CN101353376B - 一种与水稻抽穗期相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与水稻抽穗期相关基因及其编码的蛋白与应用。本发明所提供的水稻抽穗期相关基因OsDof12，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中的序列1；2)序列表中的序列2；3)编码序列表中的序列3蛋白质序列的核苷酸序列；4)与序列表中序列1或序列2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。水稻抽穗期相关基因的编码蛋白，是具有序列表中序列3的氨基酸序列，或者是将序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列3的氨基酸序列相同活性的由序列3衍生的蛋白质。本发明的与水稻抽穗期相关蛋白的编码基因OsDof12对培育早熟植物品种、扩大作物种植面积以及提高农作物产量具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种与水稻抽穗期相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主要食物。随着全球人口数量的激增和耕地面积的逐年减少，如何进一步提高水稻产量来满足人类不断增长的需求已经成为现代农业生产中的一项主要任务。
水稻抽穗期(生育期)是决定水稻的栽种地区与季节适应性的重要农艺性状，选育早熟高产的水稻品种一直为水稻育种家所重视。水稻早熟基因的发现和利用将有助于解决早熟与丰产难以兼顾的矛盾，也有利于克服籼粳亚种间F1代超亲迟熟的障碍。在水稻中，影响抽穗期的基因与拟南芥中影响开花时间的基因相对应。因此，发掘和鉴定水稻抽穗期基因(包括QTL)，开展抽穗期基因的定位、克隆等方面的研究，并深入探讨水稻抽穗期基因的分子作用机理，具有重要的理论意义和实际应用价值。与拟南芥相比，在水稻中发现的影响抽穗期的基因还相当有限。目前，在水稻中已经克隆了Hd1、Hd3a、Hd6、OsGI、se1和se5基因，它们分别和拟南芥中CO、FT、CK2、GI和HY基因相对应。在以上基因中，Hd3a基因的表达促进开花，Hd1位于Hd3a的上游，负调控Hd3a基因的表达。OsGI位于Hd1的上游，调控Hd3a基因的表达。Hd1基因在短日照条件下促进水稻早花，而在长日照条件下使水稻晚花；Hd3a基因在短日照条件下表达上调，使水稻早花；Hd6基因在长日照条件下使水稻晚花；SE5基因在长日照条件下水稻晚花。2007年，Doi等克隆了Ehd1基因，该基因独立于Hd1途径，但也是通过调控FT类似基因控制水稻抽穗期。最近，华中农业大学张启发研究组发现并分离出控制水稻产量和生育期的多效性基因—Ghd7。在长日照条件下，提高该基因的表达可推迟抽穗并增加株高和穗子大小。根据Gramene网站(http://www.gramene.org)2008年公布的数据，到目前为止共定位了734个影响水稻抽穗期的QTL。
此外，也有通过基因工程手段改变抽穗期的报道。OsMADS1、OsMADS5、OsMADS7和OsMADS8基因属于AP1/AGL9基因家族，在烟草中异域表达时可引起矮杆和早花。用OsMADS1基因转化水稻时，与转化烟草一样，转基因水稻植株也表现出明显的矮杆和早花现象，即OsMADS1基因的表达影响开花的早晚。由此推测，OsMADS1、OsMADS5、OsMADS7和OsMADS8可能是决定水稻开花期的基因，在花的诱导过程中起调控作用。至今尚未有通过基因工程手段仅改变抽穗期但不影响水稻其它性状的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种与水稻抽穗期相关的蛋白及其编码基因。
本发明所提供的与水稻抽穗期相关的蛋白，名称为OsDof12，来源于水稻属水稻(Oryza sativa var.Nipponbare)，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与水稻抽穗期相关的由1)衍生的蛋白质。
序列表中的序列3由440个氨基酸残基组成，自氨基末端第101-163位为Dof结构域，第334-440位为转录激活结构域。
为了便于OsDof12的纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述2)中的OsDof12可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的OsDof12的编码基因可通过将序列表中序列2的自5′末端第188-1510位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述与水稻抽穗期相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
