CN106795503A - 用于改善的蛋白质产生的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开的方面涉及改善来自宿主细胞的分泌性铜酶的表达的方法,其通过操纵涉及铜在宿主细胞中的转运的一种或多种蛋白质的表达水平实现,所述蛋白质例如膜结合的铜转运ATP酶和可溶性铜转运蛋白。本公开还提供了包含此类经过改善的宿主细胞的组合物以及来源于包含一种或多种感兴趣的铜酶的经过改善的宿主细胞的产物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年8月15日提交的美国临时专利申请序列号62/038,095的优先权,其全文以引用方式并入本文。
序列表
根据37C.F.R.§1.52(e)通过EFS提交的序列表以引用方式并入本文。通过EFS提交的序列表文本文件包含于2015年7月10日创建的、大小为44千字节的文件“40456-WO-PCT_ST25.txt”。
技术领域
本公开的方面涉及改善来自宿主细胞的分泌性铜酶(cuproenzyme)的表达的方法,其通过操纵一种或多种铜金属伴侣蛋白,例如膜结合的铜转运ATP酶和可溶性铜转运蛋白的表达水平实现。本公开还提供包含此类经过改善的宿主细胞的组合物以及由包含一种或多种感兴趣的铜酶的经过改善的宿主细胞制备的产物。
介绍
铜是具有氧化还原活性的过渡金属,其为多种酶(在本文称为铜酶)的必需辅因子。然而,由于其毒性,细胞中游离铜的含量必须保持在低水平。因此,少于总细胞铜的0.01%在细胞质中是游离的;大多数铜被金属硫蛋白所结合和螯合以防止其细胞毒性作用。此外,细胞中的不同区室具有不同的铜含量,其中线粒体具有比细胞质更高的铜含量,细胞质继而比高尔基体具有更高的含量。
在用于在已工程化以过表达一种或多种功能性铜酶的重组宿主细胞中产生此类酶的工业环境中,细胞中的游离铜的有限可用性是有问题的。由于以上指出的细胞铜梯度,在生产分泌性铜酶时,这一问题尤其明显。然而,在宿主细胞培养期间以实现正确平衡提供额外的铜是一个相当大的技术挑战,所述平衡即:促进功能性和分泌性铜酶的产生,而不会变得对宿主细胞有毒性。
除了与由宿主细胞产生铜酶相关的问题之外,对于从工厂排放的废水中允许的铜含量也有规定。因此,可向铜酶发酵过程添加的铜的量也存在上限。
因此,需要研发重组宿主细胞和使用此类宿主细胞来改善铜酶在发酵过程中的产生的方法。
发明内容
本发明的方面至少部分地基于以下发现:一种或多种铜金属伴侣蛋白在期望的重组宿主细胞,例如丝状真菌宿主细胞中的增加的表达可改善分泌性铜酶在宿主细胞中的产生。因此,本文提供了在基本上相同的培养条件下,与不具有一种或多种铜金属伴侣蛋白的增加表达的亲本宿主细胞相比,表现出改善的铜酶产生/分泌的具有一种或多种铜金属伴侣蛋白的增加表达的重组宿主细胞。还提供了由这些宿主细胞产生铜酶的方法以及包含由此类宿主细胞产生的铜酶的组合物。可用于主题组合物和方法的分泌性铜酶的示例包括但不限于:裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、胆红素氧化酶、儿茶酚氧化酶、多巴胺β-单加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗坏血酸氧化酶、肽基甘氨酸单加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-双氧化酶、以及过氧化物歧化酶。
本发明的方面包括但不限于以下:
1.一种用于由宿主细胞产生铜酶的方法,包括:在表达铜酶的宿主细胞中过表达铜金属伴侣蛋白,以及在足以产生铜酶的条件下培养宿主细胞,其中当在基本上相同的培养条件下培养时,与不过表达铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比,所述宿主细胞产生增大量的铜酶。
2.根据1所述的方法,其中铜酶是从宿主细胞中分泌的。
3.根据1或2所述的方法,其中铜酶选自由以下项构成的组:裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、胆红素氧化酶、儿茶酚氧化酶、多巴胺β-单加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗坏血酸氧化酶、肽基甘氨酸单加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-双氧化酶、以及过氧化物歧化酶。
4.根据以上任一项所述的方法,其中铜酶与宿主细胞是内源的。
5.根据以上任一项所述的方法,其中铜酶与宿主细胞是异源的。
6.根据以上任一项所述的方法,其中通过源自宿主细胞的启动子控制铜酶和/或铜金属伴侣蛋白的表达。
7.根据6所述的方法,其中宿主细胞为里氏木霉(Trichoderma reesei,T.reesei)细胞,并且启动子为源自里氏木霉的丙酮酸激酶(pki)或纤维二糖水解酶I(cbh1)启动子。
8.根据以上任一项所述的方法,其中宿主细胞表达至少一种另外的铜酶,其中在基本上相同的培养条件下,与不过表达铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比,至少一种另外的铜酶的产生增加。
9.根据以上任一项所述的方法,其中铜金属伴侣蛋白为膜结合的铜转运ATP酶。
10.根据9所述的方法,其中膜结合的铜转运ATP酶包含与SEQ ID NO:6具有至少60%同一性的氨基酸序列。
11.根据9或10所述的方法,其中膜结合的铜转运ATP酶选自表2。
12.根据1-8中任一项所述的方法,其中铜金属伴侣蛋白为可溶性铜转运蛋白。
13.根据12所述的方法,其中可溶性铜转运蛋白包含与SEQ ID NO:3具有至少60%同一性的氨基酸序列。
14.根据12或13所述的方法,其中可溶性铜转运蛋白选自表1。
15.根据以上任一项所述的方法,还包括在宿主细胞中过表达第二铜金属伴侣蛋白。
16.根据15所述的方法,其中第一铜金属伴侣蛋白为包含与SEQ ID NO:6具有至少60%同一性的氨基酸序列的膜结合的铜转运ATP酶并且第二铜金属伴侣蛋白为包含与SEQID NO:3具有至少60%同一性的氨基酸序列的可溶性铜转运蛋白。
17.根据以上任一项所述的方法,其中宿主细胞为丝状真菌宿主细胞。
18.根据17所述的方法,其中丝状真菌宿主选自由以下项构成的组:曲霉属(Aspergillus)、枝顶孢属(Acremonium)、出芽短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、头孢霉属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛壳菌属(Chaetomium)、拟青霉属(paecilomyces)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、内座壳属(Endothia)、Endothia mucor、镰孢属(Fusarium)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、毛霉菌属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、平革菌属(Phanerochaete)、柄孢壳菌属(Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、梨孢霉属(Pyricularia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophylum)、壳多胞菌属(Stagonospora)、踝节菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、嗜热菌属(Thermomyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、毛癣菌属(Trichophyton)、栓菌属(Trametes)、以及侧耳菌属(Pleurotus)。
19.根据17所述的方法,其中丝状真菌宿主细胞为里氏木霉、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、或埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)宿主细胞。
20.根据以上任一项所述的方法,其中过表达步骤包括增加转录因子Mac1在宿主细胞中的表达。
21.根据20所述的方法,其中增加Mac1的表达包括向宿主细胞中引入Mac1表达载体。
22.一种减少宿主细胞的铜毒性的方法,包括:在宿主细胞中过表达铜金属伴侣蛋白,其中与不过表达铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比,所述宿主细胞具有减少的铜毒性。
23.根据22所述的方法,其中宿主细胞过表达铜酶。
