ES2216284T3 - Transformacion de mohos mediada por agrobacterium, en particular de aquellos que pertenecen al genero aspergillus. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a la transformación de mohos favorecida por Agrobacterium que comprende especies de subdivisiones de hongos. Ascomycotina, Basidiomycotina, Deutermycotina, Mastigomycotina, y Zygomycotina. Los ejemplos demuestran la tranasformación deAspergillus awamori (ambos protoplastos y conidia), Aspergillus nidulans, Aspergillus Níger, colletovtrichum gleosporiodes, Fusarium solani pisi, Neurospora Crassa, Trichoderma reesei, Pleurotus ostreatus y Agaricus bisporus (todos conidia) y Fusarium graminerarum (ambos conidia y material ATCC seco congelado rehidratado). Especialmente para Asprgillus awamori, la frecuencia de transformación es mucho más alta que con las técnicas de transformación de mohos convenciones. Se ha descubierto además que no solo un gen expresable puede introducirse en estos mohos, sino que incluso múltiples copias de este gen, que además se puede orientar por ejemplo en el lugar PyrG CROMOSOMAL; COMO SE MUESTRA EN EL EJEMPLO PARA A. Awamori. Estas múltiples copias puede ser de un gen que codifica una proteína heteróloga u homóloga deseada.,

Description

Transformación de mohos mediada por Agrobacterium, en particular de aquellos que pertenecen al género Aspergillus.

La invención trata de la transformación de mohos, especialmente de mohos que pertenecen al género Aspergillus.

Antecedentes de la invención y técnica anterior (1) Técnicas generales para la transformación de microorganismos

En la tecnología del ADN recombinante, las técnicas de transformación de bacterias y levaduras se encuentran bien desarrolladas, pero las frecuencias de transformación en mohos son relativamente bajas.

Por ejemplo, en la transformación genética de la bacteria Escherichia coli se han obtenido, de forma rutinaria, frecuencias de transformación de aproximadamente 5 x 10^{8} transformantes / \mug de ADN vector, empleando un procedimiento químico para la transformación. Se transformó aproximadamente el 3,5% de las células viables (Hanahan; J. Mol. Biol. 166 (1983) 557-580). Más recientemente, se han observado frecuencias incluso mayores, de 10^{9} a 10^{10} transformantes / \mug de ADN vector tras electroporación de alto voltaje (Dower y col.; Nucleic Acid Research 16 (1988) 6127-6145). Para otras bacterias se han descrito frecuencias de transformación más bajas (por ejemplo, Chassy and Flickinger; FEMS Microbiology Letters 44 (1987) 173-177; Miller y col.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 856-860). En levaduras, se han obtenido frecuencias de transformación de hasta 1 x 10^{7} transformantes por \mug de ADN vector (Meilhoc y col.; Bio/Technology 8 (1990) 223-227 y Gietz y col.; Yeast 11 (1995) 355-360).

En mohos, las frecuencias de transformación varían desde

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solamente 0,1-0,5 transformantes / \mug de ADN vector para Agaricus bisporus (Van Rhee y col.; Mol Gen Genet 250 (1996) 252-258), pasando por

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5 transformantes / \mug de ADN vector para Fusarium graminearum A3/5 (Royer y col.; Bio/Technology 13 (1995) 1479-1483),

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aproximadamente 12 transformantes / \mug de ADN vector para Aspergillus awamori (Ward y col.; Experimental Mycology 13 (1989) 289-293), y

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20-300 transformantes / \mug de ADN vector para Aspergillus nidulans (Yelton y col.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 1470-1474) hasta

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aproximadamente 10^{4} transformantes / \mug de ADN vector para Neurospora crassa (Volmer and Yanofsky; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 4869-4873).

Como revisiones acerca de la transformación de mohos se hace referencia a los artículos:

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"Transformation in Fungi" por John R.S. Fincham publicado en Microbiological Reviews (Mar. 1989) 148-170, que explica a grandes rasgos los procedimientos posibles para la transformación de hongos, es decir tanto levaduras como mohos.

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"Genetic engineering of filamentous fungi" por Timberlake, W.E. y Marshall, M.A. Science 244 (1989) 1313-1317.

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"Transformation" por David B. Finkelstein (Capítulo 6 del libro "Biotechnology of Filamentous Fungi, Technology and Products" (1992) 113-156, editado por Finkelstein y Ball).

Basándose en esta bibliografía es evidente que se han desarrollado varias técnicas de transformación para transformar en número creciente de hongos filamentosos. La mayoría de los protocolos de transformación hacen uso de protoplastos. Los protoplastos se pueden preparar a partir de cultivos de hifas o conidios germinantes empleando Novozyme 234^{R}, una preparación multi-enzimática derivada de Trichoderma reesei. La transformación de protoplastos con ADN se lleva a cabo por electroporación o mediante la combinación de CaCl_{2} y polietilenglicol (PEG). Algunos procedimientos alternativos evitan la necesidad de generar protoplastos, lo cual hace el procedimiento más rápido y más sencillo. Las células intactas se pueden transformar usando una combinación de acetato de litio y PEG, el bombardeo de partículas (Lorito y col.; Curr. Genet. 24 (1993) 349-356 and Hergoz y col.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 45 (1996) 333-337) o también por electroporación (Ozeki y col.; Biosci. Biotech. Biochem. 58 (1994) 2224-2227).

En vista de las frecuencias relativamente bajas de transformación de mohos con respecto a las frecuencias de transformación de bacterias y levaduras, existe una necesidad de frecuencias mayores de transformación en mohos.

