FR2825580A1 - Sur-expression d'une lipoxygenase dans les plantes et diminution de la sensibilite des plantes aux maladies et aux agressions par des organismes pathogenes - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des procédés pour diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux agressions par des organismes pathogènes. Les procédés selon l'invention consistent à sur-exprimer une lipoxygénase inductible dans les plantes afin d'améliorer leur réponse aux maladies et aux pathogènes. L'invention a également pour objet des cassettes d'expression pour la sur-expression des lipoxygénases dans les plantes ainsi que des plantes transformées.

Description

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Sur-expression d'une lipoxygénase dans les plantes et diminution de la sensibilité des plantes aux maladies et aux agressions par des organismes pathogènes
La présente invention concerne des procédés pour diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux attaques par des organismes pathogènes. Les procédés selon l'invention consistent à sur-exprimer une lipoxygénase dans les plantes pour diminuer leur sensibilité aux maladies et aux agressions. L'invention a également pour objet des cassettes d'expression, des vecteurs et des plantes transformées mis en oeuvre dans les procédés selon l'invention.

Les lipoxygénases (LOXs) sont des enzymes ubiquitaires chez les plantes supérieures et les mammifères. Elles catalysent la dioxygénation d'acides gras polyinsaturés contenant un motif (Z, Z) -1, 4-pentadiène. Chez les végétaux, les substrats de l'enzyme sont l'acide linoléique (C 18 : 2) et linolénique (Cl 8 : 3), deux constituants majeurs des membranes cellulaires. Ces acides gras polyinsaturés sont généralement complexés sous forme de phosphoglycérolipides membranaires et ne sont accessibles aux LOXs qu'après action d'une phospholipase de type A2 ou d'acyl hydrolases lipolytiques. Des travaux récents suggèrent cependant que certaines LOXs pourraient, dans certaines circonstances, oxyder des acides gras estérifiés et des lipides membranaires (1-4). L'acide arachidonique, qui n'est pas détectable chez les végétaux, mais fait partie des constituants membranaires chez les Oomycètes, est également un substrat pour les LOXs végétales (5).

Les LOXs sont classées selon la position du carbone sur lequel est inséré préférentiellement l'oxygène moléculaire. Chez les végétaux, on distingue des 13-LOXs et des 9-LOXs ; une même enzyme peut cependant utiliser l'une ou l'autre position, indifféremment ou bien avec une préférence pour une position. Cette spécificité peut être modifiée en fonction des conditions de pH et de concentration en 02 du milieu (4). La spécificité de position d'une LOX n'est pas directement prévisible d'après sa séquence primaire, même si certains éléments structuraux reliés à cette propriété sont maintenant connus (6,7).

Les produits formés dans la réaction sont des hydroperoxydes d'acides gras, très réactifs et susceptibles de causer, via des réactions radicalaires, la dégradation des constituants majeurs de la cellule (lipides, protéines, acides nucléiques) (8). Les hydroperoxydes d'acides gras sont rapidement convertis en une série de composés possédant des activités biologiques diverses. Tous les produits dérivés d'acides gras polyinsaturés via une oxygénation sont collectivement nommés oxylipines.

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Les LOXs de plantes ont été associées à des processus physiologiques variés, sur la base de profils d'expression des gènes et d'activité enzymatique. Ainsi, il a été proposé que des LOXs soient impliquées dans la régulation de la maturation des graines, de la germination, de la maturation des fruits, de la sénescence des feuilles et des fleurs. La participation précise des LOXs à ces processus reste cependant à déterminer. Un rôle important est également attribué aux LOXs dans les réponses aux stress, en particulier la blessure, et les attaques parasitaires (4,5, 9). Une forte induction de l'expression de gènes LOX est ainsi mesurée dans de nombreuses plantes monocotylédones ou dicotylédones lors de leur interaction avec des bactéries, des virus ou des champignons, ainsi qu'après blessure mécanique ou causée par des insectes sur les feuilles.

Cette diversité dans les fonctions biologiques pourrait être assurée du fait de la présence de différentes isoenzymes, présentant des mécanismes de régulation ainsi que des localisations tissulaires et subcellulaires très variés, selon les espèces et les isoformes considérées (5). A cela s'ajoute la diversité des oxylipines générées à partir des produits de la LOX, qui est modulée en fonction du type d'hydroperoxyde formé et de la nature des enzymes qui les métabolisent.

Les hydroperoxydes d'acides gras générés par la LOX sont en effet convertis suivant plusieurs voies enzymatiques distinctes (4). La voie de l'hydroperoxyde lyase (HPL) catalyse le clivage de 13-ou 9-hydroperoxydes d'acides gras pour aboutir à la synthèse d'aldéhydes volatils en C6 ou en C9 et d'acides à chaîne courte, en Cl 2-ou en C9, comme

l'acide 12-oxo-trans-9-dodécénoïque, précurseur de l'acide traumatique. Les aldéhydes en C6 jouent un rôle important dans la fragrance des plantes mais certains comme le trans-2- hexenal ont aussi des propriétés anti-microbiennes (10). Récemment, il a été montré que le trans-2-hexenal pouvait aussi agir comme molécule-signal permettant l'activation de gènes de défense (11). L'acide traumatique appelé aussi hormone de blessure aurait un rôle dans la cicatrisation des tissus en favorisant les divisions cellulaires aux sites de blessures (5).

Une deuxième voie enzymatique impliquée dans la métabolisation des hydroperoxydes d'acides gras produits par la LOX concerne l'allène oxyde synthase (AOS). Cette enzyme catalyse la déshydratation de l'acide 13-hydroperoxylinolénique et forme un allène oxyde qui est le précurseur de l'acide jasmonique. L'acide jasmonique est une molécule-clé des mécanismes de signalisation de la plante permettant l'activation de nombreux gènes de défense (12) parmi lesquels les gènes codant pour des inhibiteurs de protéases, actifs contre les insectes, et aussi de nombreuses protéines PR (chitinase, défensine, thionine, glucanase).

Le rôle des jasmonates comme molécule-signal a été récemment souligné par diverses

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expériences montrant que des mutants dacM ou de tomate affectés dans la biosynthèse de ces molécules ou leur perception, présentaient une déficience dans l'induction de gènes de défense (13), une plus grande sensibilité à des organismes normalement non-pathogènes pour les plantes sauvages (14) ou une résistance réduite contre des insectes (15). Une troisième voie enzymatique de conversion des hydroperoxydes concerne la formation de divinylethers d'acides gras. Ces composés, qui peuvent être formés à partir de 13-ou de 9-hydroperoxydes ont été isolés de divers végétaux. La première divinylether synthase (DES) a été récemment clonée chez la tomate (16). Les divinylether d'acides gras produits à partir de 9-hydroperoxydes, l'acide colnéléique et l'acide colnélénique, présentent des propriétés antifongiques, notamment vis-à-vis de

Phytophthora infestans (17). y
D'autres modifications des produits de la réaction catalysée par la LOX concernent des époxydations par des époxygenases et peroxygénases. Cette voie métabolique permet la synthèse de molécules à activité antimicrobienne et pourrait intervenir dans la synthèse de monomères de cutine qui outre leur fonction structurale peuvent aussi induire l'activité de gènes de défense (18).

Les hydroperoxydes d'acides gras produits par la LOX peuvent enfin générer la formation de radicaux libres intervenant dans des mécanismes de dégradation des membranes liés à la mort cellulaire (5).

L'ensemble de ces données montre donc que l'activité initiale de la LOX est essentielle pour la synthèse d'un ensemble de molécules, dont certaines présentent des activités antimicrobiennes ou sont impliquées dans la signalisation conduisant à la défense.

L'activité LOX augmente notablement chez le tabac en réponse à des éliciteurs (19, 20). L'isolement d'un clone d'ADN complémentaire de LOX, nommé pTL-J2 (21), a permis la caractérisation du gène de tabac correspondant, appelé LOXI. Des expériences d'hybridation ADN/ARN (hybridation de type northern) ont montré que LOXI, s'exprime dans des cellules de tabac en culture consécutivement à l'application d'éliciteur et dans des plantes de tabac inoculées par l'oomycète Phytophthora parasitica nicotianae, Ppn (22).

Les transcrits correspondant à ce gène ne sont pas détectables chez des plantes saines ou des cellules non traitées. Une étude biochimique montre que in vitro la LOX de cellules de tabac élicitées permet la production de 9-et 13-hydroperoxydes d'acide gras avec une insertion préférentielle de l'oxygène moléculaire en position 9 (20).

Consécutivement à l'inoculation racinaire de tabac par Ppn, une forte induction de l'expression du gène est mesurée. Dans le cas d'une interaction incompatible (plante

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résistante/race du microorganisme avirulente), on mesure une induction précoce de l'activité du gène, avec un maximum d'accumulation de transcrits à 24 heures (22). L'induction du gène est plus tardive et de plus faible amplitude dans le cas d'une interaction compatible (plante sensible/race virulente), comme cela a également été observé dans d'autres modèles de type gène-pour-gène, comme les interactions entre la tomate et Pseudomonas syringae (23), le riz et Magnaporthe grisea (24), et la pomme de terre et Phytophthora infestans (25).

