KR100764563B1 - 식물 병저항성 유도 유전자，벡터 및 이로부터 얻어지는 형질전환체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산토모나스 오리재 피브이.오리재(벼흰잎마름병균)에서 분리된 것으로, 단자엽 식물 및 쌍자엽식물의 많은 식물체에 있어서 다양한 종류의 병에 대하여 수평저항성을 발휘하는 신규한 엘리시터 유전자, 벡터 및 이를 이용하여 얻어지는 형질전환체를 제공한다.

산토모나스 오리재, 엘리시터

Description

식물 병저항성 유도 유전자，벡터 및 이로부터 얻어지는 형질전환체{Disease Resistant Inducing Gene, Vector, and Transgenic Plant}

도 1은 본 발명의 실시예에서의 산토모나스 오리재 피브이.오리재(벼흰잎마름병균)로부터 분리한 hpa1A 유전자 및 업스트림 부위를 포함하는 염기서열

도 2A는 유전자 총을 이용하여 벼 캘러스로 트랜션트 유전자 발현검정을 수행하기 위해 사용되는 키메릭 구조체

도 2B는 트랜션트 GUS 발현검정 결과사진

도 3A는 유전자 총을 이용하여 식물체로 트랜션트 유전자 발현검정을 수행하기 위해 사용되는 키메릭 구조체[a) pBI221, b) pMS-35hpa1A]

도 3B는 콩(좌)과 중국 캐비지(우)에서의 hpa1A 유전자의 발현결과 사진

도 4는 아그로박테리움 투마파시엔 LBA4404를 경유하여 벼 캘러스에 트랜스포메이션시키기 위해 사용되는 키메릭 구조체

도 5A는 actin::uidA T0 라인의 노던 블롯 분석결과도

도 5B는 X.o.o.Kox18로 감염시킨 후 actin::uidA T0 라인에서의 병징을 관찰한 그래프

도 6A는 actin::hpa1A T0 라인의 노던 블롯 분석결과도

도 6B는 X.o.o.Kox18로 감염시킨 후 actin::hpa1A T0 라인에서의 병징을 관찰한 그래프

본 발명은 식물병원세균에 대하여 식물체에 저항성을 부여하는 엘리시터(elicitor) 유전자, 벡터 및 이를 이용하여 얻어지는 형질전환체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단자엽식물 및 쌍자엽식물의 많은 식물체에 있어서 다양한 종류의 병에 대하여 수평저항성을 발휘하는 신규한 엘리시터 유전자, 벡터 및 이를 이용하여 얻어지는 형질전환체에 관한 것이다.