(2) Transformación de plantas usando Agrobacterium

Otra técnica de transformación desarrollada para plantas se basa en el uso de Agrobacterium tumefaciens, que es una bacteria gram negativa del suelo que da lugar a tumores conocidos como "agalla de cuello" en las zonas heridas de plantas dicotiledóneas infectadas. Durante la inducción del tumor el Agrobacterium se une a las células vegetales y transfiere entonces una parte de su plásmido inductor de tumores (Ti), el ADN transferido o ADN-T, a la célula en la cual se integra en el genoma nuclear de la planta. El ADN-T está flanqueado por repeticiones directas imperfectas de 24 pares de bases. Estas repeticiones directas se conocen también como "repeticiones flanqueantes" o "flanqueantes" o "ADN-T flanqueante" o "secuencias flanqueantes" o combinaciones de los mismos. El ADN-T contiene un conjunto de genes. La expresión de un grupo de estos genes, los genes onc, lleva a la producción de fitohormonas las cuales inducen la proliferación de las células vegetales y la formación de un tumor. El proceso de transferencia depende de la inducción de un conjunto de genes de virulencia codificados por el plásmido Ti. El sistema de transferencia se activa cuando VirA reconoce los compuestos inductores procedentes de las plantas heridas, como la acetosiringona (AS). A través del activador transcripcional VirG, los loci vir restantes se activan y se produce un ADN monocatenario lineal, la cadena T, tras el corte de las repeticiones flanqueantes mediante una endonucleasa específica de sitio codificada por virD1/D2. La proteína virD2 permanece unida covalentemente al extremo 5'. La proteína de unión a ADN monocatenario VirE se une a la cadena T y el complejo resultante se transfiere a la célula vegetal. Aunque el mecanismo por el cual el complejo de ADN-T se transporta desde la bacteria hasta la célula vegetal no se conoce con exactitud, se cree que el complejo de ADN-T sale de la célula de Agrobacterium a través de una estructura transmembrana que consiste en proteínas codificadas por el operón virB. Como amplias revisiones acerca de la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens véanse Hooykaas and Schilperoort (Plant Molecular Biology 19 (1992) 15-38) y Hooykaas and Beijersbergen (Annu. Rev. Phytopathol. 32 (1994) 157-179). La capacidad de Agrobacterium tumefaciens para transferir su ADN-T a la célula vegetal, en la que se integra de forma estable en el genoma nuclear, ha llevado a un uso generalizado de este organismo para la transferencia de genes a plantas y células vegetales. Con objeto de permitir la regeneración de las plantas tras la transformación con Agrobacterium tumefaciens, los genes onc de la región T han sido delecionados, lo que da como resultado un ADN-T inactivado o no oncogénico. Se han desarrollado dos tipos de sistemas vector para la transformación de plantas. Primero un sistema binario, en el que se clonan nuevos genes entre el ADN-T flanqueante de un plásmido que contiene un ADN-T artificial. Posteriormente este plásmido se introduce en una cepa de Agrobacterium que contiene un plásmido Ti con una región vir intacta pero que carece de la región T (Hoekema y col.; Nature 303 (1983) 179-180 and Bevan; Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711-8721). Y segundo un sistema co-integrado, en el que los nuevos genes se introducen por recombinación homóloga en un ADN-T artificial ya presente en un plásmido Ti con una región vir intacta (Zambryski y col.; EMBO-J. 2 (1983) 2143-2150).

Se ha transformado una amplia variedad de plantas usando estos sistemas. Esto incluye muchas especies dicotiledóneas importantes en la agricultura como la patata, el tomate, la soja, el girasol, la remolacha azucarera y el algodón (para una revisión véase Gasser and Fraley; Science 244 (1989) 1293-1299). Aunque durante mucho tiempo pareció imposible la transformación de plantas monocotiledóneas mediante Agrobacterium, hoy día se han transformado varias especies, como el maíz (Ishida y col.; Nature-Biotechnology 14 (1996) 745-750) y el arroz (Aldemita and Hodges; Planta 199 (1996) 612-617), empleando Agrobacterium. Una de las razones por las cuales el procedimiento han encontrado un uso extenso en la transformación de plantas es su alta frecuencia de transformación. Por ejemplo, en experimentos de co-cultivo con protoplastos de tabaco se transformó aproximadamente el 25% de los microcalli, que fueron regenerados a partir de protoplastos tras su co-cultivo con Agrobacterium (20% de media) (Depicker y col.; Mol. Gen. Genet. 201 (1985) 477-484 y Van den Elzen y col.; Plant Molecular Biology 5 (1985) 149-154). Esto significa que se transformaron hasta, aproximadamente, un 5% de las células. Además, el procedimiento es mucho más fácil comparado con otros procedimientos de transformación de plantas usando ADN desnudo. Se puede aplicar a tejidos vegetales intactos como segmentos de hojas, el tallo, la raíz o los tubérculos así como a protoplastos. Además, el procedimiento tiene la ventaja de que solamente el ADN-T que comprende el ADN extraño que se va a introducir se integra en el genoma de la planta. Las secuencias del ADN vector que se requieren para la replicación y la selección del vector en la bacteria no se transportan de la bacteria a la célula vegetal. De este modo es un procedimiento de transformación relativamente limpio.

Otra especie de Agrobacterium, Agrobacterium rhizogenes, posee un sistema natural de transferencia de genes similar.

(3) Transformación de microorganismos usando Agrobacterium

Además de la muchas publicaciones acerca de la transformación de plantas empleando Agrobacterium tumefaciens, se han publicado recientemente los resultados de algunas investigaciones sobre el uso de Agrobacterium tumefaciens para transformar microorganismos. Beijersbergen y col. (Science 256 (1992) 1324-1327) demostraron que el sistema de virulencia de A. tumefaciens puede mediar la transferencia conjugativa entre agrobacterias, que se refiere solamente a la transformación de cepas diferentes de la misma especie.