与水稻抽穗期相关蛋白的编码基因包括与水稻抽穗期相关蛋白的cDNA基因和与水稻抽穗期相关蛋白的基因组基因。与水稻抽穗期相关蛋白的基因组基因具体可为如下1)或2)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；
2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述与水稻抽穗期相关蛋白的DNA分子。
序列表中的序列1由3000个碱基组成，自5′端的第167-471位脱氧核糖核苷酸为该基因组基因的第一个外显子，自5′端的第1417-2887位脱氧核糖核苷酸为该基因组基因的第二个外显子，自5′端的第472-1416位脱氧核糖核苷酸为该基因组基因的内含子。
与水稻抽穗期相关蛋白的cDNA基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：
1)其编码序列是序列表中序列2的自5′末端第188-1510位脱氧核糖核苷酸；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列2；
3)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交且编码上述与水稻抽穗期相关蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述与水稻抽穗期相关蛋白的DNA分子。
序列表中的序列2由1776个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第188-1510位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列3的OsDof12。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
扩增上述OsDof12基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
含有上述与水稻抽穗期相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有OsDof12基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2003A、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明与水稻抽穗期相关蛋白编码基因0sDof12的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是水稻等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆等双子叶植物。
使用OsDof12基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体具体可为在pCambia2003A的多克隆位点间插入上述与水稻抽穗期相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体，如pCambia2003A-OsDof12。
本发明的另一个目的是提供一种培育抽穗期提前的转基因植物的方法。
本发明所提供的培育抽穗期提前的转基因植物的方法，是将上述与水稻抽穗期相关蛋白的编码基因OsDof12导入植物中，得到抽穗期提前的转基因植物。
所述植物既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、苜宿等。
本发明构建了OsDof12的过表达载体，并将其转入水稻品种日本晴植株中，实验证明，转入OsDof12的日本晴植株抽穗期明显提前，说明OsDof12是与水稻抽穗期相关的蛋白，OsDof12蛋白及其编码基因可用于改变水稻的抽穗期。
本发明的与水稻抽穗期相关蛋白的编码基因OsDof12可通过调控FT基因而达到控制抽穗期的作用。因此，通过基因工程方法利用该基因可以有效地调节和控制抽穗期，从而使水稻的抽穗期理想化，即在完成营养生长后随即进入生殖生长阶段，快速抽穗尽而提早成熟、收获。本发明的与水稻抽穗期相关蛋白的编码基因OsDof12对培育早熟植物品种、扩大作物种植面积以及提高农作物产量具有重要意义。
附图说明
图1为OsDof12基因的结构示意图
图2为OsDof12基因的southern分析结果
图3为OsDof12基因的亚细胞定位
图4为OsDof12蛋白转录激活结构域分析
图5为OsDof12蛋白结构示意图
图6为OsDof12基因的表达分析
图7为ProOsDof12：：GUS的转基因植株的GUS基因表达分析
图8为T0代转基因植株的分子鉴定
图9为OsDof12基因过表达及对照转基因株系的表型
