CN103409432B

CN103409432B - 大豆凝集素基因lec-s的抗疫霉应用

Info

Publication number: CN103409432B
Application number: CN201310316240.8A
Authority: CN
Inventors: 高学文; 郭佩佩; 伍辉军; 张岩; 沈波
Original assignee: NANJING HOUJI BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NANJING HOUJI BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-07-25
Filing date: 2013-07-25
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2033-07-25
Also published as: CN103409432A

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及大豆凝集素基因lec-s的抗疫霉应用。本发明对大豆凝集素基因lec-s（GenBank登录号为DQ235094）进行了转基因烟草及其抗病性的研究，获得的转基因烟草对烟草疫霉表现出显著的抗性。可见，大豆凝集素基因lec-s可在培育抗疫霉病的转基因植物品种中应用。

Description

大豆凝集素基因lec-s的抗疫霉应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及大豆凝集素基因lec-s的抗疫霉应用。

背景技术

烟草疫霉是一种重要的植物病原卵菌，寄主范围广泛，可侵染70多种植物，特别是茄科植物，受害尤其严重（Erwin and Ribeiro，1996）。化学药剂的使用是目前防治植物病虫害的一种重要措施，但化学药剂的滥用对环境和农产品安全造成了严重的影响。而近年来植物抗病虫基因工程的发展则为防治植物病虫害提供了一条新途径，主要思路是将抗性相关基因通过基因工程手段转入受体植物中，从而获得植物抗病虫新品种，而且较传统育种具有基因资源多、育种周期短等特点（Kang et al，2005）。

凝集素是一种能凝集红细胞、多糖或糖复合物的非免疫来源的糖蛋白。目前为止，人们已经从多种植物、动物、细菌、病毒和真菌中分离出凝集素（Tateno et al，1998；Wang et al，1996；Inamori and Saito，1999；Leteux and Chai，2000）。迄今为止已发现的许多凝集素中，植物凝集素是最大的一个家族。在这些植物中，尤以豆科植物的种子中凝集素含量最为丰富。植物凝集素在植物中具有重要的防御功能。以往的许多研究报道表明，植物凝集素可以提高植物对真菌、细菌、线虫等多种病原物和有害昆虫的抗性（Ye et al，2001；Ooi et al，2000；Machuka and Oladapo，2000）。在发明人的前期工作中，利用RACE和反向PCR技术从大豆品种合丰29号中分离得到一个新的大豆凝集素基因，命名为lec-s（DQ235094）。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种新的大豆凝集素基因lec-s的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

大豆凝集素基因lec-s在培育抗疫霉的转基因植物品种中的应用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登录号为DQ235094。

含有大豆凝集素基因lec-s的重组质粒在培育抗疫霉的转基因植物品种中的应用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登录号为DQ235094。

有益效果：

转基因烟草由于其基因转化技术成熟，从侵染到获得再生苗的周期较短，已被作为一个模式工作系统，常被用来进行植物抗病性研究。本发明对大豆凝集素基因lec-s进行了转基因烟草及其抗病性的研究，获得的转基因烟草对烟草疫霉表现出显著的抗性。可见将大豆凝集素基因lec-s通过基因工程手段转入农作物，能够获得具有抗疫霉的转基因植物新品种。

附图说明

图1lec-s基因RT-PCR扩增图（A）和pMD18-T Simple::lec-s（B）的酶切验证图

A：M.分子量标记（DNA Marker DL2000）;1～2.从大豆品种29中扩增lec-s;3.清水对照

B：M.分子量标记（DNA Marker DL2000）;1.Sma I和Xba I酶切pMD18-T Simple::lec-s

图2大豆凝集素lec-s基因编码的氨基酸同其它大豆凝集素的同源比较

有*的位点是相似性高的位置

图3植物重组表达质粒pBI121：：lec-s构建图谱

LB.T-DNA左边界；RB.T-DNA右边界；nptⅡ.新霉素磷酸转移酶基因；Pro.启动子；Ter.终止子；gus.β-半乳糖醛酸酶基因

图4植物表达载体pBI121::lec-s构建酶切图

M1.分子量标记（DNA Marker DL2000）；M2.分子量标记（DNA Marker DL15000）；1～2.质粒pBI121::lec-s用Sma I和Xba I双酶切；3.质粒pBI121用Sma I和Xba I双酶切。

图5重组载体pBI121::lec-s转化农杆菌的PCR验证

M.分子量标记（DNA Marker DL2000）;W.阴性对照，清水；P.阳性对照，质粒pBI121::lec-s；1～3.不同的转化子。

图6转基因烟草T₀代的PCR检测

A、B：M.分子量标记(DNA Marker DL2000)；P.阳性对照，质粒pBI121::lec-s；W.阴性对照，清水；CK.阴性对照，未转化植株；1～45.转基因植株；

C：M.分子量标记(DNA Marker DL2000)；P.阳性对照，质粒pBI121；W.阴性对照，清水；

CK.阴性对照，未转化植株；1～24.转空载体植株。

图7转基因植株T₀代的Southern杂交分析

M.分子量标记（DNA Marker DL2000，λ-HindⅢdigest）；1.阳性对照，lec-s PCR扩增产物；2.未转化植株；3.转空载体植株；4～8.转基因植株