Bundock y col. (EMBO-J. 14 (1995) 3206-3214) informaron de una exitosa transformación de levaduras mediante esta bacteria del suelo. Este resultado fue posteriormente confirmado por Piers y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996) 1613-1618). Ambos grupos emplearon secuencias de ADN de S. cerevisiae como levadura de origen 2\mu (Bundock y col.; EMBO-J. 14 (1995) 3206-3214) o secuencias teloméricas de levadura y el origen de replicación ARS1 (Piers y col.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996) 1613-1618) con objeto de estabilizar el ADN-T en las levaduras. Muy recientemente, Risseeuw y col. (Mol. Cell. Biol. 16 (1996) 5924-5932) y Bundock and Hooykaas (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996) 15272-15275) informaron de resultados acerca del mecanismo de integración del ADN-T en S. cerevisiae.

Los datos disponibles gracias a estas publicaciones demuestran que la transformación de microorganismos mediante Agrobacterium tumefaciens es mucho menos eficaz que la de plantas. Tal como se ha mencionado más arriba, en plantas se ha transformado hasta aproximadamente el 5% de las células, mientras que en levaduras se han observado proporciones mucho menores de células transformadas / células receptoras, concretamente 3 x 10^{-3} (Piers y col.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996) 1613-1618) y 3,3 x 10^{-6} (Bundock y col.; EMBO-J. 14 (1995) 3206-3214).

Además, la transformación de microorganismos mediante A. tumefaciens demostró ser menos eficaz que las técnicas tradicionales de transformación de microorganismos. Generalmente la frecuencia de transformación para la transferencia de ADN desnudo se representa como el número de transformantes por \mug de ADN vector, mientras que la frecuencia de transformación para la transformación por A. tumefaciens se expresa con frecuencia como el número de células transformadas que se pueden obtener en relación con el número de células receptoras. En una publicación anterior sobre la transformación convencional de levaduras (Gietz y col.; Yeast 11 (1995) 355-360) se dan tanto las cifras de transformantes / \mug de ADN vector como las cifras de células transformadas por célula receptora, lo que da una relación entre los dos procedimientos de cálculo de la frecuencia de transformación. Gietz y col. determinaron que con su procedimiento de AcLi/ADN-SS/PEG se podía transformar un máximo de aproximadamente el 4% de las células de levadura en la reacción, es decir una frecuencia de transformación de hasta 4 x 10^{-2}. A partir de la Figura 1A de esta publicación y la descripción correspondiente se puede calcular que este 4% se corresponde con 8 x 10^{5} transformantes / \mug de ADN vector. Para la transformación de levaduras mediante A. tumefaciens las frecuencias de transformación máximas observadas son de 3 x 10^{-3} (Piers y col.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996) 1613-1618) y 3,3 x 10^{-6} (Bundock y col.; EMBO-J. 14 (1995) 3206-3214), lo que supone un factor de aproximadamente 10 ó 10,000 menor, respectivamente, que la frecuencia de transformación máxima (4%) de levaduras con ADN desnudo observado por Gietz y col. De este modo y basados en esta evidencia, A. tumefaciens no parece ser una prometedora herramienta adicional para la transformación de microorganismos, porque las frecuencias de transformación obtenidas con A. tumefaciens son mucho menores que las que se obtienen con los procedimientos convencionales de transformación de levaduras.

Resumen de la invención

La invención se basa en la idea de usar Agrobacterium para transformar mohos. A pesar de las bajas frecuencias de transformación obtenidas con una sola especie de levaduras que se acaban de mencionar, concretamente Saccharomyces cerevisiae, los inventores decidieron investigar la transformación del moho Aspergillus awamori mediada por Agrobacterium tumefaciens. El Aspergillus awamori es un importante moho para la producción de enzimas, proteínas y metabolitos, pero tiene la desventaja de que las técnicas convencionales de transformación de mohos son relativamente ineficaces tal como se ha demostrado con las cifras dadas más arriba (véase Ward y col.).

Se observó, de forma sorprendente, que la técnica de transformación de plantas con Agrobacterium tumefaciens se podía aplicar con éxito al moho Aspergillus awamori. Tras algunos experimentos se obtuvo una frecuencia de transformación de más de 7000 transformantes por 10^{7} células receptoras, lo que supone aproximadamente 400 veces la frecuencia de transformación obtenida mediante una transformación convencional (véase el Ejemplo 1 más abajo).

Posteriormente, esta técnica también se aplicó con éxito a una amplia variedad de mohos, que incluye Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Fusarium solani pisi (CBS 230.43), Fusarium graminearum (ATCC 20334), Trichoderma reesei (CBS 383.78) Colletotrichum gloeosporioides (CBS 862.70), Neurospora crassa (CBS 195.57), Pleurotus ostreatus (cepa Somycel 3015; adquirida en "Proefstation voor de Champignoncultuur"). Estos mohos pertenecen a distintos antecesores taxonómicos tal como se muestra en la Tabla 1 más abajo. La Tabla 2 más abajo da el número aproximado de géneros y especies dentro de cada división de Eumycota. La subdivisión Mastigomycotina comprende los Chytridiomycetes y los Oomicetes. Tal como se describe en el Ejemplo 11, la transformación directa de la cepa Horst U1 de Agaricus bisporus no se ha llevado a cabo con anterioridad. De este modo la invención proporciona por primera vez una transformación directa de esta importante cepa Horst U1a nivel comercial.

De este modo, en un sentido amplio la invención trata de la transformación de mohos, también conocidos como hongos filamentosos. Los Ejemplos que se dan más abajo representan las tres subdivisiones principales de Eumycota que forman, en conjunto, aproximadamente el 95% de las especies de mohos (véase la Tabla 2).

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TABLA 2 Número aproximado de géneros y especies en cada división de Eumycota (tal como lo publicaron O'Donnell y Peterson en el Capítulo 2 del libro "Biotechnology of Filamentous Fungi, Technology and Products" (1992) 7-33, editado por Finkelstein y Ball).