식물의 주위에는 어디에나 미생물이 존재하며 항상 미생물과 끊임없는 상호작용을 하고 있다. 식물에의 병 발생 여부는 이러한 상호 작용의 결과에 의존한다. 식물 병원균의 병원성은 대상 식물에 대한 여러 과정의 병 발생 단계에서의 성공 여부에 의하여 결정된다. 침입 (invasion), 인식 (recognition), 증식( multiplication), 병원성 요인의 분비 (production of virulence factor), 병증의 발현 (symptom development) 등 인위적으로 나누어진 각각의 연속적인 단계에서 침입한 균이 성공적으로 모든 단계를 마치면 그 식물은 이병식물이 되며, 어느 한 단계에서라도 성공적으로 그 단계를 마치지 못하면 그 식물은 저항성 식물이 되는 것이다. 식물의 경우 각 단계에서 최선을 다하여 병원균의 활동을 방어함으로써 저항 성으로 남으려 한다. 이와 같은 병원균과 식물과의 관계는 끊임없는 상호 신호 전달체계에 의하여 이루어진다. 식물이 병원균의 침입을 인식하고 방어작용을 가동시키면, 병원균은 그 식물에서 더 이상 성장을 못하게 된다. 이러한 현상은 비기주식물 (nonhost) 또는 저항성 (resistance) 기주 식물에서 나타나며, 이러한 저항성 반응 중 과민반응(hypersensitive response)은 식물의 중요한 방어기작으로 병원세균의 침입을 받은 부위의 세포가 급격하게 괴사하는 현상이다 (Holt et al.; 2000, Keller et al., 1999). 이와 같이 한 식물의 이병성 또는 저항성은 병원균의 침입초기에 식물병원균이 식물로 분비하는 다양한 이펙터[effector (=elicitor)]단백질과 각각의 식물이 가지고 있는 다양한 형태의 저항성 유전자에 의하여 결정된다. 이펙터 단백질에 대한 연구는 초기단계라 그 기능이 대부분 알려져 있지 않다. 기능을 추측할 수 있는 이펙터 단백질 들만 분류해 보면, 병원성에 관련된 이펙터 들, 비기주특이적인 이펙터들, 그리고 기주 특이적인 이펙터 들과 같이 구분 할 수 있다. 이러한 이펙터 외에 최근에는 식물의 저항성 유전자와 비슷한 구조를 가진 이펙터들이 보고되고 있다 (Leach and White, 1996). 식물 저항성 관련 유전자는 이펙터 단백질 보다는 훨씬 많은 수가 알려져 있으며 기능도 많이 밝혀져 있다. 이와 같이 병원균이 식물체에 침입했을 때 병원균이 내는 이펙터를 식물이 감지하면 식물의 방어기작과 관계되는 신호전달체계가 작동하게 되어 살리실레이트, 자스모네이트, 에틸렌 경로가 활성화되고 과민성 저항반응[hypersensitive resistance response(HR)]를 초래하게 된다. HR 반응은 병원균의 성장과 확산을 막아 건강한 조직을 보호한다. 식물이 병원균의 침입을 빨리 감지하여 방어기작을 작동한다면 병원균에 의한 피해를 많이 줄일 수 있을 것이다. 빨리 감지 할 수 있는 방법은 첫째로 많은 이펙터가 분비되어도 가능하며 감지하는 저항성 유전자가 많이 있어도 가능할 것이다. 그러므로 이펙터를 이용하여 효과적인 병저항성 형질전환식물체( transgenic plants)를 만들려는 시도와 저항성 관련 유전자를 대량발현 시킬 수 있는 형질전환식물체를 만들려는 시도가 많이 행해졌다. 하지만, 이들 종래기술에 의해 최근까지 얻어지는 저항성 품종들은 수직저항성을 이용한 것으로 저항성이 쉽게 무너지는 문제를 내포하고 있다.

본 발명은 상기 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 단자엽 식물 및 쌍자엽식물의 많은 식물체에 있어서 다양한 종류의 병에 대하여 수평저항성을 발휘하는 신규한 엘리시터 유전자, 이를 함유하는 벡터 및 이에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공함에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호1 기재 또는 이와 상보적인 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2 기재의 폴리펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2 기재의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 기재의 유전자와 서열번호 2 기재의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 및, 이들과 상보적인 유전자로부터 선택되는 어느 하나의 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 기재의 유전자와 서열번호 2 기재의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 및, 이들과 상보적인 유전자로부터 선택되는 어느 하나의 유전자를 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명에 의하면, 상기 형질전환된 숙주세포는 바람직하게는 벼와 애기장대 세포인 것을 특징으로 한다.

상기한 바와 같이 본 발명에 의한 유전자는 엘리시터 유전자로서, 단자엽 식물 및 쌍자엽식물의 많은 식물체에 있어서 다양한 종류의 병에 대하여 수평저항성을 발휘하는 것으로 확인되어 종래 저항성 품종이 수직 저항성인 것에서 초래되는 문제점을 극복하고 있다. 특히 본 발명에 의한 엘리시터 유전자는 도열병, 벼흰잎마름병 등에 대하여 저항성을 유도하는 효과가 우수하다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 의한 엘리시터 유전자는 식물병원세균의 일종인 산토모나스 오리재 피브이.오리재(벼흰잎마름병균)에서 분리된 것으로, 식물체내에서 저항성을 유도하는 엘리시터(139a.a)를 발현한다 (도 1참조). 상기 엘리시터 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것으로 확인되었으며, 항시 유전자가 발현되는 액틴 프로모터 하에서도 잘 발현되어지는 것으로 확인되었다. 본 발명에 따른 엘리시터 유전자를 이하에서는 hpa1A로서 명명하기로 한다. 또한, 본 발명에서는 경우에 따라 상기 서열번호 1기재의 염기서열 중 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 변형서열이 사용되어질 수 있다. 하지만, 상기 변형서열은 궁극적으로 얻어지는 최종 엘리시터 단백질의 3차원적 구조에 실질적으로 영향을 주지 않는 범위 또는 활성에 실질적으로 영향을 주지 않는 범위내일 것이 요구된다. 이와 같은 변형서열의 획득은 인위적인 유전자조작과정에서 얻어지거나, 자연적인 돌연변이 과정을 통해 얻어질 수 도 있다. 인위적인 유전자 조작과정을 통해 통상적으로 이미 잘 알려진 많은 돌연변이 유도실험 등의 과정을 통해 최종적으로 발현되어지는 단백질의 구조 및 활성을 측정하고 실질적으로 상기 서열번호 1에 의해 발현되는 단백질과 실질적으로 동일한 3차원적 구조 내지는 저항성 유도활성을 갖는 유전자를 획득하는 과정은 당업자에게는 극히 용이한 작업에 불과하므로 이에 대한 보다 상세한 설명은 생략하기로 한다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 기재의 유전자와 이들의 변형서열 이외에도 이와 상보적인 유전자를 포함한다. 상보적인 유전자는 DNA 복제과정을 통해 서열번호 1 기재의 유전자와 이들의 변형서열을 가지는 유전자로 쉽게 합성할 수 있는 주형으로 사용될 수 있다. 상보적인 유전자를 얻는 과정은 당업자에게 극히 용이한 기술에 불과하며, 이러한 서열은 서열번호 1 기재의 유전자 또는 이들의 변형서열을 주형으로 직접 작성되어질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 2 기재의 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 서열번호 2 기재의 폴리펩타이드는 139개의 아미노산 서열을 가지며, 엘리시터 활성 을 가진다.

