JPH0494687A - イネ・リポキシゲナーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、イネ・リポキシゲナーゼ遺伝子に関するもの
である。

イネ、リポキシゲナーゼは主として種子に多く存在して
おり、米を長期保存した場合の古米臭の原因はこの酵素
が脂肪酸に作用したためであると考えられている。その
ため本遺伝子を用いてアンチセンス遺伝子操作等を行な
えば本酵素を低減したイネを育種することが可能になる
。したがってこのようなイネから得た米は、品質を劣化
させることなく長期間保存できることとなり、世界の食
糧問題を解決するうえで重要な役割を果すだけでなく、
わが国においても、米の備蓄や米の輸入自由化といった
諸問題にも充分に対応できるものである。

またこれとは逆に、リポキシゲナーゼは植物の耐病性に
関与しており、リポキシゲナーゼ遺伝子を葉などで増強
させて同酵素を大量に分泌させれば耐病性が強められる
可能性があり、無農薬栽培が可能となるので、食品や環
境の農薬による汚染が防止され、本発明は無公害生物農
薬ないし公害防止技術の面でも非常に有用である。

また、本発明に係る遺伝子を微生物等で発現させること
も可能であるので、大量のりポキシゲナーゼを得ること
ができ、各種の用途に利用することができる。

例えば、植物リポキシゲナーゼは古くより小麦粉の漂白
に用いられているが、この遺伝子を用いて微生物で発現
させれば、危険な化学薬品を用いずに漂白が可能になる
のである。

このように本発明は、リポキシゲナーゼを低下させたり
あるいは逆に増加させたり、更にまたこれらの程度もコ
ントロールすることができるので、農業や食品の技術分
野のみでなく、医薬、農薬、公害防止その他の技術分野
においても重用されるものである。

（技術的背景及び問題点） リポキシゲナーゼは高等生物に広く見いだされる酵素で
あり、リノール酸、リルン酸、アラキドン酸などの１，
４〜ペンタジエン構造を有する不飽和脂肪酸に分子状酸
素を直接導入する作用を有する。

リポキシゲナーゼの生化学的性状は生物間で違いが見ら
れるものの、分子量は７万〜１ｏ万の範囲にあり、１分
子の非ヘム鉄を有する点で共通している。植物において
は大豆のりポキシゲナーゼが詳しく研究されており、３
種のりポキシゲナーゼに対応するそれぞれの遺伝子（ｃ
ＤＮＡ）が単離されている。しかし、単子葉植物ではり
ボキシゲナーゼ遺伝子の単離は全く行なわれていない。

ましてや本発明のようにイネのりポキシゲナーゼ遺伝子
の単離は全くの未知であり、　そのＤＮＡ配列の決定に
至っては示唆すらなく、本発明は全く新規な技術的解明
をはじめて果したものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、このようなイネ・リポキシゲナーゼの重要性
に鑑みてなされたものであって、遺伝子操作によってこ
の酵素のコントロールを行うという新規技術課題を設定
し、遂にその課題の解決に成功したものである。

すなわち、本発明者らは、従来知られていない上記技術
課題を新たに設定し、各方面がら研究を行い、そしてイ
ネ種子の発芽期にリポキシゲナーゼの活性が急速に上昇
してくることに着目し、この組織からの遺伝子単離につ
いて検討を重ねた結果、ｍＲＮＡの逆転写によって得ら
れるｃＤＮＡライブラリーから、リポキシゲナーゼ遺伝
子の全長をコードしているｃＤＮＡを単離することに成
功し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はイネ・リポキシゲナーゼ遺伝子（ｃ
ＤＮＡ）に関するものであり、そのＤＮＡ配列は第１図
に示される。

また１本発明はりボキシゲナーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）を
含むλファージあるいはそれより由来するプラスミドに
関し、さらには、　リポキシゲナーゼＤＮＡを含むプラ
スミドを導入した大腸菌等形質転換微生物に関するもの
である。

本発明を実施するには、先ずはじめにイネがらｍＲＮＡ
を抽出し、抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを調製す
る。ｃＤＮＡをプラスミド又はファージからなるベクタ
ーと結合し、これを宿主微生物に導入して組換え体ＤＮ
Ａを調製する。