División	Número y porcentaje de géneros	Número y porcentaje de especies
Mastigomycotina	190	(3,2)	1170	(1,8)
Zygomycotina	145	(2,5)	765	(1,2)
Ascomycotina	2720	(46,6)	28650	(45,0)
Basidiomycotina	1104	(18,9)	16000	(25,2)
Deuteromycotina	1680	(28,8)	17000	(26,8)

Para Colletotrichum gloeosporioides el procedimiento de la invención es aproximadamente 5 a 10 veces mejor que la frecuencia publicada para la transferencia de ADN desnudo (véase el Ejemplo 5). Varios otros mohos ensayados, como Fusarium graminearum (véase el Ejemplo 7), Neurospora crassa (véase el Ejemplo 8), Trichoderma reesei (véase el Ejemplo 9), y Pleurotus ostreatus (véase el Ejemplo 10), dieron frecuencias de transformación tras la transformación mediante Agrobacterium similares a los procedimientos de transferencia de ADN desnudo óptimos. Los mohos Aspergillus nidulans, Aspergillus niger y Fusarium solani dieron frecuencias de transformación tras la transformación mediante Agrobacterium más bajas que las frecuencias de la transferencia de ADN desnudo. En el caso de las especies de Aspergillus esto se debe presumiblemente a problemas con la selección de los transformantes (véanse los Ejemplo 3 y 4). Debemos apuntar que la transformación de los otros mohos no se ha optimizado. Basándose en la experiencia con la transformación de plantas mediante Agrobacterium, es probable que las frecuencias de transformación se puedan incrementar más aún.

Muchos de estos mohos son importantes en la industria, la agricultura y la investigación básica en biología.

Por ejemplo Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Trichoderma reesei y Fusarium graminearum han demostrado ser huéspedes atractivos para la producción a gran escala de proteínas homólogas y heterólogas (Van den Hondel y col.; "Heterologous gene expression in filamentous fungi" (Capítulo 18) en el libro "More Gene Manipulations in Fungi" (1991) 397-428, editado por Bennett y Lasure; Verdoes y col.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 43 (1995) 195-205; Royer y col.; Bio/Technology 13 (1995) 1479-1483). Tienen la capacidad de secretar al medio cantidades sustanciales de proteína, la fermentación a gran escala se encuentra generalmente bien establecida y poseen un estatus GRAS ("Generally Recognized As Safe"), lo que hace posible el uso de estas especies en la industria de la alimentación o del procesamiento de alimentos.

Además, el moho Fusarium graminearum A 3/5, el hongo de la micoproteína Quorn^{R}, también se ha empleado como una fuente comercial de alimentación humana en el Reino Unido durante más de 10 años (Royer y col.; Bio/Technology 13 (1995) 1479-1483).

Los mohos Fusarium solani y Colletotrichum gloeosporioides son patógenos micóticos (Marek y col.; Curr Genet 15 (1989) 421-428; Hwang y col; The Plant Cell 7 (1995) 183-193).

Tanto Aspergillus nidulans como Neurospora crassa han sido importantes organismos para la investigación básica en mecanismos genéticos, ruta bioquímicas y fisiología celular (Vollmer y Yanofsky, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 4869-4873; El libro "Aspergillus: 50 year on" (1994) editado por Martinelli y Kinghorn).

Los hongos Pleurotus ostreatus y Agaricus bisporus son comestibles e importantes en el mercado. En los Ejemplos 10 y 11 se describen transformaciones exitosas empleando un procedimiento de acuerdo con la invención.

Se ha visto además que no sólo se puede introducir un gen de expresión en estos mohos, sino incluso múltiples copias de este gen, que, además, pueden tener como objetivo, por ejemplo, el locus cromosómico pyrG. Estas múltiples copias pueden pertenecer a un gen que codifica una proteína deseada, homóloga o heteróloga. Esta forma de realización de la invención se ilustra en el Ejemplo 12.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la construcción del plásmido pUR5750.

Explicación de las abreviaturas empleadas en el esquema de la construcción:

RB = ADN-T flanqueante derecho,

Pnos = Secuencias promotoras del gen de la nopalina sintetasa,

nptII = región codificante del gen de la neomicina fosfotransferasa II de Tn5,

Tocs = Secuencias de terminación del gen de la octopina sintetasa,

TtrpC = Secuencias de terminación del gen trpC de A. nidulans,

hph = región codificante del gen de la higromicina transferasa de E. coli,

Pgpd = Secuencias promotoras del gen gpd de A. nidulans,

LB = ADN-T flanqueante izquierdo.

La Figura 2 muestra la construcción del plásmido pUR5751.

Explicación de las abreviaturas empleadas en el esquema de la construcción:

AMA1 = replicador del plásmido AMA1 de Aspergillus nidulans.

La Figura 3 muestra la autoradiografía de la transferencia Southern de ocho transformantes independientes de Aspergillus awamori (nº 1 - 8). El ADN genómico se digirió con BglII o HindIII (panel 1) o no se digirió (panel 2). M representa los marcadores de ADN de 1 kb (BRL), la banda de hibridación representa el fragmento de 1,6 kb. N (en el panel superior) es una muestra de tejido de mohos no transformados como control negativo.

La Figura 4 muestra la autoradiografía de la transferencia Southern de nueve transformantes independientes de mohos. El número 1 y 2 son transformantes de Aspergillus niger, el número 5 y 6 son transformantes de Trichoderma reesei, el número 7 y el 8 son transformantes de Fusarium graminearum, el número 9 y el 10 son transformantes de Neurospora crassa y el número 11 es un transformante de Colletotrichum gloeosporioides. Los carriles 3, 4 y 12 no contienen ADN. El ADN genómico se digirió con HindIII (panel superior) o BglII (panel inferior). P (en el panel superior) representa el control positivo, que es ADN sin digerir del transformante de Aspergillus awamori 7 (véase la figura 3). N (en el panel inferior) son muestras de mohos no transformados como control negativo. M representa los marcadores de 1 kb (BRL), las bandas de hibridación representan los fragmentos de 0,5 y 1,6 kb.