24.一种降低细胞培养发酵液中的铜含量的方法,包括:在包含铜的细胞培养基中培养过表达铜金属伴侣蛋白的宿主细胞,以产生细胞培养发酵液,其中与来源于处于基本上相同的细胞培养基中且在基本上相同的条件下培养的不过表达铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞的细胞培养发酵液相比,细胞培养发酵液中的所得铜含量降低。
25.一种重组宿主细胞,包含:编码铜酶的第一多核苷酸、以及编码铜金属伴侣蛋白的第二多核苷酸,其中在宿主细胞中表达铜酶并且在宿主细胞中过表达铜金属伴侣蛋白,并且其中在基本上相同的培养条件下,与不过表达铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比,所述宿主细胞中的铜酶的表达水平增加。
26.根据25所述的重组宿主细胞,其中铜酶是从宿主细胞中分泌的。
27.根据25所述的重组宿主细胞,其中铜酶选自由以下项构成的组:裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、胆红素氧化酶、儿茶酚氧化酶、多巴胺β-单加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗坏血酸氧化酶、肽基甘氨酸单加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-双氧化酶、以及过氧化物歧化酶。
28.根据27所述的重组宿主细胞,其中铜酶选自表3中列出的那些。
29.根据25至28中任一项所述的重组宿主细胞,其中铜酶与宿主细胞是异源的。
30.根据25至29中任一项所述的重组宿主细胞,其中通过宿主细胞的启动子控制铜酶和/或铜金属伴侣蛋白的表达。
31.根据30所述的重组宿主细胞,其中宿主细胞为里氏木霉,并且启动子为源自里氏木霉的pki或cbh1启动子。
32.根据25至31中任一项所述的重组宿主细胞,其中第二多核苷酸编码包含与SEQID NO:6具有至少60%同一性的氨基酸序列的膜结合的铜转运ATP酶。
33.根据25至32中任一项所述的重组宿主细胞,其中第二多核苷酸编码包含与SEQID NO:3具有至少60%同一性的氨基酸序列的可溶性铜转运蛋白。
34.根据25至33中任一项所述的重组宿主细胞,其中宿主细胞还包含编码第二铜金属伴侣蛋白的第三多核苷酸。
35.根据34所述的重组宿主细胞,其中第一铜金属伴侣蛋白为包含与SEQ ID NO:6具有至少60%同一性的氨基酸序列的膜结合铜转运ATP酶,并且第二铜金属伴侣蛋白为包含与SEQ ID NO:3具有至少60%同一性的氨基酸序列的可溶性铜转运蛋白。
36.根据25至35中任一项所述的重组宿主细胞,其中重组宿主细胞为丝状真菌宿主细胞。
37.根据36所述的重组宿主细胞,其中丝状真菌宿主选自由以下项构成的组:曲霉属、枝顶孢属、出芽短梗霉属、白僵菌、头孢霉属、拟蜡菌属、毛壳菌属、拟青霉属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、隐球菌属、黑蛋巢菌属、内座壳属、Endothia mucor、镰孢属、粘帚霉属、腐质霉属、Magnaporthe、毁丝霉属、漆斑菌属、毛霉菌属、脉孢菌属、平革菌属、柄孢壳菌属、拟青霉属、青霉属、梨孢霉属、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、壳多胞菌属、踝节菌属、木霉属、嗜热菌属、热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、毛癣菌属、栓菌属、以及侧耳属。
38.根据36所述的重组宿主细胞,其中丝状真菌宿主细胞为里氏木霉、黑曲霉、米曲霉、或埃默森篮状菌宿主细胞。
39.根据25-38中任一项所述的重组宿主细胞,其中重组宿主细胞过表达Mac1,其中Mac1的过表达导致铜金属伴侣蛋白在宿主细胞中的过表达。
40.一种上清液,其是由根据25至39中的一项所述的重组宿主细胞的培养物获得的。
41.一种培养上清液,其是使用根据1至21中任一项所述的方法获得的。
附图说明
技术人员将理解,附图仅用于说明目的。附图不旨在以任何方式限制本教导内容的范围。
图1A-1C:源自里氏木霉的用于铜金属伴侣蛋白的表达构建体的示意图。(图1A)用于膜结合的铜转运ATP酶的表达构建体。(图1B)用于细胞质(可溶性)铜转运蛋白的表达构建体。这些铜金属伴侣蛋白基因使用组成型丙酮酸激酶(pki)启动子表达并且包括来源于CBH1基因的终止子。使用选择性标记(hphR)潮霉素抗性基因进行携带以上质粒的转化体的选择。AmpR是用于质粒在细菌细胞中的增殖的氨苄青霉素抗性基因。(图1C)用于过表达里氏木霉酪氨酸酶(氨基酸序列:SEQ ID NO:9)的表达载体。酪氨酸酶从cbh1启动子转录并且继之以cbh1转录终止子。
图2:通过SDS-PAGE进行过量产生酪氨酸酶的菌株的14升标度发酵中的细胞外蛋白质表达的分析。培养时间在底部以小时示出并且以向上的箭头指示铜进料的开始。在左边指示酪氨酸酶和内切葡聚糖酶6蛋白质谱带(分别为Tyr和EG6)。含铜酪氨酸酶在69小时内显示出一个峰值产生并且在剩余的时间过程期间显示出减少的积聚。相比之下,非含铜酶内切葡聚糖酶6(EG6)显示出随整个时间过程的推移而增加的积聚。
图3:增加的铜含量对酪氨酸酶表达的影响SDS-PAGE显示出在增加量的铜(在各泳道的底部示出)的存在下酪氨酸酶(Tyr)的表达。如该图中所示,增加生长培养基中硫酸铜的量导致酪氨酸酶的合成减少。
图4:在0至1000μM范围内的不同铜浓度下培养的过量产生的酪氨酸酶的两种不同菌株(菌株A和C,分别为上图和下图)的分析在没有对蛋白质产生的不利影响的情况下,铜的最高浓度为大约15μM。高于15μM的铜含量导致酪氨酸酶的产生水平降低。使用酪氨酸作为底物并在286nm(空白柱)和470nm(填充柱)下检测产物的形成来测量培养上清液中存在的酪氨酸酶活性。
图5:使用针对酪氨酸酶活性的点板测定来检测在高含量的铜(6mM)的存在下培养的这些菌株中存在的酪氨酸酶活性,其中未产生可检测的酪氨酸酶。在菌株A的对照孔(泳道8中的孔)和C的对照孔(泳道1中的孔)中不可检测到酪氨酸酶活性,用虚线绘出。当用表达膜结合的铜转运ATP酶的质粒(泳道2-7中的孔)或表达细胞质(可溶性)铜转运蛋白的质粒(泳道9-12中的孔)重新转化菌株A和C时,这些菌株产生酪氨酸酶的能力恢复。因此,这些铜金属伴侣蛋白的表达可降低铜毒性并导致酪氨酸酶铜酶的表达。在该测定中通过以下方式检测酪氨酸酶活性:将10μL培养上清液和200μL的10%脱脂乳(预热至35℃)在微量滴定板中配混并将混合物在35℃下温育至少10分钟。当酪氨酸酶存在且具有活性时,脱脂乳从白色变为红色。加号指示具有可检测红色的孔。
图6:来自一色齿毛芝菌(Cerrena unicolor)的用于铜金属蛋白漆酶D的表达载体构建体,显示出从cbh1启动子转录的漆酶D基因以及CBH1信号序列和cbh1转录终止子。成熟漆酶D序列为SEQ ID NO:10。
图7A-7C:在存在和不存在铜金属伴侣蛋白的过表达的情况下,过表达漆酶D的菌株(菌株32A)中的漆酶D产生的分析。图7A示出漆酶D在菌株32A(最左边的柱,设为100%)和源自所述菌株32A的过表达胞质转运蛋白和膜结合的铜转运ATP酶两者的菌株(#46、#47和#48)(用图1A和1B所示的表达载体转化)中的相对表达水平。图7B示出漆酶D在菌株32A(最左边的柱,设为100%)和源自所述菌株的过表达膜结合的铜转运ATP酶的菌株(#2、#16、#29、#30和#31)(用图1A所示的表达载体转化)中的相对表达水平。图7C示出漆酶D在菌株32A(最左边的柱,设为100%)和源自所述菌株的过表达胞质铜转运蛋白的菌株(#5、#22、#27和#35)(用图1B所示的表达载体转化)中的相对表达水平。
具体实施方式
细胞质(可溶性)和膜结合的铜金属伴侣蛋白均用于与铜结合并将铜转运至细胞内的位置,在这些位置,铜可被结合到铜金属蛋白(例如铜酶)中(参见,例如,O'Halloran等人,Metallochaperones,an intracellular shuttle service,for metal ions.2000JBC:275(33):25057-25060;和Robinson等人,Copper Metallochaperones2010Annu.Rev.Biochem.79:537–62)。对于分泌性铜酶,多种铜金属伴侣蛋白的作用是将铜转运至高尔基复合体的内腔,包括胞质铜转运蛋白(例如,酵母Atx1多肽及其同系物)以及高尔基体膜结合铜通透酶(例如,酵母Ccc2多肽及其同系物)。在高尔基体中,铜可在表达/折叠/分泌过程期间被结合到铜酶中。(参见,例如,Huffman等人,Energetics of Copper Trafficking between Atx1 metallochaperone &the intracellular Copper transporter,Ccc2.2000JBC 275(25).18611-18614)。铜金属伴侣蛋白在所分析的所有真核生物之间是高度保守的。
本教导内容基于以下发现,即可通过过表达一种或多种铜金属伴侣蛋白来改善铜酶在宿主细胞中的分泌。因此,本教导内容提供了用于增加宿主细胞例如丝状真菌中的蛋白质分泌的方法,其通过过表达一种或多种铜金属伴侣蛋白,例如可溶性铜转运蛋白、膜结合的铜转运蛋白,或两者来实现。本教导内容还提供了用于增加的分泌的表达宿主,例如包含某些铜金属伴侣蛋白和感兴趣的铜酶的丝状真菌。
