KR20030023699A - 리폭시게나제 유전자, 이의 프로모터, 전이 펩타이드 및단백질 - Google Patents

리폭시게나제 유전자, 이의 프로모터, 전이 펩타이드 및단백질 Download PDF

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샤프라트울리히
로턴케이앤
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신젠타 파티서페이션즈 아게
유니베르시태트 취리히
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Abstract

본 발명은 신규한 리폭시게나제 유전자 및 프로모터, 전이 펩타이드 및 이로부터 유도된 단백질에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 연결된 뉴클레오타이드 서열에, 화학적으로 유도가능하지만 상처- 또는 병원체-유도가능하지는 않는 발현을 부여하는 신규한 프로모터에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 연결된 단백질을 색소체로 표적화시킬 수 있는 펩타이드 및 진균성 마이코톡신을 억제하는데 사용할 수 있는 리폭시게나제 활성을 갖는 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른, 상기 프로모터 서열, 및/또는 전이 펩타이드 및 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 재조합 서열에 관한 것이다. 상기 재조합 DNA 서열을 사용하여 유전자이식된 식물, 특히 상처 또는 병원체에 대해서는 반응하지 않지만, 화학물질에 대해서 반응하여 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 유전자이식된 식물을 생성시킬 수 있다.

Description

리폭시게나제 유전자, 이의 프로모터, 전이 펩타이드 및 단백질 {Lipoxygenase genes, promoters, transit peptides and proteins thereof}
본 발명은 신규한 리폭시게나제 유전자 및 프로모터, 전이 펩타이드 및 이로부터 유도된 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 신규한 리폭시게나제 유전자, 프로모터, 전이 펩타이드 및 단백질을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 리폭시게나제 활성을 갖는 폴리펩타이드 및 전이 펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 연결된 뉴클레오타이드 서열에, 화학적으로 유도가능하지만 상처- 또는 병원체-유도가능하지는 않는 발현을 제공하는 신규한 프로모터를 암호화하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 연결된 단백질을 색소체로 표적화시킬 수 있는 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 리폭시게나제 활성을 갖는 단백질 및 진균성 마이코톡신을 억제하는데 있어서 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 신규한 리폭시게나제 유전자, 프로모터 또는 전이 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본원에 기술된 핵산 분자 또는 재조합 분자를 포함하는 숙주 세포, 식물 또는 이의 자손에 관한 것이다.
식물은 이의 생활 주기 동안 다양한 미생물에 노출되며, 이중 다수가 질병을 야기할 수 있다. 결과적으로, 식물은 콜로니화를 피하기 위한 다수의 방어 전략을개발해 왔다. 화학제 또는 생물학제를 사용한 특정 처리법은 일반적으로 감수성인 식물이 독성 병원체를 사용한 후속적인 접종에 대해서 전신계 내성을 갖도록 유도하 수 있다. 이러한 현상은 전신계 후천성 내성 즉, SAR(systemic acquired resistance)로 공지되어져 있다.
벼에서, 예를 들면, 2,6-디클로로이소니코틴산(INA)의 유도체인, 화학제 N-시아노메틸-2-클로로이소니코틴아미드를 사용한 처리는 벼 도열병에 대항하는 우수한 내성 유도 활성을 갖는다. 흥미롭게도, N-시아노메틸-2-클로로이소니코틴아미드를 사용한 처리는 병원체에 대한 식물 방어에 관여하는 것으로 공지된 효소인, 효소 리폭시게나제(LOX, 리놀레에이트:산소 옥시도리덕타제, EC 1.13.11.12)[Seguchi et al. 1992, Journal Pest. Sci. 17, 107-113]를 유도하였다. 벼 도열병균 자체를 사용한 처리가 또한 이러한 리폭시게나제를 유도시켰다. 그러나, 현대 농경에서, 언제든지 사용할 수 있는, 화학제를 사용한 처리에 의해서만 유도되며 병원체 또는 상처에 의해서는 유도되지 않는 유전자를 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 주요 목적은 화학적으로 유도되지만 병원체 또는 상처에 의해서는 유도되지 않는 리폭시게나제 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 농경 생명공학에서 사용하기 위한 프로모터 및 전이 펩타이드 및 상기 리폭시게나제 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 제공하는 것이다.
농경 생명공학에서, 식물은 필요에 따라서 변형될 수 있다. 이를 달성하기 위한 한 가지 방법은 현대의 유전공학 기술을 사용하는 것이다. 예를 들면, 관심대상의 유전자를 식물에 도입함으로써, 식물은 특이적으로 변형되어 목적하는 표현형 형질을 발현할 수 있다. 이를 위해서, 식물은 주로 흔히 프로모터 영역, 암호화 영역 및 종결 영역을 포함하는 이종성 유전자로 형질전환된다. 식물내에서 발현을 위해 이종성 유전자를 유전자적으로 조작하는 경우, 프로모터의 선택은 종종 결정적인 요소가 된다. 특정 유전자를 구성적으로, 즉 모든 시점의 식물 및 대다수 조직 및 기관에서 발현시키는 것이 바람직할 수 있는 반면, 다른 유전자는 특정 자극에 반응하는 경우에만 또는 특정 세포 또는 조직에 한정되어 보다 바람직하게 발현된다. 화학적으로 유도가능한 프로모터는 이미 기술되어져 왔다[예를 들면, 참조: EP-A-제332 104호]. 그러나, 이들 프로모터는 또한 병원체에 의해서 유도된다. 그러나, 화학적으로 유도되지만 병원체 또는 상처에 의해서는 유도되지 않는 프로모터를 사용하는 것이 바람직한 경우도 있다. 따라서, 본 발명의 주요 목적은 식물에서 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위한 상기 선택적인 프로모터를 제공하는 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자, 발현 벡터 및 유전자이식된(transgenic) 식물을 제공한다. 관심 대상의 유전자가 식물내로 도입되는 경우, 이들은 주로 흔히 세포질에서 발현된다. 대안으로, 상기 유전자를 세포내 다른 구획에서 발현시키고자 희망할 수 있다. 이는 예를 들면, 관심 대상의 유전자를 핵 게놈 대신 색소체 게놈내로 도입시킴으로써 달성될 수 있다. 그러나, 현재, 색소체 형질전환은 모든 농경학적으로 중요한 농작물에 대한 일상적인 과정이 아니다. 관심 대상의 단백질을 색소체에서 발현시키는 또 다른 가능한 방법은 관심 대상의 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 5'-말단에 전이 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 부가하고 핵 게놈으로부터 상기 DNA 서열을 발현시키는 것이다. 전이 펩타이드는 연결된 단백질을 색소체로 표적화시킬 수 있는 펩타이드이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 전이 펩타이드를 제공하는 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 전이 펩타이드를 포함하는 재조합 DNA 분자, 발현 벡터 및 유전자전이된 식물을 제공한다. 전이 펩타이드는 완전히 이종성 작제물로서 또는 이들이 천연적으로 연결되는 프로모터 또는 암호화 영역과 함께 사용될 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명의 전이 펩타이드를 포함하는 재조합 DNA 분자, 발현 벡터 및 유전자이식된 식물을 제공한다.
농경 생명공학에서, 프로모터의 선택이 중요할 뿐만 아니라, 목적하는 표현형 형질을 암호화하는 연결된 DNA의 선택이 중요하다. 특히 바람직한 표현형 형질은 본 발명의 리폭시게나제 단백질이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 리폭시게나제 단백질을 포함하는 재조합 DNA 분자, 발현 벡터 및 유전자이식된 식물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 연결된 뉴클레오타이드 서열의 화학적으로 유도가능하지만, 상처- 또는 병원체-유도가능하지는 않는 발현을 구동시킬 수 있는 분리된 핵산 분자를 제공하며, 특히 이때, 상기 분리된 핵산 분자는:
ㆍ 수탁 번호 DSM 13524 하에 기탁된 플라스미드 pBSK+LOX4A로부터의 약 4.5kb 길이의 PstI/PstI 단편의 구성분이고,
ㆍ 서열 번호 17에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 구성분이고,
ㆍ 서열 번호 18에 기재되고,
ㆍ 서열 번호 19에 기재되고,
ㆍ 서열 번호 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
ㆍ 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
ㆍ 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 1 내지 1358번 nt를 포함하고,
ㆍ 서열 번호 3에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
ㆍ 서열 번호 2의 1702 내지 2104번 nt 및/또는 서열 번호 3의 1 내지 97번 nt 및/또는 서열 번호 3의 367 내지 1283번 nt를 포함하고,
ㆍ 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부분 중 임의의 하나의 배합물을 포함하고,
ㆍ 엄격한 조건하에서 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 17, 서열 번호 18 또는 서열 번호 19에, 또는 수탁 번호 DSM 13524 하에 기탁된 플라스미드 pBSK+LOX4A의 4.5kb PstI 단편에 하이브리드화하고, 이때, 핵산 분자는 연결된 뉴클레오타이드 서열의 화학적으로 유도가능하지만 상처- 또는 병원체-유도가능하지는 않는 발현을 구동할 수 있으며,
ㆍ 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 17, 서열 번호 18 또는 서열 번호 19, 또는 수탁 번호 DSM 13524 하에 기탁된 플라스미드 pBSK+LOX4A의 4.5kb PstI 단편의 50개 이상의 nt, 바람직하게는 약 500개 염기, 특히 약 1000개 내지 약 1500개 염기, 보다 특히 약 2000개의 염기 및 가장 특히 약 3000 내지 약 4500개 염기 길이의 연속적인 신장물을 포함하고, 이때, 분리된 핵산분자는 연결된 뉴클레오타이드 서열의 화학적으로 유도가능하지만 상처- 또는 병원체-유도가능하지는 않는 발현을 구동시킬 수 있고, 상기 50개 이상의 nt의 연속적인 신장물은 서열 번호 1, 2, 3, 17, 18 또는 19, 또는 수탁 번호 DSM 13524 하에 기탁된 플라스미드 pBSK+LOX4A의 4.5kb PstI 단편의 상응하는 길이의 연속적인 신장물과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 가지며,
ㆍ 이때, 상기 핵산 분자를 유도할 수 있는 화학적 유도제는 BTH(벤조(1,2,3)티아디아졸-7-카보티오산-S-메틸 에스테르), INA(2,6-디클로로이소니코틴산) 및 프로베나졸로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
ㆍ 이때, 상기 핵산 분자를 유도할 수 있는 화학적 유도제는 자스몬산이다.
관심 대상의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합되는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 분자가 추가로 제공되며, 특히 이때,
ㆍ 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 암호화 서열을 포함하고,
ㆍ 암호화 서열은 이의 5'-말단에서 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
ㆍ 암호화 서열은 목적하는 표현형 형질을 암호화하고,
ㆍ 암호화 서열은 선택가능한 또는 선별가능한 마커 유전자를 암호화하고,
ㆍ 암호화 서열은 항생제 내성, 바이러스 내성, 곤충 내성, 질병 내성, 또는 다른 해충에 대한 내성, 제초제 내성, 개선된 영양가, 산업적 가공에서 개선된 성능 또는 변형된 생식 능력을 부여하는 단백질을 암호화하고,
ㆍ 암호화 서열은 식물에서 상업적으로 가치있는 효소 또는 대사산물을 암호화하고,
ㆍ 암호화 서열은 안티센스 배향으로 존재한다.
본 발명의 분리된 핵산 분자 또는 재조합 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 뿐만 아니라 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자 또는 재조합 핵산 분자로 안정하게 형질전환된 숙주 세포를 추가로 제공하며, 특히 이때,
ㆍ 숙주 세포는 세균이고,
ㆍ 숙주 세포는 식물 세포이고,
ㆍ 숙주 세포는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 고구마, 사탕옥수수, 잠두, 완두, 치커리, 상추, 양배추, 꽃양배추, 브로콜리, 순무, 무, 시금치, 아스파라거스, 양파, 마늘, 후추, 셀러리, 호박(squash), 펌프킨 호박(pumpkin), 삼, 주키니 호박(zucchini), 사과, 배, 마르멜로, 멜론, 서양자두, 체리, 복숭아, 승도복숭아, 살구, 딸기, 포도, 나무딸기, 검은딸기, 파인애플, 아보카도, 파파야, 망고, 바나나, 대두, 토마토, 수수, 사탕수수, 사탕무, 해바라기, 평지, 클로버, 담배, 당근, 면화, 알팔파, 감자, 가지, 오이, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 및 침엽수 및 낙엽수 같은 나무 식물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물 세포이며, 특히 벼, 옥수수, 밀, 보리, 양배추, 꽃양배추, 후추, 호박(squash), 멜론, 대두, 토마토, 사탕무, 해바라기 또는 면화, 특히 벼, 옥수수, 밀, 수수(Sorghum bicolor), 오리새, 사탕무 및 대두 세포이고,
ㆍ 숙주 세포는 쌍떡잎 식물로부터의 식물 세포이고,
ㆍ 숙주 세포는 대두, 면화, 담배, 사탕무 및 평지로 이루어진 그룹으로부터 선택된 쌍떡잎 식물로부터의 식물 세포이고,
ㆍ 숙주 세포는 외떡잎 식물로부터의 식물 세포이고,
ㆍ 숙주 세포는 옥수수, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디, 벼 및 보리로 이루어진 그룹으로부터 선택된 외떡잎 식물로부터의 식물 세포이다.
본 발명에 따른 핵산 분자 또는 재조합 핵산 분자로 안정하게 형질전환된 식물 및 이의 자손이 추가로 제공된다. 특히, 이때, 상기 식물은 옥수수, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디, 벼, 보리, 대두, 면화, 담배, 사탕무 및 평지로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 형질전환된 식물 및 이의 자손으로부터의 종자가 추가로 제공된다.
또한, 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열을 발현하기 위한 본 발명의 분리된 핵산 분자의 용도가 제공된다.
본 발명은 추가로 하기를 기술한다:
ㆍ 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열을 발현하기 위한 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자의 용도, 및
ㆍ 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자를 제조하는 방법, 이때, 핵산 분자는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 제조되며 이때, 사용된 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나는 서열 번호 1, 2, 3, 17, 18 또는 19의 15개 이상의 염기쌍의 연속적인 신장물을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한, 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 분리된핵산 분자를 제공하며, 이때, 상기 아미노산 서열은 연결된 단백질을 색소체로 표적화시킬 수 있으며, 특히 이때,
ㆍ 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4에 기재된 서열이고,
ㆍ 상기 뉴클레오타이드 서열은 엄격한 조건하에서 서열 번호 4에 하이브리드화하며, 특히, 상기 서열은 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열과 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%의 서열 동일성을 가지며 암호화된 펩타이드는 연결된 단백질을 색소체로 표적화할 수 있다.
상기 기술된 분리된 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드 또는 펩타이드 뿐만 아니라 관심 대상의 연결된 단백질을 색소체로 표적화시키기 위한 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 용도를 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 엄격한 조건하에서 서열 번호 5에 하이브리드화하는 분리된 핵산 분자를 제공하며, 이때, 상기 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 65% 이상, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85% 및 가장 바람직하게는 95%의 아미노산 서열 동일성을 가지며 리폭시게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화한다.
본 발명은 추가로, 전술된 바와 같은 핵산 분자를 제공하며, 이때, 상기 핵산 분자는 서열 번호 7에 기재된 단백질을 암호화한다. 전술된 핵산 분자, 특히, 서열 번호 7에 의해 암호화된 또는 리폭시게나제 활성을 갖는 단백질 또는 상기 단백질의 일부분 또는 폴리펩타이드가 추가로 제공된다.
본 발명은 진균성 마이코톡신, 특히, 아플라톡신을 억제하기 위한 전술한 바와 같은 단백질의 용도를 추가로 기술한다. 본 발명은 추가로, 리폭시게나제 활성을 암호화하는 본 발명의 분리된 핵산 분자를 형질전환된 식물에서 발현시킴으로써, 식물 질병 내성을 증가시키거나 진균성 마이코톡신을 억제하는 방법을 제공한다.
상기 기술된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 분자, 이를 사용하여 안정하게 형질전환시킨 숙주 세포를 추가로 제공하며, 특히 이때, 상기 숙주 세포는 상기 기술된 바와 같은 재조합 핵산 분자로 안정하게 형질전환된 식물 세포 및 식물 및 이의 자손이다.
본 명세서 및 특허청구범위에 대한 명백하고 확고한 이해를 보장하기 위해서, 하기 정의들이 제공된다:
"DNA 셔플링(DNA shuffling)"은 DNA 분자내에서 신속하고, 용이하고 효과적으로 재배열을, 바람직하게는 랜덤하게 도입하거나 두 개 이상의 DNA 분자 사이에서 DNA 서열의 교환을, 바람직하게는 랜덤하게 생성시키는 방법이다. DNA 셔플링으로부터 수득되는 DNA 분자는 하나 이상의 주형 DNA 분자로부터 유도된 비천연성 DNA 분자인 셔플링된 DNA 분자이다.
"발현"은 식물에서 내인성 유전자 또는 이식유전자(transgene)의 전사 및/또는 해독에 관한 것이다. 안티센스 작제물의 경우, 예를 들면, 발현은 안티센스 DNA만의 전사를 의미할 수 있다.
"기능적으로 등가성 서열"은 벼 리폭시게나제 유전자 프로모터 또는 이의 일부분과 실질적으로 유사한 프로모터 활성을 가지며 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기 프로모터 서열과 하이브리드화하는 DNA 서열을 의미한다.
"유전자"는 암호화 서열 및 연결된 조절성 서열을 의미하며, 이때, 암호화 서열은 mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 센스 RNA 또는 안티센스 RNA 같은 RNA로 전사된다. 조절성 서열의 예는 프로모터 서열, 5'- 및 3'-비해독된 서열 및 종결 서열이다. 존재할 수 있는 추가 인자들은 예를 들면, 인트론이다.
"관심 대상의 유전자"는 식물내로 전달되는 경우, 식물에게 목적하는 특성들, 예를 들면, 항생제 내성, 바이러스 내성, 곤충 내성, 질병 내성, 또는 다른 해충에 대한 내성, 제초제 내성, 개선된 영양가, 산업적 가공에서 개선된 성능 또는 변형된 생식 능력을 부여하는 임의의 유전자를 의미한다. "관심 대상의 유전자"는 또한 식물에서 상업적으로 가치있는 효소 또는 대사산물의 생산을 위하여 식물내로 전달된 것일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "이종성"은 상이한 천연 또는 합성적 기원을 의미한다. 예를 들면, 숙주 세포가 형질전환되지 않은 숙주 세포에서는 생성되지 않는 핵산 서열로 형질전환되는 경우, 상기 핵산 서열은 상기 숙주 세포에 대해서 이종성인 것으로 언급된다. 형질전환되는 핵산은 이종성 프로모터, 이종성 암호화 서열, 또는 이종성 종결 서열을 포함할 수 있다. 대안으로, 형질전환되는 핵산은 완전히 이종성이거나 이종성 및 내인성 핵산 서열의 임의의 가능한 배합물을 포함할 수 있다.
"리더 영역"은 전사 개시 부위 및 해독 개시 부위 사이의 유전자내 영역이다.
"LOX"은 리폭시게나제이다.
"마커 유전자"는 선택가능한 또는 선별가능한 형질을 암호화하는 유전자를 의미한다.
"nt"는 뉴클레오타이드이며 천연 또는 합성 뉴클레오타이드이다.
"핵산 분자"는 일반적으로 DNA 또는 RNA 중 하나인 임의의 일본쇄 또는 이본쇄 폴리뉴클레오타이드이며, 천연 또는 합성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
"~와 작동적으로 결합된/작동적으로 연결된"은, 조절성 DNA 서열이 암호화 DNA 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있도록 두 개의 서열이 위치하는 경우, 조절성 DNA 서열이 RNA 또는 단백질을 암호화하는 DNA 서열과 "작동적으로 결합된" 또는 "작동적으로 연결된" 것으로 언급된다.
"식물"은 임의의 식물, 특히 종자 식물을 의미한다.
"식물 세포"는 원형질체 및 세포벽을 포함하는, 식물의 구조적 및 생리학적 단위이다. 식물 세포는 분리된 단일 세포 또는 배양된 세포의 형태, 또는 예를 들면, 식물 조직 또는 식물 기관 같은 보다 조직화된 단위의 일부분으로서 존재할 수 있다.
