。OsLOL2基因是其中之一，表达的蛋白与LSD1基因表达的蛋白有24％的同源性，含有2个C₂/C₂型的锌指基元，其锌指结构与LSD1的锌指结构有74％的同源性，因此我们从此入手，开展了对OsLOL2基因功能的研究。 

发明内容

本发明人通过对水稻EST测序和序列比对，发现一个EST所编码的蛋白含有锌指结构，与拟南芥的LSD1锌指结构高度同源，并用PCR方法从水稻cDNA文库中克隆到含有完整读码框的片段，命名为OsLOL2(SEQ IDNO：1)，完整读码框含有492个核苷酸，编码一个163个氨基酸的蛋白，该蛋白含有2个C₂/C₂型锌指结构。本发明旨在探索LSD1同源基因在水稻中的 功能，阐明OsLOL2是否参与细胞程序化死亡，是否参与植物对病原菌的抗性反应，是否在水稻中还有新的功能。 

利用转录后基因沉默的原理，构建了用于植物遗传转化的sense和antisense载体：pOsLOL2S和pOsLOL2AS，转化水稻日本晴和烟草SR1，通过分析转化系的表型和接种结果来揭示OsLOL2的功能。该方法在研究基因的功能方面有独特的优点：首先是先得到基因，可以明确而有的放矢地针对此基因开展研究，其次是利用转录后基因沉默的原理，可以将内源基因沉默而达到与突变体相同的效果，而无需筛选突变体这样繁琐费时的工作，无需做图位克隆。 

本发明揭示了水稻OsLOL2基因参与植物株高的调控，并作为正调控因子参与对水稻白叶枯病菌、稻瘟菌和烟草青枯雷尔菌的抗性反应。 

附图说明：

图1：含有完整读码框的OsLOL2的cDNA片段(SEQ ID NO：1)。 

图2：A：OsLOL2与LSD1，LOL1的同源性比较。B：OsLOL2蛋白的2个锌指结构与LSD1蛋白锌指结构同源性比较(1，2为OsLOL2蛋白的2个锌指结构域，3，4，5为LSD1蛋白的3个锌指结构域)。 

图3：OsLOL2基因的Southern blot分析，1，2和3为日本晴DNA；4，5和6为MH63 DNA；7，8，9为IR24 DNA；其中1，4，7进行EcoRI酶切；2，5，8进行BamHI酶切；3，6，9进行HindIII酶切，M为1KbMarker(New England Biolabs公司)。 

图4：pOsLOL2S(A)，pOsLOL2AS(B)，pGFP-2(C)，pOsLOL2G1(D)，pOsLOL2G2(E)，pROK2(F)，pRGFP2(G)载体图。 

图5：OsLOL2基因的sense和antisense的PCR扩增片段。M为DL2000Marker(Takara公司)，1为sense片段，2为antisense片段。扩增片段长度均为579bp。 

图6：水稻遗传转化过程中各时期愈伤状态和转化植株。A：1为水稻种子诱导的愈伤组织，2为共培养后筛选到的抗性愈伤，3为抗性愈伤预分化时的状态，4为抗性愈伤分化时的状态。B：分化获得的抗性转化植株。 

图7：水稻转化系的潮霉素抗性基因(HPT II)PCR检测。A：sense 转化系的PCR检测，1为日本晴，2，3，4，5为4个独立的sense转化系。B：antisense转化系的PCR检测，1为日本晴，2，3，4，5为4个独立的antisense转化系。M为DL2000Marker(Takara公司)，扩增片段为858bp。 

图8：水稻OsLOL2基因antisense转化系表型。1为日本晴，2，3，4，5为4个独立的antisense转化系。 

图9：水稻sense和antisense转化系半定量RT-PCR。A：sense转化系，1为日本晴，2，3，4为3个独立的sense转化系。B：antisense转化系，1为日本晴，2，3，4为3个独立的antisense转化系。M为DL2000 Marker(Takara公司)，扩增片段为579bp。 

图10：烟草OsLOL2基因sense转化系潮霉素抗性基因(HPTII)和OsLOL2基因的PCR检测。A：潮霉素抗性基因PCR检测，1-8泳道为8个独立转化系。B：OsLOL2基因的PCR检测，1-8泳道为8个独立转化系(与A相对应)。M为DL2000 Marker(Takara公司)，扩增片段为858bp。 