在更详细地描述本发明的组合物和方法之前,应理解,本发明的组合物和方法不限于所描述的具体实施方案,因为这些实施方案当然可变。还应理解,本文所用的术语仅出于描述具体实施方案,并不意在限制,因为本发明的组合物和方法的范围将仅受所附权利要求的限定。
在提供值的范围的情况中,应理解,该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限的个位的十分之一,除非上下文另有清楚规定)和该所述范围中的任何其它所述值和中间值也被涵盖在本发明的组合物和方法之内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括在较小范围中并且也被涵盖在本发明的组合物和方法之内,受到所述范围中任何明确排除的限制。在所述范围包括限值中的一个或两个的情况中,排除那些被包括的限值中的任一个或两个的范围,也被包括在本发明的组合物和方法中。
某些范围在本文中通过前置术语“约”的数值表述。术语“约”在本文中用于为它之后的确切数字以及接近或近似该术语之后的数字的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似明确所记载的数字方面,接近或近似的未记载的数字可以是在其中陈述它的上下文中提供明确记载的数字的基本等同物的数字。例如,结合数值,术语“约”是指数值的-10%至+10%的范围,除非该术语在上下文另外明确定义。又如,短语“约6的pH值”是指5.4至6.6的pH值,除非pH值另有明确定义。
本文提供的标题并不排除本发明的组合物和方法的各个方面或实施方案,这些方面或实施方案可以对说明书作为整体来参考而获得。相应地,下面即将定义的术语通过将说明书作为整体来参考得到更完全的定义。
本文档被组织成多个章节,以便于阅读;然而,读者将会认识到,在一个章节中进行的陈述可以应用到其它章节。因此,本公开的不同小节所使用的标题不应被解释为限制性的。
除非另有定义,否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明的组合物和方法所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。现在描述代表性的示例性方法和材料,不过任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于实施或测试本发明的组合物和方法。
本说明书所引用的所有公布和专利均通过引用的方式并入,如同明确且单独地指明各单独的公布或专利通过引用的方式并入并且通过引用的方式并入本文以结合公布被引用的内容公开和描述所述方法和/或材料。任何公布的引用是为了在提交日期之前公开,并且不应理解为承认由于先前发明而使本发明的组合物和方法不享受早于这些公布的权利。此外,所提供的公布的日期可能不同于真实的公开日期,真实的公开日期可能需要独立确认。
根据此具体实施方式,适用下面的缩写和定义。注意,除非上下文另外明确指明,否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此,例如,提及“酶”包括多个此种酶,而提及“剂量”,包括提及一个或多个剂量以及本领域技术人员已知的其等同物,等等。
还应指出的是,权利要求书可能撰写成排除任何可选择的元素。同样,此陈述旨在用作与权利要求元素的叙述一起使用此类排他性术语如“单独地”、“仅”等,或使用“否定性”限制的基础。
还应指出的是,如本文所用的术语“基本上由...组成”是指组合物,其中该术语之后的组分在其它已知组分的存在下总量按所述组合物总体的重量计少于30%并且不促成或干扰组分的作用或活性。
还应指出的是,如本文所用的术语“包括”是指包括但不限于术语“包括”之后的组分。术语“包括”之后的组分是需要或必需的,但是包含所述组分的组合物还可包括其它非必需或任选的组分。
还应指出的是,如本文所用的术语“由...组成”是指包括但不限于术语“由...组成”之后的组分。因此,术语“由...组成”之后的组分是需要或必需的,并且在组合物中不存在其它组分。
对于本领域技术人员而言,阅读了本公开时将显而易见的是,本文所描述和图示的各个单独的实施方案都具有分立的部件和特征部,在不背离本文描述的本发明的组合物和方法的范围或实质的前提下,这些部件和特征部能够容易地与任何其它若干实施方案的特征部分离或结合。可以按照所述事件的顺序或按照任何其它合理可能的顺序来实施任何所述的方法。
定义
术语“编码序列”在本文中定义为当置于包括启动子的适当控制序列的控制之下时转录成可翻译为多肽的mRNA的核酸序列。编码序列可包含单个开放阅读框、或例如通过内含子分隔开的若干开放阅读框。编码序列可以是例如cDNA、基因组DNA、合成DNA或重组DNA。编码DNA序列通常以起始密码子(例如ATG)开始并以终止密码子(例如,TAA、TAG和TGA)结束。
如本文所用的“铜金属伴侣蛋白”或“铜分子伴侣”是有利于在细胞中将铜转运和/或结合到铜需要性金属酶(copper-requiring metallo-enzyme)(也称为铜酶)中的蛋白质。铜金属伴侣蛋白包括胞质(或可溶性)铜转运蛋白(例如SEQ ID NO:3和表1)、膜结合的铜转运蛋白(例如SEQ ID NO:12、13、14和15;其同系物;以及与其具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的保持铜转运活性的序列)、膜结合的转运ATP酶(例如SEQ ID NO:6和表2)。后者包括存在于高尔基体膜中的铜金属伴侣蛋白,其将铜转运至将由宿主细胞分泌的蛋白质(也称为“铜通透酶”、“铜转运ATP酶”等)。
“铜酶”是包含一个或多个铜原子的任何金属酶。示例包括但不限于:裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、胆红素氧化酶、儿茶酚氧化酶、多巴胺β-单加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗坏血酸氧化酶、肽基甘氨酸单加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-双氧化酶、以及过氧化物歧化酶。
术语“源自”涵盖术语“来源于”、“从...获得”、“可由...获得”、“分离自”和“由...产生”,并且通常是指一种指定材料在另一指定材料中找到其起源或者具有可参照另一指定材料而描述的特征。
如本文所用的术语“DNA构建体”是指包含至少两个邻接的DNA多核苷酸片段的多核苷酸。
关于多核苷酸或多肽的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或多肽。
术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译两方面。
如本文所用,“表达载体”是指DNA构建体,其包括编码一个或多个指定多肽的可操作连接至能够实现一个或多个多肽在合适的宿主中的表达的合适的控制序列的DNA序列。此类控制序列可包括实现转录的启动子、任选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、以及控制转录和翻译终止的序列。不同的细胞类型可与不同的表达载体一起使用。用于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中所用载体的示例性启动子为AprE启动子;用于浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的示例性启动子为A4启动子(来自黑曲霉);用于大肠杆菌(E.coli)的示例性启动子为Lac启动子;用于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的示例性启动子为PGK1;用于黑曲霉的示例性启动子为glaA;并且用于里氏木霉的示例性启动子包括pki和cbhI。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在基因组插入物。一旦转化进合适宿主中,载体就可独立于宿主基因组复制和发挥作用,或者在合适的条件下可整合进基因组本身中。在本说明书中,质粒和载体有时互换使用。然而,本发明的组合物和方法旨在包括具有相当功能并且是或变得在本领域中已知的其它表达载体形式。因此,许多种宿主/表达载体组合可用于表达本文所述的DNA序列。