組換え体ＤＮＡが導入された形質転換微生物は、免疫学
的方法等スクリーニングの常法にしたがって目的とする
形質転換体を選択する。得られた形質転換体から目的と
するプラスミドを単離し、これを制限酵素で切断し、必
要ある場合にはブルースクリプト等プラスミドベクター
にサブクローニングして、再度スクリーニングした後、
目的とするクローンを得る。

このクローンＤＮＡを用いて形質転換体を調製し。

これを培養することにより培養物からりボキシゲナーゼ
を大量に得ることができる。また、この形質転換体から
、アルカリ抽呂法（Ｊ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｃｌ
ｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　７．１５１３（１９７９））等
常法にしたがってプラスミドを得ることができ、このプ
ラスミドを適宜制限酵素で切断して、他のベクターに組
み込んだり、他の宿主に導入することも可能である。ま
たこのＤＮＡをプラスミドベクターの強力なプロモータ
ーの下流に連結させることによって、リポキシゲナーゼ
生産能に卓越したベクタープラスミドとすることも可能
である。

更にまた本発明によれば、本発明によってクローン化す
るのに成功したイネ・リポキシゲナーゼ遺伝子を用いて
、これをプロモーター配列と本来とは逆方向に結合して
、アンチセンス遺伝子とすることができる。このアンチ
センス遺伝子をイネ植物体に導入することによってアン
チセンスＲＮＡを発現させ、　これによりリポキシゲナ
ーゼ遺伝子の発現をコントロールすることができる。

したがって本発明によってはじめて、リポキシゲナーゼ
を生成しないイネの育種が可能となり、このイネから収
穫された米は保存しても古米臭が発生せず、長期間の保
存がはじめて可能となったのである。もちろん、各種の
アンチセンス遺伝子の作成も可能であるので、プロモー
ター配列の選択と相まって、リポキシゲナーゼ含量が異
なる各種のイネを育種することもできる。

また本発明に係るリポキシゲナーゼ遺伝子は。

ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　４８７゜２３９　（１
９８８））によってクローニングすることもできる。　
すなわち、クローン化したりポキシゲナーゼ遺伝子の塩
基配列から２つの相向かい合うプライマーＤＮＡを合成
し、イネからの粗抽呂ＤＮＡとアニーリングし、このＤ
ＮＡ配列をＤＮＡポリメラーゼによって合成をくり返し
、この特定の領域のみを高度に増幅する。

また本発明に係るアンチセンス遺伝子は、イネ・リポキ
シゲナーゼ釣り出し用ＰＣＲプライマーを用いて増幅さ
れたＤＮＡ断片を用いてクローニングすることもできる
。すなわち、植物用プロモーターの下流にこのＤＮＡ断
片を挿入し、これを用いて形質転換を行う。多数の形質
転換株から、該増幅されたＤＮＡ断片を有するクローン
を分離する。

これらのクローンに含まれるプラスミドの中から、逆向
きの塩基配列を有するプラスミドを選択し、このプラス
ミドを用いて前記にしたがってアンチセンス遺伝子を作
成すればよい。なおこの場合、目的とする逆向きプラス
ミドを釣り上げるプローブとして、本発明に係るリポキ
シゲナーゼ遺伝子のＤＮＡ断片を使用すると有利にスク
リーニングが行われる。

本発明によって調製したアンチセンス遺伝子は、プラス
ミドと結合した後、エレクトロポーレーション法等常法
にしたがってイネのプロトプラストに導入し、得られた
細胞をイネ植物体に再生すればよい。このようにして、
リポキシゲナーゼの生成しないイネを栽培したり、リポ
キシゲナーゼの生成量を自由にコントロールしたりする
ことができる。

これとは逆に、本発明に係るリポキシゲナーゼ遺伝子を
含有する形質転換体を培養することにより、培養物から
りポキシゲナーゼを分離精製することも可能である。培
養は常法によって行い、培養後、酵素が菌体内にある場
合は、菌体を分離した後これを破砕し、抽呂等によって
粗酵素液を調製し、また酵素が培地中にある場合は、培
養を分取し、抽出等によって粗酵素液を調製する。次い
で粗酵素液を、塩析、透析、イオン交換樹脂処理、クロ
マト処理等を単用ないし複用して、目的とするりボキシ
ゲナーゼを単離精製する。

得られたりポキシゲナーゼは（粗製物、培養物も同じ）
、例えば食品公害をひき起すことなく小麦の漂白等に利
用される。またこれを植物体に適用することにより、耐
病性を付与することができ、きわめて安全な一種の生物
殺菌剤、生物農薬としても利用可能である。