图11：烟草OsLOL2基因sense转化系T₀代(A)和T₁代(B)表型。1为对照pCAMBIA 1302转化系，2为OsLOL2基因sense转化系。 

图12：OsLOL2基因sense转化系接种水稻白叶枯菌PXO99(1为日本晴，2为pCAMBIA 1301转化系，3为接种PSA培养基对照，4，5，6，7为sense转化系；箭头所示图片显示白色为病斑)。 

图13：OsLOL2基因antisense转化系接种水稻白叶枯菌PXO86(1为日本晴，2，3，4，5为antisense转化系；箭头所示图片显示白色为病斑)。 

图14：OsLOL2基因sense水稻转化系接种稻瘟菌Y34(1为日本晴，2，3，4为sense转化系)。 

图15：OsLOL2基因sense烟草转化系接种青枯雷尔菌(1为SR1，2为sense转化系)。 

图16：OsLOL2-GFP融合蛋白在水稻根尖细胞内的定位(左为光镜下照片，右为紫外光下荧光照片，箭头所示图片显示为绿色荧光)。 

图17：A：OsLOL2-GFP融合蛋白在烟草BY-2悬浮细胞中的定位，B：GFP蛋白在烟草BY-2悬浮细胞中的表达(左为光镜下照片，右为紫外光下荧光照片，图片显示为绿色荧光)。 

包含564bp OsLOL2基因(SEQ ID NO：1)的大肠埃希氏菌(Escherichia.coli)DH10B于2005年9月27日送中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)保藏，保藏号为CGMCCNo.1463，命名为pOsLOL2。 

具体实施方式

下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的，并非限制本发明。本发明的保护范围由后附的权利要求所界定。 

实施例1：水稻cDNA文库的构建 

按照He C等(1999)的方法构建水稻cDNA文库的构建。Trizol试剂(Invitrogen公司)提取水稻叶片总RNA，mRNA的分离用BoehringerMannheim公司的试剂盒，cDNA文库的构建用SuperScript Plasmid系统(Invitrogen公司)。其操作流程如下： 

1.总RNA的提取。取水稻的叶片加液氮在研钵中研磨至粉状，转到离心管中加Trizol试剂提取，离心后取上清，异丙醇沉淀获得水稻的总RNA。 

2.mRNA的分离。取200μg的水稻总RNA加0.5ml的裂解缓冲液，混合，65℃2分钟，加1.5μl的生物素标记的oligo(dT)₂₀探针，将此混合物转入150μl的streptavidin亲合的磁粒悬浮液中混匀，37℃温浴5分钟，然后将磁粒分离用冲洗缓冲液洗3次，加50μl重蒸水悬浮磁粒，65℃温浴2分钟，转移含mRNA的上清至新的离心管中。 

3.cDNA文库的构建。(1)第一链的合成，取2μg的水稻mRNA，加DEPC处理无菌蒸馏水至10μl混匀，70℃温浴10分钟，置冰上冷却，加4μl缓冲液，2μl 0.1M DTT，1μl 10mM dNTP，，混匀于37℃温浴2分钟，加2μlSuperScript^TM II RT，混匀于37℃温浴1小时。置冰上冷却终止反应。(2)第二链的合成，在上述反应体系中加缓冲液30μl，3μl 10mM dNTP，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA聚合酶I，1μl RNA酶H，加DEPC处理无菌蒸馏水至终体积150μl，混匀后放16℃温浴2小时。加2μl T4 DNA聚合酶继续温浴5分钟，转移到冰上冷却，加10μl 0.5M EDTA，用酚-氯仿纯化DNA。(3)加Sal I配接器。在纯化的DNA中加25μl DEPC水，10μlT4DNA连接酶缓冲液，10μl Sal I配接器(adaptor)，5μl T4 DNA连接酶。16℃连接反应20小时，用酚-氯仿纯化DNA。(4)Not I消化。在纯化的DNA中41μl DEPC水，5μl React3缓冲液，4μl Not I。37℃温浴2小时后用酚-氯仿纯化DNA。(5)柱过滤。将纯化的DNA溶解与100μl TEN缓冲液中，去除杂质。(6)与载体连接。10ng cDNA，4μl T4 DNA连接酶缓冲液，1μl经Sal I和Not I消化的pEXP-AD502载体，加DEPC水至19μl，加1μl T4 DNA连接酶，4℃反应过夜。(7)连接产物导入大肠杆菌感受态细胞。70％乙醇纯化连接产物后溶与3μl无菌蒸馏水中，取1μl电击转化大肠杆菌感受态细胞DH10B。并涂在含100mg/L氨苄青霉素(Sigma公司)的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑单克隆保存，用于提取文库质粒DNA。 