可用的表达载体,例如,可由染色体、非染色体和合成DNA序列的区段组成,诸如SV40的各种已知衍生物和已知的细菌质粒,例如来自大肠杆菌的质粒,包括col E1、pCR1、pBR322、pMb9、pUC 19以及它们的衍生物、较宽宿主范围质粒,例如RP4、噬菌体DNA,例如噬菌体λ的多种衍生物,例如NM989,以及其它DNA噬菌体,例如M13和丝状单链DNA噬菌体;酵母质粒诸如2μ质粒或其衍生物;可用于真核细胞中的载体,诸如可用于动物细胞的载体以及衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体,诸如经修饰采用噬菌体DNA的质粒或其它表达控制序列。使用本发明的组合物和方法的表达载体的表达技术在本领域中是已知的并且将总体描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Press(1989)。通常,将包括本文所述的DNA序列的此类表达载体转化到单细胞宿主中,其方法是通过整合事件直接插入特定物种的基因组中(参见例如,Bennett&Lasure,More Gene Manipulations in Fungi,Academic Press,San Diego,第70-76页(1991)以及其中所引用的描述真菌宿主中的靶向基因组插入的论文)。
术语“丝状真菌”是指真菌亚门(Eumycotina)的所有丝状形式(参见Alexopoulos,C.J.(1962),INTRODUCTORY MYCOLOGY(《菌学概论》),Wiley,New York)。这些真菌的特征是其营养菌丝体的细胞壁由甲壳质、葡聚糖和其它复合多糖组成。本教导内容的丝状真菌在形态学上、在生理上以及在遗传上有别于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长,且碳分解代谢是专性好氧的。丝状真菌包括真菌亚门,特别是盘菌亚门(Pezizomycotina)物种的所有丝状形式。丝状真菌亲本细胞可以是以下但不限于以下物种的细胞:木霉属,例如长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum);青霉菌属的种(Penicillium sp.);腐质霉属的种(Humicola sp),包括特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea);金孢子菌属的种(Chrysosporium sp.),包括C.lucknowense;毁丝霉属的种(Myceliophthora sp.);粘帚霉属的种(Gliocladium sp.);曲霉属的种(Aspergillus sp.);镰孢属的种(Fusarium sp.)、脉孢菌属的种(Neurosporasp.)、肉座菌属的种(Hypocrea sp.)(例如红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、以及裸胞壳属的种(Emericella sp.)。如本文所用,术语“木霉属”或“木霉属的种”是指先前归类为木霉属或目前归类为木霉属的任何真菌菌株。在某些实施方案中,GH61酶可来自非丝状真菌细胞。GH61A酶的示例包括以下项中发现的那些:红褐肉座菌(里氏木霉)、红棕肉座菌(Hypocrea rufa)、东方肉座菌(Hypocrea orientalis)、Hypocrea atroviridis、绿色木霉菌(Hypocrea virens)、构巢裸胞壳(Emericella nidulans)、土曲霉(Aspergillusterreus)、米曲霉、黑曲霉、川地曲霉(Aspergillus kawachii)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、禾顶囊壳(Gaeumannomyces graminis)、土星孢木霉(Trichoderma saturnisporum)、四孢脉孢菌(Neurospora tetrasperma)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、烟曲霉(Neosartorya fumigate)、费希新萨托菌(Neosartoryafischeri)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、以及异梭孢壳菌(Thielaviaheterothallica)。
术语“异源”是指通常非彼此相关的元件。例如,如果重组宿主细胞产生异源蛋白质,而在相同类型的野生型宿主细胞中不产生该蛋白质;异源启动子是在野生型宿主细胞的内源性核酸中不存在的启动子;并且可操作连接至异源编码序列的启动子是可操作连接至在野生型宿主细胞中其通常不可操作连接至的编码序列的启动子。
“异源”核酸构建体或序列,序列的一部分不是表达其的细胞天然具有的。就控制序列而言的异源是指这样的控制序列(即启动子或增强子),对于其目前调节表达的同一基因,在自然界中其不起到调节作用。一般来讲,异源核酸序列对其所在的细胞或基因组部分不是内源的,而是已通过感染、转染、转化、显微注射、电穿孔等添加至细胞。“异源”核酸构建体可含有与天然细胞中存在的控制序列/DNA编码序列组合相同或不同的控制序列/DNA编码序列组合。
“同系物”或“同源”意指生物分子与对象氨基酸序列或所指示的对象核苷酸序列具有指定程度的同一性。同源序列被认为包括与对象序列具有至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性的氨基酸或核酸序列,该同一性使用常规的序列比对工具(例如,Clustal、BLAST等)测量。通常,对象酶的同系物将包括与对象酶相同/相似的活性位点残基并且/或者表现出相似的酶活性,除非另外指明。
用于执行序列比对和确定序列同一性的方法是技术人员已知的,可在不需要过多实验的情况下进行,并且可以明确获得同一性值的计算。参见,例如,Ausubel等人编辑,(1995)Current Protocols in Molecular Biology,第19章(Greene Publishing andWiley-Interscience,New York);以及ALIGN程序(Dayhoff(1978)在Atlas of ProteinSequence and Structure 5:增刊3中(National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.)。多个算法可用于比对序列和确定序列同一性,包括例如同源比对算法(Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443);局部同源性算法(Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2:482);相似性检索方法(Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444);Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997));以及BLASTP、BLASTN和BLASTX算法(参见Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。
使用这些算法的计算机化程序也可获得,包括但不限于:ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件,或WU-BLAST-2(Altschul等人,Meth.Enzym.,266:460-480(1996));或GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,可在Genetics Computing Group(GCG)软件包,第8版,Madison,Wisconsin,USA中获得;以及Intelligenetics,Mountain View,California的PC/Gene程序中的CLUSTAL。本领域的技术人员可确定用于测量比对的适当参数,包括在正在比较的序列长度上实现最大比对所需的算法。优选地,使用程序确定的默认参数来确定序列同一性。具体地,序列同一性可通过以下方式确定:使用Clustal W(Thompson J.D.等人(1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680),利用默认参数,即:
如本文所用,“宿主细胞”或“宿主菌株”是指适用于特定目的,例如用于表达特定基因、用于增殖载体等的细胞。在某些实施方案中,宿主细胞携带包括编码根据本发明的组合物和方法的一种或多种感兴趣的蛋白质的多核苷酸序列(例如,编码铜酶和/或一种或多种铜金属伴侣蛋白的多核苷酸序列)的表达载体。宿主细胞包括原核和真核生物体,包括可用于表达期望多肽/酶(或多种多肽/酶)和/或用于载体的增殖的任何可转化微生物。宿主细胞的示例包括但不限于以下项的物种:芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、木霉属、曲霉属、酵母属(Saccharomyces)等。在某些方面,宿主细胞为重组宿主细胞,即不是天然存在的细胞(参见以下“重组”的定义)。
在将核酸序列插入细胞中的语境中,术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。