L'expression du gène LOXI n'est pas détectée dans les tissus des plantes de tabac saines à l'exception des plantes en floraison pour lesquelles des transcrits LOX sont détectés en faible quantité dans les pétales et les sépales, et des jeunes germinations (22,26). Dans ce dernier cas, une expression transitoire du gène LOXI est détectée entre les deuxième et quatrième jours après le début de la germination.

Villalba et collaborateurs (27) ont montré qu'une glycoprotéine élicitrice isolée de parois de Ppn, appelée CBEL pour Cellulose Binding Elicitor Lectin, induit le gène LOX1 lorsqu'elle est infiltrée dans le mésophylle foliaire de plantes de tabac. Les transcrits LOXI apparaissent lors des premières quatre heures suivant l'infiltration et leur niveau est maximum à 12 heures. Un polysaccharide issu d'algues marines, le À-carraghénane, est également inducteur du gène LOX1 lorsqu'il est appliqué à des plantes de tabac par infiltration dans le mésophylle foliaire (28).

Dans des cellules de tabac, l'expression du gène LOXI est détectée consécutivement à des traitements éliciteurs. Dans le cas d'éliciteur de Ppn (extrait de parois), une induction de l'expression du gène LOXI est détectée dans les deux premières heures après traitement, avec un maximum d'accumulation à 24 heures (22). La cryptogéine, un peptide éliciteur de Phytophthora cryptogea, oomycète pour lequel le tabac n'est pas un hôte ainsi que l'endopolygalacturonase de Colletotrichum lindemuthianum permettent aussi l'induction du gène LOXI (26). Il a été montré par ailleurs que l'induction du gène LOX1 était plus précoce que celle de gènes de défense comme ceux codant les protéines PR qui sont les chitinases et Il-3 glucanases, suggérant le rôle potentiel de la voie de la LOX dans la transduction du signal déclenchant les réactions de défense (26). L'expression de LOXI dans les cellules est également inductible par le methyl-jasmonate (22,29), indiquant ainsi une autoamplification possible de cette voie, alors qu'aucune accumulation de transcrits LOX n'est détectée après l'application d'acide salicylique (22).

L'analyse de l'expression du gène LOX1 montre que l'induction de la LOX constitue une réponse précoce de la plante à l'infection par Ppn, suggérant un rôle dans l'établissement de la résistance. Ce rôle potentiel a été confirmé par l'obtention de plantes

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transgeniques exprimant l AUJN complementaire du gène en orientation anti-sens. jbn eltet, ces plantes, provenant de la lignée 46-8 normalement résistante à la race 0 de Ppn, présentent des niveaux d'activité LOX fortement diminués et ont perdu leur capacité à déclencher la réaction incompatible (30, 31). Cette expérience montre clairement que l'expression du gène LOX est nécessaire à l'établissement de l'état de résistance dans l'interaction de type gène-pour-gène entre le tabac et Ppn. Les plantes anti-sens LOX sont également plus sensibles à un autre champignon pathogène du tabac, Rhizoctonia solani (30, 31). En parallèle, Rustérucci et collaborateurs (32), ont montré que des 9hydroperoxydes s'accumulent durant la réponse de type hypersensible du tabac à la cryptogéine, et que cette accumulation est nécessaire au développement de cette réaction.

Chez une autre solanacée, la pomme de terre, des oxylipines issues de la voie 9-LOX, en particulier les acides colnéléique et colnélénique, s'accumulent préférentiellement dans des cellules en culture en réponse à un éliciteur de P. infestans (33). L'ensemble de ces données suggère un rôle majeur de la voie 9-LOX chez les solanacées, dont le tabac, dans la réponse aux agents pathogènes, en particulier les Oomycètes. Chez ces plantes, la voie 13-LOX participe à la réponse aux agents pathogènes, comme le montre la synthèse précoce de jasmonates (29) ; elle est également impliquée dans la réponse à la blessure et aux insectes.

Ainsi, des plantes de pomme de terre exprimant une construction anti-sens 13-LOX se sont révélées plus sensibles à l'attaque par des insectes (34).

Peu de tentatives de sur-exprimer une LOX dans les plantes ont été rapportées dans la littérature. En effet, l'expression d'une LOX pose des questions de faisabilité en raison des propriétés toxiques potentielles des LOXs, si elles oxydent directement les biomembranes, et des produits qu'elles forment.

Chez le tabac, l'introduction de la LOX2 de soja sous le contrôle d'un promoteur chimérique, formé par fusion du promoteur 3 5 S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) et d'un"enhancer"isolé du virus de la mosaïque de la luzerne, a permis la production de cals transgéniques présentant une activité LOX environ 2 fois plus forte que celle de cals transformés avec le vecteur dépourvu de séquence LOX. Ces cals sont capables de former de 3 à 6 fois plus d'aldéhydes volatils, produits de la voie 13-LOX via une 13HPL, que les cals contrôle. Des plantes transgéniques ont été régénérées à partir de ces cals mais bien que présentant une forte accumulation de la protéine hétérologue, ces plantes n'ont pas une activité LOX différente de celle de plantes contrôle. Elles forment cependant des quantités plus importantes d'aldéhydes volatils que les plantes contrôle (35). Plus récemment, une 13-LOX spécifique des corps lipidiques de graines de concombre a été

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exprimée chez le tabac (36). La protéine hétérologue s'accumule dans toute la plante, chez les tabacs transgéniques, et en particulier dans les graines où elle est localisée essentiellement dans les corps lipidiques comme chez le concombre. Sa présence se traduit par une modification qualitative de l'activité LOX des plantes transgéniques, tant in vitro que in vivo. Une 13-LOX chloroplastique d'Arabidopsis, AtLOX2, a été utilisée dans une construction en orientation sens sous le contrôle du promoteur CaMV 35S pour transformer des arabettes. Les auteurs se sont cependant focalisés sur les évènements de transformation ayant conduit à une diminution d'activité LOX par co-suppression (37). Enfin, chez la lentille, la transformation transitoire de protoplastes avec une construction contenant une LOX de lentille sous le contrôle du promoteur CaMV 35S a conduit à une augmentation de 20% de l'activité LOX de ces protoplastes (38). Aucune des plantes ou cultures transformées décrites ci-dessus n'a été testée par rapport à une réponse en relation avec l'attaque par des agents pathogènes. Par ailleurs, les expériences réalisées concernent essentiellement des 13-LOXs.

En outre, les hypothèses concernant la participation des lipoxygénases dans les mécanismes de défense des plantes reposent essentiellement sur les activités biologiques de certaines oxylipines (39). Or, la biosynthèse d'une majorité des oxylipines, et en particulier l'acide jasmonique et les aldéhydes volatils issus de la voie 13-LOX, et les divinylethers issus de la voie 9-LOX, nécessite l'activité d'enzymes métabolisant les produits de la LOX, telles que l'AOS, l'HPL, ou la DES, au-delà de la LOX elle-même. L'expression des gènes correspondant à ces enzymes est souvent inductible. Chez la tomate et Arabidopsis thaliana, l'expression de gènes codant l'AOS et l'HPL est inductible par la blessure (40-42). Par conséquent, l'action des seules lipoxygénases ne semble donc pas suffisante pour déclencher les mécanismes de résistance des plantes.

Les plantes cultivées subissent l'agression de nombreux organismes pathogènes tels que les virus, les bactéries et les champignons mais également d'organismes ravageurs tels que les insectes. Ces agressions affaiblissent les plantes et diminuent les rendements de leur culture. Il existe donc un besoin important d'accroître les mécanismes de résistance des plantes et de diminuer leur sensibilité aux maladies et aux agressions par des organismes parasites ou pathogènes. Les mécanismes de réponse des plantes aux agressions par des agents pathogènes ont fait l'objet de nombreuses études. Il est maintenant communément admis que la voie de la lipoxygénase chez les plantes participe à leur système de défense et à l'établissement d'un état de résistance à travers la voie des oxylipines notamment.

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Cependant, la connaissance de ces voies métaboliques et des lipoxygénases n'a pas permis de développer des procédés permettant d'accroître directement la résistance des plantes.

Ce problème est résolu par la présente invention puisqu'on a maintenant constaté que la sur-expression d'une lipoxygénase dans les plantes diminue directement la sensibilité des plantes aux maladies et aux attaques par des agents pathogènes. De façon inattendue, et bien que la lipoxygénase s'intègre dans des voies métaboliques complexes, la sur-expression d'une lipoxygénase dans les plantes est suffisante pour améliorer la réponse des plantes aux agressions par des pathogènes. De plus, la sur-expression de la lipoxygénase n'affecte pas de manière substantielle le phénotype des plantes transformées en dehors des nouvelles propriétés acquises.

