CN108410869B

CN108410869B - 栽培茄果肉特异表达启动子

Info

Publication number: CN108410869B
Application number: CN201810136913.4A
Authority: CN
Inventors: 张彦杰; 邢明慧; 黄进勇; 唐培培; 李万枰; 李昀轩
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2038-02-09
Also published as: CN108410869A

Abstract

本发明公开了栽培茄果肉特异表达启动子，其为栽培茄植物脂氧合酶基因(Lox8)的启动子，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，还构建含有该启动子驱动GUS表达的重组表达载体，然后通过农杆菌介导的方法导入栽培茄，对获得的转基因栽培茄进行RT‑qPCR和GUS活性分析表明该启动子可以驱动GUS基因在栽培茄果肉中特异表达。该启动子可以作为驱动目标基因在果肉中特异高效表达的工具，为栽培茄果肉的品质改良和分子育种提供了一个有力的工具。因此，该启动子的获得，具有重要理论和应用价值。

Description

栽培茄果肉特异表达启动子

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及栽培茄植物脂氧合酶基因(Lox8)启动子及其在栽培茄果肉中特异表达的应用。

背景技术

茄子(Solanum melongenaL.)是我国餐桌上极为常见的蔬菜，果皮花青素含量丰富，营养价值高，其根具有一定的药用价值。由于栽培茄主要的食用部位是幼嫩时期的果肉，因此针对栽培茄这一组织部位的营养物质改良的研究具有重要的理论意义和实际应用价值。常规育种方法虽然在栽培茄种质改良上发挥了一定作用，但是选育年限过长及针对性差等问题，使其难以在幼嫩果肉改良上获得突破。

近年来，随着基因工程的迅速发展和转基因技术的日益完善，基因工程技术在培育优良作物品种方面显示了极大的潜力。基因工程技术势必会越来越广泛的应用于栽培茄品种的改良和育种当中。

发明内容

有鉴于此，一方面，本发明提供如下技术方案：

栽培茄植物脂氧合酶基因(Lox8)的启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

另一方面，本发明提供了含所述启动子的重组表达载体，如，所述重组表达载体是在pBI121载体的ClaI和BamH I酶切位点之间连入如SEQ IDNo.3所示核苷酸序列构建而成，即栽培茄果肉特异表达基因(Lox8)的启动子置换植物表达载体pBI121上的CaMV35S启动子。

另一方面，本发明提供了含所述重组表达载体的微生物转化体，其可以农杆菌为受体而转化得到。农杆菌可为LBA4404。

另一方面，本发明提供了SEQ ID No.3所示基因、所述重组表达载体、所述微生物转化体，用于基因工程育种的用途。

任选地，所述用途为促进目标基因在栽培茄果肉中的特异性表达。所述目标基因可以是包含GUS基因在内的功能基因或其他核酸序列。

任选地，所述SEQ ID No.3所示核酸序列是作为栽培茄果肉特异表达启动子，如植物脂氧合酶基因(LOX8)的启动子而应用的。

再一方面，本发明提供了培育果肉特异性表达目标基因，如GUS基因的栽培茄的方法，包括，使用SEQ IDNo.3所示DNA、前述重组表达载体，或者前述微生物转化体。

前述本发明任一方面中，栽培茄品种均可为Solanum melongenavar.insanum或Solanum melongena L.cv.Sanyueqie。

本发明的有益效果在于：本发明获得了栽培茄植物脂氧合酶基因(Lox8)的启动子，并构建栽培茄植物脂氧合酶基因(Lox8)的启动子重组表达载体，将该载体转入栽培茄后所得转基因栽培茄阳性植株果肉中GUS基因较叶片、花瓣等组织有极显著的表达，且其果肉经GUS组织化学染色后呈现深蓝色；与传统育种方法相比，本发明采用基因工程技术，获得特异启动子驱动GUS表达的转基因株系，深入研究该启动子的转录活性，以筛选到能够驱动目标基因在栽培茄果实特异表达的启动子，该研究的开展对栽培茄的遗传改造有重要的价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为栽培茄Lox8的启动子PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析图，其中M为DNA分子量标准(Marker)。

图2为Lox8p-GUS载体构建示意图。

图3为PCR检测NPTII报告基因在转基因栽培茄植株中的表达(M为Marker，CK-为阴性对照，CK+为阳性对照，CK-为空白对照，1-4#为转基因栽培茄植株)。