如本文所用,相对于氨基酸或核苷酸序列而言的“序列同一性百分比(%)”定义成为了实现最大比对(序列同一性百分比),将序列比对,并且,如果需要,引入空位之后,而且不考虑任何保守型取代作为序列同一性的一部分,在候选序列中与感兴趣的序列(例如,金属伴侣蛋白序列)中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。
“纯化”或“分离”或“富集”是指生物分子(例如,多肽或多核苷酸)是由其天然状态改变而来,这是通过将该生物分子与其天然相联的一些或所有天然存在的组分分离来完成的。这种分离或纯化可通过本领域公认的分离技术实现,诸如离子交换层析、亲和层析、疏水分离、渗析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀或其它蛋白质盐沉淀、离心、尺寸排阻色谱、过滤、微孔过滤、凝胶电泳或梯度分离以去除整个细胞、细胞碎片、杂质、外源蛋白质、或最终组合物中不期望的酶。还可以接着向经过纯化或分离的生物分子组合物(例如经过纯化的多肽)中添加提供附加益处的组分,例如活化剂、抗抑制剂、理想的离子、控制pH的化合物、或其它酶或化学物质。
如本文所用,“微生物”是指细菌、真菌、病毒、原生动物、以及其它微生物或微生物体。
术语“核酸”和“多核苷酸”互换使用并且涵盖单链或双链的DNA、RNA、cDNA以及它们的化学修饰物。由于遗传密码的简并性,某种特定氨基酸可用超过一种密码子来编码,因此本发明涵盖编码某种特定氨基酸序列的所有多核苷酸。
术语“可操作连接”是指能让各元件在功能上相关的元件布置关系。例如,如果启动子控制编码序列的转录,那么该启动子可操作连接至该序列;如果信号序列引导蛋白质通过宿主细胞的分泌系统,那么该信号序列可操作连接至该蛋白质。
如本文所用,术语“多肽”和“酶”互换使用,是指通过肽键连接的包含氨基酸残基的任意长度的聚合物。本文中使用氨基酸残基的常规单字母或三字母编码。所述聚合物可为直链或支链的,其可包含经修饰的氨基酸,并且其可被非氨基酸隔断。所述术语还涵盖天然改性或通过干预修饰的氨基酸聚合物;例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰,诸如与标记组分缀合。所述定义中还包括,例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知其它修饰形式的多肽。
术语“启动子”在本文定义为在细胞中指导下游多核苷酸的转录的核酸。在某些情况下,多核苷酸可包含编码序列,并且启动子可指导编码序列转录成可翻译的RNA。
术语“重组”,当参考生物组分或组合物(例如,细胞、核酸、多肽/酶、载体等)使用时,指示该生物组分或组合物处于并非天然存在的状态。换句话说,生物组分或组合物已经从其天然状态通过人工干预修饰。例如,重组细胞(或宿主细胞)涵盖表达在其天然亲本(即非重组)细胞中不存在的一种或多种基因的细胞、以不同于其天然亲本细胞的量表达一种或多种天然基因的细胞、和/或在不同于其天然亲本细胞的条件下表达一种或多种天然基因的细胞。重组核酸可与天然序列有一个或多个核苷酸的差异、可操作连接至异源序列(例如,异源启动子、编码非天然或变异的信号序列的序列等)、不含内含子序列、和/或处于分离形式。重组多肽/酶与天然序列可存在一个或多个氨基酸的差异,可与异源序列融合、可以是截短的或者具有氨基酸的内部缺失、可以天然细胞中不存在的方式表达(例如,从由于细胞中存在编码该多肽的表达载体而过表达该多肽的重组细胞)和/或处于分离形式。要强调的是,在一些实施方案中,重组多核苷酸或多肽/酶具有与其野生型对应物相同但处于非天然形式(例如,处于分离或富集形式)的序列。
术语“信号序列”是指在蛋白质的N端部分的氨基酸序列,其促进该成熟形式的蛋白质分泌到细胞外部。成熟形式的细胞外蛋白质没有信号序列,其在分泌过程期间被切除。
术语“载体”在本文被定义为这样的多核苷酸,其被设计成携带核酸序列进入一种或多种细胞类型中。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体或病毒颗粒、DNA构建体、表达盒等等。表达载体和表达盒可包括调控序列,诸如启动子、信号序列、编码序列和转录终止子。
短语“基本上相同的培养条件”等是指培养第一宿主细胞的条件与用于第二宿主细胞的那些条件相同或近似相同,由此使得可进行第一和第二宿主细胞的性能或特征的有意义的比较。将基本上相同的参数包括温度、pH、铜浓度、时间、搅拌、培养基等。建立在“基本上相同的培养条件”下进行的比较性宿主细胞培养显然在本领域普通技术人员的能力范围内。
关于细胞而使用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”意指细胞含有整合到其基因组中或作为通过多代相传保持的附加体而携带的非天然(如,异源)核酸序列的细胞。
漆酶(IUBMB酶命名法:EC 1.10.3.2)是存在于许多植物、真菌和微生物中的含铜氧化酶。漆酶作用于酚和类似分子,进行一电子氧化。漆酶可通过促进单木质醇(一类天然存在的酚)的氧化偶联而在木质素的形成中起作用。漆酶也称为:漆油氧化酶(urishioloxidase);漆酚氧化酶(urushiol oxidase);以及对苯二酚氧化酶。
酪氨酸酶(IUBMB酶命名法:EC 1.14.18.1)是存在于广泛种类的细菌、真菌、植物、昆虫、甲壳类动物和哺乳动物中的III型铜蛋白,并且涉及多种颜料分子,例如甜菜色素和黑色素的合成。酪氨酸酶也称为:一元酚单加氧酶;酚酶;一元酚氧化酶;甲酚酶;一元酚酶;酪氨酸多巴氧化酶;一元酚单氧化酶;一元酚二羟基苯丙氨酸:氧氧化还原酶;N-乙酰基-6-羟基色氨酸氧化酶;一元酚,二羟基-L-苯丙氨酸:氧氧化还原酶;邻二酚:O2氧化还原酶;以及酚氧化酶。
“GH61”或“GH61酶”或“AA9”或“AA9酶”等是指属于近期已重新归类为AA9的糖苷水解酶61家族(GH61)的酶。AA9(以前是GH61)蛋白是铜依赖性的裂解性多糖单加氧酶(LPMO)。AA9家族的描述以及AA9酶的列表可见于www.cazy.org上的碳水化合物-活性酶数据库(CAZy)(另外参见Lombard V,Golaconda Ramulu H,Drula E,Coutinho PM,Henrissat B(2014)2013.Nucleic Acids Res 42:D490–D495.[PMID:24270786]中的TheCarbohydrate-active enzymes database(CAZy))。在某些方面,AA9酶来源于里氏木霉,并且包含SEQ ID NO:11中示出的氨基酸序列、保持LPMO活性的与其具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的氨基酸序列、其等位基因变体、或其片段。来自不同物种的GH61/AA9家族成员的列表登录号(Genbank和Uniprot)提供于表3。
组合物和方法
本教导内容基于以下发现,即可通过过表达一种或多种铜金属伴侣蛋白来改善铜酶在宿主细胞中的分泌。因此,本教导内容提供了用于增加宿主细胞例如丝状真菌中的蛋白质分泌的方法,其通过过表达一种或多种铜金属伴侣蛋白,例如可溶性铜转运蛋白、膜结合的铜转运蛋白,或两者来实现。本教导内容还提供了用于增加的分泌的表达宿主,例如包含某些铜金属伴侣蛋白和感兴趣的铜酶的丝状真菌。
根据本教导内容的一个方面,提供了用于增加感兴趣的铜酶在宿主中的分泌/产生的方法,其通过在宿主细胞中过表达铜金属伴侣蛋白以及期望铜酶来实现。本教导内容的铜金属伴侣蛋白可为与铜转运相关联的任何合适的蛋白质。在一些实施方案中,铜金属伴侣蛋白可以是作为全长铜金属伴侣蛋白,具有基本上相同、或增强的铜转运功能的铜金属伴侣蛋白的片段。
在各种实施方案中,用于本教导内容的方面的铜金属伴侣蛋白包括任何胞质/可溶性或膜结合的铜转运蛋白。在一些实施方案中,铜金属伴侣蛋白选自表1和2中所示的铜转运蛋白以及它们的衍生物或同系物,例如,基于本领域技术人员普遍接受的功能或结构相似性。例如,本发明的某些方面包括与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相同或基本上相同,例如具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的一种或多种可溶性铜转运蛋白的使用。此外,本发明的某些方面包括与SEQ ID NO:6、12、13、14或15的氨基酸序列相同或基本上相同,例如具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的一种或多种膜结合的铜转运蛋白的使用。如本文所详述,表现出改善的铜酶分泌的宿主细胞可表达一种或多种膜结合铜转运蛋白、一种或多种可溶性铜转运蛋白、或膜结合和可溶性铜转运蛋白两者的组合。
一般来讲,一种或多种铜金属伴侣蛋白连同一种或多种期望铜酶一起在宿主细胞中过表达,其中铜金属伴侣蛋白和铜酶的表达处于它们自己相应的可操作连接的启动子的控制下。在一些实施方案中,铜金属伴侣蛋白和/或铜酶在期望宿主细胞的天然启动子下表达,或者,另选地,铜金属伴侣蛋白和/或铜酶在期望宿主细胞异源的启动子下表达。在一些实施方案中,铜金属伴侣蛋白和/或铜酶在组成型启动子下表达,而在其它实施方案中,铜金属伴侣蛋白和/或铜酶在诱导型启动子下表达。需注意,可采用任何启动子组合在宿主细胞中表达铜金属伴侣蛋白(即,一种或多种铜金属伴侣蛋白)和铜酶(即,一种或多种铜酶)。例如,一种或多种铜金属伴侣蛋白在异源的组成型启动子下表达,而一种或多种铜酶在天然的诱导型启动子下表达(或反之亦然)。在一些实施方案中,可操作连接的启动子可以是经过修饰的天然启动子,例如具有增强的启动子转录活性的突变型天然启动子。