La Figura 5 muestra la autoradiografía de la transferencia Southern de cuatro transformantes independientes de Agaricus bisporus (nº 1 - 4). El ADN genómico se digirió con BglII (véase 1B - 4B) o no se digirió (véase 1U - 4U). M representa los marcadores de 1 kb (BRL).

La Figura 6 muestra el diseño experimental del procedimiento para la integración dirigida de múltiples copias de un gen en el moho A. awamori.

A. El gen pyrG salvaje está representado en la parte superior de la figura. La región codificante del gen está indicada por la caja sombreada en gris claro.

B. Debajo, se muestra el locus diana que contiene el extremo 5' afuncional restante del gen pyrG y las secuencias flanqueantes 3' del locus pyrG cromosómico en la cepa AWCSCE de A. awamori. La cepa se generó a partir de un A. awamori salvaje delecionando parte del extremo 3' del gen pyrG. Esta cepa también se empleó en otro trabajo de transformación en el que un sitio I-SceI situado corriente abajo del extremo 5' restante del gen pyrG se usó con otros propósitos. "SalI - I-SceI - HindIII" hace referencia a un ADN espaciador sintético que contiene la secuencia de reconocimiento de 18 pb para la endonucleasa I-SceI (5' -TAGGGATAACAGGGTAAT- 3' = SEQ. ID. NO. 1) flanqueado por sitios SalI y HindIII; I-SceI es una endonucleasa de restricción de corte infrecuente de Saccharomyces cerevisiae.

C. El fragmento que se introduce en la cepa AWCSCE contiene un extremo 3' afuncional del gen pyrG que es parcialmente homólogo al extremo 5' restante del gen pyrG del locus cromosómico diana, una o múltiples copias del gen (indicadas por las cajas 1, 2 y n sombreadas en gris oscuro) que comprenden un gen(es) estructural(es) que codifica(n) una(s) proteína(s) deseada(s) y una secuencia adicional del locus pyrG que es homóloga a secuencias presentes inmediatamente corriente abajo del sitio I-SceI en el locus diana. Este fragmento está presente en un vector de Agrobacterium tumefaciens entre el ADN-T flanqueante presente en ese vector, y dicho vector se introduce en una cepa de Agrobacterium tumefaciens que contiene una región vir en su ADN.

D. Tras recombinación homóloga el gen pyrG intacto se restaura y las múltiples copias del gen se integran de forma simultánea en el locus pyrG, lo cual se ilustra en la parte inferior de la figura.

La Figura 7 muestra la construcción del plásmido pUR5710, pUR5711 y pUR5712. Explicación de las abreviaturas empleadas en el esquema de la construcción;

amp = gen de resistencia a la ampicilina.

pyrG = gen pyrG de A. awamori, "pyrG o pyrG" indica que el gen está truncado en el extremo 5' o 3', respectivamente.

La Figura 8 muestra la construcción de los plásmidos pUR5713 (Figura 8A) y pUR5714 (Figura 8B). Explicación de las abreviaturas empleadas en el esquema de la construcción:

pBS-SK = pBluescript^{R}-SK

La Figura 9 muestra la construcción de los plásmidos pUR5716 y pUR5718. Explicación de las abreviaturas empleadas en el esquema de la construcción:

cos = sitio cos

La Figura 10 muestra la construcción del plásmido pUR5729. Explicación de las abreviaturas empleadas en el esquema de la construcción:

Pex1A = Secuencias promotoras del gen de la 1,4-\beta-endoxilanasa de A. awamori,

cut = región codificante del gen de la cutinasa de F. solani pisi (copia sintética del ADNc),

Tex1A = Secuencias de terminación del gen de la 1,4-\beta-endoxilanasa de A. awamori,

La Figura 11 muestra la construcción del cósmido pUR5725.

La Figura 12 muestra la construcción del plásmido pUR5756.

Para las Figuras 10-12 "cut" o "cu" se empleó para indicar el cassette de expresión de la cutinasa.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un procedimiento para producir un moho transformado, caracterizado porque

(1) un fragmento de ADN que contiene al menos un gen de expresión que se va a introducir en un moho se clona primero en un vector de Agrobacterium tumefaciens entre el ADN-T flanqueante presente en ese vector:

(2) el vector que contiene el fragmento de ADN entre el ADN-T flanqueante se introduce en una cepa de Agrobacterium tumefaciens que contiene una región vir en su ADN;

(3) liberación del ADN-T que contiene dicho fragmento de ADN de dicho Agrobacterium tumefaciens añadiendo un compuesto inductor de vir, y la cepa de Agrobacterium tumefaciens se incuba con el moho que se va a transformar; y

(4) el moho transformado se selecciona de entre los mohos no transformados dependiendo de las características del ADN introducido o de su producto de expresión, y eventualmente el moho transformado se cultiva.

La selección del moho transformado se puede llevar a cabo empleando un marcador de selección. Por ejemplo, dicho marcador de selección puede ser una característica de la cepa del moho salvaje, existente en la naturaleza, mientras que la cepa del moho que se transforma es una cepa mutante para la misma, y carece de dicho marcador de selección, por ejemplo el gen de la orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (gen pyrG) que se encuentra presente en el Aspergillus awamori salvaje. Los marcadores de selección adecuados incluyen los genes de resistencia a antibióticos, genes para la utilización de metabolitos que no se utilizan normalmente en esa cepa de moho, y genes que producen un producto fácilmente detectable.