"식물질"은 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃 부분, 과실, 화분, 화관, 배주, 배낭, 난세포, 접합체, 배아, 종자, 절단물, 세포 또는 조직 배양물, 또는 식물의 임의의 다른 부분 또는 생성물을 의미한다.
"폴리뉴클레오타이드"는 (일반적으로) 하나의 뉴클레오타이드의 배당체 잔기의 3' 위치 및 인접한 뉴클레오타이드의 배당체 잔기의 5' 위치 사이의 포스포디에스테르 결합에 의해 결합된 약 10개 이상의 뉴클레오타이드의 일본쇄 단독중합체 또는 이종중합체, 또는 수소 결합에 의해 함께 유지된 두 개의 상기 일본쇄 분자를 포함하는 임의의 이본쇄 분자를 의미한다.
"프로모터"는 연결된 DNA 서열의 전사를 개시하는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터 영역은 또한 활성인자, 인핸서, 및/또는 레프레서 같은 유전자 발현의 조절인자로서 작용하는 요소들을 포함할 수 있으며 5' 비-해독된 영역의 전체 또는 일부를 포함할 수 있다.
"단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기이다.
"재조합 DNA 분자"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 함께 결합시킨 DNA 서열의 배합물이다.
"재조합 DNA 기술"은 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기술된 바와 같은, DNA 서열을 함께 결합시키는데 사용되는 방법이다.
"선별가능한 마커 유전자"는 이의 발현이 형질전환된 세포에 선택성 잇점을 부여하지는 않지만, 비형질전환된 세포로부터 형질전환된 세포를 표현형적으로 구별가능하게 하는 유전자를 의미한다.
"선택가능한 마커 유전자"는 식물 세포에서 이의 발현이 세포에게 선택성 잇점을 제공하는 유전자를 의미한다. 선택가능한 마커 유전자로 형질전환된 세포에의한 선택성 잇점은 비형질전환된 세포의 성장과 비교하여, 항생제 또는 제초제 같은 네가티브 선택제의 존재하에서 성장하는 이의 능력에 기인할 수 있다. 비형질전환된 세포와 비교하여, 형질전환된 세포에 의한 선택성 잇점은 또한 영양분, 성장 인자 또는 에너지 공급원 같은 부가된 화합물을 사용하는 이의 증강된 또는 신규한 능력에 기인할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 또한, 선택제의 부재와 비교하여, 선택제의 존재하에서 식물 세포에서 이의 발현이 예를 들면, 성장과 관련하여, 형질전환된 식물 세포에서 포지티브 효과 및 비형질전환된 식물 세포에서 네가티브 효과를 가지며, 결과적으로 형질전환된 세포에 포지티브 선택성 잇점을 제공하는 유전자 또는 유전자 배합물을 의미한다.
"서열 동일성": 서열 동일성(%)은 동역학적 프로그래밍 알고리듬에 기초하는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정된다. 본 발명의 범위내에서 바람직한 컴퓨터 프로그램은 조회가 단백질 또는 DNA인지에 관계없이 이용가능한 서열 데이터베이스 모두를 조사하도록 디자인된 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 조사 프로그램이다. 상기 조사 수단의 버젼 BLAST 2.0(Gapped BLAST)은 인터넷(현재 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)상에서 공개적으로 이용가능해 졌다. 이는 자가 발견 알고리듬을 사용하며, 이는 전체적 알고리듬에 반대로서 국부적으로 조사하여, 분리된 영역만을 공유하는 서열 사이의 상관관계를 검출할 수 있다. BLAST 조사에서 배정된 득점은 잘-정의된 통계학적 해석을 갖는다. 상기 프로그램은 바람직하게는 디폴트 값으로 설정된 선택적인 변수들을 사용하여 운영된다.
"형질전환"은 세포내로 핵산을 도입하는 것을 의미한다. 특히, 이는 관심대상의 유기체의 게놈내로 DNA 분자의 안정적인 통합을 의미한다.
본 발명은 리폭시게나제 유전자, 및 이로부터 유도된 프로모터, 전이 펩타이드 및 단백질에 관한 것이다. 화학적으로 유도되지만, 병원체 또는 상처에 의해서는 유도되지 않는 리폭시게나제 유전자가 바람직하다. 특히, 상기 리폭시게나제 유전자는 벼로부터의 것이다. 상기 리폭시게나제 유전자, 또는 이의 일부분 또는 단편은 예를 들면, PCR-기초 전략으로 수득할 수 있다. 이를 위해서, 예를 들면, 벼[Peng et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 3755-3761; Ohta et al. (1992) Eur. J. Biochem. 206, 331-336]로부터의 및 밀[Gorlach et al. (1996) Plant Cell. 8, 629-643]로부터의 공지된 리폭시게나제 암호화 서열을 정렬하여 당해 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 보존된 영역을 확인한다. 상기 방법에 의해서, 수 개의 보존된 영역이 확인되며, 이중 하나는 C-말단에 인접하여 존재하며 모든 세 개의 서열에서 불변성인 아미노산 서열 HAAVNFG를 함유한다. 이후, 전체 RNA 또는 폴리A+RNA를 비처리된 대조군 잎으로부터 및 100ppm INA 용액으로 분무하고 처리 24 및 48시간 후에 수거한 잎으로부터 분리한다.
RNA 샘플은 정방향 프라이머로서 벼 RLL2 리폭시게나제[Peng et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 3755-3761]의 C-말단 영역내 HAAVNFG 아미노산 서열 모티프에 상응하는 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 5'-CAYGCNGTNAANTTYGG-3'(서열 번호 8), 및 역방향 프라이머로서 부착된 올리고-dT 프라이머(5'-AATGCTTTTTTTTTTTTTTTV-3'; 서열 번호 9)를 사용하는 RT-PCR용 주형으로 사용한다. 상기 방법이 벼로부터의 전체 RNA 또는 폴리A+RNA를 사용하여 수행되는 경우, 대략 600bp의 PCR 생성물이 에티듐브로마이드 염색된 아가로오스 겔 상에서 INA-처리된 샘플에서만 생성되며 대조군에서는 생성되지 않는다. 당해 분야의 숙련자는 밴드의 크기는 RNA가 분리된 유기체에 따라서 보다 작거나 보다 클 수 있다는 것을 공지하고 있다. 수득된 밴드를 클로닝하고 서열 분석할 수 있으며 당해 분야에 공지된 방법으로 전체 길이 리폭시게나제 cDNA 또는 게놈성 클론을 수득하기 위하여 cDNA 또는 게놈성 라이브러리를 선별하기 위한 프로브로서 사용할 수 있다. INA-처리된 잎으로부터 작제된 벼 cDNA 라이브러리를 선별하는 경우, 3018bp 길이의 전체 길이 벼 리폭시게나제 cDNA 클론이 수득된다(서열 번호 5). RCI-1(벼 화학적으로 유도된 cDNA 1)로 명명된 상기 cDNA 클론은 105kDa의 예견된 분자량을 갖는 922개 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 2766bp(서열 번호 5의 48 내지 2816 염기)의 개방 판독 프레임(서열 번호 7)을 함유한다. 당해 분야의 숙련자에게, 상기 수득된 cDNA 클론은 전체 길이인지 아닌지에 따라서, 5' 및 3' 비해독 영역의 길이에 따라서, 및 라이브러리가 작제된 유기체에 따라서, 보다 크거나 작을 수 있다는 것은 공지되어져 있다.
RCI-1 cDNA를 화학적으로 처리된 잎, 예를 들면, INA, BTH, 프로베나졸 또는 자스몬산으로 처리한 잎으로부터의 RNA를 사용하는 노던 블롯 분석에서 프로브로 사용하는 경우, 강력한 하이브리드화 시그날이 관찰되며, 이는 RCI-1 mRNA의 축적을 나타낸다. 상처입은 잎 또는 병원체-처리된 잎으로부터의 RNA를 사용하는 경우에는 어떠한 상기 mRNA 축적도 관찰되지 않는다. 이는 놀라운 사실이며, 상처는벼에서 자스몬산의 내인성 수준을 증가시키는 것으로 공지되어져 있고 벼 도열병 감염에 대한 증가된 전신계 보호를 유도하기 때문이다[Schweizer et al. (1998) Plant J. 14, 475-481; Schweizer et al. (1997) Plant Physiol. 114, 79-88]. 그러나, 본 발명의 리폭시게나제는 벼 도열병 진균 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea) 또는 세균성 병원체 슈도모나스 시링게 피브이. 시링게(Pseudomonas syringae pv. syringae) 같은 병원체에 의해서 유도되지는 않는다. 이는, 상응하는 유전자의 프로모터 영역이, 상처- 또는 병원체-유도성이 아닌 화학적으로 유도가능한 발현 형태를 연결된 암호화 영역에 부여하는 조절성 요소를 함유해야 한다는 것을 나타낸다.
RCI-1 cDNA에 의해 암호화되는 단백질은 보리 LOX2:Hv:1(60% 동일성 및 68% 유사성)과 가장 유사하다. 아미노산 수준에서의 서열 동일성(유사성)은 낟알 및 파종물에서 주로 발견되는 벼 리폭시게나제 L-2에 대해서 43%(52%)[Ohta et al. (1992) Eur. J. Biochem. 206, 331-336]이고, 마그나포르테 그리세아 유도된 벼 리폭시게나제 RLL2에 대해서 50%(58%)[Peng et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 3755-3761]이다. 본 발명에 포함되는 DNA 서열은 엄격한 조건하에서 RCI-1 cDNA 클론(서열 번호 5)에 하이브리드화하는 것 및 이의 암호화 서열이 서열 번호 7에 기재된 단백질과 65% 이상, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85% 및 가장 바람직하게는 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖고 리폭시게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 것이다.
본 발명의 리폭시게나제 cDNA는 이. 콜라이에서 또는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 진핵성 서열을 발현시키기에 적합한 다른 임의의 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 이후, 발현된 단백질은 분석되고, 선택적으로 정제된다. 모든 이러한 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어져 있다. 본 발명의 cDNA를 발현하는 이. 콜라이 세포 추출물을 분석하는 경우, 기질로서 리놀산을 사용하여 증가된 LOX 활성이 검출되는 반면, 발현 작제물을 갖지 않거나 빈 벡터를 함유하는 이. 콜라이의 대조군 추출물은 검출가능한 LOX 활성을 갖지 않는다. 최대 활성은 약 pH 8 내지 9에서 관찰되며, 이는 RCI-1은 제1형 LOX로 분류되어야 한다는 것을 나타낸다[Siedow (1991) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 145-188]. 그러나, 최근에, 색소체성 전이 펩타이드의 존재에 기초하는 제2 분류법이 도입되었다는 것을 주지해야만 한다[Shibata et al. (1994) Plant Mol. Biol. Rep. 12, 41-42]. 이러한 방법에 따라서, RCI-1은 제2형 LOX로서 분류되어야 한다.
본 발명의 재조합 리폭시게나제의 반응 생성물을 HPLC로 분석하는 경우[Bohland et al. (1997) Plant Physiol. 114, 679-685], (13S)-하이드로퍼옥시-(9Z, 11E, 15Z)-옥타데카트리엔산(13H-HPOD)가 리놀산 또는 리놀렌산이 효소에 대한 기질로서 사용되는지에 관계없이 주요 생성물이다. (9S)-하이드로퍼옥시-(10E, 12Z, 15Z)옥타데카트리엔산(9-HPOD)는 단지 소량으로 검출된다. 13-HPOD로부터 유도된 반응 생성물은 마그나포르테 그리세아에 대한 항미생물 물질로서 작용하는 것으로 보고되어져 왔다[Shimura et al., (1981) Agric Biol Chem 45: 1431-1435; Shimura et al. (1983) Agric Biol Chem 47: 1983-1989]. 이는 본 발명의 리폭시게나제, 특히 RCI-1 LOX가, 시그날로서 작용할 수 있거나 직접적인 항미생물 활성을 나타낼 수 있는 지방산 유도체의 생성과 관련된다는 것을 나타낸다[개관: Slusarenko, A.J. (1996) The role of lipoxygenase in resistance to infection. In Lipoxygenase and Lipoxygenase Pathway Enzymes (Piazza, G.J., ed) pp. 176-197. American Oil Chemicals Society Press, Champaign, Illinois]. 한 가지 특정 구체적인 양태에서, 본 발명의 리폭시게나제는 진균성 마이코톡신의 활성을 제거하거나 실질적으로 감소시키는데 적합하며, 진균성 마이코톡신은 아플라톡신 및 이의 전구체 스테리그마토시스틴, 키트리닌, 진균성 트레모르겐스, 루피노시스, 오크라톡신, 파툴린, 루브라톡신, 스포리데스민, 스타치보티로톡신, 트리코테센스 및 제아랄레논을 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 특히 아플라톡신 및 스테리그마토시스틴을 포함한다.
본 발명의 리폭시게나제 단백질의 아미노산 서열을 보리 LoxA(GenBank 승인 번호 L35931) 또는 벼 L-2(Swissprot 승인 번호 P29250) 같은 다른 리폭시게나제의 아미노산 서열과 배열한 결과, 본 발명의 리폭시게나제는 30 내지 50개 아미노산 잔기 정도의 N-말단 신장물을 갖는 것으로 나타난다. 벼 리폭시게나제 RCI-1의 경우, 상기 신장물은 약 47개 아미노산 길이이다. 상기 N-말단 신장물은 명백히 LOX 종의 상기 부류를, 낟알 및 파종물에서 주로 발견되며 보리로부터의 LoxA, LoxB 및 LoxC[van Mechelen et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39, 1283-1298] 및 벼로부터의 LOX L-2[Ohta et al. (1992) Eur. J. Biochem. 206, 331-336]를 포함하는 또 다른 부류로부터 명백히 구별되게 한다. 상기 N-말단 신장물의 일부분 또는 전체가 리포터 유전자의 N-말단 영역에 융합되는 경우, 상기 리포터 유전자는 색소체, 특히엽록체로 표적화된다. 예를 들면, 키메라 유전자가 녹색 형광 단백질(GFP)의 암호화 서열의 5' 말단에 융합된 RCI-1 cDNA의 처음 158bp(서열 번호 4)와 함께 작제되는 경우, 이의 N-말단에서 RCI-1의 처음 37개 아미노산(서열 번호 6)을 함유하는 변형된 GFP가 수득된다. 상기 작제물을 예를 들면, 아그로박테리움 기초 형질전환 시스템에 의해 아라비돕시스 조직내로 도입시키는 경우, GFP 형광 및 엽록소 자가형광의 정확한 일치가 관찰되며, 이는 상기 융합 단백질이 엽록체에 위치한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 리폭시게나제 단백질의 N-말단 신장물이 전이 펩타이드로서 작용하여 연결된 단백질을 색소체, 특히 엽록체내로 전이시키는 기능을 한다.
부가적으로, 본 발명은 또한, 관심 대상의 연결된 뉴클레오타이드 서열에 대해 화학적으로 유도가능하지만, 상처- 또는 병원체-유도가능하지는 않는 발현을 부여할 수 있는 프로모터를 제공한다. 벼 리폭시게나제 유전자 RCI-1로부터 수득가능한 프로모터 서열이 바람직하다. 이의 기능적 및/또는 구조적 등가물을 포함하는 뉴클레오타이드 서열이 또한 본 발명에 포함된다. 따라서, 본 발명은 연결된 뉴클레오타이드 서열의 전사의 프로모터로서 기능하는 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 프로모터 영역은 또한 활성인자, 인핸서 및/또는 레프레서 같은 유전자 발현의 조절인자로서 작용하는 요소들을 포함할 수 있으며, 전사된 mRNA의 5' 비해독 리더 서열 및/또는 인트론, 및 임의로 엑손을 포함할 수 있다. 화학적으로 유도가능하지만, 상처- 또는 병원체-유도가능하지는 않는 발현이란, 본 발명에 따른 화학적 화합물이 적용되는 경우 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열이 우선적으로 발현되지만, 상처가 생기거나 병원체에 노출되는 경우에는 발현되지 않는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은, 바람직하게는 암호화 서열인 관심 대상의 연결된 뉴클레오타이드 서열의 화학적으로 유도가능하지만, 상처- 또는 병원체-유도가능하지는 않는 발현에 유용하다. 관심 대상의 연결된 암호화 서열이 센스 또는 안티센스 방향으로 발현될 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어져 있다. 추가로, 관심 대상의 암호화 서열은 형질전환시키고자 하는 식물과 관련하여 이종성이거나 동종성 기원일 수 있다. 동종성 암호화 서열의 경우, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 상기 서열의 전위 발현에 유용하다. 본 발명의 한 가지 특정 구체적인 양태에서, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열의 조절하에 관심 대상의 암호화 서열의 발현은 이의 자체 발현 및 소위 공-억제로 불리는 방법에 의해 상기 유전자의 최초 복사체의 발현을 억제한다.
본 발명의 프로모터는 예를 들면, 벼 게놈성 라이브러리를 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 본 발명에 따른 cDNA로 프로빙함으로써 벼 게놈성 DNA로부터 수득할 수 있다. 임의의 다른 유기체, 특히 식물로부터의 게놈성 DNA가 관심 대상의 임의의 유기체로부터 리폭시게나제 프로모터를 수득하기 위해서 사용될 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련자에게는 명백할 것이다. 이후, 상기 게놈성 DNA를 서열분석하고 cDNA 서열로 정렬시킨다. 기본적으로, 개시 코돈 상류의 모든 뉴클레오타이드 서열은 리폭시게나제 프로모터 영역의 일부로서 고려된다. 부가적으로, 인트론 및 임의로 엑손을 상기 영역에 부가하여 연결된 암호화 영역에 대해 화학적으로 유도가능하지만, 상처- 또는 병원체 유도가능하지는 않는 발현을 부여하는 기능성 프로모터를 형성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체적인 양태에서, 리폭시게나제 프로모터는 수탁 번호 DSM 13524로서 기탁된 플라스미드 pBSK+LOX4A로부터 약 4.5kb 길이의 PstI/PstI 단편의 구성분이다. 서열 번호 17은 플라스미드 pBSK+LOX4A로부터 약 4.5kb 길이의 PstI/PstI 단편의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 본 발명의 다른 바람직한 구체적인 양태는 전술된 4.5kb PstI/PstI 단편의 구성분들인, 서열 번호 18, 19, 1, 2, 및 3에 기재된 뉴클레오타이드 서열이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구체적인 양태는 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 1 내지 1358번 nt를 포함한다.
서열 번호 1은 4.5kb PstI/PstI 단편의 5' 말단을 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 358개 뉴클레오타이드 길이이며 이의 5' 말단에서 PstI 부위의 1 내지 6번 위치를 함유한다. 4.5kb PstI/PstI 단편의 서열 번호 1 및 서열 번호 2 사이의 영역은 약 240 내지 440 bp 길이 정도이다. 4.5kb PstI/PstI 단편의 중심 영역은 서열 번호 2에 나타내며 2104bp 길이이다. 이는 잠재적인 TATA 박스(서열 번호 2의 1261 내지 1266번 위치), 잠재적인 개시 코돈(서열 번호 2의 1359 내지 1361번 위치) 뿐만 아니라, 5' 비해독 영역 및 잠재적인 TATA 박스 상류의 뉴클레오타이드 서열들을 함유한다. 게놈성 DNA(서열 번호 2) 및 cDNA(서열 번호 5)의 비교는, 서열 번호 2의 1312 내지 1701번 위치에 위치하는 서열은 엑손 1의 전부 또는 일부를 포함하고, 서열 번호 2의 1702 내지 2104번 위치에 위치하는 서열은 인트론 1의 5' 부분을 포함한다는 것을 나타낸다. 4.5kb PstI/PstI 단편의 서열번호 2 및 서열 번호 3 사이의 영역은 약 85 내지 285bp 길이 정도이다. 4.5kb PstI/PstI 단편의 3' 말단은 서열 번호 3에 나타낸다. 이러한 서열은 1516bp 길이의 뉴클레오타이드 서열을 도시한다. 이는 5'에서 3' 방향으로 인트론 1의 3' 말단(서열 번호 3의 1 내지 97번 위치) 및 뒤이어 엑손 2(서열 번호 3의 98 내지 366번 위치), 인트론 2(서열 번호 3의 367 내지 1283번 위치) 및 엑손 3의 일부(서열 번호 3의 1284 내지 1516번 위치)를 함유한다. PstI 부위는 1511 내지 1516번 위치에 위치한다.