在某些实施方案中,一种或多种铜金属伴侣蛋白的过表达可通过改变一种或多种铜金属伴侣蛋白的天然启动子的转录抑制子或诱导物在宿主细胞中的表达来实现。例如,可减少铜金属伴侣蛋白的转录抑制子在宿主细胞中的表达,或者,相反地,可增加铜金属伴侣蛋白的转录诱导物(或激活因子)在宿主细胞中的表达。在仅仅一个示例中,可增加铜金属伴侣蛋白转录激活因子Mac1(金属结合激活因子1;酵母的铜缺乏性-诱导型转录因子)在宿主细胞中的表达,从而导致铜金属伴侣蛋白的过表达。可通过在宿主细胞中引入用于转录因子的表达盒或表达载体来实现转录激活因子(例如Mac1)表达的增加。
如本文所用,术语“启动子”是指用于指导可操作连接的编码序列(例如,基因、cDNA或合成编码序列)的转录的核酸序列。启动子可包括转录起始位点附近的必要的核酸序列,诸如,在聚合酶II型启动子的情况中为TATA元件。启动子与其它转录和翻译调控核酸序列一起统称为调控序列,控制可操作连接的编码序列的表达。一般来讲,调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活因子序列。调控序列一般将适于编码序列在其中被表达的宿主细胞并且被宿主细胞识别。
组成型启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。诱导型或阻抑型启动子是在环境或发育调控下有活性的启动子。启动子可通过环境因素的改变诱导或阻抑,诸如但不限于碳、氮、或其它营养物质的可获得性、温度、pH、同渗容摩、重金属的存在、抑制剂的浓度、压力、或上述的组合,如本领域中所已知的。启动子可通过代谢因素诱导或阻抑,诸如某些碳源的含量、某些能量源的含量、某些分解代谢物的含量、或上述的组合,如本领域中已知的。
启动子的合适的非限制性示例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、xyn1和xyn2、产黄青霉(P.chrysogenum)的阻抑型酸磷酸酶基因(phoA)启动子(参见Graessle等人,Applied and Environmental Microbiology(1997),63(2),753-756)、葡萄糖阻抑型PCK1启动子(参见Leuker等人Gene(1997),192(2),235-240)、麦芽糖诱导型、葡萄糖阻抑型MRP1启动子(参见Munro等人Molecular Microbiology(2001),39(5),1414-1426)、甲硫氨酸阻抑型MET3启动子(参见Liu等人Eukaryotic Cell(2006),5(4),638-649)。
可用于本教导内容的诱导型启动子的示例为里氏木霉的cbh1启动子,其核苷酸序列以登录号D86235寄存在GenBank中。其它示例性启动子为编码纤维素酶的基因的调控中所涉及的启动子,诸如但不限于cbh2、egl1、egl2、egl3、egl5、xyn1和xyn2。
根据本教导内容,铜金属伴侣蛋白可用于增加任何合适的铜酶在宿主中的分泌/产生。当首先在宿主细胞中表达时,可分泌铜酶通常可操作连接至信号序列,例如引导蛋白质或多肽通过细胞的分泌途径的氨基酸序列标签。信号序列可以是铜酶的天然信号序列(即,野生型酶中存在的信号序列)或异源信号序列(即,来源于通过重组方法可操作连接至成熟的感兴趣铜酶的不同分泌性蛋白质的信号序列)。可使用已知的或后来发现的任何合适的信号序列,例如来自黑曲霉葡糖淀粉酶或天冬氨酸蛋白酶的信号序列、或来自米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)或里氏木霉天冬氨酸蛋白酶或纤维素酶(例如,里氏木霉纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II或内切葡聚糖酶III)的信号序列。
根据本教导内容,铜金属伴侣蛋白可在任何宿主中用于增加期望铜酶在宿主中的分泌。在一些实施方案中,表达宿主为丝状真菌。一般来讲,“丝状真菌”是为真菌亚门的丝状形式的真核微生物。这些真菌的特征是其营养菌丝体的细胞壁由甲壳质、β-葡聚糖和其它复合多糖组成。在各种实施方案中,本教导内容的丝状真菌在形态学上、在生理上以及在遗传上有别于酵母。在一些实施方案中,本教导内容的丝状真菌包括但不限于以下属:曲霉属、枝顶孢属、出芽短梗霉属、白僵菌、头孢霉属、拟蜡菌属、毛壳菌属、拟青霉属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、隐球菌属、黑蛋巢菌属、内座壳属、Endothia mucor、镰孢属、粘帚霉属、腐质霉属、Magnaporthe、毁丝霉属、漆斑菌属、毛霉菌属、脉孢菌属、平革菌属、柄孢壳菌属、拟青霉属、青霉属、梨孢霉属、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、壳多胞菌属、踝节菌属、木霉属、嗜热菌属、热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、毛癣菌属、栓菌属、以及侧耳属。在一些实施方案中,本教导内容的丝状真菌包括但不限于以下:构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉、红褐肉座菌、粗糙脉孢霉(N.crassa)、里氏木霉、以及绿色木霉。
本教导内容的另一个方面提供了一种表达铜金属伴侣蛋白和感兴趣的期望铜酶的表达宿主。在一些实施方案中,本教导内容的表达宿主包含编码铜酶的第一多核苷酸和编码铜金属伴侣蛋白的第二多核苷酸。在一些实施方案中,表达宿主还包含编码例如与由第二多核苷酸编码的铜金属伴侣蛋白不同的第二铜金属伴侣蛋白的第三多核苷酸。此外,宿主细胞还可包括编码例如不同于由第一多核苷酸编码的铜酶的第二感兴趣的铜酶的第四多核苷酸。在某些实施方案中,编码铜酶和铜金属伴侣蛋白的多核苷酸为已例如通过转化引入宿主细胞中的重组表达盒,下文将更详细地描述。
在一些实施方案中,期望铜酶可作为融合多肽产生。在一些实施方案中,可使期望铜酶与丝状真菌有效分泌的多肽融合,以增强分泌,有利于后续纯化/鉴定或增强稳定性。
一般来讲,在本教导内容的表达宿主中编码一种或多种铜金属伴侣蛋白和/或一种或多种铜酶的一种或多种多核苷酸可基因插入或整合到表达宿主的基因组构成中,例如整合到表达宿主的染色体中,或存在于染色体外,例如在载体携带的选择标记的选择条件下作为复制载体存在于表达宿主内。
可分泌铜酶的产生/分泌可在样品(例如培养发酵液)中直接测量,例如通过检测酶活性或存在的酶量的测定。可使用免疫学方法,诸如蛋白质印记(Western blot)或ELISA定性和定量地评价可分泌铜酶的表达。此类方法的细节是本领域技术人员已知的,并且许多用于实施这种方法的试剂是可商购获得的。
表1:与可溶性(胞质)里氏木霉铜转运蛋白(SEQ ID NO:3)具有同源性的蛋白质的列表。表1示出登录号(UNIPROT)、生物体以及与SEQ ID NO:3的序列同一性。使用蛋白质序列数据库UNIPROT作为氨基酸序列的来源。使用标准蛋白质-蛋白质BLAST(blastp)针对NCBI/BLAST网站上的Uniprot数据库确定序列同一性。
表2:膜结合的里氏木霉铜转运ATP酶(或铜通透酶)(SEQ ID NO:6)的同源序列。表2示出登录号(UNIPROT)、生物体以及与SEQ ID NO:6的序列同一性。使用蛋白质序列数据库UNIPROT作为氨基酸序列的来源。使用标准蛋白质-蛋白质BLAST(blastp)针对NCBI/BLAST网站上的Uniprot数据库确定序列同一性。
表3:初始归类为糖苷水解酶61(GH61)家族且现在归类为AA9(铜依赖性的裂解性多糖单加氧酶(LPMO))的铜酶的示例。
实用性
本文详述的组合物和方法为铜酶的产生提供多种益处。例如,本公开的方面允许改善用于工业环境的铜酶的产生,包括在纤维素生物质加工中用于产生商业相关产物例如纤维素乙醇的铜酶。其它铜酶,例如漆酶和酪氨酸酶的产生的改善也具有明确的商业价值(例如,用于洗涤剂、生物燃料和食品应用中)。
此外,本公开的组合物和方法允许减少在铜酶生产中所用铜的总量,这减少了发酵过程的废水中的铜含量,因此有助于满足在工厂排放物中对这种金属的规章要求。
根据前面的描述和以下的实施例,本发明组合物和方法的其它方面和实施方案将显而易见。
实施例
根据实施例可以进一步理解本教导内容的方面,所述实施例不应理解为以任何方式限制本教导内容。
实施例1:铜对酪氨酸酶表达细胞的作用