图8T₁代转基因烟草对烟草疫霉的抗性表型实验

WT.未转化烟草；VEC.转空载体烟草；T1-11，T1-20.转基因烟草

具体实施方式

以下实施例中所涉及的材料及试剂：

烟草品种为三生烟（Nicotiana tabacum cv.Samsun NN），取烟草叶片作为转化材料。根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105、植物表达载体pBI121购自Invitrogen。

烟草组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，121℃灭菌15min。预培养培养基：MS+6-BA0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-BA1mg/L；筛选培养基：MS+6-BA1mg/L+Km100mg/L+Cb500mg/L；生根培养基：1/2MS+Km100mg/L+Cb200mg/L+IAA0.2mg/L；农杆菌培养用YEB培养基。

Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4连接酶、dNTPs、核酸分子质量标准、DNaseⅠ、PrimeScript^TM Reverse Transcriptase和SYBR Premix Ex TaqTM Kit均购自TaKaRa公司。质粒抽提和DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。植物RNA提取试剂盒Plant RNA Kit购自Omega公司。卡那霉素（Kanamycin）、羧苄青霉素（Carbenicillin）购自上海索莱宝生物科技有限公司。

实施例1pBI121::lec-s质粒的构建1.1lec-s的克隆

取大豆品种合丰29号叶片，使用Omega公司的Plant RNA Kit植物RNA提取试剂盒提取大豆总RNA，用无RNase的DNase I处理纯化。使用PrimeScript^TM Reverse Transcriptase（Takara）进行RNA反转录合成cDNA。以1μg总RNA经反转录酶获得cDNA第一链为模板，lec-s-F/lec-s-R为引物，通过PCR反应扩增的到两端含有Xba I/Sma I酶切位点的lec-s基因片段。采用Axygen公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒对PCR电泳条带进行回收。将回收的lec-s片段连接至测序载体pMD18-T Simple Vector，获得质粒pMD-18T Simple vector::lec-s。质粒pMD-18T Simple vector::lec-s转化DH5α感受态细胞，使用Axygen公司的AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取初筛阳性克隆的质粒，经PCR筛选阳性克隆，从经PCR筛选的阳性克隆中提取的质粒，使用TaKaRa公司限制性内切酶进行酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒送测序。

PCR反应体系为：

其中，上游引物lec-s-F：5’-TCTAGAATGGCCACCTCCAACTTCTC-3’（含Xba I，SEQ ID NO.1）

下游引物lec-s-R：5’-CCCGGGTTAGATGGCCTCATTGAGCAC-3’（Sma I，SEQ ID NO.2）

PCR反应程序为：

95℃预变性5min；95℃变性45sec、58.6℃复性45sec、72℃延伸40sec，30个循环；最后72℃延伸10min。

利用RT-PCR方法从大豆品种合丰29中扩增出lec-s基因（图1A），将其连接到pMD18-TSimple载体后（图1B），测序，结果表明该基因为849bp，与数据库（GenBank）中DQ235094序列的同源性为100%。将大豆凝集素lec-s基因推测的氨基酸序列同GenBank上已登录的其它大豆凝集素le1和le2进行比对（图2），结果表明:该全长cDNA所编码的氨基酸序列与le1同源性60％，与le2同源性为34％。

1.2pBI121::lec-s质粒的构建

提取质粒pMD-18T Simple vector::lec-s和pBI121，用Sma I和Xba I酶切pMD-18TSimple vector::lec-s载体和pBI121质粒，将lec-s连接到pBI121载体上，得到pBI121::lec-s质粒（图3）。pBI121::lec-s质粒转化DH5α感受态细胞，使用Axygen公司的AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取pBI121::lec-s质粒，用Sma I和Xba I酶切pBI121::lec-s质粒，将酶切验证正确的质粒送测序。参照余云舟（2003）等的方法，将重组质粒导入土壤杆菌EHA105。使用Axygen公司的AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取EHA105/pBI121::lec-s质粒，用Sma I和Xba I酶切EHA105/pBI121::lec-s质粒，将酶切验证正确的质粒送测序。

从图4可知，用Sma I和Xba I将重组质粒pBI121::lec-s酶切后，得到了预期849bp的片段。将lec-s基因的测序结果与数据库中DQ235094序列进行比对分析，同源性为100%。这说明lec-s基因已经成功连到pBI121质粒，即体外表达载体pBI121::lec-s构建成功。将验证正确的重组转基因载体冻融法转化根癌土壤杆菌EHA105。对转化后的抗性单菌落PCR检测后，挑选阳性克隆送测序，将测序结果与lec-s基因序列比对，同源性为100%。结果表明重组转基因载体已成功转入根癌土壤杆菌EHA105（图5）。