图10为OsDof12基因过表达转基因植株及对照植株OsDof12基因表达分析
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法如无特别说明均为常规方法。
T0表示从水稻品种日本晴中扩增OsDof12基因构建过表达载体转化日本晴愈伤组织得到的转基因植株，T1表示T0代植株自交产生的种子及由种子长成的植株。
实施例1、OsDof12及其编码基因的获得
1、与水稻抽穗期相关蛋白的cDNA序列的获得
以水稻品种日本晴为实验材料，提取其叶片总RNA，将其反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以5′-gtgcgaatgaaaagatttcaag-3′和5′-gatctaaatattcaaatcattatatt-3′为引物，PCR扩增与水稻抽穗期相关蛋白的cDNA序列。反应混合物如下：
| ddH2O | 18.3μl |
| 10×PCR缓冲液 | 2.5μl |
| dNTP Mixture(2.5mM) | 2.5μl |
| Taq酶(5U/μl) | 0.2μl |
| 引物(10mM) | 0.25μl |
| 引物(10mM) | 0.25μ1 |
| 模板(反转录的cDNA) | 1μl |
| Total | 25μl |
PCR反应条件：先94℃预变性4min；然后94℃变性45S；55℃退火45S；72℃延2min，共29个循环；最后72℃延伸10min。
对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明获得约1800bp左右的条带。切下该目的条带，纯化回收后将PCR产物连接到pBS-T载体上，将获得重组表达载体命名为pBS-OsDof12。对pBS-OsDof12进行测序，测序结果表明，获得1776bp的条带，该1776bp的核苷酸片段即为OsDof12，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列3所示。
在蛋白保守结构域分析网
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝Structure)中提交上述序列3的OsDof12的蛋白序列，对其结构域进行分析，结果显示，自氨基末端第101-163位氨基酸编码Dof结构域。
2、与水稻抽穗期相关蛋白的基因组序列的获得
以水稻品种日本晴为实验材料，提取其叶片基因组DNA，以此基因组DNA为模板，根据NCBI中提供的水稻基因组序列设计引物，扩增OsDof12的基因序列。以5′-gccaagtaaggcgggttgag-3′和5′-tgaatatatgcagaaaagtatcac-3′为引物，PCR扩增与水稻抽穗期相关蛋白的基因组序列。反应混合物如下：
| ddH2O | 17.3μl |
| 10×PCR缓冲液 | 2.5μl |
| dNTP Mixture(2.5mM) | 2.5μl |
| Taq酶(5U/μl) | 0.2μl |
| 引物(10mM) | 0.25μl |
| 引物(10mM) | 0.25μl |
| 模板(基因组DNA) | 2μl |
| Total | 25μl |
PCR反应条件：先94℃预变性4min；然后94℃变性45S；60℃退火45S；72℃延3min，共29个循环；最后72℃延伸10min。
对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明获得约3000bp左右的条带。切下该目的条带，纯化回收后将PCR产物连接到pBS-T载体上，将获得重组表达载体命名为pBS-OsDof12′。对pBS-OsDof12′进行测序，测序结果表明，获得3000bp的条带，该3000bp的核苷酸片段即为OsDof12的基因组序列，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。序列表中序列1自5′端的第167至471位脱氧核糖核苷酸为该基因组基因的第一个外显子，自5′端的第1417至2887位脱氧核糖核苷酸为该基因组基因的第二个外显子，自5′端的第472至1416位脱氧核糖核苷酸为该基因组基因的内含子。OsDof12基因的结构示意图如图1所示，其所编码的蛋白的结构示意图如图5所示。
实施例2、Southern blot分析
提取水稻品种日本晴的基因组DNA，分别用限制性内切酶EcoR I和Hind III消化并转膜，利用上述实施例1获得的OsDof12全长cDNA序列中自5′末端第670-1378位脱氧核糖核苷酸片段为探针进行杂交分析。杂交结果如图2所示，其中E为EcoRI单酶切后的Southern blot结果，H为Hind III单酶切后的Southern blot结果。从图2中可以看出，EcoR I和Hind III单酶切后的杂交信号均为单条带，表明OsDof12在水稻基因组中是以单拷贝形式存在。