또한, 본 발명은 서열번호 2 기재의 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함한다. 이들 유전자는 형질전환에 사용되어질 숙주의 종류에 따라 제공되는 코돈용법(codon usage)에 따라 상기 폴리펩타이드를 발현할 수 있도록 암호화하는 다양한 조합의 유전자일 수 있다.

형질전환과정은 식물체의 형질전환체 제조공정에서 통상적으로 사용되는 어떠한 시스템도 이용되어질 수 있다. 이러한 기술로서는 특히 이들에 한정되지 않지만 칼슘/폴리에틸렌 글리콜법을 이용한 원형질체의 형질전환법, 전기 천공법 및 미량주사법 또는 (코팅된)입자 충격투입법 등이 있다.

이와 같은 소위 직접 유전자 형질전환법 이외에 바이러스 벡터(예를 들면, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)로부터 얻음) 및 박테리아 벡터(예를 들면, 아그로박테리움속으로부터 얻음) 등의 벡터를 포함하는 형질전환 시스템이 널리 이용될 수 있다. 선택 및/또는 스크리닝후, 형질전환된 원형질체, 세포 또는 식물부분을 공지의 방법에 따라 완전한 식물로 재생시킬 수 있다(Horsch, R. b. et al., 1985). 형질전환법 및/또는 재생기술의 선택은 본 발명에서 중요한 것은 아니다.

벼를 포함한 단자엽 작물의 형질전환 및 재생은 표준공정은 아니나, 최근의 과학적 진보에 따라 원리적으로 단자엽 식물도 형질전환이 가능하며 형질전환 세포로부터 생식 능력이 있는 트랜스제닉 식물이 재생될 수 있음이 밝혀졌다. 이들 식물에 유전물질을 도입시키는 효과적인 방법과 더불어 이들 식물의 재생 조직배양 시스템의 개발로 형질전환은 더욱 용이하게 되었다. 최근에 단자엽 식물의 형질전 환을 위하여 채택되는 방법은 체외 배양체 또는 현탁세포의 미량투사 충격투입법 및 직접적 유전자 흡수법 또는 원형질체의 전기 천공법 등이다. 또한 이들 방법은 쌍자엽 식물의 형질전환 및 재생에도 적용될 수 있다.