实施例2农杆菌介导的烟草遗传转化

烟草的转化采用农杆菌介导的叶盘法。取烟草叶圆片（直径0.5cm）作为转化受体，在预培养基中预培养1～2d后浸入备好的农杆菌菌液感染20min，烟草叶盘与农杆菌黑暗共培养2d后，转入含羧卞霉素（500mg/L）和卡那霉素（100mg/L）的筛选培基中。25℃、L∶D=16h∶8h培养，1周继代1次。1周左右叶盘开始分化抗性愈伤组织，然后逐渐分化出抗性芽。3～6周开始有芽分化。待绿芽长到2～3cm高后，切下再生芽置于生根培养基中培养。待转化小苗株高6～8cm、根系发育良好后开瓶炼苗2d，再移栽温室培养。

其中，烟草组织培养基以MS培养基为基础（Murashige and Skoog，1962），pH5.8，121℃灭菌15min。预培养培养基：MS+6-BA0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-BA1mg/L；筛选培养基：MS+6-BA1mg/L+Km100mg/L+Cb500mg/L；生根培养基：1/2MS+Km100mg/L+Cb200mg/L+IAA0.2mg/L；农杆菌培养用YEB培养基。

实施例3转基因烟草T₀代的PCR检测

上一步共计得到转基因烟草抗性幼苗总计45株，植物总DNA提取采用CTAB法。用转基因烟草T₀代叶片总DNA为模板，空载体转化植株和未转化植株总DNA作阴性对照，质粒pBI121：：lec-s做阳性对照进行PCR扩增。根据目的基因序列设计引物lec-s-F/lec-s-R（SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2），扩增目的基因（扩增产物849bp），检测出呈阳性的有31株。检测结果表明，转基因烟草植株和阳性对照质粒一样，均能扩增出相应目的基因的特异片段849bp，而未转化植株和转空体植株没有扩增条带出现（图6A）。因此，PCR检测的结果证明外源基因已经转入到这些再生植株中。为了确保PCR扩增的准确性，还用部分载体序列设计引物pBI-vector-F/pBI-vector-R进行了扩增。其中，上游引物pBI-vector-F：FOR:5'-CACTATCCTTCGCAAGACCC-3'（SEQ ID NO.3），下游引物pBI-vector-R：REV:5'-GTGACATCGGCTTCAAATGG-3'（SEQ ID NO.4）。检测结果表明，转基因烟草植株和阳性对照质粒一样，均能扩增出相应目的基因的特异片段1303bp，而未转化植株和清水对照没有扩增条带出现（图6B），转空载体植株中均能扩增出相应目的基因的特异片段454bp（图6C）。因此，PCR检测的结果初步证明外源基因已经转入到这些再生植株中。

实施例4转基因烟草T₀代的Southern杂交检测

选取部分PCR阳性的转基因植株进行Southern杂交分析，以未转化植株和转空载体植株作阴性对照，lec-s片断PCR扩增产物做阳性对照。用1.2%琼脂糖凝胶电泳，电压2V/cm，电泳结束后用虹吸印迹法将PCR产物转移到尼龙膜上。探针基因（lec-s基因的一部分，约400bp）用地高辛标记，标记与杂交方法按照试剂盒说明书进行。杂交结果（图7）表明，5株转基因植株中均出现杂交信号，其中3株出现1条杂交信号谱带，1株出现2条杂交信号谱带，1株出现3条杂交信号谱带，说明相应的转基因植株中有1、2和3个拷贝；而未转化植株和转空载体植株则没有出现杂交信号。分子杂交进一步证明了外源基因已经稳定整合到了烟草的基因组中。

实施例5T₁代转基因烟草的抗烟草疫霉效果评价

用T₁代移栽后8周的烟草，采用菌圆片夹茎接种法进行实验，具体方法如下（Edward andJohnp，1987）。

（1）烟草疫霉在V8培养基上活化后，在边缘打取直径为0.5cm的菌丝块；

（2）取生长健康、长势一致的烟草，作好标记，以备接种；

（3）用解剖刀片在烟草茎中央切开长1cm的切口，挑取准备好的菌丝块，将一菌圆片放到切口内，然后用经消毒并用灭菌水浸泡的脱脂棉将切口四周包起来；

（4）把接种好的植株放入光照培养箱中，25℃，保温培养。

每个处理接种5株烟草，试验重复3次，每次用接种菌丝块的未转化烟草和转空载体烟草作为对照，接种后24h开始观察茎部病斑的扩展情况。

接种烟草疫霉48h后调查发病情况。结果表明，野生型烟草和转空载体烟草出现倒伏现象，且接种处病菌深入扩展到髓部，茎杆干缩使茎部的水分运输受阻，接种处茎杆凋萎，发病程度重；而转基因烟草的一个株系（T1-11）虽然出现倒伏现象，但在接种处茎杆并未凋萎，发病程度轻；另一个株系（T1-20）接种处茎杆不干缩，且未出现倒伏现象（图8）。说明转基因烟草的不同株系对烟草疫霉表现出不同程度的抗性。

Claims

1.大豆凝集素基因lec-s在培育抗烟草疫霉的转基因植物品种中的应用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登录号为DQ235094。

2.含有大豆凝集素基因lec-s的重组质粒在培育抗烟草疫霉的转基因植物品种中的应用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登录号为DQ235094。