La présente invention consiste donc à sur-exprimer une lipoxygénase dans les plantes pour diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux attaques par des organismes pathogènes ou ravageurs. L'invention a également pour objet des cassettes d'expression préférées pour la sur-expression de la lipoxygénase dans les plantes ainsi que des cellules végétales et des plantes transformées.

Description de la liste des séquences SEQ ID No. 1 : Lipoxygénase (LOX1) de tabac.

SEQ ID No. 2 : Cassette d'expression Promoteur CaMV 35S-Séquence codante du gène LOXI de tabac-Terminateur nos.

SEQ ID No. 3-6 : Amorces pour PCR.

Description de l'invention
La présente invention concerne un procédé pour diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux agressions par des organismes pathogènes. Ce procédé consiste à surexprimer une lipoxygénase dans ces plantes.

Par"lipoxygénase"on entend une enzyme catalysant la dioxygenation d'acides gras polyinsaturés contenant un motif (Z, Z)-l, 4-pentadiène. Chez les végétaux, les substrats de l'enzyme sont l'acide linoléique (C18 : 2) et linolénique (Cl 8 : 3), deux constituants majeurs des membranes cellulaires.

"Sur-expression"signifie que la lipoxygénase est exprimée à un niveau supérieur au niveau d'expression observée dans une plante référence (non induite). Cette sur-expression se traduit par une accumulation plus importante des transcrits du gène de la lipoxygénase, de

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la lipoxygénase elle-même et par une activité spécifique lipoxygénase accrue dans les tissus de la plante. Pour diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux attaques par des organismes pathogènes il est important que le niveau d'expression de la lipoxygénase soit supérieur à celui d'une plante référence lorsque se produit l'agression par l'organisme pathogène.

La sur-expression de la lipoxygénase permet de diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux attaques par des organismes pathogènes. Par"agressions d'organismes pathogènes'on entend notamment des agressions des plantes par des virus, des bactéries, des champignons, des oomycètes ou encore des insectes.

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé consiste à sur-exprimer constitutivement une lipoxygénase dans les plantes. Le terme"constitutivement"désigne l'expression temporelle et spatiale de la lipoxygénase dans les plantes dans les procédés selon l'invention. Par"constitutivement"on entend l'expression d'une lipoxygénase dans les tissus de la plante pendant toute la vie de la plante et notamment au cours de l'ensemble de son cycle végétatif. Dans un premier mode de réalisation, la lipoxygénase est exprimée de façon constitutive dans tous les tissus de plante. Dans un deuxième mode de réalisation, la lipoxygénase est exprimée constitutivement dans les racines, les feuilles, les tiges, les fleurs et/ou les fruits. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la lipoxygénase est exprimée constitutivement dans les racines, les feuilles et/ou les tiges.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la lipoxygénase est une lipoxygénase"inductible"dans une plante référence. Dans la présente invention on entend par lipoxygénase"inductible"une lipoxygénase qui n'est pas exprimée ou exprimée à des niveaux très faibles et dont l'expression est fortement induite en réponse à des éliciteurs dans la réponse au stress, aux blessures et en particulier aux maladies et aux attaques par des organismes pathogènes.

Dans un mode de réalisation préféré des procédés selon l'invention, la lipoxygénase a préférentiellement une activité de 9-lipoxygénase. Les lipoxygénases (LOX) sont classées selon la position du carbone sur lequel est inséré préférentiellement l'oxygène moléculaire.

Chez les végétaux on distingue les 13-LOX et les 9-LOX. Des méthodes permettant de déterminer la spécificité de l'activité lipoxygénase sont décrites dans la littérature (Fournier et al., Plant J. 3 : 63-70,1993 ; Homung et al., PNAS 96 : 4192-4197, 1999 ; Rustérucci et al.,
J Bio/. Biochem. 274 : 36446-36455,1999).

Toute lipoxygénase dont la sur-expression dans les plantes permet de diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux attaques par des organismes pathogènes est

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utilisable dans les procédés selon l'invention. Les lipoxygénases sont connues de l'homme du métier et d'autres lipoxygénases peuvent être identifiées en utilisant des techniques connues. On citera notamment à titre d'exemple les lipoxygénases de pomme de terre (Kolomoiets M. V. et al., Plant Physiol. 124 : 1121-1130,2000), de tomate (Genbank AY008278) de tubercule de pomme de terre (Royo et al., JBiol. Chem., 271 : 21012-21019, 1996 ; Casey, R., Plant Physiol., 107 : 265-266,1995), la lipoxygénase de graine d'amande (Mita et al., Eur. J Biochem., 268 : 1500-1507,2001) et la lipoxygénase de grain d'orge (Van Mechelem et al., Biochem. Biophys. Acta, 1254 : 221-225,1995).

De préférence, la lipoxygénase est une lipoxygénase de plante.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, il s'agit d'une lipoxygénase de plante solanacée. Parmi les plantes solanacées on citera notamment le tabac, la tomate, la pomme de terre ou encore le piment.

Dans un autre mode de réalisation préférée de l'invention, la lipoxygénase présente au moins 80% d'homologie avec la lipoxygénase 1 (LOX1) de tabac de la SEQ ID No. 1. De manière avantageuse, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % et de préférence d'au moins 98 % et plus préférentiellement d'au moins 99 % par rapport à la SEQ ID No. 1. Le terme"homologue"désigne un polypeptide pouvant présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre polypeptides ou protéines sont connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple le package UWGCG et le programme BESTFITT pour calculer les homologies (Devereux et al., Nucleic Acid Res. 12, 387-395,1984). De préférence, ces lipoxygénases homologues conservent la même activité biologique que la lipoxygénase (LOX1) de tabac de la SEQ ID No. 1. Préférentiellement, ces polypeptides ont donc une activité de lipoxygénase et encore plus préférentiellement de 9lipoxygénase.

Dans un mode de réalisation encore plus préféré, les procédés selon la présente invention utilisent la lipoxygénase de la SEQ ID No. 1.

La sur-expression de la lipoxygénase dans les plantes est réalisée en transformant les plantes ou par application sur les plantes d'une molécule stimulant la synthèse de la lipoxygénase dans la plante.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la lipoxygénase est sur-exprimée par intégration dans le génome des plantes d'une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour une lipoxygénase sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les plantes.

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Par"promoteur", on entend selon l'invention la région non codante d'un gène impliquée dans la liaison avec l'ARN polymérase et avec d'autres facteurs qui sont responsables de l'initiation et de la régulation de la transcription conduisant à la production d'un transcrit d'ARN. Les promoteurs de plantes, utilisables dans les procédés selon la présente invention, sont largement décrits dans la littérature.

De préférence, le promoteur est un promoteur constitutif dans les plantes. Les promoteurs constitutifs utilisables dans les procédés selon l'invention sont également bien connus de l'homme du métier.

Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale. On citera des promoteurs bactériens comme celui du gène de l'octopine synthase ou encore le gène de la nopaline synthase, des promoteurs viraux, comme le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur ou le promoteur CSVMV (WO 97/48819) et les promoteurs d'origine végétale comme le promoteur du gène d'histone (EP0507698) ou le promoteur d'un gène d'actine de riz (US 5,641, 876). Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer").

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le promoteur constitutif est le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'expression constitutive ou la surexpression de la lipoxygénase est obtenue en transformant les plantes de manière à placer un promoteur constitutif ou une séquence"enhancer"en amont ou à proximité du gène de la lipoxygénase dans les plantes. On peut notamment utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expression de la lipoxygénase dans les plantes.

Préférentiellement, la lipoxygénase est sur-exprimée dans les tiges, les feuilles et/ou les racines des plantes.

On entend par"plante"selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc.

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La sur-expression de la lipoxygénase peut être obtenue dans toute plante selon des méthodes connues de l'homme du métier.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les plantes sont choisies parmi les plantes solanacées. Parmi les plantes solanacées on citera notamment le tabac, la tomate, la pomme de terre ou encore le piment.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la lipoxygénase est sur-exprimée par intégration dans le génome des plantes d'une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour une lipoxygénase sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les plantes. Un polynucléotide codant pour une lipoxygénase est inséré dans une cassette d'expression en utilisant des techniques de clonage bien connues de l'homme du métier.

Cette cassette d'expression comprend les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction des séquences codant pour la lipoxygénase dans les plantes. Avantageusement, cette cassette d'expression comprend à la fois des éléments permettant de faire produire la lipoxygénase par les plantes transformées et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression. La présente invention concerne aussi des cassettes d'expression préférées pouvant être mises en oeuvre dans les procédés selon l'invention.

Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne des cassettes d'expression fonctionnelles dans les cellules végétales et les plantes comprenant un promoteur ayant une activité constitutive dans les plantes contrôlant l'expression d'un polynucléotide codant pour une lipoxygénase homologue à au moins 90 % à la lipoxygénase de la SEQ ID No. 1. De manière avantageuse, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % et de préférence d'au moins 98 % et plus préférentiellement d'au moins 99 % par rapport à la SEQ ID No. 1. De préférence, ce polynucléotide code pour une lipoxygénase ayant une activité 9-lipoxygénase. Plus préférentiellement, ce polynucléotide code pour la lipoxygénase de la SEQ ID No. 1. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le promoteur est le promoteur 358 du virus de la mosaïque du chou-fleur.

