CN102399781B - 玉米伤口诱导型启动子及活性分析 - Google Patents

Abstract

玉米伤口诱导型启动子及活性分析属生物工程技术领域，本发明提供了一种获得的玉米伤口诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1888bp区的DNA核苷酸序列；同时提供：用于玉米转化的伤口诱导型的植物表达载体，包含玉米伤口诱导型启动子序列和玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的5’非翻译区；用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的PCR引物适于扩增包含SEQ ID NO：1的序列DNA片段。本发明可用于启动抗虫、真菌基因的高效表达，应用于不耐虫、真菌的植物中使植株获得抗虫、真菌的性状，对于解决病虫害高发地区粮食危机问题有积极意义。

Description

玉米伤口诱导型启动子及活性分析

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及一段DNA序列，在低温胁迫下它可以作为启动子调控基因的表达，具体涉及一种来源于玉米脂氧合酶基因ZmLOX11并在植物中高度表达的伤口诱导型启动子序列。 

背景技术

中国是一个人口众多的农业大国，粮食安全生产事关国计民生与社会稳定。我国是农业生物灾害(病害、虫害、鼠害、草害)多发和重发的国家。据调查，我国常见农作物有害生物达1600多种，其中造成严重危害的有近100种，年发生面积达70亿亩次。联合国粮农组织的研究结果表明，农作物病虫害自然损失率在37％以上，据此测算，若不采取防控措施，我国每年因病虫危害将损失粮食3000亿斤。目前，重大农作物病虫害的控制往往依赖化学防治，农药的使用不仅增大生产成本，而且其反复施用不可避免地带来环境污染、抗药性及农产品农药残留等一系列问题。因此，加强植物病害致病机理、寄主植物抗病机制及培育抗病品种等关键问题的研究和昆虫取食作物后植物体的防御机制可为植物病虫害控制新策略的制定与防治关键技术的研发奠定理论基础，从而进一步为我国农作物优质高产、降低生产成本、减少环境污染与农产品农药残留提供技术保障。 

自转基因技术成熟以来，科学家们已经得到了很多转基因品种。然而，由于转入的基因大多数是由组成型启动子驱动表达的，组成型启动子具有高效表达、且在植物整个生长期都表达的特点，这使得大部分的转基因作物都具有植株矮小的特点，不利于植物的正常生长。而诱导型启动子在某些特定的物理或化学信号的刺激下，能够快速有效地诱导基因的转录，来抵御不良环境的影响。诱导型启动子独特的优点是它能根据自身的需求在特定的组织器官、环境下诱导基因转录，解决组成型启动子面对的问题。迄今为止，从玉米中分离的逆境诱导型的启动子很少。 

许多植物都能对人为创作或病虫害造成的机械损伤作出反应，使某些伤口诱导基因表达。这些伤口诱导的基因编码多种蛋白产物：包括几丁质酶、蛋白酶抑制剂和脂氧合酶等。RCH8是水稻的I类几丁质酶基因，中科院植物生理研究所的李红等在PUC19载体质粒中构建了一组5’端不同程度缺失的RCH8基因启动子与GUS报告基因翻译融合的重组质粒。用PEG法转入烟草原生质体中，通过测定GUS酶活性发现RCH8启动子-1016～676bp之间的DNA序列缺失后表达活力显著下降，缺失到-68bp处的启动子仅有很低的活力。此外，泛素核糖体蛋白融合基因ubi3、马铃薯pin2基因启动子同样也受到伤口诱导。 

利用伤口诱导型启动子驱动抗病虫基因的高效表达，从而改良作物的抗病虫性成为目前研究的热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的抗病虫相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这 些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种伤口诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目的基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米脂氧合酶基因ZmLOX11。 

本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的伤口诱导型启动子真核表达载体，该载体指导高水平表达目的基因ZmLOX11的伤口诱导型启动子序列和5’非翻译区。 

本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因玉米成熟胚。该转基因玉米胚能反映启动子诱导活性的高低。 

为实现上述目的，本发明克隆了玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的伤口诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体，所述载体包含带有ZmLOX11基因的5’非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米成熟胚中诱导表达，并观察到该启动子与伤口诱导相关的高水平活性。 

本发明提供一种获得的玉米伤口诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1888bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，伤口可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。 

获得的玉米伤口诱导型启动子序列源自玉米脂氧合酶基因ZmLOX11。 

一种克隆得到的玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的5’非翻译区包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的+1bp至+104bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，本发明所述的玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的5’非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。 