实施例3、OsDof12的亚细胞定位分析及转录激活结构域分析
1、OsDof12的亚细胞定位分析
分析上述实施例1获得的OsDof12蛋白，结果没有发现与已报道核定位信号相似的序列。为分析OsDof12在细胞中的定位情况，将OsDof12经Nco I酶切后与经同样酶切的含有GFP的载体CaMV35S-sGFP(S65T)-nos3′(pUC18)(该载体详细说明见参考文献Niwa Y，Hirano T，Yoshimoto K，Shimizu M，Kobayashi H.Non-invasivequantitative detection and applications of non-toxic，S65T-type green fluorescent proteinin living plants.Plant J.199918(4)：445-463.)相连接，得到重组表达载体35S-OsDof12-GFP。经测序验证无移码后，用基因枪将重组表达载体35S-OsDof12-GFP转入洋葱表皮细胞，同时以转入空载体CaMV35S-sGFP(S65T)-nos3′(pUC18)的洋葱表皮细胞作为对照。在波长500-600nm范围进行观察，结果如图3所示。从图3中可以看出，OsDof12定位于细胞核，而转空载体的则分布在整个细胞中。
2、OsDof12的转录激活结构域分析
OsDof12为Dof转录因子，具有体外转录激活活性。为验证这一功能，利用酵母单杂交系统检测OsDof12的体外转录活性。
以上述实施例1获得的OsDof12基因为模板，以F1：5′-gaattcatgggggagtgcaaggtgg-3′、R1：5′-gaattcaagatccctcttggaagg-3′和F2：5′-gaattcatgtggccatttggcgtgg-3′、R2：5′-gaattctcaagatccctcttggaagg-3′为引物，分别PCR扩增得到OsDof12的开放阅读框和OsDof12开放阅读框的3′端部分序列(序列表中序列2自5′末端第992位-第1510位)。将上述得到的两个序列分别定向插入到酵母表达质粒pBD-GAL4(Stratagene公司)的EcoR I酶切位点中，形成重组质粒。对重组质粒分别进行酶切和测序验证，将插入方向正确的重组质粒命名为pBD-OsDof12和pBD-OsDof12C-107。
将重组质粒pBD-OsDof12和pBD-OsDof12C-107分别转入酵母中，在含有His的平板上培养该转基因酵母，同时以Ga14activation domain in pYF503+pG222作为阳性对照，以空pYF503质粒+pG222作为阴性对照，结果如图4所示。结果阳性对照、转入重组质粒pBD-OsDof12和pBD-OsDof12C-107的转基因酵母都能在含有His的平板上生长并形成蓝色菌落，而阴性对照则不能在含有His的平板上生长。
结果表明，OsDof12具有体外转录激活活性。通过去除OsDof12的部分N端序列进行分析，OsDof12转录激活结构域位于OsDof12的自氨基端第334位-第440位的107个氨基酸之间。
实施例4、OsDof12的表达分析
分别提取水稻品种日本晴的叶、茎、幼穗和根等不同组织及不同发育时期(苗期、分蘖期、孕穗初期和抽穗期)的总RNA，以OsDof12特异性单链作为探针进行Northern杂交，结果如图6所示。图6A中，R表示OsDof12在水稻品种日本晴的根中的表达情况，L表示OsDof12在水稻品种日本晴的叶片中的表达情况，S表示OsDof12在水稻品种日本晴的茎中的表达情况，P表示OsDof12在水稻品种日本晴的幼穗中的表达情况；图6B中，SL表示OsDof12在水稻品种日本晴的苗期叶片中的表达情况，TL表示OsDof12在水稻品种日本晴的分蘖期叶片中的表达情况，PL表示OsDof12在水稻品种日本晴的孕穗期叶片中的表达情况，HL表示OsDof12在水稻品种日本晴的抽穗期叶片中的表达情况。
结果表明，OsDof12表达无组织特异性，表达量由高到低的顺序依次为为叶、茎、幼穗和根。在不同发育时期OsDof12的表达量存在变化，在抽穗期最高，在分蘖期最低。
以上述实施例1获得的水稻品种日本晴的基因组DNA为模板，以5′-tctagacattaccaacagtccaac-3′和5′-ccatggctcgacgactcacctcacc-3′为引物，进行PCR扩增。将PCR产物回收并测序后插入到含有GUS基因的pCambia1301载体(CAMBIA公司)的Xba I和BamH I酶切位点间，将得到的重组表达载体命名为ProOsDof12：：GUS。将重组表达载体PoOsDof12：：GUS通过农秆菌介导法转入水稻品种日本晴中，得到转基因水稻。将转基因水稻通过GUS组织化学染色检测OsDof12的表达。结果如图7所示。结果表明，转入重组表达载体ProOsDof12：：GUS的转基因水稻在愈伤组织、叶、叶舌、叶耳、穗、叶鞘、茎(节和节间)、幼芽和根组织中都有表达。GUS的组织化学染色分析进一步证实了OsDof12基因表达模式的Northern结果，同时也揭示OsDof12基因在茎中的维管束内表达。