Les cassettes d'expression selon l'invention comprennent préférentiellement une séquence terminatrice. Ces séquences permettent la terminaison de la transcription et la polyadénylation de l'ARNm. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans les plantes peut être utilisée. Pour l'expression dans les plantes on peut notamment utiliser le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore des séquences terminatrices d'origine végétale, comme par exemple le terminateur d'histone (EP 0 633 317), le terminateur CaMV 35 S et le terminateur tml. Ces séquences terminatrices sont utilisables dans les plantes monocotylédones et dicotylédones.

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Les techniques de construction de ces cassettes d'expression sont largement décrites dans la littérature (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory
Manual, 1989).

Avantageusement, les cassettes d'expression selon la présente invention sont insérées dans un vecteur pour leur réplication ou pour la transformation des plantes.

La présente invention concerne également des vecteurs pour la transformation des plantes comprenant au moins une cassette d'expression selon la présente invention. Ce vecteur peut notamment être constitué par un plasmide ou un virus dans lequel est inséré une cassette d'expression selon l'invention. De nombreux vecteurs ont été développés pour la transformation des plantes avec Agrobacterium tumefaciens. D'autres vecteurs sont utilisés pour les techniques de transformation ne reposant pas sur l'utilisation d'Agrobacterium. Ces vecteurs sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. De manière préférée, les vecteurs de l'invention comprennent également au moins un marqueur de sélection. Parmi les marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques tel que le gène nptII pour la résistance à la kanamycine (Bevan et al., Nature 304 : 184-187,1983) et le gène hph pour la résistance à l'hygromycine (Gritz et al., Gene 25 : 179-188,1983). On citera également les gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., NAR 18 : 1062,1990) pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (US 5,188, 642) pour la tolérance au glyophosate ou encore le gène HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles.

La présente invention concerne donc des vecteurs comprenant une cassette d'expression selon l'invention.

L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des plantes avec une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention.

Selon la présente invention la transformation des plantes peut être obtenue par tout moyen connu approprié, les techniques de transformation des plantes sont amplement décrites dans la littérature spécialisée.

Certaines techniques utilisent Agrobacterium notamment pour la transformation des dicotylédones. Une série de méthodes consistent à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes consistent à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. D'autres méthodes peuvent également être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.

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L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de la cellule végétale ou de la plante.

La présente invention concerne les cellules végétales transformées comprenant une cassette d'expression et/ou un vecteur selon l'invention.

Par"cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.

La présente invention concerne également les plantes transformées comprenant une cassette d'expression, un vecteur et/ou des cellules transformées selon l'invention.

On entend par"plante"selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le colza, le soja, le riz, la betterave, le tabac, le coton, etc.

FIGURES Figure 1 La figure 1 présente la construction 35S-9-LOX utilisée pour la transformation du tabac. La séquence codante 9-LOX (LOXI) a été obtenue par amplification PCR puis insérée entre le promoteur 3 5 S du virus de la mosaïque du chou-fleur (35S) et le terminateur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefasciens (tnos). Ce vecteur comprend également le gène de la néomycine phosphotransférase (NPTII) conférant la résistance à la kanamycine chez les bactéries et les plantes."F" ("sens 35S") désigne l'amorce sens et"R" ("reverse LOX1") désigne l'amorce reverse.

Figure 2 La figure 2 est un histogramme représentant la mesure de l'activité spécifique
LOX dans les tiges des plants de tabac en nKAT/mg de protéine. 46-8 WT et
49-10 WT désigne les lignées parentales. S46-21, S46-26, S49-18 désigne les lignées transgéniques. En effet, préalablement à des tests d'inoculation par
Ppn, l'activité spécifique LOX ainsi que le niveau de transcrits correspondants ont été analysés pour des tiges de plantes de tabac âgées de 12 semaines. On observe que le niveau d'activité spécifique LOX dans les trois

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lignées transgéniques retenues est significativement supérieur à celui mesuré dans les lignées parentales correspondantes.

Figure 3 La figure 3 est un histogramme représentant la mesure de la longueur des lésions en mm. Ces mesures ont été réalisées 48 heures (48h) ou 72 heures (72h) après l'inoculation. Les nombres entre parenthèses correspondent aux répétitions indépendantes réalisées. Les deux lignées S46-21 et S46-26, inoculées par Ppn 1 présentent des longueurs de lésions significativement inférieures à celles obtenues avec le même agent pathogène chez le parent sauvage, 46-8 WT. De même, la lignée S49-18 présente des lésions plus courtes que celles mesurées chez son parent sauvage 49-10 WT lors de l'inoculation de ces deux lignées par Ppn 0. Ces différences sont significatives à 48 heures et à 72 heures après l'inoculation.

EXEMPLES Exemple 1 : Matériel biologique Des plantes de tabac (Nicotiana tabacum L. ) sauvages des deux lignées quasi- isogéniques 46-8 (46-8 WT) et 49-10 (49-10 WT) ont été utilisées (Helgeson et al., Phytopath. 62,1439-1443, 1972). Ces lignées se différencient par la présence chez la lignée 46-8 WT d'un locus de résistance à la race 0 de Ppn. Ainsi, la lignée 46-8 WT est résistante à la race 0 de Ppn et sensible à la race 1 de cet agent pathogène tandis que la lignée 49-10 WT est sensible aux deux races de Ppn.

Les graines de lignées sauvages ou transgéniques sont stérilisées (Rancé et al., Plant Cell Report, 13,647-651, 1994) et semées sur milieu MS solide, additionné dans le cas des

lignées transgéniques, de kanamycine (50 Ilg. mol-1). Après 4 semaines de croissance in vitro (hygrométrie 40%, température constante 25 C, lumière 60 pol. m'. s-1 : 16h, obscurité : 8h), les plantes sauvages ou transgéniques résistantes à la kanamycine, sont transférées sur vermiculite en salle à culture (hygrométrie 80%, lumière 125 Ilmol. m-2. s-l : 16h, 25 C, obscurité : 8h, 18 C).

Les souches de Ppn utilisées correspondent aux isolats 1156 (race 0) et 1452 (race 1) (Hendrix, J. W. & Apple, J. L., Tobacco Science 11,148-150, 1967). Le mycélium de Ppn est cultivé à l'obscurité sur un milieu synthétique solide (Keen, N. T., Science 187,74-75, 1975).

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Exemple 2 : Obtention de la cassette promoteur CaMV 35S-séquence codante LOX1terminateur nos (p35S-LOXl)
TL-J2 est un ADN complémentaire de 2888 pb, correspondant au gène LOXI de tabac induit par la pathogenèse. L'obtention de cet ADN complémentaire est décrite par Véronési et collaborateurs (Véronési et al., Plant Physiol. 108,1342, 1995), sa séquence est déposée dans GenBank sous le numéro d'accession X84040. Cet ADNc a été utilisé comme matrice pour l'amplification par PCR de la séquence codante de LOXI.

Des amorces ont été synthétisées pour amplifier un fragment d'ADN de 2,6 kb, couvrant les positions 49 à 2667 de l'ADNc : - Amorce sens = 5'-GTTATCAAACAGTTTAAAATGTTTCTGGAG-3' - Amorce reverse = 5'-TGATTTAAAGTTCTATATTGAC-3' Ces amorces permettent de plus l'introduction de sites DraI (soulignés dans la séquence des amorces) en amont du codon d'initiation de la traduction et en aval du codon stop (indiqués en caractères gras dans la séquence des amorces) de la séquence LOXI.

La réaction PCR a été conduite dans un volume total de 25 ni, contenant 50 ng de plasmide pTL-J2, 50 pmol de chacune des amorces sens et reverse ci-dessus, 2,5 unités d'ADN polymérase Pfu (Stratagene Cloning Systems) et ajusté à 200 u. M de chaque dNTP et 2 mM MgCl2. Après 5 min de dénaturation à 94 C, le programme du thermocycleur était composé

de 20 cycles, incluant chacun 1 min de dénaturation à 94 C, 1 min d'hybridation à 50 C et 6 min d'extension à 72 C, suivis d'une étape finale de 40 min d'extension à 72 C.