A veces el ADN introducido en el moho se puede emplear como marcador de selección. Por ejemplo, cuando se expresa el ADN introducido, puede dar como resultado un producto que no se produce en moho no transformados, que puede ser más o menos fácil de detectar. O bien la presencia o ausencia de ADN se puede determinar aplicando técnicas de PCR.

Preferiblemente, el moho pertenece a la división micótica Eumycota, más preferiblemente a una de las subdivisiones micóticas

- Ascomycotina, incluyendo las especies Aspergillus nidulans y Neurospora crassa,

- Basidiomycotina, incluyendo las especies Bjerkandera, Coprinus, Coriolus, y las especies Agaricus bisporus, Flammulina velutipes (Enokitake), Lentinus edodes (Shiitake), Phanerochaete chrysosporium, Schizophyllum commune, Tricholoma matsutake, y Pleurotus ostreatus,

- Deuteromycotina, incluyendo las especies Beauveria y Metarhizium (adecuados como agentes para el control biológico frente a insectos), las especies Acremonium y Penicillium (adecuados para la producción de antibióticos) y las especies Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Fusarium solani, Fusarium graminearum, Trichoderma reesei, y Colletotrichum gloeosporioides,

- Mastigomycotina que comprende los Oomicetes que incluyen las especies Achlya (adecuado para la producción de proteínas farmacéuticamente activas), Phytophtora, Pythium, y Plasmopara, y los Chytridiomycetes que incluyen las especies Rhizophydium y Rhizophlyctis, y

- Zygomicotina que incluye las especies Mucor y Rhizopus.

En una forma de realización preferida de la invención se proporciona un proceso, en el que el fragmento de ADN contiene múltiples copias del gen deseado. De forma alternativa el fragmento de ADN puede contener al menos una copia de varios genes, o puede contener una copia o más de un gen fusionado.

De acuerdo con otra forma de realización preferida de la invención el fragmento de ADN se integra en un locus determinado del genoma del moho. Un ejemplo de dicho locus determinado es el locus pyrG del genoma del moho (que es conocido como locus pyrA en A. niger y locus pyr4 en Neurospora crassa). Esto posibilita la producción de un moho transformado que no contenga ninguna secuencia de ADN bacteriano indeseada incluyendo ADN-T flanqueante.

De este modo la invención proporciona un moho transformado que se puede obtener gracias a la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con la invención que no comprende ninguna secuencia de ADN bacteriano no deseada incluido ADN-T flanqueante. Este moho transformado se puede usar en un procedimiento para cultivar un moho transformado con objeto de producir una proteína deseada.

De acuerdo con otra forma de realización de la invención, se proporciona un procedimiento, en el que el fragmento de ADN se integra aleatoriamente en el genoma del moho, así como un moho transformado que se puede obtener mediante la transformación mediada por Agrobacterium, que comprende una o más partes de secuencias de ADN-T flanqueante, y un procedimiento para cultivar dicho moho transformado con objeto de producir una proteína deseada.

Se prefiere el uso de cepas de A. tumefaciens altamente virulentas, porque presentan una frecuencia de transformación relativamente alta. Dichas cepas, el uso de las mismas y los vectores para generar dichas cepas están descritos en la bibliografía; véanse Jin y col. (J. Bacteriology 169 (1987) 4417-4425 & Molecular Biology 7 (1993) 555-562), Raineri y col. (BIO/TECHNOLOGY 8 (January 1990) 33-38) e Ishida y col. (Nature Biotechnology 14 (1996) 745-750) para la transformación de plantas, y Piers y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996) 1613-1618) para la transformación de levaduras.

La transformación se puede llevar a cabo mediante un sistema binario o por co-integración de una forma similar a la que se conoce para la transformación de plantas tal como se ha descrito más arriba en la sección sobre (2) Transformación de plantas empleando Agrobacterium.

Se puede emplear cualquier tipo de tejido de los mohos incluyendo protoplastos, conidiosporas, esporas germinantes, micelios, y sedimentos, de los cuales los protoplastos, los conidios y el material de cultivo seco congelado rehidratado se ilustran más abajo.

Las ventajas de la transformación de mohos mediada por Agrobacterium incluyen

-

que es un procedimiento "de grado alimenticio" que da como resultado una cepa de moho sin residuos de genes bacterianos de resistencia a antibióticos u otras secuencias bacterianas como orígenes de replicación,

-

que se pueden introducir secciones mayores de ADN. Al contrario que en el antiguo procedimiento de transformación de mohos con ADN desnudo mediante el cual se pueden introducir hasta aproximadamente 40 kb de ADN, en la transformación de plantas mediada por Agrobacterium se introdujeron al menos 150 kb de ADN extraño en el genoma de la planta (Hamilton y col.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 9975-9979).

Ejemplos

La invención se ilustra con la ayuda de los siguientes Ejemplos 1 - 12 precedidos de una descripción de los Materiales y Procedimientos empleados. Estos Ejemplos muestran la transformación tanto de protoplastos (Ej. 1) como de conidios (Ej. 2) de A. awamori, conidios de A. nidulans (Ej. 3), conidios de A. niger (Ej. 4), Colletotrichum gloeosporioides (Ej. 5), conidios de Fusarium solani pisi (Ej. 6), tanto conidios como material seco congelado rehidratado de la ATCC de Fusarium graminearum (Ej. 7), conidios de Neurospora crassa (Ej. 8), conidios de Trichoderma reesei (Ej. 9), conidios de Pleurotus ostreatus (Ej. 10) y conidios de Agaricus biosporus (Ej. 11). Además, el Ejemplo 12 muestra la transformación de A. awamori introduciendo en el locus pyrG múltiples copias de un cassette de expresión de cutinasa.