实施例2：OsLOL2基因的获得及基因结构分析 

1.OsLOL2基因的获得 

根据OsLOL2已知的EST序列(GenBank Accession number：192760)设计引物：正向5’-AAGTCTGTGGCTGTGGCCTC-3’(SEQ ID NO：2)，反向5’-TGAAGCTTTCTTTGGAATCCG-3’(SEQ ID NO：3)，PCR扩增(反应条件：94℃4min，94℃1min，60℃1min，72℃40sec，35个循环，72℃5min。反应体系：1×PCR反应缓冲液，1U Taq酶(Takara公司)，20ng从上述单克隆提取的cDNA文库质粒DNA，0.2mM dNTP，0.2μM引物，加重蒸水至20μl)水稻cDNA文库，得到含有完整读码框(492bp)的一个564bp的片段(SEQ ID NO：1)(附图1)，该片段与pGEM-T Easy载体(Promega公司)连接，电击转化入大肠杆菌DH10B(Invitrogen公司)中并于2005年9月27日送中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1463，命名为pOsLOL2。对PCR产物测序并进行序列比对，结果显示与所对应的EST序列相同。OsLOL2编码一个含163个氨基酸残基的蛋白，对蛋白的结构分析表明其含有2个C₂/C₂型锌指，与拟南芥的LSD1基因表达的蛋白同源性达到24％(附图2A)，锌指结构区的同源性达到74％(附图2B)。 

2.OsLOL2基因结构分析 

2.1OsLOL2基因的结构 

将上述PCR扩增获得的564bp的片段与美国国家生物信息中心(NCBI)的水稻基因组全序列进行Blastn比对，结果显示，该基因位于一号染色体上，含有4个外显子和3个内含子，编码区序列长492bp，编码含163个氨基酸残基的蛋白。 

2.2OsLOL2基因的拷贝数 

利用该基因的序列与水稻全基因组进行序列比对，发现没有与之高度同源或一致的序列，表明该基因在水稻中是单拷贝。同时，如下进行Southem blot分析。 

分别选取日本晴、MH63和IR24(均由国际水稻研究所提供，IRRI)三个水稻品种的叶片，按Dellaporta等(1984)所述方法提取DNA。DNA的定量用紫外分光光度计测定法或琼脂糖凝胶电泳后EB染色法比较确定。选取在该基因上没有酶切位点的三种酶(EcoR I、BamH I和HindIII)酶切2-3μg水稻基因组DNA，30μl反应体系，37℃酶切5小时以上，酶切完全后在0.8％的琼脂糖凝胶上30V电压电泳4-5小时。电泳结束后转膜、杂交、洗膜、显影均按照《分子克隆实验指南》(Sambrook等，1989)所述方法进行。探针(上述PCR扩增获得的564bp的片段)用α-³²P-dCTP(Amersham公司)和Prime-a-Gene Labeling System探针标记试剂盒(Promega公司)进行标记。Southern blot结果表明，OsLOL2在水稻基因组内是单拷贝的(附图3)。 

实施例3：OsLOL2基因转化载体构建 

1.OsLOL2基因正义(sense)和反义(antisense)转化载体的构建 

根据OsLOL2 cDNA序列设计引物： 

sense正向5`-CCCATGGAAGTCTGTGGCTGTGGCCTC-3`(SEQ IDNO：4) 

反向5`-GGGTGACCTGAAGCTTTCTTTGGAATCCG-3`(SEQ IDNO：5) 

antisense正向5`-GGGTGACCAAGTCTGTGGCTGTGGCCTC-3`(SEQ IDNO：6) 

反向5`-CCCATGGTGAAGCTTTCTTTGGAATCCG-3`(SEQ IDNO：7) 