L'ADN de cette réaction a été digéré par DraI, et séparé sur gel d'agarose 0, 8%. Le fragment à bouts francs de 2, 6 kb a été purifié à partir du gel (Kit QiaEx II, Qiagen) et cloné au site SmaI du vecteur pIPM0 (Rancé et al., PNAS 6554-6559, 1998) entre le promoteur
CaMV 35S et la région 3'non traduite du gène de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (terminateur nos). Ce vecteur comprend également deux copies du gène de la neomycine phosphotransférase (NPTII) conférant la résistance à la kanamycine chez les bactéries et les plantes. Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer des bactéries
Escherichia coli XL1B1ue compétentes, et des colonies résistantes à la kanamycine ont été 1 sélectionnées puis criblées pour la présence de séquence LOX à l'aide de la sonde moléculaire TL-J2. Des colonies positives ont été mises en culture et les plasmides correspondant purifiés. L'orientation de la séquence LOX1 a été examinée pour chacun des plasmides par PCR en utilisant les amorces suivantes :

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- Amorce F, sens 35S : 5'-GGCCATGGAGTCAAAGATTC-3'ciblant les nucléotides 6906-6925 du promoteur CaMV 35S (séquence disponible dans Genbank sous le numéro d'accession J02048).

- Amorce R, reverse LOXI : 5'-GCTCTGGCATGAAATTTCG-3'ciblant les nucléotides 2290-2272 (brin non-codant) de TL-J2.

Les réactions d'amplification ont été conduites dans un volume de 50 u. l et comprenaient

100 ng de plasmide à tester, 10 pmol de chaque amorce et 1 unité de Taq ADN polymerase dans un milieu ajusté à 200 uM de chaque dNTP et 1, 5 mM MgClz. Le programme du thermocycleur incluait une étape de dénaturation initiale de 5 min à 94 C, puis 40 cycles consistant chacun en 1 min de dénaturation à 94 C, 1 min d'hybridation à 65 C et 2 min d'extension à 72 C, suivis d'une étape d'élongation finale de 10 min à 72 C. Les produits de la réaction ont été séparés sur gel 0.8% d'agarose. Un plasmide pour lequel la présence d'un produit d'amplification de la taille attendue (2,8 kb) indiquait l'orientation sens de la séquence LOX par rapport au promoteur CaMV 35S dans la construction, a été sélectionné.

La séquence LOX et les jonctions de celle-ci avec le promoteur et le terminateur ont été entièrement séquencées. Le plasmide ainsi vérifié est nommé p35S-LOXl. La séquence de la construction CaMV 35S-LOX1 est décrite à la SEQ ID No. 2.

Exemple 3 : Transformation génétique du tabac Le plasmide p35S-LOXl a été mobilisé dans la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens par choc thermique (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163,181-187, 1978). Une colonie résistante à la kanamycine a été isolée, le plasmide purifié, et l'intégrité de la construction vérifiée par PCR avec les amorces F et R et dans les conditions décrites ci- dessus pour la détermination de l'orientation relative de la séquence LOX. Les bactéries recombinantes obtenues ont ensuite été utilisées pour l'infection de disques foliaires de tabac, Nicotiana tabacum, lignées 46-8 WT et 49-10 WT suivant des protocoles déjà décrits (Horsch et al., Science 227,1229-1231, 1985).

Les plantes régénérées sur un milieu de Murashige et Skoog (MS) contenant 150

jg. ml'' de Kanamycine ont été placées en chambre de culture puis en serre pour l'obtention 1 des graines Tl, par auto-fécondation. Les lignées transgéniques régénérées à partir des lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT sont nommées plantes S46-x et S49-x, respectivement.

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Exemple 4 : Caractérisation des transformants primaires
La présence de la cassette d'expression 35S-LOX1 ainsi que le nombre de copies du transgène dans le génome des plantes régénérées ont été déterminés par des expériences de PCR et d'hybridation ADN/ADN (Southem). L'ADN génomique de plantes sauvages ou de plantes régénérées résistantes à la kanamycine a été préparé selon la méthode décrite par Dellaporta et collaborateurs (Dellaporta et al., Plant Mol. Biol. Rep. 1,19-21, 1983).

L'intégrité de l'ADN-T transféré a été vérifiée par amplification PCR à l'aide des amorces F sens 35S et R reverse LOTI , décrites ci-dessus. Les conditions de la réaction étaient celle décrites ci-dessus, mais la quantité d'ADN matrice était dans ce cas de 800 ng d'ADN génomique. Le nombre de copies d'ADN-T insérées a été estimé par Southern blot (50). L'ADN génomique (15 ug) a été digéré par BamH1 et les produits de digestion ont été séparés sur gel d'agarose, puis transférés sur membrane de nylon. Une sonde CaMV 35S (nucléotides 6909 à 7440 de la séquence Genbank J02048) a été utilisée après marquage au [a-32p] dCTP. Le nombre de bandes hybridant cette sonde, après révélation par autoradiographie, est une bonne indication du nombre de sites d'insertion de la construction.

Exemple 5 : Transformation du tabac par la séquence codant la LOX1 de tabac sous le contrôle du promoteur constitutif CaMV 35 S
Afin d'exprimer constitutivement la LOX1 de tabac dans des tabacs transgéniques, la séquence codante correspondante a été introduite en orientation sens dans l'ADN de transfert du vecteur binaire pIPM0, en aval du promoteur constitutif CaMV 35S (p35S) (Fig.

1A). Cette construction, appelée p35S-LOXl contient également un gène de résistance à la kanamycine (NPTII) permettant de sélectionner les cellules végétales transformées. Les lignées de tabac 46-8 WT et 49-10 WT ont été transformées par Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dans laquelle la construction p35S-LOXl a été introduite. A partir des cals sélectionnés sur un milieu contenant de la kanamycine, 15 transformants primaires indépendants S46-x dérivant de la lignée 46-8 WT ont été régénérés. La lettre x désigne le numéro de la plante obtenue. De même, 25 transformants primaires indépendants S49-x ont été régénérés à partir de la lignée 49-10 WT. Ces plantes ont été acclimatées en chambre de culture puis transférées en serre jusqu'à floraison. Les graines correspondant aux plantes T1 ont été obtenues par auto-fécondation des transformants primaires.

L'intégrité de la construction introduite dans le génome des plantes transgéniques a été vérifiée par amplification PCR à partir d'une préparation d'ADN génomique des transformants primaires cultivés sur kanamycine et d'un couple d'amorces, l'une spécifique

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de la région 5'du promoteur CaMV 35S (F) et l'autre de la région 3'de la séquence codante LOXI (R). Les produits d'amplification ont été séparés sur un gel d'agarose et révélés au bromure d'ethidium. Pour 10 des 11 transformants primaires analysés, le profil obtenu correspond à une bande unique dont la taille (2,8 kb) correspond à la taille estimée du produit. En outre, ce profil est identique à celui obtenu avec le vecteur binaire p358-LOX1, ce qui suggère qu'au moins une copie a été intégrée dans le génome de ces transformants.

En revanche, un transformant primaire ne possède pas un tel profil bien qu'il soit résistant à la kanamycine, indiquant une intégration incomplète de la construction. Les lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT, analysées en tant que témoins négatifs ne présentent pas de signal correspondant à la construction.

Le nombre de copies insérées dans chacune des lignées régénérées a été estimé par hybridation de type Southern à partir d'ADN génomique digéré par BamHI et d'une sonde homologue au promoteur CaMV 35S. L'ADN de transfert possède deux sites BamHI : le premier est situé entre le promoteur CaMV 35S et la séquence LOTI et un second dans la séquence LOX1. Les fragments BamHI hybridant la sonde CaMV 35S radiomarquée résultent donc d'une première coupure entre le promoteur CaMV 35S et LOX et d'une seconde coupure dans le génome végétal, en amont de la bordure gauche de l'ADN de transfert. L'insertion de l'ADN de transfert dans le génome des plantes étant aléatoire, les fragments BamHI hybridant la sonde CaMV 35S radiomarquée, obtenus dans le cas d'insertions multiples, auront des tailles dépendant de la position du site BamHl dans l'ADN génomique et donc probablement différentes. C'est pourquoi le nombre de ces fragments permet d'évaluer le nombre de sites d'insertion dans le génome. Les profils

obtenus indiquent que les transformants primaires S46-3, S46-4, S46-26, S49-8, et S49-13 contiennent une copie du transgène, alors que deux copies ont été insérées dans le génome des lignées S49-18 et S49-28, et trois copies dans le génome des lignées S46-21, S49-14 et S49-30. La sonde radiomarquée CaMV 35S n'a pas hybridé avec l'ADN génomique correspondant aux lignées S49-24, ni avec celui des lignées parentales 46-8 WT et 49- 10WT.

Exemple 6 : Extraction et analyse des ARN
L'ARN total a été isolé à partir d'échantillons congelés de plantes de génération T1 ou sauvages. Le matériel végétal a été broyé dans l'azote liquide et l'ARN extrait à l'aide du Kit Extract-all (Eurobio). La concentration en acides nucléiques a été estimée par spectrophotométrie. Les expériences de northern blot ont été réalisées comme

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précédemment décrit (Rickauer et al., Planta 202,155-162, 1997). Les filtres ont été hybridés avec la sonde TL-J2 radiomarquée.