为实现另一个目的，本发明提供一种用于玉米转化的伤口诱导型的植物表达载体，所述植物表达载体包含玉米伤口诱导型启动子序列和玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的5’非翻译区。 

上述用于玉米转化的伤口诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含T-DNA(转移DNA)的RB(右边界序列)和LB(左边界序列)，能够在根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)Ti质粒存在下转化植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体，例如pCAMBIA1301载体、pBI121载体。 

一种用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚，包含玉米伤口诱导型启动子序列和玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的5’非翻译区。 

本发明提供SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的PCR引物，适于扩增包含SEQ ID NO：1的序列DNA片段。 

关于本发明所述的用于植物的诱导型载体(pCAMBIA1301)，所述的玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的启动子和5’非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的启动子和5’非翻译区至含有GUS报告基因的载体中而构建的pCAMBIA1301。但是，所述GUS报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它 有用的外源基因来代替。 

本发明提供一种应用伤口诱导型瞬时表达的玉米成熟胚。 

植物能通过使用根癌农杆菌(An，G.1987，Plant Physiology)或粒子轰击方法(Lacorte 等，1997，Plant Cell Reports)将上述植物伤口诱导型启动子二元载体进行转化。 

本发明提供来自玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的伤口诱导型启动子和5’非翻译区，根据本发明的启动子和5’非翻译区使得能够在植物中进行伤口诱导表达。 

本发明的有益效果在于可用于启动抗病虫害基因的高效表达，应用于抗病虫害的转基因植物中，对于解决病虫害高发地区粮食产量下降问题有积极意义。 

附图说明

图1为玉米(B73)基因组电泳图 

图2为ZmLOX11-pro PCR电泳图 

图3为ZmLOX11-pro连T载酶切鉴定电泳图 

图4为ZmLOX11-pro连pCAMBIA-1301 PCR鉴定电泳图 

图5为ZmLOX11-pro连pCAMBIA-1301酶切鉴定电泳图 

图6为pCAMBIA 1301::ZmLOX11-Pro转农杆菌PCR鉴定电泳图 

图1至图6中：Maker从大到小依次为1849bp；1470bp；1090bp；738bp；424bp；280bp 

图7为植物表达载体构建示意图 

图8为ZmLOX11启动子的GUS检测(背面)照片 

图9为ZmLOX11启动子的GUS检测(正面)照片 

图8和图9中：ZmLOX11(a)：茉莉酸甲酯处理；ZmLOX11(b)：未处理；35S：应用最广泛的组成型启动子 

具体实施方式

下面结合附图介绍具体实施步骤，将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。尽管已经结合本发明的优选的具体实施方式来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。 

实施例1：玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的伤口诱导型启动子的克隆 

玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的启动子(启动子序列包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1888bp区的DNA核苷酸序列)，在玉米ZmLOX11基因的5’区序列中得到鉴定。 

玉米脂氧合酶基因ZmLOX11登录在NCBI GenBank(登录号：NM_001112511.1)，序列表显示本发明上述基因的植物伤口诱导型启动子和5’非翻译区的DNA序列。在本文件的启动子序列表中，转录起始位点的碱基C用+1示出，起始密码子ATG用红色下划线标注。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。启动子分析网站http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/。 

以玉米基因组DNA(图1)为模板，扩增得到目的片段，经1％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出长度为1992bp的条带(图2)，并进行回收。回收片段与pMD18-T载体连接得到重组质 粒pMD18-T::ZmLOX11Pro，提取质粒并进行酶切验证(图3)，并测序。 

更具体地说，通过PCR扩增克隆的玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的启动子和104bp的5’非翻译区(见序列表)，上述PCR所用引物详细显示在表1中。对于PCR扩增，反应程序：95℃3min；95℃30S，58.5℃30S，72℃2min，32个循环；72℃10min； 

表1：引物 

上游引物	5’TGCACTGCAGCACCAATCAAATCGAAGAGG 3’	SEQ ID NO：2
			下游引物	5’GGAAGATCTTCAATCATGGCTAGCTGCCCTG 3’	SEQ ID NO：3

实施例2：植物伤口诱导型载体的构建 

将在实施例1中所克隆的玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的伤口诱导型启动子和104bp的5’非翻译区ZmLOX11Pro(见序列表)插入到载体中，从而构建植物伤口诱导型载体。 