生成用于过表达里氏木霉酪氨酸酶(SEQ ID NO:9)的表达载体并将其转化到里氏木霉宿主细胞中。驱动编码里氏木霉酪氨酸酶的DNA序列的表达的启动子是cbh1启动子。来自这些经转化宿主细胞的分泌性蛋白的表达水平在14-L发酵培养基中测定。在34℃和pH3.5下振摇,使细胞在烧瓶中预生长,直到葡萄糖耗尽。开始葡萄糖/槐糖进料,将温度从34℃转换到28℃并且将pH从3.5转换到4。(葡萄糖/槐糖是cbh1启动子的诱导剂)。通过调节搅拌、压力和气流,使溶解氧百分比保持恒定。使发酵持续进行约200小时(取决于酶产生速率)。在图2中,通过SDS-PAGE对来自以上表达酪氨酸酶的宿主细胞的14-L级发酵的细胞外蛋白质表达进行分析。培养时间在底部以小时示出并且以向上的箭头指示发酵过程中铜进料的起始。分泌性酶酪氨酸酶和内切葡聚糖酶6在凝胶上的条带指示于左侧(分别为Tyr和EG6)。含铜酪氨酸酶在69小时内显示出一个峰值产生并且接着在剩余的时间过程中显示出减少的积聚。相比之下,非含铜酶内切葡聚糖酶6(EG6)显示出随整个时间过程的推移而增加的积聚。这说明随着时间的推移,含铜酶的表达效率低于非含铜酶。
为了改善酪氨酸酶的表达,在不同量的铜中培养过表达酪氨酸酶的宿主细胞。图3示出在增加量的铜(在各泳道的底部示出)的存在下酪氨酸酶(Tyr)的表达的SDS-PAGE分析。如该图中所示,增加生长培养基中存在的硫酸铜的量导致从宿主细胞产生的酪氨酸酶减少,而不是产量增加。这一模式在过表达酪氨酸酶的宿主细胞的两个独立菌株的酪氨酸酶活性的测定中得到证实(图4)。在图4中,在从0至1000μM范围的不同铜浓度下培养过表达酪氨酸酶的菌株A和C(分别为上图和下图),并且使用酪氨酸作为底物并在286nm(空白柱)和470nm(填充柱)下检测产物的形成来测量培养上清液中的酪氨酸酶活性。不对蛋白质产生造成不利影响的最高铜浓度为大约15μM。推测额外的铜不被正确地运输至分泌途径,因此导致低的酪氨酸酶分泌和/或细胞毒性。
实施例2:铜金属伴侣蛋白的过表达增加酪氨酸酶表达
通过与已知序列的同源性鉴定来自里氏木霉的可溶性铜转运蛋白和膜结合的铜转运ATP酶的合成基因,然后将其合成(Life Technologies)。构建这两种里氏木霉铜金属伴侣蛋白的表达载体并且使用所述表达载体确定它们的过表达是否可改善酪氨酸酶在实施例1的宿主细胞中的表达。图1A-1B示出以下示意图:(1A)膜结合的铜转运ATP酶的表达构建体以及(1B)细胞质(可溶性)铜转运蛋白的表达构建体。这些铜分子伴侣基因使用组成型丙酮酸激酶(pki)启动子表达并且包括来源于CBH1基因的终止子。
图5示出来源于过表达酪氨酸酶的细胞的酪氨酸酶活性的斑点测定的结果,所述细胞是在导致降低的/不可检测的酪氨酸酶表达的铜含量(6mM)的存在下培养的。在该测定中通过以下方式检测酪氨酸酶活性:将10μL培养上清液和200μL的10%脱脂乳(预热至35℃)在微量滴定板中配混并将混合物在35℃下温育10分钟(或更长时间)。当酪氨酸酶存在且具有活性时,脱脂乳从白色变为红色。加号指示具有明显红色的孔。
可以预知,在对照菌株A(泳道8中的孔)和C(泳道1中的孔)中不可检测到酪氨酸酶活性,用虚线绘出。然而,当用膜结合的铜转运ATP酶(泳道2-7中的孔)或细胞质(可溶性)铜转运蛋白质粒(泳道9-12中的孔)中的任一者重新转化这些菌株时,菌株A和C产生酪氨酸酶的能力恢复。因此,这些铜分子伴侣中任一者的表达导致酪氨酸酶铜酶的表达显著增加。
实施例3:铜金属伴侣蛋白的过表达增加漆酶表达
图6示出来自一色齿毛菌的铜金属蛋白漆酶D的表达载体构建体(从cbh1启动子转录,具有CBH1信号序列和cbh1转录终止子)。成熟漆酶D序列为SEQ ID NO:10。
图7A-7C示出过表达漆酶D的菌株(菌株32A)中漆酶D产生的分析,其中存在和不存在上述铜金属伴侣蛋白(由图1中描绘的载体表达的SEQ ID NO:3和6)中的一者或两者的过表达。图7A示出漆酶D在菌株32A(最左边的柱,设为100%)和源自所述菌株32A的过表达胞质转运蛋白和膜结合的铜转运ATP酶两者的菌株(#46、#47和#48)(用图1A和1B所示的表达载体转化)中的相对表达水平。图7B示出漆酶D在菌株32A(最左边的柱,设为100%)和源自所述菌株的仅过表达膜结合的铜转运ATP酶的菌株(#2、#16、#29、#30和#31)(用图1A所示的表达载体转化)中的相对表达水平。图7C示出漆酶D在菌株32A(最左边的柱,设为100%)和源自所述菌株的仅过表达胞质铜转运蛋白的菌株(#5、#22、#27和#35)(用图1B所示的表达载体转化)中的相对表达水平。将转化体在微量滴定板中培养5天并使用ABTS测定(ABTS=2,2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))测定漆酶表达。对于ABTS测定,将10μl的5天龄液体培养物转移到新的板,加入150μl的100mM NaOAc,pH 5和20μl的4.5mM ABTS。使用Spectra Max分光光度计以20秒间隔测量OD420 5分钟。该数据显示,膜结合的铜转运蛋白ATP酶的表达自身或与细胞质(可溶性)铜转运蛋白的结合表达显著改善了漆酶D产生。
尽管以说明和示例的方式对上述组合物和方法进行了相当详细的描述以使理解透彻,但根据本文的教导内容对本领域一般技术人员显而易见的是,可在不脱离所附权利要求的实质和范围的情况下对本发明进行某些改变和修改。
因此,上文仅说明本发明组合物和方法的原理。应当理解,虽然未在本文明确地描述或示出,本领域的技术人员将能够设计实施本发明组合物和方法的原理并且包括在其实质和范围之内的各种布置方式。此外,本文所引用的所有示例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明组合物和方法的原理以及由发明人贡献以推动技术发展的概念,并且将被理解成并不局限于此类专门引用的示例和条件。另外,本文的所有记载本发明组合物和方法的原理、方面和实施方案及其具体示例的陈述均旨在涵盖其结构和功能等效物。另外,预期此类等效物包括目前已知的等效物和在将来开发的等效物,即无论结构如何,所开发的执行相同功能的任何元件。因此,本发明组合物和方法的范围不旨在局限于本文示出和描述的示例性实施方案。
序列表
Claims (41)
1.一种用于由宿主细胞产生铜酶(cuproenzyme)的方法,包括:
在表达铜酶的宿主细胞中过表达铜金属伴侣蛋白,以及
在足以产生所述铜酶的条件下培养所述宿主细胞,
其中当在基本上相同的培养条件下培养时,与不过表达所述铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比,所述宿主细胞产生增加的量的所述铜酶。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述铜酶是从所述宿主细胞中分泌的。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述铜酶选自由以下项构成的组:裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、胆红素氧化酶、儿茶酚氧化酶、多巴胺β-单加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗坏血酸氧化酶、肽基甘氨酸单加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-双氧化酶、以及过氧化物歧化酶。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述铜酶与所述宿主细胞是内源的。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述铜酶与所述宿主细胞是异源的。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中通过源自所述宿主细胞的启动子控制所述铜酶和/或所述铜金属伴侣蛋白的表达。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述宿主细胞为里氏木霉(Trichoderma reesei,T.reesei)细胞,并且所述启动子为源自里氏木霉的丙酮酸激酶(pki)或纤维二糖水解酶I(cbh1)启动子。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞表达至少一种另外的铜酶,其中在基本上相同的培养条件下,与不过表达所述铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比,所述至少一种另外的铜酶的产生水平增加。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述铜金属伴侣蛋白为膜结合的铜转运ATP酶。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述膜结合的铜转运ATP酶包含与SEQ ID NO:6具有至少60%同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求9或10所述的方法,其中所述膜结合的铜转运ATP酶选自表2中列出的那些。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述铜金属伴侣蛋白为可溶性铜转运蛋白。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述可溶性铜转运蛋白包含与SEQ ID NO:3具有至少60%同一性的氨基酸序列。