なお後者において、リポキシゲナーゼ遺伝子を常法にし
たがって植物体に導入せしめ、リポキシゲナーゼを発現
しうる耐病性を有する植物を育種することも可能である
ので、このような方法によっても後者と同じ効果を奏せ
しめることができる。

以下、本発明を実施例によって更に詳述する。

実施例１ （１）試薬及び材料 Ａ）試薬 ｃＤＮＡ合成キットはファルマシア社、ギガパックキッ
ト、抗体スクリーニングキット（ピコブルー）、プラス
ミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）はストラータ
ジーン社、ＤＮＡデイレ−ジョンキットはプロメガ社、
制限酵素は東洋紡から購入した。なお、　ＩＰＴＧはイ
ンプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイドの略号
である。

Ｂ）材料 イネは品種；日本晴を用いた。ウサギは（株）清水実験
材料より購入した。

（２）ウサギ抗体の作成 イネ種子の胚芽から太田らの方法（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉ
ｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　５０．３１６５−３１７１．１９８６）に
よって精製されたりボキシゲナーゼＬ−３の５００μｇ
を２羽のウサギにそれぞれ注射して、さらに２週間後に
同量を注射して抗体を作成した。

（３）　ｃＤＮＡライブラリーの作成 イネを暗所で３日間発芽させて、その全体からＲＮＡを
グアニジュウム塩を用いて単離した。　さらにこのＲＮ
ＡからオリゴｄＴカラムを用いてポリ（Ａ）ＲＮＡを調
製した。このＲＮＡ５μｇからファルマシア社のｃＤＮ
Ａ合成キットを用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮ
Ａに同キットを用いてＥｃｏＲＩアダプターを付加し、
　　ＥｃｏＲＩ消化したλｇｔｌｌベクターとライゲー
ションさせた。これをストラータ社のギガパックゴール
ドを用いてパッケージングした。得られた組換体ファー
ジは大腸菌に感染させＬＢ培地上で増殖させた。これを
ｃＤＮＡライブラリーとして以降の実験に用いた。

（４）　ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングｃＤＮ
Ａライブラリーに含まれる約４０万の組換体を大腸菌に
感染させた後、ＬＢ培地にブレーティングし、４２°Ｃ
で３時間培養したのちＩＰＴＧを含むニトロセルロース
フィルターを培地上にかぶせ、３７℃で３時間培養した
。このフィルターを取り出し牛血清アルブミンでブロッ
キングしたのち、イネ・リポキシゲナーゼＬ−３に対す
る抗体と反応させた。

これを抗体スクリーニングキットを用いてリポキシゲナ
ーゼ抗体に反応するクローンを同定した。

このようなりローンを単離し、２次、３次のスクリーニ
ングを行なって、単一のクローンのみからなる５種のク
ローンを得た。ウェスタン分析よりスクリーニングに用
いた抗体はりポキシゲナーゼ以外にも他のポリペプチド
と反応することが判明したため、エピトープセレクショ
ン法により５種のクローンの内、２種をリポキシゲナー
ゼのクローンとして同定した。これらをλＲＬ３３およ
びλＲＬ３２と命名した。

これらをＥｃｏＲＩで消化して、　プラスミドベクター
であるブルースクリプトにサブクローニングし、それぞ
れｐＲＬ３３．　ｐＲＬ３２と命名した。これらの制限
酵素地図を作成したところｐＲＬ３３が約２００ｂｐ長
いが、同じ遺伝子に由来するものであることが判明した
。

これらはりボキシゲナーゼ遺伝子の全長をコードしてい
なかったので、ｐＲＬ３２の５′末端にある５ａＱＩ断
片を用いてライブラリーを再度スクリーニングして４０
個のポジティブクローンを単離した。

そのなかで　λＲＬＣＩＩと命名したクローンは全長を
コードしていたため、以降はこのクローンを解析した。

（５）イネ・リポキシゲナーゼ遺伝子の塩基配列の決定 λＲＬＣＩＩをＥｃｏＲＩ消化してブルースクリプトに
サブクローニングしてｐＲＬｃｌｌと命名した。ｐＲＬ
ｃｌｌを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換
体は微工研にＦＥＲＮ　Ｐ−１１６３５として寄託した
。この形質転換体を大量培養し、得られたｐＲＬｃｌｌ
をＤＮＡデイレ−ジョンキットを用いて長さが約２００
ｂｐずつ異なるクローンを得た。これらから１本鎖ＤＮ
Ａを調製して、その塩基配列をジデオキシ法で決定した
。これらのうち一部は一本鎖ＤＮＡの調製が困難であっ
たため２本鎖ＤＮＡをテンプレートとして塩基配列の決
定を行なった。