서열 번호 1 내지 3에 제시된 서열 정보에 근거하여, 본 발명의 DNA 서열은 예를 들면, 플라스미드 pBSK+LOX4A 또는 벼로부터의 게놈성 DNA 또는 다른 임의의 관심 대상의 유기체로부터의 DNA를 주형으로 사용하는 PCR에 의해 수득할 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 상기 서열을 수득하는 방법을 공지하고 있다. 이후, 이러한 서열들은 리포터 유전자에 융합시켜 프로모터 활성을 입증할 수 있다. 예를 들면, 키메라 유전자는 GFP 암호화 서열에 융합된 RCI-1 유전자의 5' 조절 서열의 일부를 포함하도록 작제될 수 있다. 이를 위해서, pBSK+LOX4A(실시예 9 참조)를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 위한 주형으로서 사용할 수 있다. 유전자-특이적 프라이머를 디자인하여 상기 유전자의 5' 프로모터 영역을 증폭시킬 수 있다. 예를 들면, 역방향 프라이머 R1(서열 번호 12)과 정방향 프라이머 F1(서열 번호 13) 및 F2(서열 번호 14)와의 배합물을 사용하여, 개시 메티오닌 상류 약 1.2kb 및 약 2kb인 조절 서열을 분리한다. 정방향 프라이머 F1 및 역방향 프라이머 R1으로 증폭시킨 PCR 단편의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 18에 나타내며, 정방향 프라이머 F2 및 역방향 프라이머 R1으로 증폭시킨 PCR 단편의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 19에 나타낸다. 프라이머의 클로닝을 용이하게 하는 것은 예를 들면, 유전자 특이적 서열 및 GATEWAYTM클로닝 기술(제조원: Life Technologies, GIBCO BRL, Rockville, MD USA)을 위한 attB 재조합 부위로 구성된다. 역방향 프라이머로서, 프라이머 R1이 사용될 수 있으며, 이는 하기 서열을 갖는다: 5'-CAAGAAAGCTGGGT TGACAAATTAAGTTGTCAGTGTG-3'(서열 번호 12). 역방향 프라이머 R1의 유전자 특이적 서열은 밑줄이 그어져 있으며(서열 번호 2의 1356 내지 1334번 위치에 상응함), attB 재조합 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 정방향 프라이머의 예는 프라이머 F1 및 F2이다. 정방향 프라이머 F1은 하기 서열을 갖는다: 5'-CAAAAAAGCAGGCT TGTAACATCCTACTCCTATTGTG-3'(서열 번호 13). 정방향 프라이머 F1의 유전자 특이적 서열은 밑줄이 그어져 있으며(서열 번호 2의 159 내지 181번 염기에 상응함), attB 재조합 서열은 이탤릭체로 나타낸다. R1과 병용하는 F1은 약 1.2kb의 단편을 증폭시킨다. 정방향 프라이머 F2는 하기 서열을 갖는다: 5'-CAAAAAAGCAGGCT CCCCGTCTTTATCTACTC-3'(서열 번호 14). 정방향 프라이머 F2의 유전자 특이적 서열은 밑줄이 그어져 있으며(서열 번호 1의 31 내지 48번 염기에 상응함), attB 재조합 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 프라이머 R1과 병용하는 F2는 약 2kb의 단편을 증폭시킨다.
네스티드 PCR(nested PCR) 전략을 사용하여, 조절 서열은 우선 프라이머 F1+R1 또는 F2+R1으로 증폭시킨 후, 프라이머 attB1(5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'; 서열 번호 15) 및 프라이머 attB2(5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'; 서열 번호 16)를 사용하는 2차 PCR을 수행할 수 있다. 최적 어닐링 온도는 구배 써머사이클러(DNA Engine, 제조원: MJ Research, Inc. Waltham, MA, USA) 및 유전자-특이적 프라이머 F1+R1 또는 F2+R1을 사용한 하기 PCR 조건[(94℃: 10초):(94℃: 10초/45℃ 내지 70℃ 구배: 10초/72℃: 10초)X15]을 사용하여 결정할 수 있다. PCR 이후, 생성물을 겔 전기영동으로 가시화시킬 수 있으며, 가시 생성물을 제공하는 최고의 Tm을 갖는 반응으로부터의 DNA는 attB1+attB2 프라이머를 사용한 증폭을 위해서 선택할 수 있다. 후속적인 PCR 증폭에서, 하기 PCR 조건을 사용할 수 있다:[(94℃: 10초):(94℃: 10초/50℃ 내지 70℃ 구배 10초/72℃: 10초)X15]. 이후, 수득되는 PCR 생성물은 제조원의 프로토콜(참조: Instruction Manual of GATEWAYTMClong Technology, GIBCO BRL, Rockville, MD, USA, http://www.lifetech.com/)에 따라서 BP 반응을 통해 pENTR내에서 엔트리 클론(Entry Clones)을 생성시키는데 사용할 수 있는 attB 재조합 부위로 플랭킹시킨다. 수득되는 플라스미드는 RCI-1 개시 코돈의 5'쪽으로 약 1.2kb 및 약 2kb를 함유하며 pENTR+LOXp1.2, pENTR+LOXp2로서 인용된다. 이후, 조절/프로모터 서열을 지침서[GATEWAYTMCloning Technology, 제조원: GIBCO BRL, Rockville, MD, http://www.lifetech.com/]에 기술된 바와 같은 제조원의 프로토콜에 따라서 GATEWAYTM기술을 사용하여 재조합에 의해서 mGFP-5 리포터 유전자(제조원: MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, England)에 융합시킨다.간략하면, 상기 프로토콜에 따라서, 엔트리 벡터내 프로모터 단편을, GFP 리포터의 5' 쪽에 attR 부위를 갖는 mGFP-5 암호화 영역을 함유하는 이원 아그로박테리움 데스티네이션 벡터(Agrobacterium destination vector)와의 LR 반응을 통해 재조합시킨다. 삽입된 단편의 배향은 att 서열에 의해 유지되며, 최종 작제물은 서열분석으로 입증한다. 상기 작제물을 pLOXp1.2 promoter::GFP 또는 pLOXp2promoter::GFP로 명명하고 전기천공법으로 아그로박테리움 투메패시언스내로 형질전환시킬 수 있다. 임의의 다른 이원 벡터를 또한 변형시켜 본 발명의 프로모터 단편을 연결된 리포터 유전자의 발현을 구동하도록 위치하게 할 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 예를 들면, pGPTV-BLEO(ATCC 수탁번호 77392), pBI121(제조원: Clontech, Palo Alto, California) 또는 pCambia 1302(Cambia, Canberra, Australia) 같은 시판중인 이원 벡터로부터 출발하여 상기 벡터를 작제하는 방법을 공지하고 있다.
이후, 유전자이식된 식물을 예를 들면, 아그로박테리움-매개된 형질전환 기술을 사용하여 생산한다. 유전자 융합 단백질의 발현은 하기 필터 설정(여기 476/488㎚; GFP-방출 515 내지 552㎚, 엽록소-방출 673 내지 695㎚)을 사용하여 PLAPO x100 오일 침지 대물렌즈(제조원: Leica Microsystems, Heidelberg, Germany) 및 Leica-TCS 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용한 공촛점 영상화에 의해서 형질전환체내에서 모니터링할 수 있다. GFP 형광 및 엽록소 자가형광은 독립적인 2-채널-검출을 사용하여 동시에 기록한다.
pCRI promoter::GFP 작제물을 발현하는 유전자이식된 벼 식물로부터의 잎의 공촛점 영상화를 수행하여 비생물학적 및 생물학적 유도제에 대한 반응에서 프로모터 활성을 분석할 수 있다.
서열 번호 1 내지 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 기초하여, 관심 대상의 임의의 프라이머 조합을 선택하여 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다양한 길이의 DNA 단편을 PCR 증폭시킬 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 따라서, 관심 대상의 임의의 영역을 서열 번호 1 내지 3으로부터 증폭시킬 수 있다. 예를 들면, 프라이머는 인트론 1 또는 인트론 2 또는 5' 상류 영역을 구체적으로 증폭시키기 위해서 디자인할 수 있다. 5' 상류 영역은 본원에서 잠재적인 TATA 박스 및 리폭시게나제 단백질의 잠재적인 개시 코돈 사이의 영역으로서 정의된다. 당해 분야의 숙련자는 또한, 서열 번호 2의 1702 내지 2104번 nt 및/또는 서열 번호 3의 1 내지 97번 nt 및/또는 서열 번호 3의 367 내지 1283번 nt를 포함하는 DNA 분자를 수득하기 위한 것과 같이, 서열 번호 1, 2 및/또는 3의 다양한 일부분과 함께 인트론 1 및/또는 인트론 2를 혼합하는 것을 고려할 것이다.
추가로, 또한, 상기 서열 중 임의의 하나를 리폭시게나제 cDNA 서열의 3' 비해독 영역(서열 번호 5의 2817 내지 3018번 위치)과 함께 혼합하는 것이 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따라 기능하는, 즉 연결된 뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 유도 가능하지만 상처- 또는 병원체-유도된 발현은 유도하지 않을 수 있는, 벼 RCI-1 리폭시게나제 유전자로부터 유래된 단편들을 포함한다. 이는 상기 프로모터 단편을 생성시키고, 이들을 선택가능한 또는 선별가능한 마커 유전자에 융합시킨 후 원형질체를 사용한 일시적인 발현 분석법에서 또는 안정하게 형질전환된 식물에서 프로모터 활성의 유지에 대해서 융합 작제물을 분석함으로써 시험할 수 있다. 상기 분석법은 통상의 숙련자의 기술 범위내에 속한다. 본 발명의 바람직한 핵산 분자 단편은 약 500개 염기 이상, 특히 약 1000개 염기 내지 약 1500개 염기 사이, 보다 특히 약 2000개 염기 및 가장 특히 약 3000개 염기 내지 약 4500개 염기 길이이다.
하나 이상의 뉴클레오타이드의 돌연변이, 삽입, 결실 및/또는 치환이 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 서열 번호 1, 2 및 3의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 서열 정보로부터 유도된 보다 긴 또는 보다 짧은 단편내로 도입될 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련자에게 명백한 것이다. 또한, 본 발명의 변형되지 않거나 변형된 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 서열을 셔플링시켜 변화시킬 수 있다. 본 발명에 따른 변이체 뉴클레오타이드 서열의 기능을 시험하기 위해서, 관심 대상의 서열을 선택가능하거나 선별가능한 마커 유전자에 작동적으로 연결시키고 마커 유전자의 발현을 원형질체를 사용한 일시적인 발현 분석법에서 또는 안정하게 형질전환된 식물에서 시험한다. 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현을 구동할 수 있는 뉴클레오타이드 서열은 모듈 방식으로 제조될 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어져 있다. 따라서, 보다 짧은 핵산 분자 단편으로부터의 발현 수준은 가장 긴 단편으로부터의 것과는 상이할 수 있으며, 서로 각각 상이할 수 있다. 예를 들면, 감소-조절성 상류 요소의 결실은 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 반면, 증가-조절성 요소의 결실은 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 연결된 뉴클레오타이드 서열의 조절된 발현에 필요한 프로모터 요소의 확인을 위한 또 다른 방법은 소위 링커-스캐닝 분석법이다. 링커-스캐닝 돌연변이유발은 이의 돌연변이가 프로모터 활성을 변화시키는 짧은 정의된 모티프의 동정을 가능하게 한다. 따라서, GUS 리포터 유전자 또는 또 다른 마커 유전자의 암호화 서열에 융합된 일련의 링커-스캐닝 돌연변이체 프로모터는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 작제할 수 있다. 이후, 이러한 작제물을 예를 들면, 아라비돕시스에 형질전환시키고 GUS 활성을 수 개의 독립적인 유전자이식된 주들에서 분석한다. 이후, 프로모터 활성에 대한 각각의 돌연변이의 효과를 돌연변이되지 않은 벼 리폭시게나제 유전자 프로모터를 함유하는 동등한 수의 유전자이식된 주들과 비교한다. 화학적으로 유도가능하지만 상처 또는 병원체-유도가능하지는 않는 발현과 관련된 모티프가 돌연변이되는 경우, 리포터 유전자의 발현 수준은 변화된다는 것이 예견된다. 예를 들면, 대조군 작제물로부터의 것 보다 화학적 유도제에 의한 GUS 활성의 더 높은 평균 유도가 검출된다면, 네가티브 조절 요소가 상기 작제물에서 돌연변이되었을 가능성이 높다. 한편, 본 발명에 따른 화학적 조절제에 의한 GUS 활성의 유도가능성의 완전한 상실이 관찰되는 경우, 화학적 유도에 필요한 포지티브 조절 요소가 돌연변이되었을 가능성이 높다. 다음 단계에서, 특히 잠재적인 포지티브 조절 요소의 경우에, 돌연변이된 단편들에 상응하는 야생형 서열은 최소 프로모터에 융합시키고 신규하게 작제된 프로모터는 연결된 마커 유전자에 조절성 발현을 부여하는 능력에 대해서 시험된다.
본 발명은 또한 본 발명의 RCI-1 프로모터의 기능성 등가물, 즉 엄격한 조건하에서 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 17, 서열 번호 18 또는서열 번호 19 중 어느 하나에 또는 수탁 번호 DSM 13524로 기탁된 플라스미드 pBSK+LOX4A의 4.5kb PstI/PstI 단편에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 엄격한 하이브리드화는 65℃의 온도, 바람직하게는 60℃의 온도 및 가장 바람직하게는 55℃의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 2배 농도(2X)의 시트르산염 완충된 염수(SSC)에서 수행되며, 이후 동일한 온도에서 감소된 SSC 농도를 갖는 완충액을 사용하여 지지체를 세정함으로써 수행된다. 상기 감소된 농도의 완충액은 전형적으로 0.1% SDS를 함유하는 1/10 농도의 SSC(0.1 X SSC), 바람직하게는 0.1% SDS를 함유하는 0.2 X SSC, 및 가장 바람직하게는 0.1% SDS를 함유하는 1/2 농도의 SSC(0.5 X SSC)이다. 사실, 다른 유기체로부터의 RCI-1 리폭시게나제 프로모터의 전체 또는 일부분에 대한 기능성 등가물은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3 중 어느 하나 또는 수탁 번호 DSM 13524로 기탁된 플라스미드 pBSK+LOX4A의 4.5kb PstI/PstI 단편을 관심 대상의 유기체, 특히 또 다른 단자엽 식물로부터 분리된 게놈성 DNA와 하이브리드화시켜 확인할 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 다른 유기체로부터 상동성 서열을 동정하기 위한 당해 분야에 공지된 수 많은 방법들이 존재하기 때문에, 상기 서열을 확인하는 방법을 숙지하고 있다. 이후, 상기 신규하게 동정된 DNA 분자를 서열분석할 수 있고 상기 서열을 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 17, 서열 번호 18 또는 서열 번호 19 중 어느 하나, 또는 수탁 번호 DSM 13524로 기탁된 pBSK+LOX4A의 4.5kb PstI/PstI 단편의 뉴클레오타이드 서열과 비교하고, 프로모터 활성을 시험할 수 있다. 본 발명의 범위내에는, 서열 번호 1, 2 또는 3의 뉴클레오타이드 서열과 50개 이상의 뉴클레오타이드길이에 대하여 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 DNA 분자가 포함된다. 서열 동일성(%)은 동역학적 프로그래밍 알고리듬에 기초한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정한다. 본 발명의 범위내에서 바람직한 컴퓨터 프로그램은 조회가 단백질인지 DNA인지에 관계없이 이용가능한 서열 데이터베이스 모두를 조사하도록 디자인된 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 조사 프로그램을 포함한다. 상기 조사 도구의 버젼 BLAST 2.0(Gapped BLAST)는 인터넷(현재, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 상에서 공개적으로 이용가능하다. 이는 전체 배열에 대한 반대로서 국부적으로 조사하는 자가 발견식 알고리듬이며 따라서, 단지 분리된 영역만을 공유하는 서열 사이에서 상관관계를 검출할 수 있다. BLAST 조사에서 할당된 득점은 잘-정의된 통계학적 해석을 갖는다. 상기 알고리듬은 바람직하게는 디폴트 값으로 설정된 선택적인 변수들을 사용하여 운영된다.
바람직한 경우, 본 발명의 프로모터는 색소체에서, 특히 엽록체에서 관심 대상의 연결된 암호화 영역의 화학적으로 조절된 발현을 위하여, 예를 들면, 서열 번호 4에 도시된 뉴클레오타이드 서열을 사용함으로써, 본 발명에 따른 전이 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 융합시킬 수 있다.
본 발명에 따른 화학적 조절제는 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 통한 유전자의 발현을 조절하는 물질로서 정의된다. 용매화 또는 다른 착화 분자 또는 음이온의 존재 또는 부재하에서, 이온 형태 또는 중성 형태의 상기 물질은 일반적으로 시간 조절이 목적되는 화학적으로 조절가능한 유전자를 함유하는 시스템에 대해서 외인성일 것이다. 외인성 화학 조절제의 사용은, 시스템내의 조절제의 양을 조절하는 용이성과 편리함으로 인해 바람직하다. 그러나, 본 발명은 또한, 내인성 조절제, 예를 들면, 시스템내의 이의 활성 또는 수준이 시스템내의 다른 성분 또는 시스템에 작용하는 다른 성분에 의해 인공적으로 조절되는 화학제의 사용을 포함할수 있다.
본 발명에 따른 화학적 조절제는 벤조산, 살리실산, 폴리아크릴산 및 이의 치환된 유도체를 포함하며, 적합한 치환체는 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 알킬티오 및 할로겐, 특히 INA, BTH, 프로베나졸, 자스모네이트 및 메틸 자스모네이트를 포함한다.
본 발명의 화학적으로 조절가능한 DNA 서열 및 키메라 유전자를 위한 부가적인 조절제 그룹은 벤조-1,2,3-티아디아졸 구조에 기초하며, 하기 유형의 화합물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: 벤조-1,2,3-티아디아졸카복실산, 벤조-1,2,3-티아디아졸티오카복실산, 시아노벤조-1,2,3-티아디아졸, 벤조-1,2,3-티아디아졸카복실산 아미드, 벤조-1,2,3-티아디아졸카복실산 하이드라지드, 및 이의 유도체.
바람직한 조절제 그룹은 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카복실산, 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-티오카복실산, 7-시아노벤조-1,2,3-티아디아졸, 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카복실산 아미드, 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카복실산 하이드라지드, 및 이의 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
적합한 유도체는 벤조-1,2,3-티아디아졸 잔기가 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 할로알킬, 저급 할로알콕시, 저급 알킬티오, 시아노, 니트로 및 할로겐 같은 농약의 방향족 환계에서 정상적으로 사용되는 작은 치환체로 치환되거나 치환되지 않은 상기 유형의 화합물의 전형들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 유도체는 추가로, 카복실산, 티오카복실산, 카복실산 아미드 또는 카복실산 하이드라지드 기능성 그룹 중 하나가 지방족, 아르지방족 또는 방향족 잔기로 치환되거나 치환되지 않은, 상기 벤조-1,2,3-티아디아졸 화합물의 전형을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 잔기는 알킬(특히 저급 알킬), 알콕시(특히 저급 알콕시), 저급 알콕시알킬, 알콕시알콕시알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 페닐알킬(특히 벤질), 나프틸알킬, 페녹시알킬, 알케닐, 및 알키닐을 포함하지만, 이에 제한되지는 않으며, 이때, 치환체의 알킬 부분은 하이드록시, 할로겐, 시아노 또는 니트로로 치환되거나 치환되지 않으며, 치환체의 방향족 부분은 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 할로알킬, 저급 할로알콕시, 저급 알킬티오, 시아노, 니트로 및 할로겐 같은 농약의 방향족 환계에서 정상적으로 사용되는 작은 치환체로 치환되거나 치환되지 않는다.