종자에서 특정한 목적으로 사용하기 위하여 재조합 유전자를 높게 또는 적절한 수준으로 발현시키는 것으로 이미 공지된 조절서열이 본 발명에서도 사용될 수 있다. 이와 같은 조절서열은 식물 또는 식물 바이러스로부터 얻어지거나 또는 화학적 방법으로 합성될 수 있다. 이러한 조절서열은 종자에서 전사를 지휘하는 프로모터를 들 수 있다. 발현율을 높이기 위한 프로모터로서는 특히 이들에 한정되지 않지만 종자-특이 유전자의 프로모터, 특히 브라시카 나퍼스의 CruA 프로모터와 같은 저장 단백질 유전자의 프로모터(Ryan et al., 1989)또는 구조적 발현 유전자의 프로모터 예컨대 CaMV(Cauliflower Mosaic Virus)의 35S 프로모터(Guilley et al., 1982) 등이 있다. 다른 조절서열은 종결서열 및 폴리아데닐화 시그날 그리고 식물에서 이와 같은 기능을 하는 모든 서열 등이 여기에 포함될 수 있다. 구체적인 예로서는 아그로박테리움 투마파시엔의 노팔린 신타아제 유전자의 3'측위 영역 또는 브라시카 나퍼스의 CurA유전자의 3'측위 영역 등이 있다. 또한 조절서열에서는 CaMV의 35S프로모터에서 발견되는 것과 같은 인핸서서열, AIMV(Alfalfa Mosaic Virus) RNA4의 리더 서열과 같은 mRNA안정화 서열(Brederode et al., 1980)또는 이와 같은 기능을 하는 기타 서열 등이 포함될 수 있다.

또한, 경우에 따라서는 병저항성 관련 유전자는 특정 식물체 내에서 대량으로 발현되어지는 경우에는 식물에 스트레스를 주게 되어 변형된 표현형을 나타낼 수 있다. 따라서, 경우에 따라서는 병저항성 관련 유전자의 발현율을 적절한 수준으로 조절해 주는 것이 필요한데, 이러한 경우 병원균의 침입시에만 발현되는 프로모터를 이용하는 경우 보다 효과적인 병 저항성 식물체를 개발할 수 있을 것이다. 이를 위해 다른 환경조건 즉, 예를 들어 무생물적 스트레스(abiotic stress)나, 내생 신호 분자(endogenous signal molecule)에 의해 영향을 받지 않으면서 감염부위에서만 병원균에 의해 조절되는 엘리시터의 생성이 국소적으로 빠르게 이루어지는 것이 바람직하다. 선행 기술에 의하면 hsr203J 프로모터는 담배 식물체에서 병원균의 침입시에만 유전자의 발현을 유도시키는 것이 알려져 있으며, 본 발명의 실험결과 위 hsr203J 프로모터는 벼에서도 유용한 것으로 확인되었다.

상기 본 발명의 적합한 유전자 구성체의 모든 부분(프로모터, 조절서열, 안정화서열, 시그날 서열 또는 종결서열)은 필요하다면 공지 기술을 사용하여 이들의 조절 특성이 변하도록 변이 될 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

<실시예 1> 유전자 분리 및 동정

산토모나스 오리재에서 엘리시터 유전자를 분리하기 위하여 먼저 전체 산토모나스 오리재 유전자를 함유하고 있는 유전자 도서관(라이브러리)을 만들었다. 라이브러리는 전체 산토모나스 오리재 유전자를 분리하여 Sau3A 제한효소를 처리하여 분리한 뒤 BamHI 제한효소를 처리한 클로닝 벡터 pLAFR3 에 전부 넣었다. 총 5,000 개의 콜로니를 선발하여 총 유전자를 함유한 라이브러리를 구축하였다. 병저항성 유도에 관련된 유전자가 hrp 유전자군에 함께 있으므로 먼저 hrp 유전자군을 서던 분석에 의하여 찾았다. 총 26 kb 크기의 hrp 유전자 군을 찾았으며 그 유전자군의 끝 부분에 엘리시터 hpa1A 유전자가 위치하고 있었다 (도 1참조). hpa1A 유전자를 분석한 결과 139 아미노산을 가지고 있으며 13.7 kDa의 무게를 가지고 pI는 4.03으로 추정된다. 산토모나스 오리재에서 분리된 엘리시터는 산토모나스 글라이신스에서 분리된 유전자와 44.68％의 상동성을 가지며 산토모나스 시트라이에서 분리된 유전자와 70.92％의 상동성을 가진다. 본 유전자를 데장균에 넣어 단백질을 대량 발현시켰으며 그 결과를 이용한 항체를 가지고 검정한 결과 엘리시터가 산토모나스 오리재에서 생성 분비됨을 확인할 수 있었다.

