CN101864416B - 玉米根部淹水表达Zmzf基因的启动子 - Google Patents
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Abstract
本发明属植物基因工程技术领域，其特征是从玉米自交系Mo17中克隆获得一种玉米根部淹水高效表达Zmzf基因的启动子，该启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；利用本发明所提供的Zmzf基因的启动子，与抗虫、抗病、抗逆等目的基因连接，并应用于旱生植物的遗传转化，在涝渍、淹水等厌氧条件下，可以促进下游目的基因的高效表达，提高转基因植株根部的抗虫、抗病、抗逆境等能力；同时该启动子只在根部表达，不涉及食用转基因植物地面以上部分的食品安全问题；因此，本发明在旱生植物的耐渍遗传改良中具有很好的应用前景。
Description
技术领域：
本发明涉及玉米根部淹水高效表达Zmzf基因的启动子，属植物基因工程技术领域。
背景技术：
我国南方春玉米和北方夏玉米在正常的栽培季节中，经常遭受洪涝和渍害，玉米根系长期处于低氧状态，导致玉米减产10％-40％。创制耐渍玉米新种质的途径一般有两条，一是发掘和利用现有玉米种质或其近缘物种中的有利基因，通过杂交、回交等育种手段或分子标记辅助选择等生物技术手段，将耐渍相关基因导入现有优良玉米育种材料中。然而，玉米及其近缘种耐渍资源的缺乏，至今未培育出耐渍性较强的新种质。二是利用基因工程技术对玉米进行耐渍性遗传改良。由于植物耐渍分子机理的复杂性，尽管已经克隆出了一些与耐渍相关的基因、顺式元件及转录因子，但仍然不能解决生产中遇到的实际问题。
玉米Zea mays bZip factor基因，筒称为：Zmzf基因(下同)。Zmzf基因的启动子含有厌氧反应相关的ARE和GC-motif顺式元件，是典型的厌氧响应启动子。Zmzf基因启动子的克隆，目前尚未见有报道。
发明内容：
本发明的目的是从玉米自交系Mo17中克隆玉米根部淹水高效表达Zmzf基因的启动子，并利用该启动子对旱生植物的耐渍性进行遗传改良。
本发明的技术方案是：
1.玉米自交系Mo17叶片总DNA的提取
取玉米叶片5.0g于液氮中研磨，转入50ml离心管中。加预热至95℃的CTAB缓冲液(1.17M NaCL、0.0016M EDTA-8.0，0.835M Tris-7.5，1.6％CTAB，1％β-疏基乙醇)10ml，混匀。在65℃水浴锅内反应90分钟，不时轻摇离心管。取出离心管，待冷至室温后，加入等体积氯仿∶异醇(24∶1)，小心摇动试管10分钟。8000rpm离心10分钟，将上清转至另一50ml离心管中。加2/3体积异丙醇，小心混匀，将棉絮状DNA转入盛10ml 70％乙醇的50ml离心管中，浸泡12小时。倒掉70％乙醇，将DNA晾干，加入1ml TE溶液溶解。待DNA完全溶解后，转入2.0ml离心管中，加入10μl 10mg/ml RNaseA，混匀；在37℃下，温育2小时。再用1ml苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，8000rpm离心10分钟。将上清液转入2.0ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC(pH5.2)，2/3体积异丙醇沉淀DNA。将棉絮状DNA转入2.0ml离心管中，用70％乙醇洗涤一次，短暂离心，使DNA贴壁，倒去70％乙醇，晾干DNA。待DNA晾干后，加入0.5ml TE溶液，完全溶解DNA，于-20℃长期保存。
2.Zmzf基因启动子的克隆
根据Zmzf基因第一个外显子，设计、合成3个特异性右引物(Bf1、Bf2、Bf3)，分别与4个简并引物(AD1、AD2、AD3、AD4)进行TAIL-PCR扩增。回收第三轮的扩增产物，并连接到pGEM-T easy载体上，进行DNA测序。根据测序所得的DNA序列再设计、合成3个特异性右引物，重复上述实验，不断进行TAIL-PCR扩增。当所得序列向前延伸近2Kb左右，将DNA序列拼接起来，进行生物信息学分析。
TAIL-PCR第一轮扩增：2.5μl 10×PCR缓冲液，2μl 10mM dNTPs，1μl 10mM特异引物Bf1，1μl 10mM简并引物(AD)，1单位Taq酶，40ng模板 DNA，总体积25μl。TAIL-PCR扩增程序为：92℃3分钟，95℃1分钟；94℃30秒，65℃1分钟，72℃2分钟，循环5次；94℃30秒，25℃2分钟，Rampingto 72℃2分钟，72℃2分钟；94℃30秒，65℃1分钟，72℃2分钟，94℃30秒，65℃1分钟，72℃2分钟，94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分钟，循环15次；72℃5分钟。