벤조-1,2,3-티아디아졸 구조에 기초한 조절제는 조절제로서 실질적으로 작용하는 분자를 방출할 수 있는 모든 분자 시스템을 포함한다.
벤조-1,2,3-티아디아졸 구조에 기초한 바람직한 조절제 그룹은 벤조-1,2,3-티아디아졸-카복실산, 알킬 그룹이 탄소수 1 내지 6을 함유하는 알킬 벤조-1,2,3-티아디아졸카복실레이트, 및 상기 화합물들의 치환된 유도체를 포함한다. 적합한 치환체는 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 알킬티오 및 할로겐을 포함한다. 특히,벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카복실산 및 이의 알킬 에스테르, 예를 들면, 메틸 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카복실레이트는 PR 단백질 유전자로부터 분리된 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 포함하는 키메라 DNA 서열에 대한 바람직한 유도제이다. 언급된 화학적 조절제의 합성 및 살생물제로서의 이의 용도는 문헌[영국 특허 제1,176,799호 및 문헌: Kirby, P. et al., J. Chem. Soc. S 2250 (1970)]에서 확인할 수 있다.
벤조-1,2,3-디아디아졸 구조에 기초한 바람직한 종 중에는, 예를 들면, 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카복실산, 메틸 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카복실레이트, n-프로필 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카복실레이트, 벤질 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카복실레이트, 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카복실산 2급-부틸하이드라지드 등을 언급할 수 있다.
본 발명의 화학적으로 조절가능한 DNA 서열에 대한 부가적인 조절제 그룹은 피리딘 카복실산 구조, 예를 들면, 이소니코틴산 구조, 및 바람직하게는 할로이소니코틴산 구조에 기초한다. 디클로로이소니코틴산 및 이의 유도체, 예를 들면, 저급 알킬 에스테르가 바람직하다. 상기 부류의 화합물의 적합한 조절제는 예를 들면, 2,6-디클로로이소니코틴산, 및 이의 저급 알킬 에스테르, 특히 메틸 에스테르가 있다.
화학적 조절제는 순수한 형태, 용액 또는 현탁제로서, 분말 또는 더스트(dust)로서, 또는 농경학적으로 또는 생체반응기 과정에서 사용되는 다른 통상적인 제형으로 적용될 수 있다. 상기 제형은 고체 또는 액체 담체를 포함할 수있으며, 즉 조절제가 이와 혼합되어 식물, 조직, 세포 또는 조직 배양물 등에 대한 적용을 촉진시키거나, 저장, 조작 또는 수송 특성을 개선시키기 위한 물질을 포함한다. 적합한 담체의 예는 실리케이트, 점토, 탄소, 황, 수지, 알콜, 케톤, 방향족 탄화수소 등을 포함한다. 통상적인 습화가능한 분말 또는 수성 유제로서 제형화되는 경우, 조절제 제형은 하나 이상의 통상적인 이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 습화제, 유화제 또는 분산제를 포함할 수 있다.
조절제는 또한, 조절제에 의해 조절되는 임의의 키메라 유전자에 의해서 조절되는 특성과 관련되거나 관련되지 않은 특정 잇점을 식물에게 부여하는데 바람직한 또 다른 제제와 병용하여 식물에 적용시킬 수 있다. 예를 들면, 조절제는 수분 매개제와 혼합되어 수분과 관련이 없는 유전자이식된 특성의 발현 바로 직전에 적용되는 것이 바람직하다. 또한, 이는 제초제와 혼합되어 그밖의 경우에는 상기 효과가 최대치가 되는 시간에서 제초제의 효과를 완화시키기 위해서 적용될 수 있다.
액체 제형으로서, 조절제는 식물 잎, 줄기 또는 가지에, 파종 전 종자에 또는 식물을 지지하는 토양 또는 다른 성장 매질에 분무제로서 적용시킬 수 있다. 조절제는 또한, 생체반응기 시스템에서 사용할 수 있으며, 조절은 조절제 제형의 반응 매질에 대한 단일 부가에 의해서 또는 예정된 시간 동안 점진적으로 부가에 의해서 달성된다.
조절제는 목적하는 조절을 달성하기에 충분한 양과 시간 동안 적용된다. 바람직한 조절제는 이를 적용하는 양에서 식물, 식물 조직 또는 식물 세포에 식물독성이나 다른 유해한 효과를 전혀 나타내지 않거나 최소한의 식물 독성 또는 유해한효과만을 나타내는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 상기 화학적 조절제를 상기 기술한 바와 같은 화학적으로 조절가능한 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 식물 조직, 식물 또는 종자에 적용하는 것을 포함하는, 화학적으로 유도가능하지만, 상처 또는 병원체 유도가능하지는 않는 유전자의 전사를 조절하는 방법에 관한 것이다. 식물 조직, 식물 또는 종자가 바람직한 바와 같은 상기 언급된 화학적으로 조절가능한 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 방법이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 목적은 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합된 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하는 것이다. 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열은 예를 들면, 리보솜성 RNA, 안티센스 RNA 또는 단백질로 해독되지 않는 임의의 다른 유형의 RNA를 암호화할 수 있다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구체적인 양태에서, 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열은 단백질 생성물로 해독된다. 프로모터 서열과 연결된 뉴클레오타이드 서열은 형질전환시키고자 하는 식물과 동종성이거나 이종성 기원일 수 있다. 서열은 또한 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 기원에 관련없이, 연결된 뉴클레오타이드 서열은 이를 결합시킨 프로모터의 발현 특성에 따라서 형질전환된 식물에서 발현될 것이다. 프로모터 서열과 연결된 동종성 뉴클레오타이드 서열의 경우, 본 발명에 따른 프로모터는 상기 동종성 서열의 전위적 발현에 유용하다. 전위적 발현은 프로모터 서열과 연결된 뉴클레오타이드 서열이 상기 서열이 이의 자체 프로모터의 조절하에서는 발현될 수 없는 조직 및 기관에서 상이한 시점에 발현되는 것을 의미한다. 본 발명의 한 가지 특정 구체적인 양태에서, 프로모터 서열과 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현은 그 자체 발현 및 소위 공억제로 불리는 과정에 의해서 유전자의 본래의 복사체의 발현을 억제한다.
본 발명의 바람직한 구체적인 양태에서, 연결된 뉴클레오타이드 서열은 화학적으로 유도가능하지만, 상처- 또는 병원체 유도가능하지는 않는 방식으로 바람직하게 발현되는 단백질을 암호화할 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 이를 형질전환시킨 식물에 목적하는 표현형 형질을 부여하는 단백질을 암호화한다. 예로는 항생제 내성, 바이러스 내성, 곤충 내성, 질환 내성, 또는 다른 해충에 대한 내성, 제초제 내성, 개선된 영양가, 산업적 공정에서 개선된 성능 또는 변화된 생식 능력을 부여하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 있다. 연결된 뉴클레오타이드 서열은 또한 식물에서 시판중인 유용한 효소 또는 대사산물의 생산을 위해 식물에 전달된 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, 선택가능한 또는 선별가능한 마커 유전자, 즉 선택가능한 또는 선별가능한 특성을 암호화하는 암호화 영역에 작동적으로 결합된 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자를 포함한다.
선택가능한 또는 선별가능한 마커 유전자의 예는 하기 기술된다. 특정 표적 종에 있어서, 상이한 항생제 또는 제초제 선택 마커가 바람직할 수 있다. 형질전환에서 일상적으로 사용되는 선택 마커는 카나마이신, 파로모마이신, 게네티신 및 관련 항생제에 대한 내성을 부여하는 nptII 유전자[Vieira and Messing, 1982, Gene 19: 259-268; Bevan et al., 1983, Nature 304: 184-187], 아미노글리코사이드 3'-아데닐릴트랜스퍼라제를 암호화하고 스트렙토마이신 또는 스펙티노마이신에 대한 내성을 부여하는 세균 aadA 유전자[Goldschmidt-Clermont, 1991, Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089], 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hph 유전자[Blochlinger and Diggelmann, 1984, Mol. Cell. Biol. 4: 2929-2931], 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr 유전자[Bourouis and Jarry, 1983, EMBO J. 2: 1099-1104]를 포함한다. 사용되는 다른 마커는 제초제 포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제[White et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18: 1062; Spencer et al. 1990, Theor. Appl. Genet. 79: 625-631], 글리포세이트 내성을 암호화하는 돌연변이체 EPSP 신타제 유전자[Hinchee et al., 1988, Bio/Technology 6: 915-922], 이미다졸리온 또는 설포닐우레아 내성을 부여하는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제(ALS) 유전자[Lee et al., 1988, EMBO J. 7: 1241-1248], 아트라진에 대한 내성을 부여하는 돌연변이체 psbA 유전자[Smeda et al., 1993, Plant Physiol. 103: 911-917], 또는 문헌[EP 제0 769 058호]에 기술된 바와 같은 돌연변이체 프로토포르피리노겐 옥시다제 유전자를 포함한다. 문헌[특허 출원 WO 제93/05163호]에 기술된 바와 같은 포스포만노오스 이소머라제 유전자 같은 포지티브 선택을 초래하는 선택 마커가 또한 사용된다.
형질전환된 세포의 확인은 또한 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), β-글루코로니다제(GUS), 루시퍼라제(LUC) 및 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 형질전환된 세포에 표현형적으로 식별할 수 있는 특성을 부여하는 임의의 다른 단백질을 암호화하는 유전자 같은 선별가능한 마커 유전자의 발현을 통해서 달성할 수 있다. 본발명의 추가의 목적은 관심 대상의 연결된 뉴클레오타이드 서열에 융합된 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다. 상기 벡터에서, 외래 핵산 분자는 다중링커 영역에 삽입되어, 상기 외인성 서열은 예를 들면, 세균 또는 식물 기원일 수 있는 적합화된 숙주내에서 발현될 수 있다. 예를 들면, 아그로박테리움 투메패시언스 이원 벡터 pBIN19로부터 유도된 플라스미드 pBl101은 베타-글루쿠로니다제(GUS) 발현 시그날을 사용하여 프로모터의 클로닝 및 시험을 가능하게 한다[Jefferson et al, 1987, EMBO J. 6: 3901-3907]. 상기 벡터의 크기는 12.2kb이다. 이는 낮은 복사수의 RK2의 복제 오리진을 가지며 세균 및 식물 모두에서 카나마이신 내성을 부여한다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 수 많은 다른 발현 벡터들이 당해 분야의 숙련자에게 공지되어져 있다.
본 발명의 추가의 목적은 본 발명의 재조합 DNA 서열을 포함하는 유전자이식된 식물을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 기술된 형질전환 방법 중 임의의 하나에 의해 수득된 개선된 특성들을 갖는 식물 세포, 상기 세포로부터 유도된 식물, 식물질, 상기 식물로부터 유도된 자손 식물 및 종자, 및 농경학적 생성물에 관한 것이다. 본 발명에 따라 형질전환된 식물은 단자엽 또는 쌍자엽 식물일 수 있으며, 벼, 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 고구마, 사탕옥수수, 잠두, 완두, 치커리, 상추, 양배추, 꽃양배추, 브로콜리, 순무, 무, 시금치, 아스파라거스, 양파, 마늘, 후추, 셀러리, 호박(squash), 펌프킨 호박(pumpkin), 삼, 주키니 호박(zucchini), 사과, 배, 마르멜로, 멜론, 서양자두, 체리, 복숭아, 승도복숭아, 살구, 딸기, 포도, 나무딸기, 검은딸기, 파인애플, 아보카도, 파파야, 망고, 바나나, 대두, 토마토, 수수, 사탕수수, 사탕무, 해바라기, 평지, 클로버, 담배, 당근, 면화, 알팔파, 감자, 가지, 오이, 아라비돕시스 탈리아나, 및 침엽수 및 활엽수 같은 나무 식물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 형질전환되는 바람직한 식물은 벼, 옥수수, 밀, 보리, 양배추, 꽃양배추, 후추, 호박(squash), 멜론, 대두, 토마토, 사탕무, 해바라기 또는 면화, 특히 벼, 옥수수, 밀, 수수(Sorghum bicolor), 오리새, 사탕무 및 대두이다. 본 발명의 재조합 DNA 서열은 수 많은 공지된 방법으로 식물 세포내로 도입시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련자는, 상기 방법의 선택은 형질 전환을 위한 표적 식물의 유형, 즉 단자엽 또는 쌍자엽 식물에 따라서 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 식물 세포를 형질전환시키는 적합한 방법은 미세주입법[Crossway et al., 1986, Bio Techniques 4: 320-334], 전기천공법[Riggs and Bates, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83: 5602-6506], 아그로박테리움-매개된 형질전환법[Hichee et al., 1988, Bio/Technology 6: 915-922; EP 제0 853 675호], 직접적인 유전자 전달법[Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2717-2722], 및 제조원(Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin and Dupont, Inc., Wilmington, Delaware)[참조: 예를 들면, 미국 특허 제4,945,050호 및 문헌: McCabe et al., 1988, Bio/Technology 6: 923-926]으로부터 이용가능한 장치를 사용한 탄도 입자 가속법을 포함한다. 형질전환시키고자 하는 세포는 분화된 잎 세포, 배형성 세포, 또는 임의의 다른 유형의 세포일 수 있다. 원형질체의 직접적인 형질전환에서, 원형질체내로의 외인성 유전물질의 흡수는 화학제 또는 전기장을 사용하여 증강시킬 수 있다. 이후, 외인성 물질은 핵 게놈내로 통합될 수 있다. 이전의 작업은 쌍자엽 담배 식물에서 수행되며, 이는 외래 DNA를 도입하여 자손 식물로 유전시킨다[Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2712-2722; Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet 199: 169-177]. 단자엽 원형질체, 예를 들면, 트리티쿰 모노코컴(Triticum monococcum), 롤륨 멀티플로럼(Lolium multiflorum, 이탈리아 독보리), 옥수수 및 검은 맥시코 사탕옥수수의 원형질체를 상기 과정으로 형질전환시킨다. 부가적인 바람직한 구체적인 양태는 문헌[EP 제0 292 435호 및 EP 제0 846 771호]에 기술된 바와 같은 옥수수에 대한 원형질체 형질전환 방법이다. 옥수수 형질전환에 대해서는, 또한 문헌[Koziel et al., 1993, Bio/Technology 11: 194-200]을 참조한다. 벼의 형질전환은 원형질체를 사용하는 직접적인 유전자 전달 기술 또는 입자 폭격으로 수행할 수 있다. 원형질체-매개된 형질전환은 자포니카-형 및 인디카-형에 대해서 기술되어져 있다[Zhang et al., 1988, Plant Cell Rep., 7: 379-384; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274-276; Datta et al. 1990, Bio/Technology 8: 736-740]. 상기 기술된 두 유형 모두는 또한 입자 폭격을 사용하여 일상적으로 형질전환시킬 수 있다[Christou et al., 1991, Bio/Technology 9: 957-962]. 문헌[특허 출원 EP 제0 332 581호]는 푸이데애(Pooideae) 원형질체의 생성, 형질전환 및 재생에 대한 기술을 기술하고 있다. 이러한 기술들은 닥틸리스(Dactylis) 및 밀을 포함하는 모든 푸이데애 식물의 형질전환을 가능하게 한다. 추가로, 밀 형질전환은 문헌[특허 출원 EP 제0 674 715호 및 문헌: Weeks et al., 1993, Plant Physiol. 102: 1077-1084]에 기술되어져 있다. 이렇게 작제된 식물 발현 벡터는 예를 들면, 통상적인 식물 형질전환 방법에 따라 벼의 캘러스내로 도입시키고, 뿌리 및 잎의 분화를 이로부터 유도시킨 후, 배양을 위해서 화분으로 옮김으로써, 형질전환된 벼를 수득할 수 있다.
본 발명의 DNA 서열 또는 벡터를 사용한 형질전환으로 생성된 식물은 식물 전체 및 대부분의 조직 및 기관에서 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열을 발현할 것이다.
상기 기술된 유전자이식된 식물내로 유전공학적으로 도입된 유전자 특성은 유성 생식 또는 무성 생식으로 자손에게 전달되며, 따라서 자손 식물에서 유지되고 증식될 수 있다. 일반적으로, 상기 유지 및 증식은 경작, 파종 및 수확 같은 특정 목적에 부합하도록 개발된 공지된 농경학적 방법을 사용한다. 수경법 및 온실 기술 같은 전문화된 방법을 또한 적용할 수 있다. 본 발명에 따른 유전자이식된 식물의 유익한 유전자 특성의 사용은 추가로, 해충, 제초제 또는 스트레스에 대한 내성 같은 개선된 특성, 개선된 영양가, 증가된 수율, 또는 비바람에 의해 쓰러짐과 흩뿌려짐으로부터의 보다 적은 손실을 초래하는 개선된 구조를 갖는 식물의 개발을 목적으로 하는 식물 육종에서 수행될 수 있다. 다양한 육종 단계들은 교배시키고자 하는 주의 선택, 모주의 직접적인 수분 또는 적합한 자손 식물의 선택 같은 잘-정의된 사람 중재에 의해서 특성화된다. 목적하는 특성에 따라서, 상이한 육종 방법을 사용한다. 관련된 기술들은 당해 분야에 잘 공지되어져 있으며 하이브리드화, 동계 교배, 역교배 육종, 다중주 육종, 다양한 혼합, 종간 하이브리드화, 이수체 기술 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 하이브리드화 기술은 또한 기계적, 화학적 또는 생화학적 방법에 의해 식물을 불임화시켜 웅성 또는 자성 불임식물을 생산하는 것을 포함한다. 웅성 불임 식물의 상이한 주의 화분을 사용한 타화 수분은 웅성 불임이지만 자성 수정능력이 있는 식물의 게놈이 균질하게 양쪽 모계 주의 특성들을 수득할 것이라는 것을 보증한다. 따라서, 본 발명에 따른 유전자이식된 식물은 예를 들면, 제초제 또는 살충제 처리 같은 통상적인 방법의 효과를 증가시키거나 이의 변형된 유전자 특성으로 인해 상기 방법을 불필요하게 만드는 개선된 식물주의 육종에 사용될 수 있다. 대안으로, 이의 최적화된 유전자 "장착(equipment)"으로 인해, 비교할만한 발생적 악조건에 대하여 내성이 없는 생성물에 비해 보다 우수한 품질의 수확된 생성물을 생산할 수 있는 개선된 스트레스 내성을 갖는 신규한 농작물이 수득될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적하는 유기체내에서 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는데 사용할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 것이다. 상기 분자는 통상적으로 "프로모터"로 언급된다. 상기 유기체는 세균, 식물 또는 임의의 다른 관심 대상의 유기체일 수 있다.
추가로, 서열 번호 1 내지 3의 내용물은 당해 분야의 숙련자가 서열 번호 1, 2 또는 3에서 15개 염기쌍의 임의의 연속하는 서열 및 바람직하게는 20 내지 30개 염기 이상의 연속하는 서열에 의해 특성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 주형으로부터 DNA 단편을 증폭시키기 위한 시도로서 폴리머라제 연쇄 반응을 위한 올리고뉴클레오타이드를 디자인하는 것을 가능하게 할 수 있다. 상기 뉴클레오타이드는 서열 번호 1, 2 또는 3의 15개 염기쌍 및 바람직하게는 20 내지 30개 이상의 염기쌍을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 폴리머라제 연쇄 반응은 상기 올리고뉴클레오타이드 하나 이상을 사용하여 수행되며 이의 증폭 생성물은 본 발명의 또 다른 구체적인 양태를 구성한다.
서열 목록의 서열에 대한 간략한 기술
서열 번호 1은 벼 RCI-1 유전자의 5' 상류 서열의 일부이다.
서열 번호 2는 잠재적인 TATA 박스 및 잠재적인 개시 코돈을 포함하는 벼 RCI-1 유전자의 일부이다.
서열 번호 3은 인트론 1의 일부분, 엑손 2, 인트론 2 및 엑손 3의 일부분을 포함하는 벼 RCI-1 유전자의 일부이다.
서열 번호 4는 벼 리폭시게나제 RCI-1 전이 펩타이드의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열 번호 5는 벼 리폭시게나제 RCI-1 cDNA의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열 번호 6은 벼 리폭시게나제 RCI-1 전이 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 번호 7은 벼 리폭시게나제 RCI-1 cDNA의 추정 아미노산 서열이다.