图4为Lox8的启动子驱动GUS基因在转基因栽培茄阳性植株中的表达量(RT为根，ML为成叶，YL为嫩叶，PT为花瓣，SP为萼片，F为果肉)。

图5为转基因栽培茄子与野生型对照组不同组织的GUS组织化学染色结果。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明进行详细的描述。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例中使用的栽培茄品种为“Solanum melongena L.cv sanyueqie”。pBI121载体、大肠杆菌DH5α、含有游动质粒pRK2013的大肠杆菌“协助”菌(简称helper)和根癌农杆菌LBA4404为本领域常用材料；限制性内切酶为Thermo Scientific公司产品、RNA提取试剂盒为Invitrogen公司产品、PMD^TM19-T载体、连接试剂盒DNA Ligation KitVer.2.0(T4DNA连接酶/SolutionI)、Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒为TIANGEN公司产品；GUS染色试剂盒为北京华越洋产品；荧光定量试剂盒为Roche公司产品。

一、获得栽培茄(三月茄)Lox8基因的启动子序列

根据Eggplant Genome DataBase中栽培茄(Solanum melongena L)植物脂氧合酶基因(Sme2.5_05147.1_g00002.1)设计克隆Lox8启动子的引物，分别为Lox8p-F和Lox8p-R，引物序列如下：

Lox8p-F：5'-aattgagtttaggcaaatccc-3'(SEQ ID No.1)；

Lox8p-R：5'-tgttttggtctctaaggagt-3'(SEQ ID No.2)；

提取栽培茄(三月茄)嫩叶基因组DNA，以其为模板，分别以SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2为引物，扩增Lox8的启动子序列，PCR反应体系为：ddH₂O 16.5μL、10×PCRBuffer 2.5μL、25mM MgCl₂2.5μL、dNTP(10μM)1.0μL、100μM的上、下游引物各0.5μL、cDNA模板1.0μL、TaqDNA聚合酶0.5μL，共25μL；PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共35个循环；最后72℃后延伸10分钟。将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示。结果显示，扩增获得约2000bp的目的条带，然后将扩增产物采用DNA纯化试剂盒进行回收纯化，将纯化的Lox8启动子全长片段与PMD^TM19-T载体连接，获得重组质粒PMD^TM19T::Lox8p。测序结果显示，Lox8启动子全长为1922bp，核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

二、构建Lox8基因启动子驱动标签基因GUS的重组表达载体

根据pBI121载体的多克隆位点和Lox8启动子的核苷酸序列，设计构建重组表达载体的引物，具体为：

Lox8p-oF：5'-cggcatcgataattgagtttaggcaaatccc-3'(SEQ ID No.4)。

Lox8p-oR：5'-acgtggatcctgttttggtctctaaggagt-3'(SEQ ID No.5)。

以重组质粒PMD^TM19-T::Lox8p为模板，以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为引物，进行PCR扩增，PCR反应体系为：ddH₂O 16μL、10×PrimeSTARBuffer(含MgCl₂)2.5μL、dNTP(2.5μM)4.0μL、上下游引物各0.5μL、质粒模板1.0μL、PrimeSTARHS DNA聚合酶0.5μL，共25μL，PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共35个循环。扩增获得两侧带BamHI和Cla I酶切位点的Lox8基因启动子；纯化后用BamHI和Cla I双酶切，再与经同样双酶切的pBI121载体在T4DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒Lox8p-GUS。

三、将重组质粒Lox8p-GUS转化农杆菌

将根癌农杆菌LBA4404在含有1.2％(w/w)琼脂、50mg/L利福平和500mg/L链霉素的YEB固体培养基上划线，28±2℃黑暗条件下培养2-2.5天至长出单菌落；同时分别将含有重组质粒Lox8p-GUS的大肠杆菌DH5α和含有游动质粒Prk2013的大肠杆菌在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，37±2℃条件下倒置培养14-16小时至长出单菌落；将根癌农杆菌LBA4404单菌落、含有游动质粒Prk2013的大肠杆菌单菌落和含有重组质粒Lox8p-GUS的大肠杆菌DH5α单菌落依次重叠均匀涂在含有1.2％(w/w)琼脂的YEB固体培养基(pH7.2)中央直径为1cm的圆圈中，28±2℃黑暗条件下倒置共培养24小时至长出菌团，用接种环挑取菌团适量，在含有质量分数为1.2％的琼脂、50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基(pH7.2)中划线，28±2℃黑暗条件下倒置培养2-2.5天至长出单菌落，挑取3-4个单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基(pH7.2)，在28±2℃、黑暗、200rpm条件下摇床培养1.5天至菌液均匀且OD₆₀₀为1.8-2.0，提取重组质粒，用Sac I和Xba I进行双酶切鉴定，阳性重组子即为Lox8p-GUS农杆菌工程菌株，-80℃冻存备用。

四、农杆菌介导的表达载体转化三月茄

将含有Lox8p-GUS的农杆菌工程菌株接种于含有质量分数为1.2％的琼脂、50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB固体培养基上，在28±2℃黑暗条件下活化2-3天至长出单菌落，挑取单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB液体培养基20mL，在28±2℃、200rpm条件下扩大培养1.5天，再将所得菌液按体积比为1:100接入含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB液体培养基中，在28±2℃、200rpm条件下扩大培养至OD₆₀₀为1.8～2.0，然后28±2℃离心弃上清，菌体用新鲜的YEB液体培养基洗涤，再用含有质量分数为3％的蔗糖、pH为5.8的MS培养基100mL重悬，制得农杆菌工程菌液。