<실시예 2> 사용된 균과 유전자 조작

플라즈미드 pHG21A (from Dr. Dominique Roby; Pontier et al, 1994)에서 hsr203J 프로모터를 EcoRⅠ으로 잘라 pBleuscriptKS+에 구축하여 6.4Kb의 전달벡터를 제조하였다 (도 2A). 병원성 세균의 침입 시만 유전자의 발현을 유도하는 프모터로 담배에서 유래한 hsr203J 프로모터가 벼에서 발현되는지 확인하기 위해 종자 치상 후 4주된 캘러스에 pMS-hsr (도 2A)을 투사한 후 X. oryzae pv. oryzae Kxo85를 처리하여 uidA 유전자의 발현을 관찰하였다 (도 2B). 무 처리 구와 완충액 처리 구에서는 0시간과 24시간 샘플 모두 아무런 반응이 없었고 병원균 처리 후 24시간 에서 uidA 유전자가 발현되었다. 이를 통해 hsr203J 프로모터가 벼에서도 병원균에 의해 발현됨을 알 수 있었다.

트렌션트 에세이(Transient assay)를 위해 hpalA는 CaMV 35s 프로모터와 함께 pBluescriptKS 벡터에 넣어졌고 (pMS-35hpa1A), hsr203j 프로모터와 대조구로서 uidA 유전자는 pHG21A 에서 EcoRⅠ으로 분리하여 pBluscriptKS로 다시 재조작되었다 (pMS-hsr) (도 3A).

<실시예 3> 트랜션트 에세이

유전자 총(gene gun)을 이용한 트랜션트 에세이는 Bio-Rad PDS-1000/He 시스템을 사용했으며 재료 준비과정은 Bio-Rad 매뉴얼에 따라 수행되었다. 플라즈미드 DNA (pMS-35hpa1A, pMS-hsr) 0.8 ㎍을 0.5 ㎎의 텅스텐 입자에 코팅하여 1,100 psi의 압력으로 각 샘플에 투사(Bombardment)하였다. HR 반응을 보기 위해 콩(cv. Williams)의 1차 엽과 배추의 잎을 10％ NaOCl로 표면 살균하고 MS0 배지에 얻어 투사시킨 후 25℃, 12시간 빛이 비치는 조건에서 3일간 배양하였다. GUS 반응을 위해 4주된 낙동 벼 캘러스를 2N6 배지에 얻어 투사한 후 28℃, 암 상태에서 밤샘한 후 10 mM MgCl₂ 에 현탁한 X. oryzae pv. oryzae Kxo85(OD=0.5)를 분무 접종하고 0 시간, 24 시간에 샘플링하여 -70℃에 보관하였다. 각 샘플은 X-gluc 인산완충용액(0.1 M 인산 (pH6.7), 50 mM K3[Fe(CN6)], 50 mM K4[Fe(CN6)]ㆍ3H₂O, 10 mM EDTA(pH8.0), 0.5％ 트리톤 X-100)에 0.1 ㎎/㎖ X-gluc 스톡 (N,N-디메틸 포름아마 이드내에 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-글루큐로나이드)을 1/100로 희석한 용액에 넣어 28℃에서 1일간 반응시킨 후 100％ EtOH로 세척한 후 관찰하였다.

실험결과에 의하면, 대조구인 uidA 유전자(리포터 유전자)가 들어 있는 pBI221에서는 아무 반응을 보이지 않았고, 엘리시터 유전자가 있는 pMS-35hpa1A에서는 HR 반응을 확인하였다. 이를 통해 hpa1A가 저항성을 유도할 수 있는 엘리시터를 생성하는 정보를 가지고 있음을 확인 할 수 있었다 (도 3B).

<실시예 4> 형질전환

아그로박테리움을 이용한 벼의 형질전환에 사용할 벡터에 항시 발현을 위한 액틴 프로모터와 병원균 접종시에만 발현하도록 하기 위해 hsr203J 프로모터가 이용되었고, 상기 두 종류 프로모터에 uidA, hpa1A 유전자를 각각 조작하여 넣었다 (도 4). 아그로박테리움을 이용한 형질전환을 위한 벡터들은 형질전환할 각각의 타겟 유전자를 MAR (matrics attachment region) 유전자를 포함하는 pSB11 벡터에 구축하였고, 헬퍼 플라즈미드 pRK2013을 사용한 triparental mating을 통해 형질전환에 사용될 vir 유전자들을 포함한 pSB1 플라스미드를 가진 아그로박테리움 LBA4404에 트랜스포메이션 되었다 (Komari, T. et al. 1994).