서열 번호 8은 축퇴성 프라이머이다.
서열 번호 9는 결합된 올리고 dT 역방향 프라이머이다.
서열 번호 10은 정방향 프라이머이다.
서열 번호 11은 역방향 프라이머이다.
서열 번호 12는 역방향 프라이머 R1이다.
서열 번호 13은 정방향 프라이머 F1이다.
서열 번호 14는 정방향 프라이머 F2이다.
서열 번호 15는 프라이머 attB1이다.
서열 번호 16은 프라이머 attB2이다.
서열 번호 17은 플라스미드 pBSK+LOX4A로부터의 약 4.5kb PstI/PstI 단편의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열 번호 18은 정방향 프라이머 F1 및 역방향 프라이머 R1을 사용한 PCR에 의해 수득된 벼 RCI-1 유전자의 5' 상류 서열의 일부이다.
서열 번호 19는 정방향 프라이머 F2 및 역방향 프라이머 R1을 사용한 PCR에 의해 수득된 벼 RCI-1 유전자의 5' 상류 서열의 일부이다.
서열 번호 20은 GIG 리포터 유전자를 갖는 GatewayTM변형된 pNOV2347 이원 GatewayTM데스티네이션 벡터이다.
서열 번호 21은 GIG, GUS 인트론 GUS, 인트론을 갖는 GUS 암호화 서열이다.
서열 번호 22는 pNOV6800 이원 벡터이다.
기탁
기탁된 물질 수탁 번호 기탁 일자
pBSK+LOX4A DSM 13524 2000. 06. 06.
pNOV6800 NRRL B-30480 2001. 05. 25.
pBSK+LOX4A는 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124, Braunschweig, Deutschland)에기탁되었다. pNOV6800은 NRRL(the Agricultural Research Service Culture Collection, of the National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, United States of Department of Agriculture, 1815 North Unuversity Street, Peoria, Illinois 61640 USA)에 기탁되었다.
하기는 본 발명의 예시적인 실시예이다. 본 발명은 본 발명의 개별적인 양태의 단일 예시로 의도된 하기된 특정 구체적인 양태로서 이의 범위가 제한되지는 않으며, 기능적으로 등가물인 모든 작제물, 프로모터, 전이 펩타이드 또는 효소들도 본 발명의 범위내에 포함된다.
본원에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술들은 당해 분야에 공지되어져 있으며 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; and Ausubel et al., 1994, "Current protocols in molecular biology", John Wiley and Sons, New York]에 기술된다.
실시예 1: 식물질 및 처리
벼 식물(Oryza sativa cv. Kusabue)을 16시간 명/8시간 암 주기로 25℃에서 80% 습도하에서, 철 비료 용액(Gesal Pflanzen Tonic, 제조원: Novartis, Basel,Switzerland)이 스며든 점토를 담은 화분에서 성장시킨다.
엠. 그리세아(M. grisea, 품종 007 및 031; 공급원: the Institute of Biochemistry, Faculty of Agriculture, Tamagawa University, Machida-shi, Tokyo 194, Japan)를 오트밀 전분 아가(오트-플레이트 30g/ℓ, 아가-아가 20g/ℓ, 전분 10g/ℓ 및 효모 추출물 2g/ℓ) 상에서 배양한다. 27℃에서 2주 동안 배양한 후, 기생 균사체(aerial mycelia)를 멸균 압설자로 제거하고 암광(310 내지 360㎚)하에 추가로 배양하여 동시적인 포자화를 유도한다. 접종을 위해서, 분생자 농도를 분무 용액내에서 1 x 106/㎖(젤라틴 1g/ℓ, 0.1% 트윈-20)로 조정한다
식물을 파종 12 내지 14일 후에 분생자 현탁액을 잎에 분무시켜 접종시켰다. 습한 암실(26℃, 약 100% 상대 습도)에서 접종 24시간 후, 식물을 동일한 온도 및 상기 기술된 바와 같은 광 조건하에서 습한 대기 중에서 유지시킨다.
화학적 유도제를 사용한 식물 처리는 잎 3개의 출현시인 파종 후 10일째에 수행한다. 모든 화학제 농도는 ppm(활성 성분 ㎎/도포된 용액 ℓ)으로 제시된다. 프로베나졸을 상기 기술된 바와 같은 토양 침습물에 의해서 순수한 물질 250ppm 용액으로써 도포시킨다[Thieron et al. (1995) Systemic acquired resistance in rice: Studies on the mode of action of diverse substances inducing resistance in rice to Pyricularia oryzae. Mededelingen Faculteit Landbouwkundige en Toegepaste Biologische Wetenschappen Universiteit Gent. 60, 421-430]. BTH(활성 화합물 및 습화가능한 분말의 1:1(w/w) 혼합물) 및 INA(활성 화합물 및 습화가능한 과립의 1:3(w/w) 혼합물)의 제형을 분무시켜 잎에 도포시킨다. 모든 대조군은 활성 화합물 비함유 분무-용액을 도포시켜 수행한다. 자스몬산을 상기 기술된바와 같이 에탄올 중 1mM 용액으로서 도포시킨다[Schweizer et al. (1997) Plant Physiol. 114, 79-88]. 전신계 조직에서 상처화 및 유전자 발현의 측정은 문헌[Schweizer et al. (1988) Plant J. 14, 475-481]에 따라 수행한다.
실시예 2: cDNA 라이브러리 작제
전체 RNA를 100ppm INA로 처리한 벼 잎으로부터 추출하고 24 및 48시간 후에 수거한다. 폴리A+-RNA를 실시예 2에서 기술된 바와 같이 제조하고 상기 양 시점으로부터 등량을 모은다. cDNA 라이브러리는 제조원의 지침에 따라서 람다 Zap Express cDNA 합성 키트(제조원: Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 작제한다.
실시예 3: 벼 리폭시게나제 cDNA RCI-1의 클로닝
A. PCR에 의한 벼 리폭시게나제 cDNA 단편의 클로닝
PCR-기초 전략을 사용하여 INA-처리된 벼 잎으로부터 리폭시게나제 cDNA 단편을 생성시킨다. 벼로부터 두 개의 리폭시게나제 서열[Peng et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 3755-3761; Ohta et al. (1992) Eur. J. Biochem. 206, 331-336] 및 밀로부터의 한 개의 서열[Gorlach et al. (1996) Plant Cell. 8, 629-643]을 배열시킴으로써, 수 개의 보존된 영역을 확인하며, 이중 하나는 C-말단에 인접하며모든 세 개의 서열에서 불변성인 아미노산 서열 HAAVNFG를 함유한다.
전체 RNA를 비처리된 대조군 잎, 및 100ppm INA로 분무시킨 24 및 48시간 후의 잎으로부터 문헌[Dudler & Hertig (1992) J. Biol. Chem. 267, 5882-5888]에 기술된 바와 같이 추출한다. 폴리A+-RNA는 전체 RNA로부터 퀵 mRNA 분리 키트(제조원: Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 제조한다. 두 시점으로부터의 폴리A+-mRNA 샘플을 모으고 폴리A+RNA의 1㎍ 분획물을 정방향 프라이머로서 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 5'-CAYGCNGTNAANTTYGG-3'(서열 번호 8; 이는 벼 RLL2 리폭시게나제의 C-말단 영역에서 HAAVNFG 아미노산 서열에 상응한다)[Peng et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 3755-3761] 및 결합된 올리고-dT 역방향 프라이머(5'-AATGCTTTTTTTTTTTTTTTV-3'; 서열 번호 9)를 사용한 RT-PCR을 위한 주형으로서 사용한다.
역전사는 하기와 같은 수행한다:
1㎕ RNA(1㎍/㎖), 8㎕ 5x RT-완충액, 4㎕ 결합된 올리고-dT 역방향 프라이머(100pmol/㎕), 4㎕ dNTP(각각, 10mM) 및 18㎕ H2ODEPC를 혼합하고 94℃에서 15분 동안 항온처리한다. 이를 42℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 42℃로 옮긴 5분 후, 3㎕ AMV-RT(제조원: Boehringer) 및 2㎕ RNAse 억제제(제조원: Boehringer)를 부가한다. 역전사는 75℃에서 5분 동안 항온처리함으로써 종결시킨다. 역전사된 RNA를 사용한 PCR은 하기와 같이 수행한다:
3㎕ cDNA(상기 참조), 10㎕ 10x PCR-완충액, 1㎕ 결합된 올리고-dT 역방향 프라이머(100pmol/㎕), 1㎕ 축퇴성 프라이머(100pmol/), 2㎕ dNTP(각각, 10mM), 0.5㎕ Taq DNA 폴리머라제(제조원: Boehringer) 및 82.5㎕ H2O를 혼합하고 하기 프로그램에 적용시킨다:
1 사이클: 94℃/15분, 39℃/2분, 72℃/3분
35 사이클: 94℃/30초, 39℃/30초, 72℃/1분
1 사이클: 94℃/1분, 39℃/2분, 72℃/10분.
이후, 0.5㎕의 신선한 Taq DNA 폴리머라제를 부가하고, 20회의 추가 사이클을 상기 제시된 조건하에서 수행한다.
처리된 잎 및 비처리된 잎으로부터 유도된 PCR 생성물을 에티듐브로마이드-염색된 아가로오스 겔 상에서 가시화시킨다. 대략 600bp의 PCR 생성물이 INA-처리된 샘플에서만 나타나며 대조군에서는 나타나지 않는다. INA-처리된 프로브를 갖는 레인에서만 나타나는 약 600bp 밴드에 상응하는 겔 조각을 절단해 낸다. DNA를 후속적으로 겔로부터 추출하고 pGEMTeasy벡터(제조원: Promega, Madison, USA)내로 클로닝시키고, 수득되는 플라스미드는 pKL-5로 명명한다.
B. 전체 길이 벼 리폭시게나제 cDNA 클론을 수득하기 위한 cDNA 라이브러리 스크리닝
pKL-5의32P-표지된 삽입물을 프로브로 사용하여 INA-처리된 벼 잎으로부터작제된 람다 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다(실시예 2 참조). 포지티브 클론을 정제한다. 최대 삽입물을 갖는 것을 RCI-1(벼 화학적으로 유도된 cNDA 1;ricechemicallyinduced cDNA 1)로 명명하고 제조원의 지침에 따라서 생체내 절개에 의해서 pBK-CMV(제조원: Stratagene) 파아지미드 벡터내로 서브클로닝하였다. 수득되는 플라스미드를 pRCI-1로 명명한다. RCI-1 삽입물을 CY5-표지된 프라이머 및 ALF DNA-서열분석기(제조원: Pharmacia, Upsala, Sweden)를 사용하여 프라이머 워킹(primer walking)에 의해서 양쪽 쇄 상에서 서열분석한다.
RCI-1 cDNA 삽입물(서열 번호 5)은 3018bp로 이루어지며 105kDa의 예견된 분자량을 갖는 922개 아미노산 잔기(서열 번호 7)의 단백질을 암호화하는 2766bp의 개방 판독 프레임(서열 번호 5의 48 내지 2816번 염기)을 함유한다. 추정된 해독 개시 부위는 개방 판독 프레임내 최초 메티오닌 코돈이다. 서열 비교 결과, RCI-1 단백질은 보리 LOX2:Hv:1[Voros et al. (1998) Eur. J. Biochem. 251, 36-44]과 아미노산 수준에서 60% 동일성 및 68% 유사성을 나타내며 가장 유사하였다. 두 개의 이미 공지된 벼 리폭시게나제 형태에 대한 아미노산 수준에서의 서열 유사성(동일성)은 각각, L-2[Ohta et al. (1992) Eur. J. Biochem. 206, 331-336]에 대해서는 52%(43%) 및 RLL2[Peng et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 3755-3761]에 대해서는 58%(50%)이었다.
RCI-1 벼 리폭시게나제는 색소체, 특히 엽록체로 상기 부류의 단백질을 지시하는 것으로 생각되는 N-말단 신장부(서열 번호 6; 서열 번호 7의 아미노산 1 내지 36번에 상응함)를 갖는다. 이러한 잠재적인 엽록체 표적화 서열은 상기 부류의 리폭시게나제(LOX) 종들을 보리로부터의 LoxA, LoxB 및 LoxC[van Mechelen et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39, 1283-1298] 및 벼로부터의 LOX L-2[Ohta et al. (1992) Eur. J. Biochem. 206, 331-336]를 포함하는 낟알 및 파종물에서 우세하게 발견되는 또 다른 부류로부터 명백히 구분되게 한다.
실시예 4: 서던 블롯 분석
게놈성 DNA를 CTAB 과정[Ausubel et al. (1987) Current protocols in molecular biology, Wiley and Sons, New York]을 사용하여 벼 잎으로부터 추출한다. 표준 과정에 따라서, 제한 효소로 절단하고, 아가로오스 겔 상에서 전기영동으로 분리하고, GeneScreen 막(제조원: Dupont NEN, Brussels, Belgium)으로 전이시킨다. 필터를 68℃에서 밤새 1M NaCl, 1% SDS, 10% 덱스트란 설페이트, 및 100㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA 중에서 RCI-1 cDNA의 처음 1280bp를 포함하는 pRCI-1의 EcoRI/HindIII 단편으로 이루어진32P-표지된 프로브에 하이브리드화시킨다. 필터를 65℃에서 0.2 x SSC(1x SSC는 150mM NaCl, 15mM 시트르산나트륨이다), 0.1% SDS에서 세척한다.
프로브의 서열내부를 절단하지는 않는 다수의 효소를 사용하여 절단시킨 DNA를 분석하는 경우, 프로브에 하이브리드화하는 1 내지 3개의 밴드가 검출된다. 이는, RCI-1 이외에, 상기 프로브와 약하게 교차-하이브리드화하는 하나 이상의 벼 유전자가 존재한다는 것을 제시한다.
실시예 5: RCI-1 발현 연구
다량의 RCI-1 전사체 상에서 다양한 자극에 대한 효과는 RNA 겔 블롯 분석을 사용하여 조사한다. 이를 위해서, 전체 RNA를 문헌[Dudler. & Hertig. (1992) J. Biol. Chem. 267, 5882-5888]에 기술된 바와 같이 처리된 및 비처리된 잎으로부터 추출한다. 겔 블롯 분석을 위해서, 전체 RNA 10㎍을 슬롯 당 적하하고 포름알데하이드 아가로오스 겔 상에서 분리한 후, GeneScreen 막으로 옮기고, UV 교차결합기(제조원: Amersham, UK)를 사용하여 교차 결합시킨다. 레인에 대한 적하는 옮기기 전에 겔의 에티듐 브로마이드 염색에 의해 조사한다. 필터를 68℃에서 밤새 1M NaCl, 1% SDS, 10% 덱스트란 설페이트, 및 100㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA 중에서 RCI-1 cDNA의 처음 1280bp를 포함하는 pRCI-1의 EcoRI/HindIII 단편으로 이루어진32P-표지된 프로브에 하이브리드화시킨다. 필터를 65℃에서 0.2 x SSC(1x SSC는 150mM NaCl, 15mM 시트르산나트륨이다), 0.1% SDS에서 세척한다. 벼 리보솜 단백질 L3(RP-L3, 승인 번호 D 12630)의 일부분을 암호화하는 528bp cDNA 단편을 구성성 발현된 전사체에 대한 프로브로서 사용한다. 상기 단편을 행운으로 증폭시킨 후, 부분적인 리폭시게나제 콜론 pKL-5와 함께 클로닝시킨다. INA로 처리한 벼 잎을 사용한 시간 경과 시험은 RNA 겔 블롯 분석으로 분석한다. 하이브리드화 시그날은 대략 3200bp 길이의 RNA에 상응하는 독특한 밴드 및 약 1200 내지 1700bp의 흐릿한 시그날로서 나타난다. 동일한 막을 스트립핑한 후 구성적으로 발현된 유전자(RP-L3)을 사용하여 동일한 막을 재프로빙함으로써, 고품질의 RNA 제제를 확인한다. 따라서, 흐릿한 시그날은 아마도 높은 전환율로 인해, RCI-1 전사체가 특히 불안정하다는 것을 나타낸다. 상기 시간 경과 시험으로, RCI-1 전사체가 처리 8시간 후 축적되기 시작하여 24 내지 48시간 후에 최대 수준에 도달한다는 것이 확인된다. 유사하게, INA의 기능성 유사체인 내성 활성인자 BTH를 사용한 처리가 또한 RCI-1 전사체 축적을 유도하며, 상이한 부류의 내성-유도 화학제인 프로베나졸(상표명 오리제메이트)도 또한 그러하다[Kessmann et al. (1994) Ann. Rev. Phytopathol. 32, 439-459]. 프로베나졸 처리에 대한 반응으로 RCI-1 mRNA 축적의 지연된 시간 경과는 시그날링에서의 차이라기 보다는, 적용의 상이한 방식을 반영할 수 있으며, 즉, INA 및 BTH의 경우에는 잎에 분무되는 반면 프로베나졸은 토양 침습화에 의한다. 따라서, RCI-1 전사체는 다수의 상이한 화학적 내성 유도제의 적용시 축적된다. 반대로, RCI-1 mRNA 수준은 벼 도열병에 대한 내성의 생물학적 유도제인 비-숙주 병원체인 피. 시링게 피브이. 시링게(P. syringae pv. syringae)를 사용한 접종[Smith & Metraux (1991) Physiol. Mol. Plant Pathol. 39, 451-461] 또는 벼 도열병의 원인균인 엠. 그리세아(M. grisea)의 감염 이후에 증가하지 않는다.
추가로, RCI-1 전사체 수준은 벼 잎에 대한 1mM 자스몬산(JA)의 분무 7 내지 12시간 후 급격히 증가한다. 흥미롭게도, 벼에서 JA의 내인성 수준을 증가시키고 도열병 감염에 대한 증가된 전신계 보호를 유도하는 것으로 공지된 상처[Schweizer at al. (1998) Plant J. 14, 475-481; Schweizer et al. (1997) Plant Physiol. 114, 79-88]는 국부적 뿐만 아니라 전신계적으로 RCI-1 전사를 활성화시키지 않는다. 화학적 유도제를 사용한 처리 후 RCI-1 전사체의 관찰된 축적이 벼 잎에서 리폭시게나제(LOX) 효소 활성에서의 증가와 상관관계가 있는지를 조사하기 위해서, LOX 활성을 나타낸(상기 참조) RNA 겔 블롯 분석에서 또한 사용된 BTH-처리된 벼 잎에서 측정한다. RNA 겔 블롯 분석 결과와 일치하여, 효소 활성에서의 현저한 증가가 BTH 처리 24 내지 48시간 후 관찰된다. 또한, RCI-1 전사체 축적을 촉발시키기에 충분한 BTH 투여량은 또한, LOX 효소 활성의 증가를 야기한다. 상기 두 결과 모두는 효소 활성에서의 증가는 주로 RCI-1 (및 상동성) 유전자(들)의 활성화에 기인한다는 가정과 일치한다. 이러한 가설을 추가로 분석하기 위해서, BTH-처리된 벼 식물로부터 유도된 RNA를 병원체-유도된 유전자[RLL2; Peng et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 3755-3761] 및 파종물에서 발현되는 유전자[L-2; Ohta et al. (1992) Eur. J. Biochem. 206, 331-336]에 상응하는 다른 벼 LOX cDNA들로 프로빙시킨다. RCI-1 mRNA와 반대로, RLL2 및 L-2 전사체는 INA, BTH 및 프로베나졸을 사용한 처리 후 축적되지 않는다.