其中，构建sense转化载体的一对引物，正向引物附带一个Nco I酶切位点，反向引物附带一个BstE II酶切位点。构建antisense转化载体的一对引物，正向引物附带一个BstE II酶切位点，反向引物附带一个Nco I酶切位点。利用两对引物PCR扩增水稻cDNA文库，PCR的反应体系含10ng左右的cDNA文库的质粒，1×扩增缓冲液，1U Taq酶，0.2mmol/L dNTPs，0.2μmol/L引物组成20μl反应体系。反应条件是94℃4min，94℃50sec，60℃50sec，72℃50sec，循环35次。反应结束后在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，紫外灯下观察有两条579bp的带。将两片段从胶中切下用胶回收试剂盒(Omega公司)回收，并连接到pGEM-T Easy(Promega公司)载体上，电击转化大肠杆菌DH10B感受态细胞(Invitrogen公司)，涂在含100mg/L氨苄青霉素(Sigma公司)的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑单菌落于5ml液体LB培养基中37℃下250转/分钟摇动培养12小时，取0.5ml菌液送上海生工生物公司测序确定片段正确，剩余菌液提质粒，用Nco I和BstE II(Takara公司)双酶切并回收两个片段。同时，Nco I和BstE II双酶切pCAMBIA 1301质粒(CAMBIA公司)，回收载体片段。然后将回收的两片段分别连接到pCAMBIA 1301载体片段上，构建成pOsLOL2S和pOsLOL2AS两个转化载体(附图4A，B)。将两个载体电击转化入大肠杆菌感受态细胞，并涂在含50mg/L卡那霉素(Sigma公司)的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑单菌落于5ml液体LB培养基中37℃250转/分钟摇动培养12小时，取1ml菌液提质粒，质粒DNA用Nco I和BstEII酶切验证，将转化成功的含有构建载体的菌液于-80℃保存。将两个载体电击转化根癌农杆菌EHA105(Hood等，1993)的感受态细胞，并涂在含50mg/L卡那霉素(Sigma公司)和10mg/L利福平(Sigma公司)的LB固体培养基上，28℃培养36-48小时，挑单菌落于5ml液体LB培养基中200转/分28℃摇动培养12小时，取1ml菌液提质粒，质粒DNA用Nco I和BstE II酶切验证。将转化成功的含有构建载体的菌液于-80℃保存，用于遗传转化。 

2.OsLOL2基因与GFP基因融合表达载体构建 

根据OsLOL2 cDNA序列(SEQ ID NO：1)设计引物： 

正向5`-CCTCGAGAAGTCTGTGGCTGTGGCCTC-3`(SEQ ID NO：8) 

反向5`-GGGTACCTCCACCGGCTTCAGCTAGCCCTGATG-3`(SEQ IDNO：9) 

其中，正向引物附带XhoI酶切位点，反向引物附带KpnI酶切位点，另加6个核苷酸(编码2个甘氨酸)做缓冲。 

PCR扩增水稻cDNA文库(反应条件：94℃4min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环，72℃5min。反应体系：1×PCR反应缓冲液，1U Taq酶(Takara公司)，20ng cDNA文库质粒DNA，0.2mM dNTPs，0.2μM引物，加重蒸水至20μl)，将扩增片段(536bp)连接到pGEM-T Easy载体上，测序验证。XhoI和KpnI(Takara公司)双酶切并回收所需片段，然后将该片段与经XhoI和KpnI双酶切的pGFP2(附图4C，Kost B等1998)连接，构建成瞬间表达载体pOsLOL2G1(附图4D)。将此载体电击转化进入大肠杆菌DH10B中保存。PstI和EcoRI(Takara公司)双酶切pOsLOL2G1，将表达部分切下，与PstI和EcoRI双酶切的pCAMBIA1300(CAMBIA公司)连接，构建成永久表达载体pOsLOL2G2(附图4E)。将此载体电击转化入大肠杆菌DH10B(Invitrogen公司)感受态细胞，并涂在含50mg/L卡那霉素(Sigma公司)的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑单菌落于5ml液体LB培养基中250转/分37℃摇动培养12小时，取1ml菌液提质粒，质粒DNA用PstI和EcoRI酶切验证，将转化成功的含有构建载体的菌液于-80℃保存。将验证正确的质粒电击转化根癌农杆菌EHA105(Hood等，1993)的感受态细胞，并涂在含50mg/L卡那霉素(Sigma公司)和10mg/L利福平(Sigma公司)的LB固体培养基上，28℃培养36-48小时，挑单菌落于5ml液体LB培养基中200转/分28℃摇动培养12小时，取1ml菌液提质粒，质粒DNA用PstI和EcoRI酶切验证。将转化成功的含有构建载体的菌液于-80℃保存，用于遗传转化。 

将pGFP2载体上的GFP基因用XbaI和SacI(Takara公司)双酶切，回收，与经XbaI和SacI双酶切的pROK2(附图4F，Baulcombe等，1986)载体连接构建成永久表达的载体pRGFP2(附图4G)作为对照。 