TAIL-PCR第二轮扩增：取第一轮的PCR产物1μl，再加入39μl ddH2O，稀释40倍。2.5μl 10×PCR缓冲液，2μl 10mM dNTPs，1μl 10mM特异引物Bf2，1μl 10mM简并引物(AD)，1单位Taq酶，1μl稀释40倍的第一轮TAIL-PCR产物，总体积25μl。TAIL-PCR扩增程序为：94℃30秒，65℃1分钟，72℃2分钟，94℃30秒，65℃1分钟，72℃2分钟，94℃30秒，45℃1分钟，72℃2分钟，循环12次；72℃5分钟。
TAIL-PCR第三轮扩增：取第二轮的PCR产物1μl，再加入9μl ddH2O，稀释10倍。2.5μl 10×PCR缓冲液，2μl 10mM dNTPs，1μl 10mM特异引物Bf3，1μl 10mM简并引物(AD)，1单位Taq酶，1μl稀释10倍的第二轮TAIL-PCR产物，总体积25μl。TAIL-PCR扩增程序为：94℃40秒，45℃1分钟，72℃2分钟，循环20次；72℃1分钟。
3.转化载体的构建
使用带酶切位点的引物，以玉米自交系Mo17的DNA为模板进行PCR扩增。将PCR产物与pGEM-T easy载体连接，转化Escherichia coli DH5α，生长在含氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体平板上的白色菌株被分离出来。经PCR检测，选择阳性克隆进行DNA测序，提取所克隆Zmzf基因启动子序列正确的质粒DNA。使用限制性内切酶酶切质粒，1％琼脂糖凝胶电泳，回收Zmzf启动子片段。使用相对应的内切酶酶切pBI121载体，将Zmzf基因启动子构建 到pBI121载体中，构建成pBI121-Zmzf-GUS载体，转化到农杆菌GV3101菌株中。
对所克隆的Zmzf基因的启动子进行DNA测序，其核苷酸序列如下：
序列表SEQ ID NO：1
<110>长江大学
<120>玉米淹水诱导高效表达Zmzf基因的启动子
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2008
<212>DNA
<213>Zea mays
<220>
<221>promoter
<222>(1)..(2008)
<400>1
gttttgaggt cgattggagt tacggatttt agttagcaac atttttacta acataacatc 60
aatctgtcca gtattataaa actgcaatgt tttggttttg tgatgattag gagaaggcga 120
actaaatatt tttaagcttc cacaatcatt cattccctct gattgtctac tttagcatca 180
tacaatccta aatattatat atcacaagaa aattcatagg ttctttacac atcagttgtt 240
ttagctataa attttagcta taaattttag ttctatcaca tcagttgttt gaatactagt 300
tagaactatt aaatatagtc taactataaa actaattata tgtataagaa ctatacggca 360
agacaagtct taagcttaat tgatctataa taatttgcta atcatagatt aattaggctt 420
aataattttg actcgtcgtt tagtctttat atatgtaatt agttttatac ttagactata 480
tttaatatta tgaatttaaa tatcccatga gacatgaact aatcttgagt cacgtcaaat 540
caaaaagata ctcgtgcctt tttgtattaa ctagtccact atctaagaac taaacatatc 600
actgctagct aatattttga actaaacttt agctagctaa agcttagata tgatgaaact 660
gaatgatctt ttagtttcaa ttaggaaatc atgcattatt acttcagatc atcatgtaaa 720
tctattttaa aaaaatgttc aaacaaaaaa aaagttatac atagtccttc caccaacgta 780
taaaccctat tgtagtctga attataaagg gcatgtttgg ttcagttttt tctgaccagc 840
ttttctaaga acatgtctgt aaagaaattt tggttgtaga aagaatctaa atattatggg 900
gattacgtgc ggaggaagat gaaatggttc aaaggatcca ggacctagaa agcgatggat 960
ttctactatc gtgacgactc aatcgatatt atgttcatgt tgtttttgga cgatttttac 1020