Exemple 7 : Analyse de l'accumulation des transcrits LOX dans les lignées transgéniques Tl
Le niveau d'expression LOX a été évalué dans les différentes lignées transgéniques T1 en mesurant l'accumulation des transcrits LOX par northern blot. Les échantillons d'ARN totaux ont été préparés à partir de jeunes plantes de tabac transgéniques de 4 semaines sélectionnées in vitro sur un milieu contenant de la kanamycine. L'évaluation des niveaux respectifs d'expression du transgène dans ces lignées a été réalisée en comparant les profils obtenus avec le niveau de transcrits détectés dans des plantes sauvages, ainsi que dans une suspension cellulaire de tabac contrôle (témoins négatifs), ou dans une suspension cellulaire de tabac traitées par des éliciteurs de Ppn (témoin positif). Les résultats obtenus indiquent que le niveau de transcrits est faible, voire indétectable, dans les lignées

transgéniques S46-3, S46-4, S49-8, S49-13, S49-24, S49-28 et S49-30. En revanche, les lignées S46-21, S46-26, S49-14 et S49-18 présentent une accumulation importante de transcrits LOX atteignant, après quantification, de 30 à 66 % du niveau détecté dans les cellules de tabac élicitées. Aucune accumulation de transcrit LOX n'est détectée dans la lignée sauvage ni dans les cellules de tabac témoin. L'introduction de la construction promoteur 358-LOXl dans le tabac s'accompagne donc d'une expression constitutive importante dans les lignées transgéniques S46-21, S46-26, S49-14 et S49-18.

Exemple 8 : Immunodétection de la LOX
Obtention d'un sérum polyclonal de lapin anti-LOX1 de tabac : Des lapins ont été immunisés avec une protéine de fusion exprimée chez Escherichia coli et comprenant les 244 résidus C-terminaux de la LOX1 de tabac fusionnés à la glutathione S-transférase (GST) de Schistosomajaponicum. Un fragmentXhoI de pTL-J2, correspondant aux nucléotides 1921 à 2888, a été inséré au siteXhoI du vecteur pGEX-5X-3 (Pharmacia, séquence disponible dans Genbank sous le numéro d'accession U13858) ce qui a permis l'obtention d'une fusion traductionnelle avec la séquence codante de la GST. Une colonie de bactéries contenant le plasmide recombinant a été sélectionnée et mise en culture. Ces bactéries ont été traitées par l'isopropylthio-ss-galactoside à 4 mM pendant 16 heures à 37 C afin d'induire la production de la protéine de fusion. Les bactéries ont été récoltées par centrifugation à 6000 x g pendant 10 min puis les protéines ont été extraites par re-

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suspension du culot bactérien dans une solution tamponnée ajustée à 140 mM NaCl, 2, 7 mM KCI, 10 mM Na2HP04, 1, 8 mM KH2P04, pH 7, 3, à raison de 40 ut de solution par ml de culture, puis soniquation du mélange en 3 cycles de 1 min chacun, sur la glace. Le soniquat a été centrifugé à 10000 x g pendant 5 min et les protéines insolubles contenues dans le culot de centrifugation ont été récupérées et extraites dans le tampon de charge SDSPAGE 1X (50) à 100 C pendant 10 min. Après une nouvelle centrifugation à 10000 x g pendant 5 min, l'extrait protéique a été chargé sur un gel dénaturant de polyacrylamide à 8%. Après électrophorèse et brève coloration au bleu de Coomassie, le gel a été décoloré et la bande correspondant à la protéine de fusion (55 kDa) a été excisée du gel et utilisée pour l'immunisation des animaux (Eurogentec). L'un des sérums, qui présentait le meilleur titre par rapport à la protéine de fusion et à la LOX1 de tabac a été retenu comme sérum antiLOX1. Analyse western : Des extraits enzymatiques dialysés et concentrés, préparés comme décrit ci-dessus, ont été séparés en SDS-PAGE sur un gel à 10% à raison de 100 ag de protéines par piste, et après électrophorèse, les protéines séparées ont été transférées sur membrane de nitrocellulose par electro-transfert. Les analyses western ont été réalisées selon des protocoles standards. Le sérum anti- LOX1 à la dilution de 1 : 1000 a été utilisé comme anticorps primaire, et des IgGs de chèvre anti-IgGs de lapin, couplées à la phosphatase alcaline (Sigma), ont été utilisées comme anticorps secondaire. L'activité enzymatique phosphatase alcaline a été détectée par la méthode au NBT-BCIP.

Exemple 9 : Détection de la protéine LOX1 dans les lisnées transgéniques Tl
A partir des lignées transgéniques exprimant constitutivement le transgène LOX1, la recherche de la protéine LOX1 a été entreprise par une analyse western. Des extraits de protéines solubles, préparés à partir des parties aériennes de plantes de 8 semaines, ont été séparés par SDS-PAGE. La détection de la protéine LOX1 a été réalisée à l'aide d'un sérum polyclonal de lapin dirigé contre la partie C-terminale de la protéine LOX1. La révélation immunochimique montre la présence d'une bande unique dans les pistes correspondant aux lignées transgéniques S46-26 et S49-18. La taille du produit correspondant, comprise entre 79 et 101 kDa, est cohérente avec la taille calculée à partir de la séquence primaire de la protéine LOX1 (92kDa). En revanche, la protéine LOX1 n'est pas détectée dans les extraits préparés à partir des lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT. L'expression constitutive du transgène LOXI s'accompagne donc d'une accumulation de la protéine correspondante dans les lignées transgéniques S46-26 et S49-18.

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Exemple 10 : Mesure de l'activité LOX
Les échantillons de plantes sauvages ou transgéniques ont été congelés puis broyés dans l'azote liquide et homogénéisés dans le tampon phosphate de sodium 0.25 M, pH6.5, contenant 5% de polyvinylpolypirrolidone, à raison de 1 ml de tampon par g de matière fraîche. Après décongélation, les extraits ont été mélangés au vortex et centrifugés pendant 5 min à 12000 x g. Le surnageant de centrifugation constitue l'extrait enzymatique brut.

Deux méthodes de mesure de l'activité LOX ont été employées.

Méthode chromatographique (CCM) : Un protocole a été adapté à partir d'une méthode décrite par Caldelari et Farmer (Caldelari, D. & Farmer, E. E., Phytochemistry 47,599-604, 1998). L'essai LOX a été conduit avec un aliquote de l'extrait enzymatique brut correspondant à 50 ug de protéines, dans un volume total de 0,4 ml de tampon phosphate de sodium 0,25 M, pH 6,5, saturé en air et contenant de l'acide linoléique marqué au 14C sur le carbone 1, à une concentration finale de 1, 2 u. M, pendant 30 min à 30 C. Le mélange réactionnel a ensuite été extrait 2 fois avec un mélange methanol-chloroforme (2 : 1) et les phases organiques ont été concentrées sous flux d'azote. Les extraits ont été séparés en chromatographie sur couche mince sur des plaques de silice, dans un mélange ether-hexaneacide formique (70 : 30 : 1). Les produits radio-marqués issus de la métabolisation de l'acide linoléique ainsi que le substrat restant ont été révélés par phosphorimaging. La quantité de substrat restant dans chaque réaction a été estimée par comparaison avec une réaction contrôle sans extrait enzymatique (logiciel ImageQuaNT) Méthode spectrophotométrique : L'extrait enzymatique brut a été dialysé et concentré par centrifugation sur une unité Ultrafree-4 (Millipore) équipée d'une membrane Biomax lOkDaNMWL, pendant 30 min à 3500 x g et à 4 C, puis a subi trois étapes de lavage par addition de 0,5 ml de tampon phosphate de sodium 0,25 M, pH 6,5 et centrifugation dans la même unité. L'activité LOX a été déterminée dans un essai d'un volume total de 475 Ill, par

mesure de la formation de diènes conjugués à A. 234 nm (8=27000 M-I. cm-l) pendant 4 min à 30 C, dans du tampon phosphate de sodium 0, 25 M, pH 6, 5, saturé en air. L'acide linoléique a été utilisé comme substrat à la concentration finale de 820 u. M. Les résultats sont exprimés en nanokatal. mg' protéines. La teneur en protéines des aliquotes testés a été déterminé par la méthode de Bradford (Bradford, Anal. Biochem. 72,248-254, 1976).