用体积分数为75％的酒精浸泡三月茄种子2min，无菌水冲洗3次；灭过菌的饱和Na₃PO₄浸泡种子20min，并不时剧烈振荡，无菌水冲洗3次；1％(V/V)的NaClO水溶液浸泡种子10min，无菌水冲洗7次；无菌水浸泡种子4h，播种在MS固体培养基上，光照培养箱26℃(16h光照)/18℃(8h黑暗)培养直至子叶展平，切取已展平的子叶即得栽培茄外植体。将栽培茄外植体的子叶切下，在MS液体培养基中浸泡1h，滤纸吸干残留液体培养基并放置在质量分数为3％的蔗糖、质量分数为0.8％的琼脂、1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、pH为5.8的MS固体培养基中，26℃(16h光照)/18℃(8h黑暗)预培养1d后置于农杆菌工程菌液中浸染15分钟后，放回质量分数为3％的蔗糖、质量分数为0.8％的琼脂、1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2℃黑暗条件下共培养48小时，再转入含有质量分数为3％的蔗糖、质量分数为0.8％的琼脂、1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、500mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2℃、光周期16h/d、光照强度1000-2000Lux条件下培养至长出愈伤组织及抗性芽；将长2-3cm的抗性芽切下，转入含有质量分数为3％的蔗糖、质量分数为0.8％的琼脂、250mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2℃、光周期16h/d、光照强度1000-2000Lux条件下培养至生根，即得转基因三月茄植株。

五、转基因三月茄阳性植株的筛选

1.PCR检测NPTII报告基因在转基因栽培茄植株中的表达

根据载体Lox8p-GUS中的NPTII报告基因序列，设计如下特异检测引物：

NPTII-F：5'-gacaatcggctgctctga-3'(SEQ ID No.6)；

NPTII-R：5'-aactccagcatgagatcc-3'(SEQ ID No.7)。

分别取转基因三月茄植株和野生型三月茄植株，提取基因组DNA，再以所得基因组DNA为模板、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示序列为引物进行PCR扩增，检测NPTII报告基因在转基因三月茄植株和野生型三月茄植株中的表达。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果如图3所示，阳性转基因三月茄植株的PCR产物在900bp位置出现目标DNA条带，经测序证明与NPTII报告基因片段序列一致，证实这些植株为转基因三月茄阳性植株。

2.qPCR检测Lox8启动子驱动GUS基因在转基因三月茄阳性植株中的表达

根据栽培茄Lox8启动子序列和栽培茄内参基因CAC序列，设计如下引物：

qSmGUS-F：5'-tggcagtgaagggcgaacagt-3'(SEQ ID No.8)；

qSmGUS-R：5'-tcagcgtaagggtaatgcgaggt-3'(SEQ ID No.9)；

qSmCAC-F：5'-cctgatctgaagttgggcttaaatg-3'(SEQ ID No.10)；

qSmCAC–R：5'-tggtggaaagtaacatcatcgagc-3'(SEQ ID No.11)。

分别取转基因三月茄阳性植株和非转基因三月茄植株的幼叶，提取总RNA，将其反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以qSmGUS-F和qSmGUS-R，qSmCAC-F和qSmCAC-R为引物进行qPCR，检测GUS基因在转基因三月茄阳性植株各个组织中的表达量，结果如图4所示，转基因三月茄阳性植株果肉中GUS基因有极显著的表达，极显著地高于嫩叶、成叶、花瓣。

六、转基因三月茄阳性植株不同组织的GUS蛋白表达活性分析

将上述筛选出的转基因三月茄阳性植株和野生型植株不同组织进行GUS组织化学染色，将三月茄叶片、根、萼片、花瓣、果肉浸泡在GUS染色液中，于37℃保温1小时至过夜。再将叶片等绿色组织转入70％乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。肉眼观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点(附图以黑白图展示时，蓝色点越多的材料颜色越深)，观察分析转基因三月茄阳性植株不同组织的染色结果，结果如图5所示。

由图5可知，转基因阳性三月茄果肉被染成深蓝色，颜色加深程度，比嫩叶、成叶、花瓣等组织都极显著，与前面RT-qPCR结果相一致。由以上结果可知，该转基因栽培茄果肉特异启动子的获得，将对未来的栽培茄的果肉的品质改良奠定了重要基础。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明的实质精神和范围。

序列表

<110> 郑州大学

<120> 栽培茄果肉特异表达启动子

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aattgagttt aggcaaatcc c 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgttttggtc tctaaggagt 20