caaaataatt cttataaaag tactgaaaag ctgtggtgtt tgatgacagt ctatatcatc 1080
gtttggtgac gagaagctaa aaaaggtcca aacaaacgtg accaaaacag cttggccata 1140
aagtgccttt ttttaccatg attctggtaa cctaacgttc ttttaacgtt cttttacaag 1200
cagcttctat tgttctcgat gtatcggtta aaaccagatc acaagtaaga gaccgtttgt 1260
agcaaaagga ttggaaggat tgaagaggct aaaacctctt tattattaaa ggggattaag 1320
gctaaaatct ttctgctatt taaaattaaa catctaggga attttagctc gtttaatccc 1380
tcaaatgttt acgatgaaat taatttaacg aaaatataaa atacctattt ttgtgtcacg 1440
tatccggtat cccaaagaga agtccaatac gtagggaaaa aatttggtgc agcactgctg 1500
taaaccagag tgtttgcagc ccctcacaaa aaagaggata gaccccaccc gcagcaacaa 1560
aaatgttatc tggtggacct gcaggtgagg tctatcctcc tttttgtgag aggctgcaaa 1620
ccactctggt ttgcagcagt gctgcaccaa atttttttcc aatacgtatg ctgcgaaaac 1680
cagattaaca tttcccagct tatcacaaaa gaagcaatga tatttccact cccaaggaaa 1740
aaagagagag aaaaaaaggt agtaggcggc aatccaacgg cggggacctc cgcccgcctc 1800
cggcatggaa aaatcgccgc gggggccggc gaggggggca gcttcgtcat ttccggcgcc 1860
ctcctccttt cctttatctc tctccccacg cccccacgtt tcgcccccca tttcgaagcc 1920
caccgaattc cctgcgattc ctctcccctc gcctcctcgt ctccccctag ggttagcacc 1980
tcgctgcctc cgattcaatc ataatatg 2008
4.转Zmzf基因启动子拟南芥植株的获得
将含pBI121-Zmzf-GUS载体的GV3101农杆菌接种于LB液体培养基，加入利福平和卡那霉素至终浓度为100mg/L，28℃振荡培养。离心收集菌体，用ddH2O稀释至OD＝0.8，每100ml菌液加入5.0g蔗糖和50μl Silwet L-77。使用floraldip方法对拟南芥进行侵染，成熟后收获种子，将种子播在含100mg/L卡那霉素的MS固体筛选培养基上。从筛选培养基中长出的抗性植株，经PCR检测后 确定为转Zmzf基因启动子阳性植株。
5.Zmzf基因启动子活性的检测
在拟南芥苗期进行淹水处理，将正常生长和淹水处理的转基因拟南芥幼苗进行GUS染色。结果发现，在正常生长条件下，转Zmzf启动子拟南芥植株的根和叶片，未出现GUS染色的蓝色；而淹水条件下，转Zmzf基因启动子拟南芥的根呈现较强的GUS蓝色，叶片未见GUS蓝色。研究表明Zmzf基因启动子既是一个在根中表达的组织特异型启动子，同时也是一个淹水诱导表达的诱导型启动子。
利用本发明所提供的Zmzf基因的启动子，与抗虫、抗病、抗逆等目的基因连接，并用于旱生植物的遗传转化，在淹水、涝渍条件下，可提高转基因植株根部的抗虫、抗病、抗逆境等能力；同时该启动子只在根部表达，不涉及食用转基因植物地面以上部分的食品安全问题；Zmzf基因启动子在旱生植物的耐渍遗传改良中，具有很好的应用前景。
具体实施方式：
把Zmzf基因的启动子克隆到转化载体上，其后连接一个Tnos终止子，构建成一个转化载体。将所转化的目的基因以正确的方向，克隆到Zmzf基因启动子与Tnos终止子之间，构建好转化载体。然后通过基因枪轰击法或农杆菌介导法将目的基因转化到受体细胞中，通过组织培养等技术手段获得转基因植株。在涝渍、淹水条件下，Zmzf基因启动子可以启动促进下游目的基因在植株根部的高效表达。
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1.玉米根部淹水表达Zmzf基因的启动子，其特征在于启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
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