实施例5、OsDof12基因的过表达分析
为了进一步研究OsDof12基因在水稻发育过程中的功能，将上述实施例1获得的OsDof12基因置于质粒pCambia2300A(CAMBIA公司)的Actin启动子的控制下，得到重组表达载体pCambia2300A-OsDof12。利用农杆菌介导的方法，将重组表达载体pCambia2300A-OsDof12导入到水稻品种日本晴中，同时以转入质粒pCambia2300A的日本晴作为对照。结果获得了6个T0代转入重组表达载体pCambia2300A-OsDof12的转基因株系和10株转入质粒pCambia2300A的对照株。
对上述获得的6个T0代OsDof12过表达转基因株系和对照植株进行分子鉴定，以F4：5′-ctcagcattgttcatcggtag-3′和R4：5′-cccttgctatccagttcctc-3′为引物，检测OsDof12的表达情况，同时以NPTII作为内参，结果如图8所示。其中，1为载体pCambia2300A-OsDof12的分子鉴定结果，2为负对照(水)，CK为转入空载的对照植株的分子鉴定结果，OD1-6分别表示6个T0代OsDof12过表达转基因株系的分子鉴定结果。
6个OsDof12过表达转基因阳性株系和对照植株的表型结果如图9所示。结果表明，6个OsDof12过表达转基因阳性株系均比对照植株出现抽穗期提前的现象。OsDof12过表达转基因阳性株系在北京地区于8月10日开始抽穗，而对照植株则于9月6日开始抽穗，转入重组表达载体pCambia2300A-OsDof12的转基因水稻比作为对照的水稻平均早抽穗27天。
对OsDof12过表达转基因阳性株系和对照植株进行RT-PCR分析，结果如图10所示。结果表明，OsDof12过表达转基因阳性株系比对照植株在OsDof12基因RNA水平上有明显增加，这种OsDof12基因的RNA表达水平和提前抽穗表型一致。
对T1代OsDof12过表达转基因株系分离群体进行分析，结果表明，抽穗期提前表型和转基因完全连锁，即转基因阳性植株均出现抽穗期提前，而分离出的非转基因植株则抽穗期正常。以上研究结果表明，OsDof12基因的过表达会使水稻抽穗期提前，因此可以通过控制OsDof12基因的表达水平调节抽穗期。
序列表
<160>3
<210>1
<211>3000
<212>DNA
<213>水稻属水稻(Oryza sativa var.Nipponbare)
<400>1
<210>2
<211>1776
<212>DNA
<213>水稻属水稻(Oryza sativa var.Nipponbare)
<400>2
<210>3
<211>440
<212>PRT
<213>水稻属水稻(Oryza sativa var.Nipponbare)
<400>3
Claims (6)
1.一种培育抽穗期提前的转基因植物的方法，是将序列表中序列3所示的氨基酸序列的编码基因转入宿主植物中，得到抽穗期提前的转基因植物；
所述宿主植物为水稻。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：序列表中序列3所示的氨基酸序列的基因组基因的核苷酸序列是序列表中的序列1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：序列表中序列3所示的氨基酸序列的cDNA基因为如下1)或2)所述的基因：
1)其编码序列是序列表中序列2的自5′末端第188-1510位脱氧核糖核苷酸；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列2。
4.序列表中序列3所示的氨基酸序列的编码基因在培育抽穗期提前的转基因植物中的应用，所述转基因植物为转基因水稻。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：序列表中序列3所示的氨基酸序列的基因组基因的核苷酸序列是序列表中的序列1。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：序列表中序列3所示的氨基酸序列的cDNA基因为如下1)或2)所述的基因：
1)其编码序列是序列表中序列2的自5′末端第188-1510位脱氧核糖核苷酸；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列2。
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