实施例4：植物遗传转化 

1.水稻的遗传转化 

1.1愈伤组织的诱导 

取成熟的水稻(日本晴)种子脱壳，用70％乙醇处理1分钟，0.1％氯化汞处理15分钟，灭菌的去离子水清洗4次以上，在干净滤纸上晾干后转移到含2mg/L 2，4-D(Sigma公司)的NB₀培养基上，parafilm膜封口，放在25℃培养箱内暗培养诱导胚性愈伤。7天后，把诱导的愈伤从种子上剥离，转移至新的NB₀培养基上继代培养(附图6A1)，约20天后用于转化。 

1.2遗传转化 

将含有所要转化载体pOsLOL2S，pOsLOL2AS和pOsLOL2G2的EHA105保存液在含有卡那霉素(50mg/L)(Sigma公司)和利福平(10mg/L)(Sigma公司)的LB固体培养基上划线，28℃暗培养2天，挑单克隆菌斑入含相同浓度抗生素的LB液体培养基上，28℃，200转/分摇动培养16-18小时至菌液浓度达到OD₅₉₅≈0.5，取1ml菌液提质粒酶切验证，另取1ml菌液到含有相同浓度抗生素的100mlAB培养基中继续培养12-14小时至菌液浓度达到OD₅₉₅≈0.8。将菌液倒入灭菌的50mL离心管中，室温4000转/分离心30分钟收集菌体，倒掉上清，用AAM培养基重悬清洗菌体1次，离心，再用AAM培养基悬浮菌体至OD₅₉₅≈0.4。 

挑选黄色、光亮、生长旺盛的水稻愈伤组织至无菌的培养皿中，把AAM培养基悬浮农杆菌菌体倒入该培养皿轻轻摇动混匀使水稻愈伤充分浸泡在菌液中，室温静置约40分钟。倒掉菌液，将浸有菌液的愈伤转移至2N6-AS培养基上，parafilm膜封口，置培养箱中25℃黑暗条件下共培养2-3天，期间检查农杆菌的生长情况，以农杆菌长满水稻愈伤的表面为宜。 

将共培养后的愈伤转移到干净灭菌的三角瓶中，用灭菌的去离子水清洗10次以上，直至液体显清晰为止，用无菌的去离子水定容至100ml，加头孢霉素(北京鼎国生物技术公司)至浓度为500mg/L，氨苄青霉素(Sigma公司)至浓度为200mg/L，120转/分25℃摇动2-2.5小时。倒掉液体将洗后愈伤转移至无菌滤纸上晾干。将晾干的愈伤转移至含有2mg/L 2，4-D、250mg/L头孢霉素、200mg/L氨苄青霉素和50mg/L潮霉素B(Roche公司)的NB₀培养基上，封口25℃暗培养，筛选转化愈伤。期间时常观察愈伤状态和生长情况，避免杂菌污染。约15天后有抗性愈伤长出。挑取抗性愈伤至新的相同培养基上继代培养一次(附图6A2)。 

1.3愈伤分化和转化苗的获得 

将继代培养约20天的抗性愈伤转移至含有1.0mg/L 6-BA(Sigma公司)、2.0mg/L NAA(Sigma公司)、5.0mg/L ABA(Sigma公司)和50mg/L潮霉素B的NB₀培养基上25℃暗培养，预分化(附图6A3)3-4周。转移白色紧实的预分化愈伤至含有2.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IAA(Sigma公司)、1.0mg/L NAA、1.0mg/L KT(Sigma公司)和50mg/L潮霉素B的NB₀ 培养基上，封口，转移至25℃光照培养箱中16小时光照，8小时黑暗分化培养直至愈伤变绿，出现芽、根分化(附图6A4)。将转化水稻小苗转移到1/2MS固体培养基上生长(附图6B)，半个月后移栽至盆中。 

2.烟草的遗传转化 

2.1外植体的获得 

将烟草SR1种子(购自中国农业科学院植物品种保藏中心)用70％乙醇浸泡1分钟，10％次氯酸钠(内加0.01％吐温20)浸泡10分钟，灭菌水洗4次以上，将种子放在无菌干净滤纸上吸干水分，撒在1/2MS固体培养基上，封口。28℃暗培养2天后，转到28℃光照培养(16小时光照，8小时黑暗)。发芽后转到含有1/2MS固体培养基的玻璃瓶中，待苗长至约3周后即可取其叶片用于遗传转化。 

2.2遗传转化 

将含有所要转化载体pOsLOL2S和pCAMBIA1302的EHA105保存液在含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(20mg/L)的LB固体培养基上划线，28℃暗培养2天，挑单克隆菌斑入含相同浓度抗生素的LB液体培养基上，28℃，200转/分摇动培养16-18小时至菌液浓度达到OD₅₉₅≈0.8，将菌液用1/2MS培养基稀释10倍待用。 