Materiales y procedimientos Cepas bacterianas y de mohos

Para la clonación bacteriana se empleó la cepa DH5\alpha de Escherichia coli (genotipo: F^{-}, endA1, hsdR17 (r_{k}^{-} m_{k}^{+}), supE44, thi-1, lambda^{-}, recA1, gyrA96, relA1, \Delta(argF-lacIZYA)U169, deoR (phi80d-(lacz) \DeltaM15); Hanahan; J. Mol. Biol. 166 (1983) 557-580). Se empleó la cepa LBA1100 de Agrobacterium tumefaciens para la transformación de los mohos (Beijersbergen y col., 1992, Science, 256, p. 1324-1327). Se usaron las cepas de mohos Aspergillus awamori nº40 (derivado de A. awamori CBS 115.52 también mencionada en el documento WO 93/12237, página 9 línea 13), Aspegillus niger (cepa N402, un mutante en cspA1 (conidióforos cortos) de Aspergillus niger var. niger ATCC9029, CBS 120.49 descrita en el documento WO 91/19782 de UNILEVER), Aspergillus nidulans (Lab collection URL-VL), Fusarium solani pisi (CBS 230.34), Fusarium graminearum (ATCC 20334), Trichoderma reesei (CBS 383.78), Colletotrichum gloeosporioides (CBS 862.70), Neurospora crassa (CBS 195.57), y Pleurotus ostreatus cepa Somycel 3015 y Agaricus bisporus cepa Horst U1 (ambos adquiridos en "Proefstation voor de Champignoncultuur", P.O. Box 6042, 5960 AA Horst, Holanda), como receptores de las transformaciones con Agrobacterium tumefaciens.

La preparación de A. awamori nº40 (también conocido como A. niger var. awamori nº40) se describió en el documento WO 91/19782 en la página 13, líneas 29-39, que decían lo siguiente:

"El nivel de producción de transformantes de A. niger var. awamori se puede, sin embargo, incrementar aún más usando cepas mutantes adecuadas de A. niger var. awamori, como A. niger var. awamori nº40, que produce claramente más xilanasa que la cepa salvaje".

"El mutante A. niger var. awamori nº40 se ha obtenido por mutagénesis de las esporas de A. niger var. awamori y la selección para la producción de xilanasa. En medio nuevo el transformante ``xylA'' A. niger var. awamori nº40 produjo 190 000 U de xilanasa, lo que supone un incremento considerable con respecto al transformante de A. niger var. awamori que más produce."

En esta memoria descriptiva se emplearon los siguientes sitios para endonucleasas de restricción:

Dando extremos cohesivos		Dando extremos romos
AflII	15	C\downarrowTTAAG	25	SmaI	CCC\downarrowGGG
BamHI		G\downarrowGATCC
BglII		A\downarrowGATCT
EcoRI		G\downarrowAATTC
HindIII		A\downarrowAGCTT
KpnI	20	GGTAC\downarrowC
NotI		GC\downarrowGGCCG
PstI		CTGCA\downarrowG
SacI		GAGCT\downarrowC
SalI		G\downarrowTCGAC

Y los 18 pb para la endonucleasa de restricción de corte infrecuente de Saccharomyces cerevisiae I-SceI:

5' -TAGGGATAACAGGGTAAT- 3' = SEQ. ID. NO. 1

Construcción del plásmido

El plásmido pUR5750 (véase la Figura 1) se construyó clonando un fragmento BglII/HindIII de 4 kb, que está presente en el vector pAN7.1 (Punt y col.; Gene 56 (1987) 117-124) y contiene el promotor del gen gpd de A. nidulans fusionado a la región codificante del gen hph de E. coli seguido de secuencias de terminación del gen trpC de A. nidulans, en los sitios BamHI / HindIII del vector binario pBIN19 (Bevan, M.; Nucleic Acids Res. 22 (1984) 8711-8721).

El plásmido pUR5751 (véase la Figura 2) se construyó clonando el replicador del plásmido AMA1 de Aspergillus nidulans (Aleksenko and Clutterbuck; Molecular Microbiology 19 (1996) 565-574) como un fragmento HindIII de 5,3 kb procedente del plásmido pUR7984 en el sitio HindIII de pUR5750. pUR7984 se obtuvo clonando el fragmento HindIII AMA1 de 5,3 kb procedente de pHELP1 (proporcionado por Clutterbuck) en el sitio HindIII de pAN7.1. El fragmento HindIII AMA1 de 5,3 kb es el fragmento entre el sitio HindIII de la posición 367 y el sitio HindIII de la posición 5620 de la secuencia depositada en la EMBL/GenBank/DDBJ Nucleotide Sequence Data Library bajo el número de registro X78051.

La cepa LBA1100 de Agrobacterium, descrita en primer lugar por Beijersbergen y col. (Science 256 (1992) 1324-1327) y a la que se hace referencia en varias publicaciones posteriores, se electroporó con las construcciones pUR5750 y pUR5751 de acuerdo con Mozo y Hooykaas (Plant Mol. Biol. 16 (1991) 917-918).

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Esta cepa LBA1100 de Agrobacterium fue depositada el 27 de marzo de 1997 bajo el Tratado de Budapest en el Centraalbureau voor Schimmelcultures en Baarn, Holanda (nº. CBS 634.97).