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Exemple 11 : Transformation in vitro de l'acide linoléique par les plantes transgéniques Tl
Le niveau d'activité LOX des plantes transgéniques a été comparé à celui des lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT en mesurant, in vitro, la capacité de différents extraits enzymatiques à transformer un substrat naturel de cette enzyme, l'acide linoléique. Ces extraits, préparés à partir des parties aériennes de plantes âgées de 8 semaines, ont été incubés in vitro avec de l'acide linoléique marqué au 14C. Les produits radiomarqués, extraits puis séparés par chromatographie en couche mince (CCM), ont été révélés à l'aide d'un phosphorimager. A partir de l'image digitalisée de la CCM, l'acide linoléique non métabolisé à la fin de la réaction a été quantifié pour chaque piste et exprimé en pourcentage de l'acide linoléique mesuré dans une réaction témoin ne comportant pas d'extrait enzymatique. Ces pourcentages correspondent à la moyenne de trois répétitions indépendantes. Dans les essais, l'acide linoléique disparaît presque complètement dans les pistes correspondant aux plantes transgéniques S46-26 et S49-18 avec seulement 5 et 10 % de substrat restant en fin de réaction alors que dans le cas des lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT, environ 50 % du substrat n'est pas métabolisé. Afin de vérifier que cette différence entre les lignées WT et transgéniques est bien due à l'expression constitutive du transgène introduit, la même réaction a été réalisée en pré-incubant les extraits enzymatiques avec de l'ETYA (acide 5,8, 11, 14-eicosatétraynoïque), un inhibiteur spécifique des LOXs. Dans ce cas, environ 50 % de l'acide linoléique est détecté en fin de réaction aussi bien pour les lignées parentales que pour les lignées transgéniques. Ceci suggère que l'ensemble des lignées possède une activité indépendante de la LOX, capable de métaboliser une partie de l'acide gras introduit. Dans le cas où les extraits enzymatiques sont bouillis avant d'être incubés avec le substrat, entre 80 et 90% de l'acide gras est extrait en fin de réaction, montrant qu'il s'agit bien d'une réaction enzymatique et suggérant soit qu'une partie du substrat (entre 10 et 20%) est dégradée chimiquement, soit qu'elle n'est pas extractible dans les conditions utilisées. Cette expérience montre donc que les lignées transgéniques S46-26 et S49-18 présentent une activité de conversion de l'acide linoléique sensible à l'ETYA, ce qui n'est pas le cas des lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT.

Ceci montre que l'expression constitutive du transgène LOXI, ainsi que la présence de la protéine LOX1 dans les lignées transgéniques se traduit également par une augmentation de l'activité LOX dans ces plantes. Cette augmentation d'activité a également été mesurée dans la lignée S46-21.

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Exemple 12 : Inoculation de plantes de tabac par Ppn pn Une méthode d'inoculation caulinaire du tabac par Ppn a été employée. Des plantes de tabac sauvages (lignées 46-8 WT et 49-10 WT) ou transgéniques, âgées de 12 semaines, ont été inoculées par application d'une pastille de mycélium sur la tige après section de la partie apicale de celle-ci (à environ un tiers du sommet) avec une lame de rasoir. Les pastilles de mycélium provenaient de cultures en milieu gélosé âgées de 7 jours. Des plantes contrôle ont été traitées de manière identique, à l'exception de l'application de la pastille de mycélium, remplacée par une pastille de milieu stérile. Les tiges contrôle et inoculées ont été recouvertes d'un film d'aluminium pour préserver les tissus végétaux et le mycélium de la dessiccation.

Exemple 13 : Observation et mesure des symptômes
Les symptômes ont été observés et quantifiés 48 heures ou 72 heures après inoculation. Les tiges ont été sectionnées longitudinalement et la longueur des lésions a été mesurée pour chaque demi-tige en cinq points équidistants, répartis sur toute la largeur de la section. La longueur de lésion utilisée pour chaque individu correspond à la moyenne de ces 10 mesures.

Exemple 14 : Mesure de l'accumulation des transcrits LOXI et de l'activité spécifique LOX dans les tiges des lignées transgéniques Tl
La méthode retenue pour tester l'interaction entre le tabac et le microorganisme pathogène, Ppn, consiste à inoculer la tige par du mycélium de Ppn, après section de l'apex de la plante. En préambule à cette expérience, le niveau d'expression du transgène ainsi que l'activité spécifique LOX des tiges des lignées transgéniques S46-21, S46-26 et S49-18 ont été comparés à ceux observés chez les lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT. Pour chaque lignée, des ARNs totaux ont été préparés à partir d'un pool de 3 morceaux de tige provenant chacun d'une plante indépendante. Le résultat de l'hybridation avec une sonde LOX/radiomarquée confirme l'accumulation des transcrits LOX dans les tiges des lignées transgéniques S46-21, S46-26 et S49-18 alors qu'aucun transcrit LOX n'est détecté dans les lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT. L'activité spécifique LOX a également été mesurée dans cet organe à partir d'extraits enzymatiques concentrés et dialysés. L'analyse a été réalisée au spectrophotomètre en mesurant, à 234 nm, l'apparition des hydroperoxydes d'acide gras. Pour chaque lignée étudiée, 3 mesures indépendantes ont été réalisées. Les

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résultats obtenus, rassemblés dans un histogramme (Fig. 2), indiquent que l'activité spécifique LOX mesurée dans les lignées transgéniques S46-21, S46-26 et S49-18 est de 1,8 à 5 fois plus importante que le niveau d'activité mesuré dans les lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT. En outre, ces niveaux d'activité atteignent 25 % (S46-21) et 70 % (S49-18) du niveau d'activité LOX mesuré dans des cellules de tabac élicitées pendant 24 heures (353,8 nkat. mg' protéine, donnée non montrée). Cette analyse confirme donc que l'expression constitutive du transgène LOX ainsi que l'augmentation de l'activité LOX mesurées dans les plantes transgéniques caractérisent également les tiges.

Exemple 15 : Analyse de l'interaction entre Ppn et les lignées transgéniques Tl ayant pn et les lignées t une activité LOX constitutive
Afin d'examiner les conséquences de l'expression constitutive LOXI chez les lignées transgéniques S46-21, S46-26 et S49-18 sur leur interaction avec Ppn, des plantes de ces lignées, âgées de 12 semaines, ont été inoculées par cet agent pathogène au niveau des tiges. Les symptômes obtenus après inoculation par une race virulente de Ppn ont été comparés à ceux observés au cours d'une interaction compatible mettant en jeu la lignée parentale correspondante. Ainsi, les lignées S46-21, S46-26 et 46-8 WT ont été inoculées par la race 1 de Ppn alors que les lignées S49-18 et 49-10 WT ont été inoculées par la race 0 de Ppn. Un témoin d'incompatibilité a été réalisé en inoculant la lignée 46-8 WT par la race 0 de Ppn. Les symptômes obtenus 48 heures ou 72 heures après l'inoculation ont été observés sur des sections longitudinales des tiges et les lésions ont été mesurées (figure 3).

Les symptômes observés sur les lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT sont typiques des interactions tabac/Pp ; la lignée 46-8 WT, inoculée par la race 0 de Ppn, présente des lésions sèches et localisées caractéristiques d'une interaction incompatible. En revanche, les

longues lésions brunes macérées, observées dans les interactions 46-8 WT/Ppn 1 et 49-10 WT/Ppn 0 traduisent la colonisation de la tige par l'agent pathogène et sont typiques d'interactions compatibles. En comparaison avec ces dernières, les lésions mesurées dans les lignées transgéniques, inoculées par la même race virulente que celle utilisée avec la lignée parentale correspondante, sont nettement réduites. Chez les deux lignées transgéniques retenues, S46-21 et S46-26, l'inoculation par la race 1 du champignon ne provoque pas la formation des ces longues lésions macérées. On observe des lésions beaucoup plus réduites que dans le cas compatible mais également beaucoup moins macérées. Cette différence est également observée lorsque sont comparées l'interaction compatible 49-10WT/Ppn 0 (lignée sauvage sensible àPpn 0) et l'interaction entre la

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lignée transgénique S49-18, qui est issue de la lignée 49-10WT, et Ppn 0. On observe que les lésions provoquées lors de l'interaction S46-26/Ppn 1 ressemblent davantage aux nécroses apparaissant lors d'une interaction incompatible (46-8 WT/Ppn 0), qu'aux lésions accompagnant la colonisation des tissus de la plante par le champignon dans le cas d'une

interaction compatible (46-8 WT/Ppn 1). Par exemple, les lésions obtenues 48 heures après l'inoculation dans les interactions S46-21/Ppn 1 et S46-26/Ppn 1 sont respectivement 3, 4 et 2, 4 fois plus courtes que celles mesurées dans l'interaction compatible 46-8 WT/Ppn 1. Pour la lignée S49-18, l'inoculation par la race 0 de Ppn provoque des lésions 2 fois plus courtes que celles observées pour la lignée parentale 49-10 WT inoculée par la même race du champignon. L'ensemble de ces résultats montre que l'expression constitutive LOX dans les lignées transgéniques s'accompagne d'une limitation nette de la progression du champignon.

Au delà de la réduction de taille des lésions observées dans les lignées transgéniques inoculées par une race virulente de Ppn, la nature de celle-ci est également modifiée. Les lésions obtenues dans l'interaction S46-26/Ppn 1 ne sont pas macérées comme dans l'interaction compatible 46-8 WT/Ppn 1 mais plutôt sèches comme dans l'interaction incompatible 46-8 WT/Ppn 0. Ceci montre que l'activité constitutive LOX mesurée dans les lignées transgéniques S46-21, S46-26 et S49-18 participe activement à la résistance du tabac à Ppn.