取烟草叶片，剪成1cm²大小，在稀释的菌液中浸泡15分钟，取出叶片放在无菌滤纸上吸干。将吸干叶片正面朝下放在1/2MS固体培养基上， 28℃暗培养48-72小时。 

2.3分化和转化株的获得 

将共培养后的叶片移至分化培养基(MS，+2mg/L 6-BA、0.1mg/LIAA、30g/L蔗糖和2.0g/L Phytagel，pH5.8-6.0)+500mg/L羧苄青霉素(欣经科生物技术公司)和抗性筛选抗生素(20mg/L潮霉素B))，封口膜封口，放在光照培养箱中(16小时光照，8小时黑暗)，28℃培养。当分化培养基上愈伤组织长出大于1厘米的幼芽时，将其剪下移至生根培养基(MS，+0.2mg/L IAA)+抗生素(500mg/L羧苄青霉素，20mg/L潮霉素B)上，继续光照培养，待根长出。苗长高后移栽到土中。 

3.烟草悬浮细胞的遗传转化 

将固体培养基上的烟草愈伤组织块(BY-2)(Nagata等，1992)转到NT液体培养基中悬浮培养3-5天，得到烟草悬浮细胞。 

将含有所要转化载体pRGFP2和pOsLOL2G2的EHA105保存液在含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(10mg/L)的LB固体培养基上划线，28℃培养2天，挑单克隆菌斑入含相同浓度抗生素的LB液体培养基上，28℃，200转/分摇动培养16-18小时至菌液浓度达到OD₅₉₅≈0.8。 

取10ml烟草悬浮培养细胞至干净无菌三角瓶中加1ml摇好的农杆菌菌液混匀，室温静置4小时。再加10ml NT培养基至三角瓶中，125转，28℃摇动共培养24-36小时。将共培养的悬浮细胞系转入50ml离心管中，800转/分室温离心去掉上清，用1/2MS洗悬浮细胞5-8次，加20mlNT培养基和羧苄青霉素，卡那霉素(pRGFP2)或潮霉素B(pOsLOL2G2)至终浓度分别为500mg/L，50mg/L(pRGFP2)或20mg/L(pOsLOL2G2)，悬浮培养5-7天，继代培养直至有抗性细胞产生。 

实施例5：转化系的表型分析 

在水稻转化中，OsLOL2 sense转化载体(pOsLOL2S)共获得111个转化系，antisense转化载体(pOsLOL2AS)共获得91个转化系，提取转化系水稻DNA，根据pCAMBIA1301载体上潮霉素抗性基因(潮霉素磷酸转移酶HPT II)序列设计引物正向：5’-TGCGCCCAAGCTGCATCAT-3’ (SEQ ID NO：10)反向：5’-TGAACTCACCGCGACGTCTGT-3’(SEQ IDNO：11)，PCR扩增(反应条件：94℃5min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环，72℃5min。反应体系：1×PCR反应缓冲液，1U Taq酶(Takara公司)，20ng水稻基因组DNA，0.2mM dNTP，0.2μM引物，加重蒸水至20μl)4个独立的sense转化系和4个独立的antisense转化系的基因组DNA以检测转化系是否为阳性(附图7A，B)。结果对照日本晴无扩增条带，sense和antisense转化系均有扩增条带，说明转化株为阳性。通过对sense和antisense转化系从T₀代到T₄代的表型观察发现，与对照日本晴相比，antisense转化系植株表现矮小(附图8)，而sense转化系与对照无明显差异。 

对上述sense和antisense转化系(附图8中2，3，4)进行半定量RT-PCR分析(水稻RNA用Invitrogen公司的Trizol试剂按说明书提取，用DNAase I(Takara公司)处理RNA样品，反转录用Invitrogen公司的SuperScript^TM first-strand synthesis system进行，3μg的水稻总RNA做模板)，从反转录反应体系中取1μl作为PCR反应的模板(反应条件：94℃2min，94℃1min，60℃40sec，72℃50min，25个循环，72℃3min。反应体系：1×PCR反应缓冲液，1U Taq酶(Takara公司)，0.2mM dNTP，0.2μM引物(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)，加重蒸水至20μl)进行PCR反应，琼脂糖凝胶电泳。结果表明，在antisense转化系(附图9A)中OsLOL2基因的表达受到明显的抑制，sense转化系(附图9B)中OsLOL2基因表达量则明显提高。综合转化系的表型和OsLOL2基因表达的分子检测，发现该基因表达量下降，水稻植株表现矮小，OsLOL2基因过量表达时，对植株的生长无明显影响。由此表明，OsLOL2基因参与了水稻生长发育。 