아그로박테리움 LBA4404로의 트랜스포메이션 과정은 다음과 같다. 먼저 옮길 엘리시터 유전자를 함유한 pSB11AP, HP, AH, HH의 플라즈미드를 대장균에 트랜스포메이션 한 뒤 이 대장균을 헬퍼 플라즈미드 pRK2013를 가진 대장균과 혼합하였다. 트랜스포메이션 할 시간이 지난 후 아그로박테리움 LBA4404와 혼합한 뒤 항생제가 전혀 없는 영양배지에서 하루 배양하였다. 플라즈미드 pSB1과 pSB11은 서로 결합하여 단일 교차(single crossover)를 이룬 후 pSB111이란 하나의 플라즈미드로 되고 항생제 테트라사이클린을 이용하여 원하는 유전자를 함유한 균만을 선발하였다.

이렇게 선택된 아그로박테리움 LBA4404는 각각의 형질전환될 유전자를 함유한 아그로박테리움 LBA4404(pSB111AP, HP, AH, HH)들로서 원하는 유전자의 존재 여부를 플라즈미드의 분리와 분석을 통하여 확인한 뒤 벼의 캘러스 형질전환에 사용하였다. 벼의 형질전환 과정은 다음과 같다.

껍질 벗긴 낙동 종자(벼)를 70％ EtOH에서 1분, 50％ Clorox 용액에서 15분씩 2회 소독하고 멸균수로 10분씩 3회 이상 세척하였다. 소독한 종자는 2N6 배지(Hiei, et al., 1994)에 치상하고 28℃, 암 상태에서 4주간 배양하여 배발생 캘러스를 형성시킨 후 새로운 2N6 배지에 옮겨 4일간 더 배양하였다. 형질전환을 위해 각 유전자를 갖고 있는 LBA4404 균주들은 50 ㎎/ℓ스펙티노마이신, 10 ㎎/ℓ 테트라사이클린을 포함하는 AB 한천 배지 전체에 고루 퍼지도록 접종하여 28℃에서 2일간 배양한 후 50㎎/ℓ 스펙티노마이신, 10 ㎎/ℓ 테트라사이클린을 포함하는 AAM 배지 (Hiei, et al., 1994)에 현탁하여 600 mM에서 OD 1.8-2.0 이 되도록 준비하였다. 새로운 배지에서 4일간 배양한 캘러스들과 각 균주의 현탁액을 10분간 공배양한 후 2N6-AS 배지(Hiei, et al,. 1994)에 옮겨 23-25℃, 암 상태에서 3일간 배양하였다. 3일 후 캘러스들을 250 ㎎/ℓ 세포탁심(cefotaxime)을 포함한 멸균수로 수 차례 세척하여 250 ㎎/ℓ 세포탁심과 6 ㎎/ℓ PPT(L-phosphinothricin)가 첨가된 2N6-CP 배지로 옮겨 28℃, 암상태에서 3주간 배양하였다. 3주 후 갈변하지 않고 생 생한 캘러스들을 새로운 2N6-CP로 옮겨 2주간 더 배양하였다. 2주 후 살아남은 캘러스들을 30 g/ℓ 수크로즈, 2 ㎎/ℓ 키네틴, 0.5 ㎎/ℓ NAA, 250 ㎎/ℓ 세포탁심과 3 ㎎/ℓ PPT를 포함하는 MSR-CP(pH 5.8)로 옮겨 26℃, 항시 빛이 비치는 조건에서 한 달간 배양하였다. 한 달 후 새로운 MSR-CP로 옮겨 더 배양한 후 형성된 슈트(shoot)를 30 g/ℓ 수크로즈를 포함하는 MS0 (pH 5.8)에 옮겨 뿌리를 형성시켰다. 7-8일 후 뿌리가 잘 형성되면 순화과정을 거쳐 흙에 이식한 후 온실로 옮겼다. 식물체가 어느 정도 적응하면 제초제 (0.03％ 바스타) 저항성을 확인하였다.

형질전환 실험결과 각 구조체별로 12 - 56 라인, 23 - 105 개체에 이르는 T0를 얻었다 (표 1). uidA와 hpa1A 유전자를 이용한 구조체는 비교적 쉽게 형질전환이 되었고 T0도 많은 수를 얻을 수 있었다.