14.根据权利要求12或13所述的方法,其中所述可溶性铜转运蛋白选自表1中列出的那些。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,还包括在所述宿主细胞中过表达第二铜金属伴侣蛋白。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述第一铜金属伴侣蛋白为包含与SEQ ID NO:6具有至少60%同一性的氨基酸序列的膜结合的铜转运ATP酶,并且所述第二铜金属伴侣蛋白为包含与SEQ ID NO:3具有至少60%同一性的氨基酸序列的可溶性铜转运蛋白。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞为丝状真菌宿主细胞。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述丝状真菌宿主选自由以下项构成的组:曲霉属(Aspergillus)、枝顶孢属(Acremonium)、出芽短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、头孢霉属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛壳菌属(Chaetomium)、拟青霉属(paecilomyces)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、内座壳属(Endothia)、Endothia mucor、镰孢属(Fusarium)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、毛霉菌属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、平革菌属(Phanerochaete)、柄孢壳菌属(Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、梨孢霉属(Pyricularia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophylum)、壳多胞菌属(Stagonospora)、踝节菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、嗜热菌属(Thermomyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、毛癣菌属(Trichophyton)、栓菌属(Trametes)、以及侧耳属(Pleurotus)。
19.根据权利要求17所述的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞为里氏木霉、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、或埃默森篮状菌(Talaromycesemersonii)宿主细胞。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法,其中所述过表达步骤包括增加转录因子Mac1在所述宿主细胞中的表达。
21.根据权利要求20所述的方法,其中增加Mac1的表达包括向所述宿主细胞中引入Mac1表达载体。
22.一种减小宿主细胞的铜毒性的方法,包括:
在宿主细胞中过表达铜金属伴侣蛋白,其中与不过表达所述铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比,所述宿主细胞具有减小的铜毒性。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述宿主细胞过表达铜酶。
24.一种降低细胞培养发酵液中的铜含量的方法,包括:
在包含铜的细胞培养基中培养过表达铜金属伴侣蛋白的宿主细胞,以产生细胞培养发酵液,其中当在基本上相同的培养条件下在基本上相同的细胞培养基中培养时,与由不过表达所述铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞得到的细胞培养发酵液的铜含量相比,所述所得细胞培养发酵液中的铜含量降低。
25.一种重组宿主细胞,所述宿主细胞包含:
编码铜酶的第一多核苷酸,以及
编码铜金属伴侣蛋白的第二多核苷酸,其中所述铜酶在所述宿主细胞中表达并且所述铜金属伴侣蛋白在所述宿主细胞中过表达,并且其中在基本上相同的培养条件下,与不过表达所述铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比,所述宿主细胞中的所述铜酶的表达水平增加。
26.根据权利要求25所述的重组宿主细胞,其中所述铜酶是从所述宿主细胞分泌的。
27.根据权利要求25或26所述的重组宿主细胞,其中所述铜酶选自由以下项构成的组:裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、胆红素氧化酶、儿茶酚氧化酶、多巴胺β-单加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗坏血酸氧化酶、肽基甘氨酸单加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-双氧化酶、以及过氧化物歧化酶。
28.根据权利要求27所述的重组宿主细胞,其中所述铜酶选自表3中列出的那些。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的重组宿主细胞,其中所述铜酶与所述宿主细胞是异源的。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的重组宿主细胞,其中通过所述宿主细胞的启动子控制所述铜酶和/或所述铜金属伴侣蛋白的表达。
31.根据权利要求30所述的重组宿主细胞,其中宿主细胞为里氏木霉,并且所述启动子为来源于里氏木霉的pki或cbh1启动子。
32.根据权利要求25至31中任一项所述的重组宿主细胞,其中所述第二多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:6具有至少60%同一性的氨基酸序列的膜结合的铜转运ATP酶。
33.根据权利要求25至32中任一项所述的重组宿主细胞,其中所述第二多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:3具有至少60%同一性的氨基酸序列的可溶性铜转运蛋白。
34.根据权利要求25至33中任一项所述的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞还包含编码第二铜金属伴侣蛋白的第三多核苷酸。
35.根据权利要求34所述的重组宿主细胞,其中所述第一铜金属伴侣蛋白为包含与SEQID NO:6具有至少60%同一性的氨基酸序列的膜结合的铜转运ATP酶,并且所述第二铜金属伴侣蛋白为包含与SEQ ID NO:3具有至少60%同一性的氨基酸序列的可溶性铜转运蛋白。
36.根据权利要求25至35中任一项所述的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞为丝状真菌宿主细胞。
37.根据权利要求36所述的重组宿主细胞,其中所述丝状真菌宿主选自由以下项构成的组:曲霉属、枝顶孢属、出芽短梗霉属、白僵菌、头孢霉属、拟蜡菌属、毛壳菌属、拟青霉属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、隐球菌属、黑蛋巢菌属、内座壳属、Endothia mucor、镰孢属、粘帚霉属、腐质霉属、Magnaporthe、毁丝霉属、漆斑菌属、毛霉菌属、脉孢菌属、平革菌属、柄孢壳菌属、拟青霉属、青霉属、梨孢霉属、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、壳多胞菌属、踝节菌属、木霉属、嗜热菌属、热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、毛癣菌属、栓菌属、以及侧耳属。
38.根据权利要求36所述的重组宿主细胞,其中所述丝状真菌宿主细胞为里氏木霉、黑曲霉、米曲霉、或埃默森篮状菌宿主细胞。
39.根据权利要求25-38中任一项所述的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞过表达Mac1,其中Mac1的过表达导致所述铜金属伴侣蛋白在所述宿主细胞中的过表达。
40.一种上清液,其是由根据权利要求25至39中任一项所述的重组宿主细胞的培养物获得的。
41.一种上清液,其是使用根据权利要求1至24中任一项所述的方法获得的。
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