更具体地说，是将植物表达载体pCAMBIA 1301及重组质粒pMD18-T::ZmLOX11Pro用Pst I和Bgl II分别进行酶切，然后将它们插入载体pCAMBIA1301的Pst I和Bgl II酶切位点。该载体被称作pCAMBIA 1301::ZmLOX11Pro，用于驱动GUS基因的表达，经PCR鉴定(图4)和酶切鉴定(图5)获得启动子与载体的重组质粒。 

在图7中，以编码β-葡糖酸醛酶的基因GUS为报告基因，选择标记为潮霉素抗性基因。此外35s-pro代表HPTII的启动子，而35s-ter代表HPTII的终止子，ZmLOX11Pro代表GUS的启动子，而Nos-ter代表GUS的终止子。 

实施例3：鉴定玉米伤口诱导型启动子的活性 

通过电激转化法，将在实施例2中构建的载体pCAMBIA 1301::ZmLOX11Pro转移到根癌农杆菌EHA105中，提取质粒并进行PCR鉴定(图6)。 

为鉴定启动子的伤口诱导活性，利用Jefferson等(EMBO J，1987)的方法将玉米的胚茉莉酸甲酯处理再检测GUS的活性。 

更具体地说，是将玉米种子浸泡催芽，然后将种子纵切成两半，茉莉酸甲酯诱导培养24h，将玉米种子在GUS检测液中于37℃过夜，GUS检测液：1mg/ml X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)、50mM磷酸钠缓冲溶液(PH＝7.0)，10mM EDTA，0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、0.1％TritonX-100，20％甲醇。如图8和图9所示，经过茉莉酸甲酯诱导的玉米胚显示出高水平的GUS活性，而未经诱导的玉米胚显示出低水平的GUS活性。 

工业实用性 

如上所述，本发明提供玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的伤口诱导型启动子和5’非翻译区。 

本发明提供分别将玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的启动子和5’非翻译区插入至pCAMBIA1301而制得的植物表达载体。 

经使用所述的植物表达载体进行鉴定，本发明所述的玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的启动子和5’非翻译区能够在伤口诱导后启动下游基因的表达。因此，本发明可用于提高抗病虫害基因的启动活性，最终获得能用于生产的抗病、抗虫粮食作物或植被。 

序列表 

SEQ ID NO.1的序列(带功能元件标记) 

(i)序列特征：(A)长度：-1bp至-1888bp；+1bp至+104bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。 