在烟草转化中，OsLOL2sense转化载体转化烟草共获得20个转化系，选8个转化系做潮霉素抗性基因(HPT II)PCR(反应条件：94℃5min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环，72℃5min。反应体系：1×PCR反应缓冲液，1U Taq酶(Takara公司)，20ng烟草基因组DNA，0.2mM dNTP，0.2μM引物(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11)，加重蒸水至20μl)以检测转化系是否为阳性(附图10A)，结果表明8个转化系均有扩增条带，说明均为转化植株。同时进行了OsLOL2基因PCR反应(反 应条件：94℃5min，94℃1min，60℃50sec，72℃1min，35个循环，72℃5min。反应体系：1×PCR反应缓冲液，1U Taq酶(Takara公司)，20ng烟草基因组DNA，0.2mM dNTP，0.2μM引物(SEQ ID NO：4和SEQID NO：5)，加重蒸水至20μl)检测OsLOL2基因转化是否成功(附图10B)。结果表明这8个转化系也均有OsLOL2基因的扩增条带，说明OsLOL2基因被成功转化进烟草中。烟草转化系T₀代(附图11A)和T₁代(附图11B)表型观察发现，OsLOL2 sense烟草转化系与对照pCAMBIA1302转化系相比，植株表现矮小。 

实施例6：OsLOL2的水稻sense和antisense转化系对水稻白叶枯菌(Xanthomonas Oryzae pv.Oryzae)的抗性 

2004年4月和8月分别在海南和北京对OsLOL2基因sense和antisense转化系进行水稻白叶枯菌接种试验。采用剪刀剪切接种法，分别接种两个菌株：PXO86(对日本晴不致病，国际水稻研究所提供，IRRI)和PXO99(对日本晴致病，国际水稻研究所提供，IRRI)。接种后10天左右观察叶片病斑的形成情况。结果发现OsLOL2基因sense转化系表现为对水稻白叶枯菌(PXO99)抗性增强(附图12)，antisense转化系表现为对水稻白叶枯菌(PXO86)抗性减弱(附图13)。由此表明，OsLOL2基因与水稻的抗病性相关，OsLOL2基因过量表达能提高水稻的抗病性，而表达量降低会减弱水稻的抗病性。 

实施例7：OsLOL2基因的sense水稻转化系对稻瘟菌(Magnaporthe grisea)的抗性 

选择10个sense水稻转化系的T3代纯合系和对照日本晴用于稻瘟菌Y34的接种实验。每个系播种20粒种子，发芽15天后接种稻瘟菌，接种7天后观察结果(附图14)。日本晴叶片有明显的病斑产生，病斑大且呈继续扩展趋势，有的叶片甚至大部分枯死，表现出明显的感病症状，感病等级达到5级。sense转化系的叶片表现为过敏性反应，只有极小病斑产生，表现为抗性，感病等级为0级或1级。该结果再次表明，OsLOL2基因的过量表达能够提高水稻的抗病性。 

实施例8：OsLOL2基因的sense烟草转化系对青枯雷尔菌(Ralstoniasolanacearum)的抗性 

烟草青枯病是由青枯雷尔菌引起的一种以土壤传播为主的细菌性病害。为了研究OsLOL2基因在异源植物中的抗病反应，我们对sense烟草转化系进行接种试验。接种10天后观察发病情况。野生型植株的叶片表现出明显的病斑产生和感病症状，而转化系叶片病斑明显小于野生型病斑(附图15)。此结果表明，OsLOL2基因在烟草中也能够参与对病原菌的抗性。 

实施例9：OsLOL2基因的亚细胞定位 

pOsLOL2G2转化载体转化水稻共获得67个转化系，将T₀代转化系的种子灭菌在1/2MS培养基上发芽，待到芽长至1厘米左右时取根尖生长点压片在绿色荧光显微镜下观察GFP融合蛋白的细胞内定位。结果发现细胞核的荧光很强，说明OsLOL2-GFP融合蛋白富集于细胞核内(附图16)，OsLOL2所表达的蛋白是核蛋白。 

pOsLOL2G2转化载体转化的烟草悬浮细胞(BY-2)，压片后在绿色荧光显微镜下观察，结果与水稻一致，细胞核区的荧光很强(附图17A)，也说明该融合蛋白在烟草细胞中定位于核内。而单独的GFP在核内外均有分布(附图17B)。以上结果充分证明OsLOL2基因表达的锌指蛋白是在细胞核内起作用的。 