<표 1>

구조체	T0 라인	개체	죽은 것	불임
act1::uidA	43	98	3	12
hsr203J::uidA	36	67	4	2
act1::hpa1A	56	92	3	2
hsr203J::hpa1A	52	105	21	13

actin::uidA의 경우 43 라인-98 개체를 얻었고 대부분의 T0 라인은 표현형에 있어서 야생형과 동일하였지만 일부 라인은 왜소하며 잘 자라지 못하거나 죽어버리기도 하고 정상적으로 성장한 12 개체도 불임이었다. hsr203J::uidA의 경우 4개체가 죽었고 2개체는 불임으로 판명되었으며 31 라인-62 개체는 아직 성장 중이어서 불임여부를 판별할 수는 없지만 모두 잘 성장하고 있다. X.oryzae pv. oryzae에서 분리한 엘리시터인 hpa1A는 액틴 프로모터와 hsr203J 프로모터에서 비교적 쉽게 형질전환 되었다. act1::hpa1A는 56 라인-92 개체, hsr203J::hpa1A는 52 라인-105 개 체를 얻었으며 이중 act1::hpa1A에서 3개체가 죽고 정상적으로 성장한 2개체가 불임이었다. hsr203J::hpa1A의 경우 비교적 많은 수 인 21개체가 죽었고 13개체는 불임으로 판명되었다.

<실험예 1> 유전자의 발현검정 및 병저항성 검정

실험과정

액틴 프로모터를 이용한 형질전환체 T0 라인들의 잎을 채취하여 트리졸 (Ambion Co.)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 1.8％ 포름알데하이드 겔에 내려 Hybond-N⁺(Amersham Co.) 막에 전이한 후 ³²P를 이용하여 각 유전자의 발현을 확인하였고 콩에서 분리한 defense-related gene(PAL : 페닐알라닌 암모니아-리아제, CHS : 칼콘 합성효소, IFS : 이소플라본 합성효소, POX : 퍼옥시다제, PR1 : pathogenesis-related protein 1)의 발현도 확인하였다.

병저항성 검정을 위하여, 성숙한 형질전환체 중 액틴 프로모터 그룹 T0 라인의 잎에 10 mM MgCl₂ 에 현탁한 Xanthomonas oryzae pv. oryzae Kxo18 (OD=0.5)를 가위 접종하고 14일 후 병발생 정도를 병반 길이를 측정하여 검정 하였다.

실험결과

형질 전환체 중 actin::uidA T0 라인의 경우 uidA 유전자를 프로브로 사용하여 노던 블롯을 수행한 결과 야생형을 비롯하여 모든 레인(lane)에서 비특이적인 결과가 나와 그 유전자가 발현되는지 확실하게 판단하기 어려웠지만 (도 5A), GUS 검정을 통해 확인한 결과 모두 β-글루큐로니다제 활성을 보여 uidA 유전자가 발현되었음을 확인하였다. 콩에서 분리한 병방어관련 유전자의 발현을 actin::hpa1A 라인과 비교해 볼 때 병방어 유전자 중 PAL과 CHS의 발현은 uidA에 의해 유도되지 않았다. X.o.o Kxo18을 접종한 결과 1, 7a, 9a, 14b에서 다소 낮은 수준의 병징을 보이지만 대부분 10cm이상의 높은 수준의 병징을 나타내었다 (도 5B). 이들은 야생형과 함께 트랜스포메이션의 대조구로 사용할 수 있을 것이다.

actin::hpa1A T0 라인의 경우 hpa1A 유전자가 라인별로 다르게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 5, 16, 39 라인은 hpa1A가 발현되지 않았고 32, 33, 40, 41, 42, 43, 48 라인은 다른 라인 보다 많이 발현되었으며 PAL 유전자의 발현을 분명하게 확인할 수 있었다. 이중 33과 48을 제외한 32, 40, 41, 42, 43에서는 CHS 유전자도 발현됨을 알 수 있었다 (도 6A). X. oryzae pv. oryzae Kxo18을 접종한 결과 일부 10cm이상의 높은 수준의 병징을 나타내지만 대부분 낮은 병징을 보였고 특히 PAL과 CHS가 모두 발현되는 41, 42, 43 라인은 상당히 저항성을 보이는 것으로 확인되었다 (도 6B).

본 발명에 의하면 단자엽 식물 및 쌍자엽식물의 많은 식물체에 있어서 다양한 종류의 병에 대하여 수평저항성을 발휘하는 엘리시터 유전자를 제공할 수 있으며, 따라서, 종래 저항성 품종이 수직 저항성인 것에서 초래되는 문제점을 극복할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 상기 예시된 유전자 서열 이외에도 이들과 상보적인 서열 또는 다양한 변형서열이 이용되어질 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이며, 또한, 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

<참조문헌>

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