得られた塩基配列及びアミノ酸配列（一部）を第１図に
示した。

また、得られたＰＲＬＣＩＩを下記の方法で発現ベクタ
ーと接続し、得られたクローンで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）を形質転換し、これを微工研にＦＥＲＭ　Ｐ−１１
６３６として寄託した。

方法： イネ・リポキシゲナーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）　（ｐＲＬ
ｃｌｌ）を制限酵素ＡｓｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化して
からＫｌｅｎｏｗを用いてフィルイン反応を行い、１％
アガロースゲル電気泳動でこの断片を単離した。これを
ＢａｍＨＩで消化してからフィルインした発現ベクター
　ｐＥＴ３ａとライゲーションさせた。これを用いて大
腸菌Ｈ８１０１株を形質転換させ、リポキシゲナーゼ遺
伝子がＴ７プロモーターの下流に５′→３′の方向に入
っているものを選択した。このクローンをρＥＴ３ａ／
ＲＬＯＸ２と命名した。このクローンＤＮＡを用いて大
腸菌ＢＬ２１　（ＤＥ３）株を形質転換した。このクロ
ーン（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１６３６，以下クローンと呼ぶ
）を以下に用いた。

大腸菌の培養： クローンを３−の５０μｇ／ｍＱのアンピシリンを含む
ＬＢ培地に接種し３７℃で一晩培養した。この１ｍＱを
５０ｍＱの培地に加え６００ｎｍでのＯＤが１．０に達
するまで培養した。これに０．４ｍｇ／ｍＱとなるよう
にＩＰＴＧ　（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノサイド）を加え、１５℃で１６時間培養を続けた。

この培養液から大腸菌を回収し、破壊し、上清液につい
てリポキシゲナーゼ活性をリノール酸を基質として酸素
電極法によって測定したところ、培養液１ｍＱあたりの
力価は、１４．４の結果が得られた。

（発明の効果） 本発明によってはじめてイネ・リポキシゲナーゼ遺伝子
の構造が解明された。

したがって本遺伝子を植物体において増強せしめること
により、本酵素が本来有している耐病性を植物体に付与
することができ、無農薬栽培が可能となる。したがって
このような植物を育種すれば、農薬公害が回避でき、農
薬散布に要するコストも軽減できる。

また、本遺伝子を微生物等で発現させることによって本
酵素を大量生産することができるので、得られた酵素を
小麦粉の漂白等の各種用途に有利に利用することができ
る。

更にまた注目すべきことに、本発明によればイネ・リポ
キシゲナーゼについてアンチセンス遺伝子を作成するこ
とが可能となった点である。このアンチセンス遺伝子を
用いてイネについて遺伝子操作を行えば、本酵素を低減
ないしは消滅せしめたイネを育種することが可能となり
、その結果得られた米は古米臭がなく長期保存が可能と
なる。

したがって本発明は米に関する諸問題を解決するうえで
も重要な役割を果すものと大いに期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図はイネ・リポキシゲナーゼ遺伝子の塩基配列とア
ミノ酸配列を図示したものである。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 ヴ浣 鞄コ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）イネ・リポキシゲナーゼ遺伝子。
2. （２）第１図に示す塩基配列及びアミノ酸配列を含む、
   イネ・リポキシゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ。
3. （３）イネ・リポキシゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡとベ
   クター断片とを結合させてなるファージ及び／又はプラ
   スミド。
4. （４）請求項３に記載のファージ又はプラスミドを宿主
   微生物に導入してなる形質転換微生物。
5. （５）形質転換微生物がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
   ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求
   項４に記載の形質転換微生物。
6. （６）第１図に示すＤＮＡ配列を切断したＤＮＡ断片か
   らなる、イネ・リポキシゲナーゼ遺伝子釣り出し用プロ
   ーブ。
7. （７）第１図に示すＤＮＡ配列を含む、アンチセンスイ
   ネ・リポキシゲナーゼ遺伝子構築用ＤＮＡ。