실시예 6: 이. 콜라이에서의 RCI-1의 발현
RCI-1 암호화 영역을 이. 콜라이 발현 벡터의 IPTG-유도가능한 프로모터의 조절하에 위치시킨다. 보다 구체적으로, RCI-1 cDNA를, 유일한 PstI 부위를 PstI 절단으로 제거하고 점착성 말단을 T4 DNA 폴리머라제로 평활말단화시켜 재결합시킨 SphI 발현 벡터[Stuber et al. (1990) System for high-level prodcution in Escherichia coli and rapid purification of recombinant proteins: Applicationsto epitope mapping, preparation of antibodies, and structure-function analysis. In Immunological Methods, (Levkovits, I. & Pernis, B., eds) pp. 121-152. Academic Press, New York]인 pDS56/RBSII에 클로닝시킨다. 상기 신규 벡터를 pDS56/RBSII, SphI(-PstI)으로 명명한다. SphI 부위를 정방향 프라이머 5'-GTCAGC ATGC TCACGGCCAC-3'(서열 번호 10; SphI 부위는 밑줄 그어져 있고; 해독 개시 코돈은 이탤릭체로 나타낸다) 및 역방향 프라이머 5'-CATTGACGACCTCCGACAAG-3'(서열 번호 11; 이는 내부 XhoI 부위의 하류(서열 번호 5의 149번 뉴클레오타이드 위치)에 어닐링한다)를 사용하여 146bp RCI-1 단편의 PCR 증폭에 의해 RCI-1 cDNA의 해독 개시 부위에 도입시킨다. 증폭된 단편을 SphI 및 XhoI으로 절단하고 단일 반응에서 RCI-1 cDNA(서열 번호 5의 149 내지 2468번 뉴클레오타이드 위치)의 중간 부분을 함유하는 2.3kb XhoI/BamHI 단편과 함께 SphI 및 BamHI으로 절단시킨 pSD56/RBSII, SphI(-PstI)내로 함께 결합시킨다. 수득되는 벡터(pExpr1)을 제한 분석으로 검사한다. 이후, pExpr1을 PstI(서열 번호 5의 891번 염기에 상응하는, 상기 cDNA 삽입물의 상부 쇄 중 891번 위치에서) 및 SalI(삽입물의 하류의 pDS56/RBSII, SphI(-PstI)의 다중 클로닝 부위에서)으로 절단시키고, 수득되는 cDNA 단편을 pRCI-1(상기 cDNA 삽입물의 하류의 다중 클로닝 부위내 XhoI 절단물)의 상응하는 PstI/PstI 단편과 교체한다. IPTG-유도가능한 프로모터의 조절하에서 완전한 RCI-1 암호화 영역을 함유하는 수득되는 작제물(pExprRCI-1)을 후속적으로 M15 이. 콜라이 세포에 형질전환시킨다.[Stuber et al. (1990) Systems for high-level production in Escherichia coli and rapid purification of recombinantproteins: Applications to epitope mapping, preparation of antibodies, and structure-function analysis. In Immunological Methods(Levkovits, I. & Pernis, B., eds) pp. 121-152. Academic Press, New York].
재조합 RCI-1 단백질의 생산은 OD600을 1까지 성장시킨 250㎖ 이. 콜라이 M15 배양물에 1mM IPTG(최종 농도)를 부가하여 유도하며 추가로 19℃에서 밤새 진탕기 상에서 항온배양한다. 상기 세포를 원심분리(5000g, 10분)시켜 수거하고, 5㎖ 용해 완충액(1㎎ I-1 라이소좀을 함유하는 50mM Na-포스페이트 완충액 pH 7.5) 내에 재현탁시킨다. 빙상에서 30분 동안 항온처리한 후, 용해물을 원심분리(12000g, 15분)한 후, 펠렛을 막자사발에 옮기고 추출 완충액(0.1M K-포스페이트 완충액, pH 7, 30㎎ 폴리비닐-폴리-피롤리돈, 1mM EDTA)에서 분쇄시킨다. 원심분리 후, 투명한 상등액을 추가의 생화학적 분석을 위한 효소 제제로서 사용한다.
상기 작제물로 형질전환시킨 이. 콜라이의 추출물의 SDS-PAGE 분석으로, 웨스턴-블롯 상에서 LOX-특이적 항체에 의해 인식되는 약 103kDa의 분자량을 갖는 신규한 단백질을 확인한다. 상기 크기는 105kDa(실시예 3 참조)의 예견값과 일치한다.
실시예 7: RCI-1 리폭시게나제 활성의 생화학적 분석
리폭시게나제 활성은 기질로서 리놀산 및 재조합 RCI-1 효소 추출물[Bohland et al. (1997) Plant Physiol. 114, 679-685]로부터의 5 내지 20㎕를 사용하여 234㎚에서 30℃에서 분광광도계적으로 측정한다. pH 최적화를 결정하기 위해서, 중복하는 pH 범위의 상이한 완충액(pH 4 내지 6: 0.1M Na-아세테이트; pH 6 내지 8: 0.1M Na-포스페이트; pH 8 내지 10: 0.1M 트리스-HCl)을 사용한다. 반응 생성물의 몰 흡광도 계수, 2.5 x 107/㎝/mol을 효소 활성의 계산에 사용한다.
상기 세균의 조 추출물은 기질로서 리놀산을 사용하여 증가된 LOX 활성을 나타내는 반면, 발현 작제물이 없거나 빈 벡터를 함유하는 이. 콜라이의 대조군 추출물은 검출가능한 LOX 활성을 나타내지 않는다. 최대 활성은 pH 8 내지 9 정도에서 관찰되며, 이는 RCI-1은 제1형 LOX[Siedow (1991) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 145-188]로 분류되어야만 한다는 것을 나타낸다. 그러나, 최근에, 색소체 전이 펩타이드의 존재에 기초한 제2 분류법이 도입되어 있음을 주지해야 한다[Shibata et al. (1994) Plant Mol. Biol. Rep. 12, 41-42]. 이러한 체계에 따르면, RCI-1은 제2형 LOX로 분류되어야만 한다.
RCI-1 단백질의 효소 활성의 생성물은 HPLC[Bohland et al. (1997) Plant Physiol. 114, 679-685]로 분석한다. 재조합 RCI-1 단백질로부터 수득된 대략 0.2nkat 효소 활성을 30℃에서 20분 동안 2㎖ 0.1M 트리스-HCl pH 8.8에서 50㎕ 기질 용액(리놀산 또는 α-리놀렌산 각각 10㎕; 20㎕ 에탄올, 20㎕ H2O)과 함께 항온처리한다. 반응은 희석된 HCl를 사용하여 pH 3.0으로 낮추고, 과산화수소를 CHCl31㎖를 사용하여 추출하고 물로 2회 세척한다. 반응 생성물을 HPLC-분석(4-㎛ 입자 크기, Suprashere-Si, 4.6x 125㎜; 제조원: Merck, Darmstadt, Germany)한다. 등용매성 용출은 헥산:2-프로판올:아세토니트릴:아세트산(98.3:1.5:0.1:0.1, v/v/v/v)을 사용하여 1㎖/분의 유속으로 수행한다. 생성물을 234㎚에서 검출하고 표준은 제조원(Biomol, Hamburg, Germany)으로부터 수득하거나 문헌[Bohland et al. (1997) Plant Physiol. 114, 679-685]에 기술된 바와 같이 대두 리폭시게나제와 항온처리하여 각각 리놀산 또는 α-리놀렌산로부터 제조한다.
재조합 RCI-1의 반응 생성물은 HPLC로 분석하는 경우, 리놀산 또는 리놀렌산 중 어떤 것이 효소에 대한 기질로서 작용하는지에 관계없이, (13S)-하이드로퍼옥시-(9Z, 11E, 15Z)-옥타데카트리엔산(13-HPOD)이 우세한 생성물이다. (9S)-하이드로퍼옥시-(10E, 12Z, 15Z) 옥타데카트리엔산(9-HPOD)는 단지 소량으로 검출된다.
실시예 8: RCI-1 전이 펩타이드::GFP 리포터-유전자 작제 및 형질전환
RCI-1 단백질의 N-말단 37개 아미노산(서열 번호 6), 클로닝 과정으로부터 기인하는 4개의 아미노산 및 이후에 GFP 서열을 순서대로 함유하는 융합 단백질을암호화하는 키메라 유전자를 작제한다. 이를 위해서, pRCI-1(실시예 3B 참조)를 cDNA 삽입물의 149번 위치(서열 번호 5의 149번 염기에 상응함) 이후 상부 쇄 및 삽입물의 하류 다중 클로닝 부위에서 절단하는, XhoI으로 절단하고 재결합시킨다. 수득되는 플라스미드는 RCI-1 cDNA의 처음 158bp를 함유하며, 클로닝 부위 하류에서 벡터의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5의 150 내지 158번 염기와 동일하기 때문이다. 상기 플라스미드는 pRCI158로 인용된다. 전이 펩타이드 cDNA(서열 번호 4)를 포함하는 이의 삽입물은 EcoRI 및 XbaI으로 절단하며, 이들 모두는 다중 클로닝 부위에서 절단하며, 점착성 말단은 클레나우 효소를 사용하여 보충하여 평활말단화시킨다. 평활말단화된 단편을 mGFP-5 암호화 영역(MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, England)을 함유하는 이원 pCambia 1302 벡터(제조원: Cambia, Canberra, Australia)의 보충되고 탈인산화된 SpeI 클로닝 부위내로 클로닝한다. 삽입된 단편의 정확한 배향을 제한 절단으로 검사하고 최종 작제물을 서열분석으로 입증한다. 상기 작제물을 pRCI transit peptide::GFP로 명명하고 삼모계 교배(triparental mating)에 의해 아그로박테리움 투메패시언스 균주 LBA 4404내로 형질전환시킨다. 아라비돕시스 잎 세포의 형질전환은 문헌[kapila et al. (1997), Plant Sci. 122, 101-108]에 따라서 발아 14일 후, 아라비돕시스 탈리아나, 생태형 Wassiljewskija(Ws)의 온전한 잎내로 아그로박테리움 침투에 의해서 달성된다. 융합 단백질의 발현은 형질전환 2일 후, 하기 필터 설정(여기 476/488㎚; GFP-방출 515 내지 552㎚, 엽록소-방출 673 내지 695㎚)을 사용하여 PLAPO x100 오일 침지 대물렌즈(제조원: Leica Microsystems, Heidelberg, Germany) 및 Leica-TCS 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용한 공촛점 영상화에 의해서 조사한다. GFP 형광 및 엽록소 자가형광은 독립적인 2-채널-검출을 사용하여 동시에 기록한다.
pRCI transit peptide::GFP 작제물을 발현하는 유전자이식된 아라비돕시스 식물로부터의 잎의 공촛점 영상화로 GFP 형광 및 엽록소 자가형광의 엄격한 일치가 확인되며, 이는 융합 단백질이 엽록체내에 위치한다는 것을 나타낸다.
실시예 9: RCI-1 프로모터 영역의 클로닝
A. 벼의 λ-DASH 게놈성 DNA 라이브러리의 스크리닝
오리자 사티바 씨브이. 노린(Oryza sativa cv. Norin) 식물로부터 유도된 게놈성 DNA를 나타내는 λ-DASH II/BamHI DNA 라이브러리를 제조원(Stratagene, La Jolla, USA)으로 프로토콜에 따라서 작제한다. 라이브러리의 역가는 2.12 x 1010pfu/㎖로 결정된다. 라이브러리의 스크리닝은 제조원(Stratagene)의 프로토콜에 따라서 수행한다. 상기 라이브러리를 NZY 아가를 함유하는 530㎠ 바이오-분석 디쉬(제조원: Nalge Nunc Int., Naperville, USA)상에 위치시킨다. 밀도는 150,000pfu/플레이트로 조정하고 제조원(Stratagene)의 프로토콜에 따라서 숙주 균주로서 이. 콜라이 XL1-블루 MRA(제조원: Stratagene, La Jolla, USA)를 사용하여 플레이팅을 수행한다. 플라크를 나일론 막(HybondTM0.45㎚, 제조원: Amersham, Uppsala, Sweden) 상에 옮기고 DNA를 UV 교차결합기(제조원: Amersham, Uppsala, Sweden)내에서 교차 결합시킨다. 벼 RCI-1 리폭시게나제 cDNA 클론 pRCI-1(서열 번호 5)의 5' 프라임 말단을 나타내는 900bp PstI-단편을32P로 표지하고 밤새 표준 과정[Maniatis et al., 1982]에 따라서 65℃에서 하이브리드화시켜 플라크 리프트시킨다. 스크리닝의 부가적인 2회로 포지티브 λ-클론(λLOX4)가 수득된다.
B. 잠재적인 LOX 프로모터 영역의 서브클로닝
λ-클론의 액체 용해물 DNA 제제를 표준 과정에 따라서 제조하고 PstI 제한효소를 사용한 절단 및 0.6%(w/v) 아가로오스 겔 상에서 겔 전기영동으로 분석한다. 서던 블롯팅 및 후속적인 RCI-1 cDNA의 900bp PstI-단편에 대한 막의 하이브리드화를 표준 과정에 따라서 수행한다. λLOX4의 4.5kb 단편에 상응하는 강력한 밴드가 검출된다. 상기 4.5kb DNA 단편을 pBluescript/SK+ 벡터(제조원: Stratagene, La Jolla, USA)내로 서브클로닝시킨다. 이. 콜라이 DH5α 세포의 형질전환을 표준 과정에 따라서 수행하고 형질전환체를 암피실린(100㎍/㎖)을 함유하는 LB 아가 상에서 선택한다. 이러한 수득되는 클론을 pBSK+LOX4A로 명명한다. 클론 pBSK+LOX4A를 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 수탁 번호 DSM 13524로서 2000년 6월 6일자로 기탁하였다. 클론 pBSK+LOX4A는 4.5kb PstI/PstI 단편 상에 RCI-1 리폭시게나제 프로모터를 함유하며 추가로 DNA 서열분석으로 분석한다. 클론 pBSK+LOX4A는 5'에서 3' 방향으로, 서열 번호 1, 2 및 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열 번호 1은 4.5kb PstI/PstI 단편의 5' 말단을 포함한다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 358개 뉴클레오타이드 길이이며 이의 5' 말단쪽에서 1 내지 6 위치에서 PstI-부위를 함유한다. 4.5kb PstI/PstI 단편의 서열 번호 1 및 서열 번호 2 사이의 영역은 약 240 내지 440bp 길이이다. 4.5kb PstI/PstI 단편의 중간 영역은 서열 번호 2에 나타내며 2104bp 길이이다. 이는 잠재적인 TATA 박스(서열 번호 2의 1261 내지 1266번 위치), 잠재적인 개시 코돈(서열 번호 1359 내지 1361번 위치) 뿐만 아니라 잠재적인 5' 비해독 영역 및 TATA 박스의 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 게놈성 DNA(서열 번호 2) 및 cDNA(서열 번호 5)의 비교는, 서열 번호 2의 1312 내지 1701번 위치에 위치한 서열은 엑손 1의 전부 또는 일부를 포함하고, 서열 번호 2의 1702 내지 2104번 위치에 위치한 서열은 인트론 1의 5' 일부분임을 나타낸다. 4.5kb PstI/PstI 단편의 서열 번호 2 및 서열 번호 3 사이의 영역은 약 85 내지 285bp 길이이다. 4.5kb PstI/PstI 단편의 3' 말단은 서열 번호 3에 나타낸다. 상기 서열은 1516bp 길이의 뉴클레오타이드 서열을 도시한다. 이는 5'에서 3' 방향으로 인트론 1의 3' 말단(서열 번호 3의 1 내지 97번 위치), 엑손 2(서열 번호 3의 98 내지 366번 위치), 인트론 2(서열 번호 3의 367 내지 1283번 위치) 및 엑손 3의 일부분(서열 번호 3의 1284 내지 1516번 위치)을 함유한다. PstI 부위는 1511 내지 1516번 위치에 위치한다.
실시예 10: 플라스미드 증폭 및 클론 pBSK+LOX4A의 DNA 서열분석
형질전환체를 암피실린(100㎍/㎖)을 함유하는 LB 배지의 50㎖ 밤새 배양물 중에서 37℃에서 성장시킨다. 세포를 수거하고 플라스미드 DNA를 Jetstar Midi 플라스미드 추출 키트(제조원: Genomed GmbH, Bad Oeynhausen, Germany)를 사용하여 추출한다. 클론 pBSK+LOX4A의 서열분석은 쇄 종결 방법[Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor]을 사용하여 수행한다. 서열분석 반응은 제조원의 지침에 따라서 BigDyeTM종결인자 사이클 서열분석 키트(제조원: Perkin-Elmer Corp., Norwalk, Connecticut)를 사용하여 수행하며, 서열들은 373DNA-서열분석기(Applied Biosystems, Foster City, California)를 사용하여 측정한다. 이들은 조합되어 위스콘신 서열 분석 팩키지(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)를 사용하여 분석된다. 불명확성은 상응하는 전기영동된 프린트를 비교함으로써 명확해진다. 서열 번호 1은 pBSK+LOX4A의 4.5kb 삽입물의 5' 말단에 상응하고, 서열 번호 2는 중간에 상응하며 서열 번호 3은 3' 말단에 상응한다.
실시예 11: CaMV 35S 프로모터::RCI-1 cDNA 작제물의 작제
출발 플라스미드는 식물 이원 벡터 pBI121(제조원: Clontech, Palo Alto, California)이며, 이는 CaMV 35S 프로모터의 조절하에 위치한 GUS 리포터 유전자를 함유한다. GUS 리포터 유전자를 pBI121로부터 제거하고 RCI-1 cDNA로 교체한다. 이를 위해서, pBI121을 제한 효소 SstI으로 절단하고, 점착성 말단을 표준 과정에 따라서 dNTP 및 T4 DNA 폴리머라제로 보충한다. SmaI으로 절단한 후, 벡터 단편을 아가로오스 겔 전기영동으로 GUS 리포터 유전자로부터 분리하고 재결합시킨다. 상기 벡터를 pBI121(-GUS)로 명명한다. pBI121(-GUS)를 BamHI으로 절단하고, 점착성 말단을 dNTP 및 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 보충하여 평활말단화시키고, 상기 벡터를 EcoRI 및 XbaI으로 pCRI-1로부터 절단해 내고 이의 점착성 말단을 dNTP 및 T4 DNA 폴리머라제로 평활말단화시킨 후, RCI-1 cDNA 단편을 상기 벡터내로 연결시킨다. 이. 콜라이에 형질전환시킨 후, 플라스미드를 수 많은 클론으로부터 제조한다. RCI-1 단편의 배향은 삽입물의 바로 상류를 절단하는 XbaI 및 RCI-1 cDNA의상부 쇄를 2688번 뉴클레오타이드 뒤에서 절단하는 BamHI을 사용하여 제한 절단으로 조사한다. 정확한 배향은 약 2700bp 길이의 단편을 초래하며, 잘못된 배향은 약 350bp의 단편을 초래한다. 이후, 정확한 배향으로 RCI-1 cDNA를 함유하는 플라스미드 즉, CaMV 35S 프로모터 다음에 EcoRI 부위에서 보충된 플라스미드를 선택하고 p35S promoter::RCI-1 cDNA로 명명한다. 아그로박테리움 매개된 형질전환을 위해서, 상기 플라스미드를 전기천공법으로 아그로박테리움 투메패시언스 균주 LBA 4404내로 형질전환시킨다.
실시예 12: 벼의 형질전환
형질전환된 아그로박테리움 투메패시언스 균주를 30㎎/ℓ 하이그로마이신 B 및 3㎎/ℓ 테트라사이클린으로 보충한 AB 액체 배지에서 3일 동안 성장시키고, 1mM 베타인으로 보충된 2N6-As 배지[Hiei, Y. et al., Plant J., 6, 271-282 (1994)] 상에서 2㎎/ℓ 2,5-D를 함유하는 N6 배지[Chu, C.C. et al., Sci, Sin., 18, 659-668 (1975)] 중 성숙 종자의 소인편으로부터 유도된 3주된 캘러스와 함께 2 내지 3일 동안 25℃에서 암 조건하에 공배양한다. 공-배양된 캘러스를 100㎎/ℓ세폭탁심을 함유하는 멸균수로 세척하고, 다시 40㎎/ℓ 하이그로마이신 및 100㎎/ℓ 세폭탁심을 함유하는 N6 배지에서 3주 동안 배양한다. 활발히 성장하는 하이그로마이신-내성 캘러스를 선택 배지[예를 들면, MS 배지(제조원: Life Technologies) + 0.2㎎/ℓ NAA(나프탈렌 아세트산)+ 2㎎/ℓ키네틴 + 2% 솔비톨 + 1.6% 파이트아가(제조원: Gibco) + 50㎎/ℓ하이그로마이신 B + 250㎎/ℓ 세폭탁심] 상으로 옮기고,40μmol/㎡/s의 지속적인 광 조건하에서 2 내지 3주 동안 배양한다. 이렇게 수득된 모종을 화분에 옮기고 10시간 광/14시간 암 조건하에서 성장실에서 성장시켜 유전자이식된 벼 식물을 수득한다.