<210> 3

<211> 1922

<212> DNA

<213> 三月茄(Solanum melongena L.cv sanyueqie)

<400> 3

aattgagttt aggcaaatcc ccttgaggga aggcaaacct cagtgctgag tttaggcgaa 60

tatcatacaa cgggcaaacc ttaatgagga cgttgagtcc ataaagagag tatatgtatc 120

aactcatctt aagatgagaa gtctcatatc ggtaaaacac atgagagata ttgggtgtat 180

aagtaaacat gtcttaccta ctagtgacac attttaaagt tgtgtcagtc taggccaaaa 240

acggacaata tcactagcgg attgtactgt tacaagtttt cctagtcact tatattaata 300

tttgtttcgt cccatttata tgaaactttt ttctttttag tccatctaaa aaatatatgt 360

tatatagaaa taatttaatt ttaaaattct ttttttacat ttaatgaaat gattttcaat 420

catacaaata tctaaaaatt atttcagacc acaaggttca aaagtctttc tttttttttt 480

gataaatagg gtcacataaa ataagacaaa aagagtgtgt ttagaaaagt aatatgcaat 540

ctattttaat tagtatattg tgcttgttta atttcgagtg tcccaagttt ttgatagtac 600

tttttaatta ttataattgt tgttgttgtt gttgttttat aaaaaataaa atttcaagac 660

aaaatttact aaagtcaaat ctataaatag tattttggct ctgcccttga tttgaatgag 720

ctcaattttt tacgtgtcat atttaagatc acaaattaaa aaatattttg ttatatttaa 780

tataatttta atttagaact ataaaagtaa aaatattttt ttattattta aaatttttat 840

atcaaattaa attagatcat ttttcaaaaa cgaagtatca ctcttgtgtt ttttttttct 900

ttagaaaaaa catgatctct ctttcccata gctaaacctt ccaaaattgc ctatcattgg 960

accacaaatt aaataattag tccctcccaa actcaaagtt taatcaatca atcaattcgt 1020

tgaaagaatg aatccatcta aatattgtag tgtagatgat atattgtcca ccctaacaaa 1080

caattattgt tcttttaaaa atttatttaa tatatatata tataaattac aatttaaaag 1140

acaaatgtaa ttcaagaaga ctaaaatttt gaaattccaa agttcaaatt ttaaattcac 1200

ctttaaattt atagcagaat ttctgaatat aaaatcgatc caaaacttat gaatgtatat 1260

gcaatctaaa ttggtggtag ctaccatcta gatttttatg tttgtcaatt tatcatttgt 1320

atatcgtatt tgtttaatgt caagtgccac aagtttttaa taggtatatc atacttgttc 1380

aatttcgagt atcacaagtt tttgataaca ttgttgttat ttttattgtt attactgtta 1440

ttattttata ttaaaaatac aaatataaat caaagttatt gaattttgtc gaactataaa 1500

taatattgtg gctctgccct tggtacggat gagctcaaaa gcttttgatt agatcttgta 1560

ttagcattag aaaattcatt ataaatatgc acacttaata ataaactgtg aaattcagtg 1620

taataatcca tcttgtaacg agaagtcaca catcaacaaa atacagaaga tatgttagat 1680

atataagtaa acaaacctaa ttacctatta ttgacacatt ttaaagtcgt gcgagcctcg 1740

gaataatatc gctagcagac taggtcgtta cattcagtag ctaaatgaga ctcataaact 1800

tcaaatttat ccgataaata tccatgaaga aagttatact tgacaaagac atagccaaaa 1860

gaaaagcaaa aagaacaaaa cttcatcatc tatataaaga gaactcctta gagaccaaaa 1920

ca 1922

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggcatcgat aattgagttt aggcaaatcc c 31

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgtggatcc tgttttggtc tctaaggagt 30

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacaatcggc tgctctga 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aactccagca tgagatcc 18

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggcagtgaa gggcgaacag t 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcagcgtaag ggtaatgcga ggt 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cctgatctga agttgggctt aaatg 25

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggtggaaag taacatcatc gagc 24

Claims

1.SEQ ID No.3所示DNA、含其的重组表达载体或者含其的微生物转化体用于基因工程育种的用途，所述用途为促进目标基因在栽培茄果肉中的特异性表达。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述重组表达载体是在pBI121载体的Cla I和BamH I酶切位点之间连入如SEQ ID No.3所示DNA序列而构建成的。

3.如权利要求1所述的用途，其特征是，所述微生物转化体是以农杆菌为受体而转化得到。

4.如权利要求3所述的用途，其特征是，所述农杆菌为LBA4404。

5.如任一在先权利要求所述的用途，其特征是，SEQ ID No.3所示DNA序列是作为栽培茄果肉特异表达的启动子而应用的。