(ii)分子类型：核苷酸 

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1 

-1888    CACCAATCAA ATCGAAGAGG AAGAAGAGGA TGAAGACAGT GATGATAACA 

-1833    CAACCGACCC TAGTGCAGGT GATGATGGCA ACCATGGTGA TGTTGGATTA 

-1788    TATTGTGCAG GAGGGAGTGG TGCAAGAGGG AGTAGTGCAG GAGAGAGTGG 

-1738    TGCATGAGAT TGGAGGTCCA CTAGAGGAAG TCGGTTCACC CATGCCACAC 

-1688    AACATTCTTA CCATGATGCA CCTCATTCAC AGCGAGAGAC AATAAGTGGT 

                          ← 

-1638    CGGCATCGTT CAGTTTCATT TTCTGTCCAA GATGGAATCC GTAGCTCAAG 

                         TCA-element 

-1588    TAGCTCCAAT TCTTCTAACT ATCCGCTTGG ACAAGACTCA GTCTATAACC

                                   ←                  TATA-box 

-1538    CTTTTGCATG GCAATGGCAA CCGGGTCAAG GACCACCAGA CAAAGTACCA 

         P-box                    Box-W1 

-1488    CCATCGATCA TGTATGGGTA TGGAAACTAT GGACCCCCTC CACCGCCATA 

                                        AuxRR-core 

-1438    TTCAAATTTG TCAAATAAGT ACCCACCAGG ACCACAATAT GGGTATGGAT 

                                              CAAT-box 

-1388    AAGTTCCCGC TGCACCAGTA TGTTATTTTT GCTTCGTGGA TAAGTATTTA 

-1338    TTTGCCGTTC TTGTTTTCTC GCTAATGTAT CTCATATCTT TTTGTATAGA 

                                 ←                    TATA-box 

-1288    ACTATCACTA TGACGGATTG AAACCATATC ACGATCCTTA CAACATGCTT 

                  CGTCA-motif   ARE 

-1238    GGGTACTATC ACTATGACTC GAGCTGAACA TGTGAGTATT ATAAAAATAA 

                       ←                          TATA-box 

-1188    GTCGACCTAT GTGTCGTTGA CGCATTGGAG AGATGCAAAA AAAACTTGTA 

                   TGA-element   CAAT-box 

-1138    TTTGAGTATC GCGAAGTTCG TTGGTTGTTT GTTGTATAAG AACTGAAGTT 

-1088    TGCGGTTGCA TATGTATGTC GTATGTTATT TTGGTAAATA TATGTCGTGT 

                                                 TATA-box 

-1038    GGATCAATTA ATATTTACTG TGCAATGTGA ATCGAGCAAA TTACAAATAG 

-988    AATCCTGTCA TTTTTTTCTT ATGTAAAAAA TAGTGAAAAC CGATGCATTT 

Skn-1_motif                    TATA-box 

-938    TTTTTGGAAA ACCAACGGTT TAGGGAAGTT TAATTTACCG CAGGTTTTTC 

                     CCAAT-box 

-888    ATCGATAAAC CGCCACGAAA CTAAGTTTGA TTTGGTTTGG GTAAACTGGT 

                                             ARE 

-838    CGGTACGCGG AGTTACCGAA ACCGAAGGGG TGCGGGTTTT TTAGGCTCAA 

                         LTR          ←        TATA-box 

-788    AACGGTAAAC CCGTCGACCA TTTGCTCATT GTAACAGCAA CATGACCGTC

                     ←            CAAT-box        CGTCA-motif 

-738    AACAACGTGA CCAGTTGCCG AGCAGGTCAA GTTGCAGTCG GTGACCATCT 

                    MBS           Wbox 

-688    TCTCAGAGCC GGGCACCTCG ATCTTCAGTC GACAGCGACC AGCGGTCGTG 

-638    CATGTGCAGC CTCCAGCCTT GCCACGACTT ACCTACCTGG CCAAGGCGAG 

                                            ABRE 

-588    TTGCGAGCTA CTCTTGTGAG GGGCACACCG GCCCACGCGT CGCACACGGT 

                         ← 

-538    ACATATCCAT GGAACCACGT ACGCCCAGAT CGATCGTTTC GAGACAATCT 

                          ABRE                        CAAT-box 

-488    TCTCTTTGTC CATGGCAAGA CGTTGGACAC TGCAACAGCA ATGGTACTTG 

-438    ATCGTCAGAG CACTCATCGG TGGTCAGGGA AACAGTTCGA GCCAATCCGC 

      CGTCA-motif                                   CAAT-box 

-388    CCTTTCAAAG ACCCGGCCTG TCGATCCTCT CGAGATCGAG TCGTTGGTCC 

                                                 TGA-element 

-338    TTCCGTTCCA CGCGAGATCC TGTTAGGTGG TCACGGAAAC AGTTCGAGCC 

                                           ← 

-288    TGCCTTGCAA AGAACAGCTC GCTCTGAGCA TTGGCACACA CACACCACAC 

                                        CAAT-box 

-238    CAGTCGCTGA TATTAGAGAA AATTCCTGGT ATGCCATCAT ATTTTATACT 

                            HSE                       TATA-box 

-188    CATCCCTTGT GTGCCACTGA GTGGCATATA GGTATATTTT TTGGTGTCTA

                                           TATA-box 

-138    TGACATGTGG GGCTAGTGGC ATACAAGGAA TGAGTATATT TTCCAGTGGC 

Skn-1_motif      ←            ←                 ABRE 

-88     ATACAGGGAA TTGGCCCCTG ATATTATTCC GATCCCCCAC GTGCAACACG 

              CAAT-box        TATA-box 

                                                 +1 

-38     GCATCTACCC CACCGGACTC ACTATATCTA CGGCCCATCA GCATACGCAC 

                             TATA-box 

+13     AGACCGCGCG CTCGGTCGAC TACTGGCTAG CTTGTTTCAG TCGTCCGATC 

+63     TGATCTACAG AAAAAGCAGG GGCAGGGCAG CTAGCC    ATGATT 。

Claims (3)

1.一种获得的玉米伤口诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种用于玉米转化的伤口诱导型的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体包含权利要求1所述的玉米伤口诱导型启动子序列。

3.一种PCR引物对，其序列如SEQ ID NO：2和3所示，所述引物对适于扩增如权利要求1所述玉米伤口诱导型启动子序列，其中SEQ ID NO：2序列为：5’TGCACTGCAGCACCAATCAAATCGAAGAGG 3’，SEQ ID NO：3序列为：5’GGAAGATCTTCAATCATGGCTAGCTGCCCTG 3’。

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