실시예 13: 옥수수의 형질전환
제1형 배형성된 옥수수 캘러스 배양[Green et al., Miami Winter Symposium 20, 1983]은 온실 성장시킨 물질로부터의 1.5 내지 2.5㎜ 길이의 미성숙 배아로부터 개시한다. 배아를 수분 약 14일 후 표면-멸균된 이삭으로부터 무균적으로 절개한다. 배아를 2% 슈크로오스 및 5㎎/ℓ클로람벤을 갖는 D 캘러스 개시 배지[Duncan et al., Planta 165: 322-332, 1985] 상에 또는 3% 슈크로오스 및 0.75㎎/ℓ 2,4-d를 갖는 KM 캘러스 개시 배지[Kao and Michayluk, Planta 126: 105-110, 1975] 상에 위치시킬 수 있다. 배아 및 배형성 배양물을 암 조건에서 후속적으로 배양한다. 배형성 반응물을 약 14일 후 이식물로부터 제거한다. D 캘러스 개시 배지로부터 배형성 반응물을 2% 슈크로오스 및 0.5㎎/ℓ2,4-d를 갖는 D 캘러스 유지 배지 상으로 위치시키는 반면, KM 캘러스 개시 배지로부터의 것은 2% 슈크로오스 및 5㎎/ℓ 디캄바(Dicamba)를 갖는 KM 캘러스 유지 배지 상으로 위치시킨다. 3 내지 8주 후에 약한 선택성 서브배양물을 신선한 유지 배지로 옮긴 후, 고품질의 조밀한 배형성 배양물을 확립한다. 활발히 성장하는 배형성 캘러스 조각을 유전자 전달을 위한 표적 조직으로서 선택한다. 상기 캘러스 조각을 유전자 전달 약 4시간 전에 12% 슈크로오스를 갖는 유지 배지를 함유하는 표적 플레이트 상에위치시킨다. 캘러스 조각을 표적 플레이트의 중심으로부터 8 및 10㎜의 반지름으로 원형으로 배열한다.
프로모터-RCI-1 cDNA 작제물 또는 RCI-1-프로모터-리포터 유전자 작제물을 함유하는 플라스미드 DNA를 문헌[DuPont Bioplistics manual]에 기술된 바와 같이 금 미세담체 상에 침전시킨다. 각각의 플라스미드 2 내지 3㎍을 각각 6회 발사 미세담체 제제에서 사용한다. 유전자를 PDS-1000He Biolistics 장치를 사용하여 표적 조직내로 전달시킨다. Biolistics 장치 상의 설정은 다음과 같다: 파열 디스크 및 거대담체 사이 8㎜, 거대담체 및 중지 스크린 사이 10㎜ 및 중지 스크린 및 표적 사이 7㎝. 각각의 표적 플레이트를 650psi 파열 디스크를 사용하여 2회 발사한다. 200 x 200 스테인레스 스틸 메쉬(제조원: McMaster-Carr, New Brunswick, NJ)를 중지 스크린 및 표적 조직 사이에 위치시킨다.
유전자 전달 7일 후, 표적 조직 조각을 고삼투압 배지로부터 선택 배지로 옮긴다. BAR 유전자를 사용한 선택을 위해서, 표적 조직 조각을 100㎎/ℓ 글루포시네이트 암모늄(Basta) 또는 20㎎/ℓ 바이알라포스(bialaphos)(Herbiace)를 함유하는 유지 배지 상으로 위치시킨다. 모든 아미노산을 선택 배지로부터 제거한다. 상기 고수준 선택 배지 상에서 5 내지 8주 후, 임의의 성장하는 캘러스를 3 내지 20㎎/ℓ Basta를 함유하는 배지로 서브배양시킨다.
만노오스 포스페이트 이소머라제 유전자를 사용한 선택을 위해서, 표적 조직을 슈크로오스 비함유 및 1% 만노오스를 함유하는 이의 각각의 유지 배지 상으로 위치시킨다. 아미노산은 상기 배지로부터 제거하지 않는다. 5 내지 8주 후, 성장하는 캘러스를 슈크로오스 비함유 및 1.5% 만노오스를 함유하는 D 캘러스 유지 배지 또는 1% 슈크로오스 및 0.5% 만노오스를 함유하는 KM 캘러스 유지 배지 상으로 서브배양시킨다. 선택 배지에서 성장하는 배형성 캘러스를 10 내지 20개 식물을 생산하기에 충분한 캘러스가 생성될 때까지 4 내지 8주 동안 2주마다 서브배양시킨다. 최초 표적 조직 조각으로부터의 선택에서 살아남은 조직을 단일 클론으로서 서브배양시키고 독립적인 형질전환 사건으로 명명한다.
상기 시점에서, Basta에서 선택된 클론을 3% 슈크로오스(MSS)를 함유하고 어떠한 선택 제제로 함유하지 않는 변형된 MS 배지[Murashige and Skoog, Physiol. Plant, 15: 473-497, 1962]로 옮기고, 광 조건하에 위치시킨다. 0.25㎎/ℓ 안시미돌 및 0.5㎎/ℓ 키네틴을 상기 배지에 부가하여 배 발생을 유도하거나 2㎎/ℓ 벤질 아데닌을 부가한다. 만노오스를 사용하여 선택된 클론을 2% 슈크로오스 및 1% 만노오스(MS2S+1M)를 함유하고 안시미돌 및 키네틴을 상기와 같이 부가한 변형된 MS 배지 또는 2% 슈크로오스 및 0.5% 만노오스(MS2S+0.5M)을 함유하고 벤질 아데닌을 상기와 같이 부가한 변형된 MS 배지 상으로 옮긴다.
Basta선택으로부터 재생하는 클론을 2주 후에 안시미돌 및 키네틴 또는 벤질 아데닌을 함유하지 않는 MS3S 배지로 옮긴다. 만노오스 선택으로부터 재생하는 클론을 2주 후에 각각 호르몬을 함유하지 않는 MS2S+1M 및 MS2S+0.5M 배지로 옮긴다. 모든 클론으로부터 뿌리를 갖거나 갖지 않는 재생하는 슈트(shoot)를 MS3S 배지를 함유하는 Magenta 박스로 옮기고 뿌리를 갖는 작은 식물을 궁극적으로 회수하고 온실내 토양으로 옮긴다.
식물을 변형된 48-웰 클로로페놀 레드 분석을 사용하여 PMI 유전자의 발현에 대해서 시험하며, 이때, 배지는 슈크로오스를 함유하지 않고 0.5% 만노오스를 함유한다. 잎 샘플(약 5㎜ x 5㎜)을 상기 분석 배지에 위치시키고 약 72시간 동안 암 조건에서 성장시킨다. 식물이 PMI 유전자를 발현하는 경우, 이는 만노오스를 대사시킬 수 있으며 배지는 황색으로 변화할 것이다. 그렇지 않은 경우, 상기 배지는 붉은색을 유지할 것이다.
형질전환 사건은 또한, 표준 배양 기술들을 사용하여 미성숙 접합성 배아로부터 수득된 제1형 캘러스를 사용하여 수행되었다. 유전자 전달을 위해서, 제1형 캘러스 약 300㎎을 유전자 전달 1 내지 2일 전에 신선한 배지로 서브배양시키고, 표적 조직 조각을 선택하고 이를 환형으로 12% 슈크로오스를 함유하는 배지 상에 표적 플레이트의 중심으로부터 10㎜에 위치시켜 제조한다. 약 4시간 후, 상기 조직을 제조원(DuPont)으로부터의 PDS-1000/He Biolistic 장치를 사용하여 폭격한다. 형질전환시키고자 하는 플라스미드는 제조원(DuPont)으로부터의 표준 프로토콜을 사용하여 1㎛ 금 입자 상에 침전시킨다. 유전자는 650spi에서 표적 플레이트 당 2회의 발사를 사용하여 전달된다. 유전자 전달 약 16시간 후, 캘러스를 2% 슈크로오스를 함유하지만 어떠한 선택 제제도 함유하지 않는 표준 배양 배지에 옮긴다. 유전자 전달 12 내지 13일 후, 표적 조직 조각을 Basta 또는 바이알라포스로서 40㎎/ℓ 포스피노트리신을 함유하는 선택 배지로 옮긴다. 상기 캘러스를 12 내지 16주 동안 선택시 서브배양시키며, 이후 생존하여 성장하는 캘러스를 식물 생산을 위한 Basta로서 3㎎/ℓ 포스피노트리신을 함유하는 표준 재생 배지로 옮긴다.
실시예 14: 대두의 형질전환
글리신 맥스(Glycine max)의 원형질체를 문헌[Tricoli et al., 1986, Plant Cell Rep. 5: 334-337; or Chowhury and Widholm, 1985, Plant Cell Rep. 4: 289-292; or Klein et al., 1981, Plant 152: 105-114]에 기술된 바와 같은 방법으로 제조한다. 원형질체 현탁물은 플라스틱 1회용 큐벳내로 1㎖ 분획물로서 분배된다. 형질전환을 위해서, 10㎍ DNA를 10㎕ 멸균 증류수에 부가하고 문헌[Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2717-2722]에 기술된 바와 같이 멸균시킨다. 상기 용액을 온화하게 혼합하고 실온(24 내지 28℃)에서, 471 전극 조합을 사용하는 BTX-트랜스펙터 300 전기천공 장치로부터 10ms의 지수적 붕괴 상수로 400V㎝-1의 펄스에 적용시킨다.
상기를 하나 이상의 하기 변형으로 반복한다:
(1) 사용 전압은 200V㎝-1이거나, 100V㎝-1내지 800V㎝-1범위이다.
(2) 지수적 붕괴 상수가 5ms, 15ms 또는 20ms이다.
(3) 25㎕ 멸균수 중 전단된 소 흉선 DNA 50㎍을 플라스미드 DNA와 함께 부가한다.
(4) 플라스미드 DNA를 적합한 제한 효소(예를 들면, BamHI)로 처리하여 사용전에 선형화시킨다.
원형질체를 배지를 고화시키기 위한 알기네이트의 부가 없이, 문헌[Klein et al., 1981, Plant 152: 105-114; Chowhury and Widholm, 1985, Plant Cell Rep. 4:289-292; or Tricoli et al., 1986, Plant Cell Rep. 5: 334-337]에 기술된 바와 같이 배양한다.
실시예 15: 면화의 형질전환
표준 방법으로 작제된 형질전환을 위한 이원 벡터를 함유하는 아그로박테리움 균주를 pH를 5.6으로 조정하고 0.15% 만니톨, 50㎍/㎖ 스텍티노마이신 및 1㎎/㎖ 스트렙토아미신으로 보충한 글루타메이트 염 배지에서 18 내지 24시간 동안 성장시킨 후 이들을 항생제를 비함유하는 동일한 배지에서 2의 OD600까지 희석시킨다. 이후, 상기 세균을 3 내지 5시간 동안 성장시킨 후 0.2 내지 0.4의 OD600까지 희석시키고 표면 멸균된 면화 종자로부터 절단된 디스크의 접종에 사용한다.
면화 종자를 10% 클로록스내에서 20분 동안 침지시킨 후 멸균수로 세정한다. 상기 종자를 암 조건에서 0.7% 물 아가 상에서 발아시킨다. 파종물을 1주일 동안 성장시킨 후 떡잎 표면 상에 세균을 접종한다.
접종한 떡잎이 캘러스를 형성하게 하여 이들을 절단하여 MS 염, 3% 슈크로오스, 100㎍/㎖ 카르베니실린 및 100㎍/㎖ 메폭심을 함유하는 0.7% 아가 상에 위치시킨다. 캘러스를 4개의 플레이트용으로 충분한 양이 수득될 때까지 3주마다 신선한 배지로 옮긴다. 독성 아그로박테리움 균주로부터 성장하는 캘러스 1/2을 호르몬을 비함유하고 50㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 배지로 옮긴다.
실시예 16: 아스퍼길러스 플라버스(Aspergillus flavus)/아플라톡신 질환 분석
접종물 생산 및 접종 프로토콜:
접종물은 아스퍼길러스 플라버스의 4개의 고도의 독성 분리물로부터의 분생자의 동등 혼합물이다. 각각의 분리물을 12시간 광 조건으로 28℃에서 12 내지 16일 동안 감자-덱스트린 아가 상에서 페트리 디쉬 중에서 각각 성장시킨다. 배지를 포함하는 배양물을 증류수와 혼합하고 이중층 무명천을 통해 여과시킨다. 분생자 농도를 헤마토사이토미터를 사용하여 평가하고 증류수로 조정한다. 100㎖ 당 트윈 20 2방울을 계면활성제로서 부가한다. 분생자 현탁액을 사용 직전에 제조하고 빙상에서 저장하여 연구실로부터 필드로 옮긴다.
각각의 식물의 1차 이삭을 핀-보오드 접종기[Plant Disease (1994) 78: 778-781]를 사용하여 1 x 106분생자/㎖의 포자 현탁액으로 털이 중간 정도 자란 단계(털이 출현한 이삭이 50%)에서 20 내지 24일째 접종한다.
이삭 부패율 및 아플라톡신 분석:
접종 40 내지 45일 후, 이삭의 껍질을 벗기고 1 내지 9의 가시적인 질환 중증도(1= 질환 없음, 9= 90 내지 100% 감염됨)를 각각의 접종된 이삭에 대해서 평가하고 각각의 플롯에 대해서 평균을 낸다.
경우에 따라, 이삭을 강제로 공기로 건조시키고 껍질을 벗긴다. 각각의 플롯에 대해서 낟알을 모으고 마이코톡신 분석에 대해서 서브샘플링한다.
서브샘플들을 Romer Mill(모델 2A)로 분쇄하고 표준 AOAC 방법을 사용하여 박층 크로마토그래피로 전체 아플로톡신에 대해서 분석한다.
실시예 17: GUS 또는 GFP 리포터 유전자에 작동적으로 결합된 5'-프로모터 단편을 함유하는 식물 형질전환 벡터의 작제
프로모터::리포터 융합체를 생산하기 위해서, pBSK+LOX4A(실시예 9 참조)를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 위한 주형으로 사용한다. 유전자-특이적 프라이머를 사용하여 상기 유전자의 5' 프로모터 영역을 증폭시킨다. 역방향 프라이머 R1(서열 번호 2) 및 정방향 프라이머 F1(서열 번호 13) 및 F2(서열 번호 14)를 조합하여 사용하여, 개시 메티오닌의 약 1.2kb 및 약 2kb 상류의 조절성 서열을 분리한다. 정방향 프라이머 F1 및 역방향 프라이머 R1을 사용하여 증폭시킨 PCR 단편의 뉴클레오타이드 서열을 서열 번호 18에 나타내고, 정방향 프라이머 F2 및 역방향 프라이머 R1을 사용하여 증폭시킨 PCR 단편의 뉴클레오타이드 서열을 서열 번호 19에 나타낸다. 클로닝의 용이성을 위해서, 프라이머들은 GATEWAYTM클로닝 기술(제조원: Life Technologies, Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, USA)을 위한 유전자 특이적 서열 및 attB 재조합 부위들로 이루어진다. 역방향 프라이머로서, 하기 서열을 갖는 프라이머 R1을 사용한다: 5'-CAAGAAAGCTGGGT TGACAAATTAAGTTGTCAGTGTG-3'(서열 번호 12). 역방향 프라이머 R1의 유전자 특이적인 서열은 밑줄 그어져 있고(서열 번호 2의 1356 내지 1334번 위치에상응함), attB 재조합 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 정방향 프라이머들은 프라이머 F1 및 F2이다. 정방향 프라이머 F1은 하기 서열을 갖는다: 5'-CAAAAAAGCAGGCT TGTAACATCCTACTCCTATTGTG-3'(서열 번호 13). 정방향 프라이머 F1의 유전자 특이적 서열은 밑줄 그어져 있고(서열 번호 2의 149 내지 181번 염기에 상응함), attB 재조합 서열은 이탤릭체로 나타낸다. R1과 조합하여 F1은 약 1.2kb의 단편을 증폭시킨다. 정방향 프라이머 F2는 하기 서열을 갖는다: 5'-CAAAAAAGCAGGCT CCCCGTCTTTATCTACTC-3'(서열 번호 14). 정방향 프라이머 F2의 유전자 특이적 서열은 밑줄 그어져 있고(서열 번호 1의 31 내지 48번 염기에 상응함), attB 재조합 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 프라이머 R1와 조합하여 F2는 약 2kb의 단편을 증폭시킨다.
네스티드 PCR 전략을 사용하여, 조절성 서열을 프라이머 F1+R1 또는 F2+R2를 사용하여 우선 증폭시킨 후 프라이머 attB1(5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'; 서열 번호 15) 및 프라이머 attB2(5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'; 서열 번호 16)를 사용하여 2차 PCR을 수행한다. 하기 PCR 조건들을 유전자-특이적 프라이머 F1+R1 또는 F2+R1과 함께 사용한다: [(94℃: 15분):(94℃: 10초/53℃: 10초/72℃: 1분)X15:(72℃: 2분)]. PCR 이후, 생성물을 사용하여 attB1+attB2 프라이머를 사용하여 증폭을 위한 2차 PCR을 수행한다. 후속적인 PCR 증폭에서, 하기 PCR 조건을 사용한다: [(94℃: 15분):(94℃: 15초/68℃: 2분, 15초)X25:(68℃: 3분)]. 이후, 수득되는 PCR 생성물을 attB 재조합 부위로 플랭킹시키고 제조원의프로토콜(참조: Instruction Manual of GATEWAYTMCloning Technology, GIBCO BRL, Rockville, MD, UDA, http://www.lifetech.com/)에 따라서 BP 반응을 통해서 pDONR201내 엔트리 클론을 생성시키는데 사용한다. 수득되는 플라스미드는 RCI-1 개시 코돈의 약 1.2kb 및 약 2kb를 함유하며, pENTR+LOXp1.2 및 pENTR+LOXp2로서 인용된다.
1. 생성된 엔트리 벡터 작제물
ㆍ pENTR+LOX1.2(pDONR201 + att 재조합 서열에 의해 플랭킹된 1.2kb 프로모터 단편)
ㆍ pENTR+LOX2(pDONR201 + att 재조합 서열에 의해 플랭킹된 2kb 프로모터 단편).