Exemple 16 : Analyse de l'interaction entre Ppn et les plantes transgéniques Tl ayant une activité LOX constitutive-innoculation racinaire
Des plantes exprimant constitutivement la LOX1 de tabac ont été obtenues précédemment. Dans un test d'inoculation caulinaire, ces plantes ont montré une sensibilité réduite à Phytophthora parasitica var. nicotianae (Ppn) en comparaison de la lignée sauvage dont elles sont issues. Le comportement de ces plantes dans un test d'inoculation racinaire a été étudié.

Des plantes de tabac (Nicotiana tabacum L. ) sauvages de la lignée 46-8 (46-8 WT) caractérisée par la présence d'un locus de résistance à la race 0 de Ppn et des plantes de la lignée transgénique sens-lipoxygénase S46-21, dérivant de la lignée 46-8 WT, ont été semées in vitro. Les graines de lignées sauvages ou transgéniques ont été stérilisées et semées en boîtes de Pétri, sur milieu MS solide à raison d'environ 30 graines par boîte, en intercalant un disque de toile synthétique entre le milieu et les graines. Les boîtes ont été

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placées en position inclinée pour orienter la croissance des racines. Après 3 semaines de 2-1 croissance in vitro (hygrométrie 40%, température constante 25 C, lumière 60 mol. m-2. s-1 : 16h, obscurité : 8h), les disques de toile supportant les plantes ont été transférés dans de nouvelles boîtes de Pétri contenant du milieu MS liquide et des billes de verre, et les plantes ont été replacées en chambre de culture pendant 2 jours, avant inoculation. Les souches de Ppn utilisées correspondent aux isolats 1156 (race 0) et 1452 (race 1). Le mycélium de Ppn a été cultivé à l'obscurité sur un milieu synthétique solide.

Une méthode d'inoculation racinaire du tabac par une suspension de zoospores de Ppn a été employée. Une colonie de mycélium de Ppn obtenue sur milieu V8 a été placée en carence sur eau gélosée pendant 4 jours, puis les zoospores ont été libérées par choc froid (30 min à 15 C puis 30 min à température ambiante) dans 10 ml d'eau. Après comptage, la suspension de zoospores est ajustée à 4000 spores/ml. Pour chaque boîte, le milieu MS liquide est retiré et remplacé par la suspension de spores. Les plantes ne présentant aucun symptôme de maladie sont comptées après 6 à 11 jours, et le pourcentage de survie (plantes dépourvues de symptômes 1 plantes totales) est calculé pour chaque combinaison.

Afin d'examiner les conséquences de l'expression constitutive LOXI chez le tabac sur l'interaction avec Ppn, des plantes de la lignée transgénique S46-21, âgées de 3 semaines, ont été inoculées au niveau des racines par la race 1 virulente de cet agent pathogène. Le devenir des plantes inoculées a été comparé à celui de plantes sauvages de la lignée parentale correspondante 46-8 WT inoculées par cette même race (interaction compatible). Un témoin d'incompatibilité a été réalisé en inoculant la lignée 46-8 WT par la race 0 de Ppn dans les mêmes conditions ainsi qu'un contrôle non inoculé. Les plantes ont été observées 6 ou 11 jours après inoculation dans une première expérience, et 7 jours après inoculation dans une deuxième expérience. Les plantes exemptes de symptômes de maladie ont été dénombrées et les pourcentages de survie ont été calculés (Tableau 1).

La lignée 46-8 WT, inoculée par la race 0 de Ppn, ne présente pas de symptômes et le pourcentage de survie est très voisin de 100%. En revanche, dans l'interaction 46-8 WT/ Ppn 1, la colonisation des plantes par l'agent pathogène se traduit par une mortalité importante et un faible pourcentage de survie (20 à 24%). En comparaison avec cette interaction compatible, les plantes de la lignée transgénique sens LOX S46-21, inoculées par la même race virulente que celle utilisée avec la lignée 46-8 WT d'origine, présentent un pourcentage de survie beaucoup plus élevé, et ceci dans deux expériences indépendantes (taux de survie 80 à 88 %). L'ensemble de ces résultats confirme que l'expression

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constitutive LOX chez le tabac s'accompagne d'une diminution remarquable de la sensibilité à Ppn.

Tableau 1. Pourcentage de survie des plantes sauvages ou transgéniques sens-LOX, après inoculation avec la race 1 virulente de Ppn, et comparaison avec l'interaction incompatible 46-8 WT/race 0

<tb>
<tb> Nombre <SEP> Taux <SEP> de <SEP> surviea
<tb> total <SEP> de
<tb> EXPERIENCE <SEP> N01 <SEP> J6 <SEP> Jll
<tb> plantes
<tb> 46-8 <SEP> WT/Ppn <SEP> 0 <SEP> (incompatible) <SEP> n=58 <SEP> 100% <SEP> 100%
<tb> 46-8 <SEP> WT/Ppn <SEP> 1 <SEP> (compatible) <SEP> n=55 <SEP> 24. <SEP> 0% <SEP> 20. <SEP> 0%
<tb> 846-21/Ppn <SEP> 1 <SEP> n=54 <SEP> 88. <SEP> 8% <SEP> 88. <SEP> 8%
<tb> EXPERIENCE <SEP> N02 <SEP> 17
<tb> 46-8 <SEP> WT <SEP> contrôle <SEP> n=47 <SEP> 95. <SEP> 7%
<tb> 46-8 <SEP> WT/Ppn <SEP> 1 <SEP> (compatible) <SEP> n=82 <SEP> 21. <SEP> 9 <SEP> %
<tb> S46-21 <SEP> / <SEP> Ppn <SEP> 1 <SEP> n=65 <SEP> 80. <SEP> 0%
<tb>

iaux de survie = vo nombre de plantes sans symptômes de maladie/nombre total de plantes

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52. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal.

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53. Seo, H. S., Song, J. T., Cheong, J.-J., Lee, Y.-H., Lee, Y.-W., Hwang, I., Lee, J.

S. & Choi, Y. D. (2001) Jasmonic acid carboxyl methyltransferase : A key enzyme for jasmonate-regulated plant responses, Proc. Natl. Acad. Sci. U S. A. 98,4788-4793.

Claims (18)

1. Revendications 1) Procédé pour diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux agressions par des organismes pathogènes caractérisé en ce qu'il consiste à sur-exprimer une lipoxygénase dans lesdites plantes.
2. 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il consiste à sur-exprimer constitutivement une lipoxygénase dans lesdites plantes.
3. 3) Procédé selon l'une des revendications 1-2 dans lequel ladite lipoxygénase a une activité de 9-lipoxygénase.
4. 4) Procédé selon l'une des revendications 1-3 dans lequel ladite lipoxygénase est une lipoxygénase de plante.
5. 5) Procédé selon l'une des revendications 1-4 dans lequel ladite lipoxygénase est une lipoxygénase de plante solanacée.
6. 6) Procédé selon l'une des revendications 1-5 dans lequel ladite lipoxygénase est homologue à au moins 80 % à la lipoxygénase de la SEQ ID No. 1.
7. 7) Procédé selon la revendication 6 dans lequel ladite lipoxygénase est représentée à la

   SEQ ID No. 1.
8. 8) Procédé selon l'une des revendications 1-7 dans lequel ladite lipoxygénase est sur- exprimée par intégration dans le génome de ladite plante d'une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour ladite lipoxygénase sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les plantes.
9. 9) Procédé selon la revendication 8 dans lequel ledit promoteur est un promoteur constitutif dans les plantes.

   <Desc/Clms Page number 33>
10. 10) Procédé selon la revendication 9 dans lequel ledit promoteur constitutif est le promoteur 358 du virus de la mosaïque du chou-fleur.
11. 11) Procédé selon l'une des revendications 1-10 dans lequel ladite lipoxygénase est sur- exprimée dans les tiges, les feuilles et les racines desdites plantes.
12. 12) Cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes caractérisée en ce qu'elle comprend un promoteur ayant une activité constitutive dans les plantes contrôlant l'expression d'un polynucléotide codant pour une lipoxygénase homologue à au moins 90 % à la lipoxygénase de la SEQ ID No. 1.
13. 13) Cassette d'expression selon la revendication 12 dans laquelle ledit polynucléotide code pour une lipoxygénase ayant une activité 9-lipoxygénase.
14. 14) Cassette d'expression selon l'une des revendications 12 ou 13 dans laquelle ledit polynucléotide code pour la lipoxygénase de la SEQ ID No. 1.
15. 15) Cassette d'expression selon l'une des revendications 12-14 dans laquelle ledit promoteur est le promoteur 3 5 S du virus de la mosaïque du chou-fleur.
16. 16) Vecteur caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon l'une des revendications 12-15.
17. 17) Cellules végétales transformées caractérisées en ce qu'elles comprennent une cassette d'expression selon l'une des revendications 12-15 et/ou un vecteur selon la revendication

    16.
18. 18) Plantes transformées caractérisées en ce qu'elles comprennent une cassette d'expression selon l'une des revendications 12-15, un vecteur selon la revendication 16 et/ou des cellules végétales transformées selon la revendication 17.