结论： 

OsLOL2参与了水稻和烟草的生长发育。过量表达该基因后，水稻表现出对水稻白叶枯病菌、稻瘟菌抗性的提高，烟草表现出对青枯雷尔菌抗性的提高，因此该基因在研究水稻株高发育、探索植物抗病信号传导和水稻品种的抗病改良中可发挥重要的作用。OsLOL2表达的蛋白定位于细胞核内，推测它是作为转录因子发挥作用的。 

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附表1：水稻遗传转化用培养基 

附表2：烟草BY-2遗传转化用培养基 

IB070355-序列表 

SEQUENCE LISTING 

<110>中国科学院微生物研究所 

<120>与水稻生长发育和抗病性相关的编码锌指蛋白的水稻新基因 

<130>IB070355 

<160>11 

<170>PatentIn version 3.1 

<210>1 

<211>564 

<212>DNA 

<213>水稻(Oryza sativa) 

<400>1 

aagtctgtgg ctgtggcctc agaggagatg tctcagctac cacttgcatc gcaggcaact   60 

actacagacc ttgtcagtac aactgcaatg cagccacaat ctgagggtat agtggatgag  120 

tcattgcagc ctcagcatcc accctcttct accgcacatg attcaccttg tttacaggac  180 

tctgtgccat tggtgccacc accaccttcc ccttacctaa ataaagaagt aggtcaaatg  240 

gtatgtggaa gctgccgtat tcttcttgct tattttagag gtgctggtta tgttcactgt  300 

acttgttgcc agacaatgaa ctatgtattg gaagctcatg aagttggtaa ggtgcattgt  360 

ggacactgtg cgacattatt gatgtatcct tttggtgcgc ctgctgttaa gtgctcgttg  420 

tgcctctttg tcactgaaat tggagggcgg aatgttcgcc gtcggttatc aatcgagcaa  480 

cccacaagaa ctaactcatc agggctagct gaagcctgat cagtcctggt cccatgtacc  540 

catcggattc caaagaaagc ttca                                         564 

<210>2 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>2 

aagtctgtgg ctgtggcctc                                               20 

<210>3 

<211>21 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>3 

tgaagctttc tttggaatcc g                21 

<210>4 

<211>27 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>4 

cccatggaag tctgtggctg tggcctc          27 

<210>5 

<211>29 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>5 

gggtgacctg aagctttctt tggaatccg        29 

<210>6 

<211>28 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>6 

gggtgaccaa gtctgtggct gtggcctc         28 

<210>7 

<211>28 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>7 

cccatggtga agctttcttt ggaatccg         28 

<210>8 

<211>27 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>8 

cctcgagaag tctgtggctg tggcctc          27 

<210>9 

<211>33 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>9 

gggtacctcc accggcttca gctagccctg atg        33 

<210>10 

<211>19 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>10 

tgcgcccaag ctgcatcat                        19 

<210>11 

<211>21 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>11 

tgaactcacc gcgacgtctg t                     21 

Claims (3)

1.表达载体在抗水稻病害方面的应用，其中所述病害包括水稻白叶枯病和稻瘟病，所述表达载体是以从保藏号为CGMCC No.1463的大肠杆菌中获得的包含SEQ ID NO：1的pOsLOL2为模板，以SEQ IDNO：8和9所示的核苷酸序列为引物扩增的核苷酸序列经EcoRI和PstI限制性内切酶位点克隆入植物表达载体pCAMBIA 1300而获得的pOsLOL2G2。

2.表达载体在控制水稻株高方面中的应用，所述表达载体是以从保藏号为CGMCC No.1463的大肠杆菌中获得的包含SEQ ID NO：1的pOsLOL2为模板，以SEQ ID NO：8和9所示的核苷酸序列为引物扩增的核苷酸序列经EcoRI和PstI限制性内切酶位点克隆入植物表达载体pCAMBIA 1300而获得的pOsLOL2G2。

3.表达载体在抗烟草青枯病中的应用，所述表达载体是以从保藏号为CGMCC No.1463的大肠杆菌中获得的包含SEQ ID NO：1的pOsLOL2为模板，以SEQ ID NO：8和9所示的核苷酸序列为引物扩增的核苷酸序列经EcoRI和PstI限制性内切酶位点克隆入植物表达载体pCAMBIA1300而获得的pOsLOL2G2。

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