상기 엔트리 벡터를 사용하여 옥수수 또는 벼 형질전환을 위한 이원 프로모터::리포터 플라스미드를 작제한다. 조절성/프로모터 서열을 GUS 리포터 유전자[Jefferson et al., 1987, EMBO J 6: 3901-3907] 또는 GFP에 문헌[GATEWAYTMCloning Technology, GIBCO BRL, Rockville, MD, http://www.lifetech.com/]에 기술된 바와 같은 제조원의 프로토콜에 따라서 GATEWAYTM기술을 사용하여 융합시킨다. 간략하면, 상기 프로토콜에 따라서, 엔트리 벡터내 프로모터 단편을 LR 반응을 통해서 GUS 또는 GFP 리포터 유전자의 5' 쪽에 attR 부위를 갖는, 인트론과 함께 GUS 암호화 영역 또는 GFP를 함유하는 이원 아그로박테리움 데스티네이션 벡터(각각, pNOV2347 또는 pNOV2361)와 재조합시킨다. 삽입된 단편의 배향은 att 서열에 의해서 유지되며 최종 작제물은 서열분석으로 입증된다. 이후, 상기 작제물을 전기천공법으로 아그로박테리움 투메패시언스내로 형질전환시킨다.
pNOV2347 또는 pNOV2361은 T-DNA의 좌 및 우측 경계 사이에서 VS1 복제 오리진, 골격내 아그로박테리움 virG 유전자 및 옥수수 유비퀴틴 프로모터-PMI 유전자-nos 종결인자 발현 카셋트를 갖는 이원 벡터이다. PMI(포스포만노오스 이소머라제)는 이. 콜라이 manA 유전자[Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16: 219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803]의 암호화 영역이다. nos(노팔린 신타제) 종결인자는 아그로박테리움 투메패시언스 T-DNA로부터 수득된다[Depicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1(6), 561-573]. 옥수수 유비퀴틴 프로모터, 포스포만노오스 이소머라제 암호화 영역 및 nos 종결인자는 pNOV2347의 4114 내지 5114번 nt, 6192 내지 7295번 nt, 및 7356 내지 7604번 nt에 위치한다. pNOV2361은 pNOV2361이 GUS 리포터 유전자 대신에 GFP를 갖는다는 것을 제외하고는 pNOV2347과 동일하다. 리포터-프로모터 카셋트는 우측 경계에 가장 인접하게 삽입된다. 상기 이원 벡터내 선택가능한 마커 발현 카셋트는 좌측 경계에 가장 인접하게 삽입된다. 상기 벡터들은 GATEWAYTM재조합 구성분을 함유하며, 이들은 GATEWAYTM벡터 전환 시스템(제조원: Life Technologies, www.lifetech.com)을 사용하여 attR 부위, ccdB 및 클로람페니콜 내성 마커를 함유하는 평활-말단화된 카셋트를 결합시킴으로써 이원 벡터 골격내로 도입된 것이다. GATEWAYTM카셋트는pNOV2347의 2351 내지 4050번 nt(상보성) 사이 및 pNOV2361의 9201 내지 10910번 nt 사이에 위치한다. 프로모터 카셋트는 LR 재조합 반응(제조원: Life Technologies, www.lifetech.com)을 통해서 삽입되며, 이로써, 2351 내지 4050 사이에서 pNOV2347의 DNA 서열이 제거되고 att 서열에 의해서 플랭킹된 LOX 프로모터 단편으로 교체된다. 재조합으로 인트론(GIG) 서열과 함께 GFP 또는 GUS 리포터 유전자에 융합된 프로모터 서열이 생성된다. GIG 유전자는 GUS의 385 내지 576번 nt에서 솔라눔 투베로섬(Solanum tuberosum)으로부터의 ST-LS1 인트론[스탠턴 겔빈 박사로부터 수득함, Purdue University; 및 문헌(Narashmhulu et al., 1996, Plant Cell, 8: 873-886)에 기재됨]을 함유한다. 하기에서 이원 벡터 작제물내의 선택가능한 마커 및 프로모터-리포터 카셋트의 배향을 나타낸다.
2. 안정한 형질전환을 위한 생성된 작제물
ㆍ pNOV6800(RB nos + GIG 유전자 + LOX1.2 프로모터 단편-ZmUbi + PMI 유전자 + nos LB)
ㆍ pNOV6801(RB LOX1.2 프로모터 단편 + GFP 유전자 + nos-ZmUbi + PMI 유전자 + nos LB).
pNOV6800의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 22에 나타낸다. pNOV6800 및 pNOV6801은 이원 벡터의 우 및 좌측 경계 사이에 위치하는 발현 카셋트내에서만 상이하다.
3. 비교를 위해 사용되는 작제물
ㆍ pNOV2110(RB ZmUbi 프로모터 + GFP 유전자 + nos-ZmUbi + PMI 유전자 + nos LB)
ㆍ pNOV3640(RB nos-GIG-ZmUbi 프로모터 nos-AtPPOdm-ZmUbi 프로모터 LB).
GUS-인트론-GUS, GFP 및 폴리A 단편은 상기 LOX 프로모터 작제물에서 사용되는 것과 동일하다. ZmUbi 프로모터는 pNOV2110내 12 내지 2009번 염기의 단편과 상응하며 옥수수 유비퀴틴 유전자의 프로모터, 엑손 1 및 인트론 1을 함유한다. AtPPOdm 서열은 정상적으로는 상기 효소를 불활성화시키는 제초제에 대한 내성을 부여하는 프로토포리노겐 옥시다제 단백질[미국 특허 제5,939,602호]의 돌연변이된 형태를 암호화한다.
실시예 18: 옥수수의 아그로박테리움-매개된 형질전환
미성숙 옥수수 배아의 형질전환은 문헌[Negrotto et al., (2000) Plant Cell Reports 19: 798-803]에 기술된 바와 같이 필수적으로 수행된다. 본 실시예에 있어서, 모든 배지 성분들은 문헌[Negrotto et al. 상기]에 기술된 바와 같다. 그러나, 문헌에 기술된 다양한 배지 성분들이 치환될 수 있다.
1. 형질전환 플라스미드 및 선택가능한 마커
형질전환에 사용되는 유전자는 실시예 17에 기술된 바와 같이 옥수수 형질전환에 적합한 벡터내로 클로닝된다. 사용되는 벡터는 포스포만노오스이소머라제(PMI) 유전자[Negrotto et al. (2000) Plant Cell Reports 19: 798-803]를 선택가능한 마커로서 함유한다.
2. 아그로박테리움 투메패시언스의 제조
식물 형질전환 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 균주 LBA4404(pSB1)을 YEP(효모 추출물 5g/ℓ, 펩톤 10g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, 아가 15g/ℓ, pH 6.8) 고체 배지에서 28℃에서 2 내지 4일 동안 성장시킨다. 약 0.8 x 109개 아그로박테리움을 100μM 아세토시링곤(As)를 보충한 LS-inf 배지(LSAs 배지)[Negrotto et al., (2000) Plant Cell Rep 19: 798-803]상에서 현탁시킨다. 세균을 상기 배지에서 30 내지 60분 동안 예비-유도시킨다.
3. 접종
A188 또는 다른 적합한 옥수수 유전자형으로부터의 미성숙 배아를 8 내지 12일된 이삭으로부터 절개하여 LS-inf + 100μM As(LSAs)내로 넣는다. 배아를 신선한 감염 배지로 1회 세정한다. 이후, 아그로박테리움 용액을 부가하고 배아를 30초 동안 볼텍싱하고 5분 동안 세균이 정착되게 한다. 이후, 배아를 LSAs 배지 위에 소인편 방향으로 옮기고 2 내지 3일 동안 암실에서 배양한다. 후속적으로, 페트리 디쉬 당 20 내지 25개 배아 정도를 세폭탁심(250㎎/ℓ) 및 질산은(1.6㎎/ℓ)을 보충시킨 LSDc 배지내로 옮긴 후 10일 동안 28℃에서 암조건에서 배양한다.
4. 형질전환된 세포의 선택 및 형질전환된 세포의 재생
배형성 캘러스를 생산하는 미성숙 배아를 LSD1M0.5S 배지(디캄바 대신 0.5㎎/ℓ2,4-D, 10g/ℓ만노오스, 5g/ℓ슈크로오스 및 질산염 비함유한 LSDc)로 옮긴다. 배양물은 3주째 서브배양 단계로 6주 동안 상기 배지에서 선택한다. 생존하는 캘러스를 LSD1M0.5S 배지로 옮겨 증량시키거나 Reg1 배지[Negrotto et al., 2000에서 기술된 바와 같이]로 옮긴다. 광 조건(16시간 광/8시간 암 섭생)하에 배양한 후, 녹색 조직을 성장 조절제[Negrotto et al., 2000에서 기술된 바와 같이] 없이 Reg2 배지로 옮기고 1 내지 2주 동안 항온배양한다. 모종을 Reg3 배지[Negrotto et al., 2000에서 기술된 바와 같이]를 함유하는 Magenta GA-7 박스(제조원: Magenta Corp., Chicago, Ill)로 옮기고 광 조건하에서 성장시킨다. 프로모터-리포터 카셋트에 대해 PCR 포지티브인 식물을 토양으로 옮기고 온실에서 성장시킨다.
실시예 19: GUS 리포터 유전자 분석
프로모터 활성은 β-글루쿠로니다제(GUS) 효소의 발현에 대한 조직화학적 및 형광 분석법을 사용하여 정성적으로 및 정량적으로 평가한다.
1. 조직화학적 β-글루쿠로니다제(GUS) 분석
프로모터 활성의 정성적 평가를 위해서, 다양한 조직 및 기관을 GUS 조직화학적 분석법에서 사용한다. 전체 기관 또는 조직의 일부를 GUS 염색액내로 침지시킨다. GUS 염색액은 1mM 45-브로모-4-클로로-3-인돌릴 글루쿠로나이드(DMSO 중 X-Gluc, Duchefa, 20mM 스톡), 100mM Na-포스페이트 완충액 pH 7.0, 10mM EDTA pH 8.0 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유한다. 조직 샘플을 37℃에서 1 내지 16시간 동안 항온처리한다. 경우에 따라서, 샘플을 엽록소를 제거하기 위해서 70% EtOH로 수회 세척하여 투명화시킬 수 있다. 염색 후, 조직을 광학 현미경하에서 가시적으로 관찰하여 GUS 발현 패턴을 나타내는 청색 염색물을 평가한다.
2. β-글루쿠로니다제(GUS) 형광 분석
다양한 조직 및 기관에서 프로모터 활성의 정성적 분석을 위해서, GUS 발현을 형광광도계적으로 측정한다. 조직 샘플을 수거하고 빙냉시킨 GUS 추출 완충액(50mM Na2HPO4pH 7.0, 5mM DTT, 1mM Na2EDTA, 0.1% 트리톤 X100, 0.1% 사르코실) 중에서 분쇄시킨다. 분쇄된 샘플을 미세원심분리기에서 10,000rpm으로 4℃에서 15분 동안 원심분리시킨다. 원심분리 후, 상등액을 GUS 분석 및 단백질 농도 결정을 위해 제거한다.
GUS 활성을 측정하기 위해서, 식물 추출물을 37℃로 예비 승온시킨 GUS 분석 완충액(50mM Na2HPO4, pH 7.0, 5mM DTT, 1mM Na2EDTA, 0.1% 트리톤 X100, 0.1% 사르코실, 1mM 4-메틸움벨리페릴-베타-D-글루쿠론산 이수화물(MUG))에서 분석한다. 반응물을 항온처리하고 100㎕ 분획물을 30분 동안 10분 간격으로 제거하여 2% Na2CO3900㎕를 함유하는 튜브에 부가하여 반응을 종결시킨다. 이후, 종결된 반응물을365㎚ 여기 및 455㎚ 방출 파장에서 Tecan 분광형광광도계 상에서 판독한다. 단백질 농도를 제조원의 프로토콜에 따라서 BCA 분석법을 사용하여 측정한다. GUS 활성은 상대적인 형광 단위(RFU)/㎎ 단백질로서 표현된다.
실시예 20: GFP 리포터 유전자 분석
프로모터 활성은 현미경 영상화 형광을 사용하여 정성적으로 및 녹색 형광 단백질의 발현을 분석하기 위한 형광 분석법을 사용하여 정량적으로 평가한다.
1. GFP 발현의 현미경적 평가
프로모터::GFP 융합물의 발현은 GFP2 및 GFP3 필터 설정을 사용하여 Leica MzFLIII 형광 현미경(제조원: Leica Microsystems, Heidelberg, Germany)을 사용하여 현미경 영상화에 의해 형질전환체에서 모니터링한다.
2. 정량적인 GFP 형광광도계 분석
조직 또는 유전자이식된 식물에서 GFP의 발현을 분석하기 위해서, 회수된 조직을 동결시키고 동결된 조직을 완전히 분쇄시킨다. 분쇄 후, 추출 완충액(EB; 10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 100mM NaCl, 1mM MgCl2, 10mM DTT 및 0.1% 사르코실) 300㎕를 부가한다. 볼텍싱하여 샘플을 잘 혼합하고, 10분 동안 원심분리시킨 후, 상등액을 신규한 튜브 또는 미세역가 플레이트 웰에 옮겨 판독한다. 이후, 샘플 튜브또는 플레이트는 10의 섬광 및 100의 증폭율에 대해서 465㎚ 여기 및 512㎚ 방출 파장으로 설정된 Tecan 분광형광광도계 플레이트 판독기내로 삽입한다. 발현 수준이 특정 샘플내에서 측정 한계(셀 내의 VALUE를 말함)를 초과할 정도로 너무 높은 경우, 변수들을 8의 섬광 및 80의 증폭율로 변화시킨다.
단백질 농도를 제조원의 프로토콜에 따라 BCA 분석법을 사용하여 측정한다. GFP 활성은 상대적인 형광 단위(RFU)/㎎ 단백질로서 표현된다.
실시예 21: 프로모터 활성의 평가
프로모터::리포터 융합체를 평가하기 위해서, 조직 샘플을 비처리된 대조군 식물 및 화학적 활성화제, BTH 또는 자스몬산으로 처리한 식물로부터 수거한다. 유전자이식된 벼에서, 화학적 유도제를 사용한 처리는 T1 종자의 파종 10일 후 3개의 잎이 출현시 수행한다. 유전자이식된 옥수수에서, 화학적 유도제를 사용한 처리는 T1 종자의 파종 3주일 후 수행한다. 모든 화학제 농도는 ppm(활성 성분 ㎎/적용된 용액 ℓ)으로서 제시된다. 프로베나졸은 문헌[Thieron et al. (1995) Systemic acquired resistacne in rice: Studies on the mode of action of diverse substances inducing resistance in rice to Pyricularia oryzae. Mededelingen Faculteit Landbouwkundige en Toegepaste Biologische Wetenschappen Universiteit Gent. 60, 421-430]에 기술된 바와 같이 토양 침지에 의해서 순수한 물질의 250ppm 용액으로서 적용된다. BTH(활성 화합물 및 습화가능한 분말의 1:1(w/w) 혼합물)를 분무시켜 잎 상에 적용한다. 모든 대조군은 활성물질을 비함유하는 분무-용액의 적용에 의해 수행된다. 자스몬산은 문헌[Schweizer et al. (1997) Plant Physiol. 114, 79-88]에 기술된 바와 같이 1mM 용액으로서 적용된다. 상처 및 전신계 조직에서의 유전자 발현의 측정은 문헌[Schweizer et al. (1998) Plant J. 14, 475-481]에 따라서 수행된다.
본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형들이 전술한 기술 및 실시예로부터 당해 분야의 숙련자에는 명백할 것이다. 상기 변형들은 첨부된 특허청구범위의 범위내에 속하는 것으로 의도된다.
다양한 참고문헌 및 특허들이 본원에 인용되었으며, 이들은 모두 이의 전체가 참조문헌으로 도입된다.
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(PCT 규칙 13bis)
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C. 추가 정보 (미적용시 공백으로 함) 상기 정보는 다음장에 포함된다 □
우리는 이용가능한 경우 전문가 해결책을 요청한다.
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기탁 기관의 주소 (우편 번호 및 국가를 포함)미국 일리노이주 61604 페오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815
기탁일:2001년 5월 25일 수탁 번호:NRRL B-30480
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Claims (44)

  1. 연결된 뉴클레오타이드 서열의 화학적으로 유도가능하지만 상처- 또는 병원체-유도가능하지는 않는 발현을 구동할 수 있는 분리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 수탁 번호 DSM 13524로서 기탁된 플라스미드 pBSK+LOX4A로부터의 약 4.5kb 길이의 PstI/PstI 단편의 구성분인, 분리된 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 서열 번호 17에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 구성분인, 분리된 핵산 분자.
  4. 제3항에 있어서, 서열 번호 18에 나타낸 분리된 핵산 분자.
  5. 제3항에 있어서, 서열 번호 19에 나타낸 분리된 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서, 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  7. 제1항에 있어서, 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 1 내지 1358번 nt를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  8. 제1항에 있어서, 서열 번호 2의 1702 내지 2104번 nt 및/또는 서열 번호 3의 1 내지 97번 nt 및/또는 서열 번호 3의 367 내지 1283번 nt를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열들 또는 이의 일부분들 중 어느 하나의 조합을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  10. 엄격한 조건하에서 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 17, 서열 번호 18 또는 서열 번호 19에, 또는 수탁 번호 DSM 13524 하에 기탁된 플라스미드 pBSK+LOX4A의 4.5kb PstI 단편에 하이브리드화하며, 작동적으로 결합된 뉴클레오타이드 서열의 화학적으로 유도가능하지만 상처- 또는 병원체-유도가능하지는 않는 발현을 구동할 수 있는 분리된 핵산 분자.
  11. 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 17, 서열 번호 18 또는 서열 번호 19, 또는 수탁 번호 DSM 13524 하에 기탁된 플라스미드 pBSK+LOX4A의 4.5kb PstI 단편의 50개 이상의 nt의 연속적인 신장물을 포함하며, 작동적으로 결합된 뉴클레오타이드 서열의 화학적으로 유도가능하지만 상처- 또는 병원체-유도가능하지는 않는 발현을 구동할 수 있는 분리된 핵산 분자.
  12. 제11항에 있어서, 50개 이상의 nt의 연속적인 신장물이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 17, 서열 번호 18 또는 서열 번호 19, 또는 수탁 번호 DSM 13524 하에 기탁된 플라스미드 pBSK+LOX4A의 4.5kb PstI 단편의 50개 이상의 nt의 연속적인 신장물과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 분리된 핵산 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 유도제가 BTH(벤조(1,2,3)티아디아졸-7-카보티오산 S-메틸 에스테르), INA(2,6-디클로로이소니코틴산) 및 프로베나졸로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 분리된 핵산 분자.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 유도제가 자스몬산인 분리된 핵산 분자.
  15. 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합된 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 분자.
  16. 제15항에 있어서, 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열이 폴리펩타이드 암호화 서열인 재조합 핵산 분자.
  17. 제16항에 있어서, 암호화 서열이 이의 5'-말단에서 서열 번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 암호화 서열이 목적하는 표현형 형질을 암호화하는 재조합 핵산 분자.
  19. 제16항에 있어서, 암호화 서열이 안티센스 배향으로 존재하는 재조합 핵산 분자.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 분리된 핵산 분자 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 핵산 발현 벡터.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 분리된 핵산 분자 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산 분자를 사용하여 안정하게 형질전환시킨 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 식물 세포인 숙주 세포.
  23. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 분리된 핵산 분자 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산 분자를 사용하여 안정하게 형질전환시킨 식물 및 이의 자손.
  24. 제23항에 있어서, 옥수수, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디, 벼, 보리, 대두, 면화, 담배, 사탕무 및 평지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 식물.
  25. 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열을 발현시키기 위한 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자의 용도.
  26. 분리된 핵산 분자가, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 17, 서열 번호 18 또는 서열 번호 19의 15개 이상의 뉴클레오타이드의 연속적인 신장물인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 하나 이상을 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 생성됨을 특징으로 하는, 제1항에 따른 분리된 핵산 분자의 생성 방법.
  27. 연결된 단백질을 색소체로 표적화시킬 수 있는 서열 번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  28. 제27항에 있어서, 서열 번호 4에 나타낸 분리된 핵산 분자.
  29. 엄격한 조건하에서 서열 번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 분리된 핵산 분자.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 펩타이드.
  31. 제28항의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 펩타이드.
  32. 연결된 관심 대상의 단백질을 색소체로 표적화시키기 위한 제30항 또는 제31항에 따른 펩타이드의 용도.
  33. 엄격한 조건하에서 서열 번호 5에 하이브리드화하고, 이로부터 암호화된 단백질이 서열 번호 7에 나타낸 아미노산 서열과 65% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며, 리폭시게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는, 분리된 핵산 분자.
  34. 제33항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 7에 나타낸 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  35. 제33항 또는 제34항에 따른 분리된 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 단백질.
  36. 제34항에 따른 분리된 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는단백질.
  37. 진균성 마이코톡신을 억제하기 위한 제35항 또는 제36항에 따른 단백질의 용도.
  38. 식물을 제33항 또는 제34항에 따른 핵산 분자로 형질전환시키고 리폭시게나제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 발현시킴으로써, 식물에서 진균성 마이코톡신을 억제하는 방법.
  39. 제27항 내지 제29항 또는 제33항 또는 제34항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 분자.
  40. 제39항에 따른 재조합 핵산 분자를 사용하여 안정하게 형질전환시킨 숙주 세포.
  41. 제40항에 있어서, 식물 세포인 숙주 세포.
  42. 제39항에 따른 재조합 핵산 분자를 사용하여 안정하게 형질전환시킨 식물 또는 이의 자손.
  43. 제42항에 있어서, 옥수수, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디, 벼, 보리, 대두, 면화, 담배, 사탕무 및 평지로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물.
  44. 제43항에 따른 식물 또는 이의 자손의 종자.
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