Experimentos de transformación

La cepa de Agrobacterium que contenía el vector binario pUR5750 se creció a 29ºC durante toda la noche en placas de LB con los antibióticos adecuados en las siguientes concentraciones: kanamicina, 100 \mug/ml; espectinomicina, 250 \mug/ml; rifampicina, 20 \mug/ml. Una única colonia se sembró por estrías en una placa de medio mínimo. El medio mínimo (MM) contiene por litro: 10 ml de tampón K pH 7,0 (K_{2}HPO_{4} 200 g/l, KH_{2}PO_{4} 145 g/l), 20 ml de M-N (MgSO_{4}.7H_{2}O 30 g/l, NaCl 15 g/l), 1 ml de CaCl_{2}.2H_{2}O al 1% (p/v), 10 ml de glucosa al 20% (p/v), 10 ml de FeSO_{4} al 0,01% (p/v), 5 ml de elementos de esporas (ZnSO_{4}.7H_{2}O 100 mg/l, CuSO_{4}.5H_{2}O 100 mg/l, H_{3}BO_{3} 100 mg/l, MnSO_{4}.H_{2}O 100 mg/l, NaMoO_{4}.2H_{2}O 100 mg/l) y 20 ml de NH_{4}NO_{3} al 20% (p/v) (Hooykaas y col.; J. Gen. Microbiol. 110 (1979) 99-109) bacto-agar a 15 g/l y los antibióticos adecuados. Las placas se incubaron a 29ºC de 1 a 2 días. Se inocularon varias colonias en medio mínimo que contenía los antibióticos adecuados y se crecieron a 29ºC durante toda la noche. Tras la dilución de las células de Agrobacterium hasta una OD_{\text{660 nm}} de aproximadamente 0,15 en medio de inducción, el cultivo se creció durante 6 horas a 29ºC. El medio de inducción (IM) difiere del medio mínimo en que se sustituyeron los 10 ml de glucosa al 20% (p/v) por glucosa 10mM y se añadió MES 40 mM (ex Sigma) (pH 5,3), glicerol al 0,5% (p/v) y acetosiringona (AS) 200 \muM. Con objeto de confirmar que la transformación de los mohos mediante Agrobacterium es dependiente de la transferencia de ADN-T, se incluyó un control negativo en el cual se había omitido el inductor de vir AS. Los conidios se obtuvieron creciendo las cepas de moho a temperatura ambiente sobre un filtro de nitrocelulosa (Hybond-N, Amersham) situado sobre una placa de PDA (Agar Patata Dextrosa) durante varios días y lavando posteriormente los filtros con una solución salina fisiológica. Los protoplastos de A. awamori se prepararon tal como describieron Punt y Van den Hondel (Methods in Enzymology 216 (1993) 447-457). Para la transformación de protoplastos, se mezcló una alícuota de 100 \mul que contenía de 10^{6} a 10^{7} protoplastos con 100 \mul del cultivo de Agrobacterium. Para la transformación de los conidios, éstos se diluyeron en una solución salina fisiológica a una concentración de 10^{6}, 10^{7} ó 10^{8} conidios/ml y se mezclaron 100 \mul con 100 \mul del cultivo de Agrobacterium. Posteriormente, las mezclas se plaquearon sobre filtros de nitrocelulosa situados sobre placas de IM (medio IM con 15 g/l de bacto-agar) con glucosa 5 mM y se incubaron a temperatura ambiente o a 29ºC durante 2, 3, 5 ó 6 días (tal como se indica en los ejemplos). Las muestras que actuaban como control negativo se incubaron en placas de IM en las cuales se había omitido el inductor de vir AS. A continuación, los filtros se ttransfirieron placas de medio mínimo para Aspergillus (Bennett and Lasure, Growth media In: Bennett and Lasure (eds) More gene manipulations in fungi, Academic Press, San Diego (1991) 441-458) o placas de PDA con cefotaxima 200 \muM para matar las células de Agrobacterium e higromicina (para las concentraciones véanse los Ejemplos) para seleccionar los transformantes.

Aislamiento de ADN e transferencia Southern

La transferencia Southern se llevó a cabo para confirmar a nivel molecular que la célula de moho se había transformado y que el ADN deseado se había integrado en el genoma.

Para obtener material de micelios para el aislamiento de ADN genómico, se inocularon aproximadamente 10^{8} conidios del moho en 50 ml de medio mínimo para Aspergillus suplementado con 0,5% de extracto de levadura y se incubaron durante un periodo entre 22 horas y 3 días a 30ºC en un agitador a 200 rpm. Los micelios se recogieron con la ayuda de Miracloth^{R} (Calbiochem) y se congelaron en N_{2} líquido. Las muestras congeladas se pulverizaron hasta dar un polvo fino empleando un Mikro-Dismembrator^{R} (ex Braun Biotech International) durante 1 minuto a 1750 rpm. El ADN genómico del moho se aisló empleando Qiagen genomic tips (número de catálogo 10223) y siguiendo un protocolo para la purificación de ADN genómico para hongos filamentosos proporcionado por el fabricante. Se omitió la etapa de digestión del material de la pared celular. Se digirieron aproximadamente 2,5 \mug de ADN con BglII o HindIII (4 unidades/\mug) durante 16 horas y se separaron en un gel de agarosa al 0'8% en TBE. El ADN se transfirió a una membrana Hybond N por transferencia capilar (toda la noche) y la membrana se (pre-)hibridó de acuerdo con el protocolo de Hybond.

Para la transferencia Southern presentada en la Figura 3 se usó como sonda el fragmento BglII/HindIII de 4 Kb procedente de pAN7.1 descrito más arriba. Para las transferencias Southern presentadas en las Figuras 4 y 5 se usó como sonda el fragmento BamHI/EcoRI de 0,8 kb, que contiene parte del gen hph de E. coli. Se obtuvo una sonda marcada con dCTP- \alphaP^{32} usando el RTS probe DNA Labelling System de Gibco BRL (número de catálogo 10387-017). Las autoradiografías electrónicas se obtuvieron usando un Instant Imager (Packard).

Ejemplo 1 Transformación de protoplastos de A. awamori

Para el aislamiento de protoplastos, se inocularon 10^{6} conidios/ml de A. awamori en un frasco con 200 ml de medio MM con 0,5% de extracto de levadura y se incubaron durante 18 horas a 30ºC en un agitador a 200 rpm. Los micelios se recogieron con la ayuda de Mirocloth^{R} estéril y se lavaron con MgSO_{4} 0,6 M frío. Los micelios se resuspendieron en medio OM (por litro: 500 ml de MgSO_{4} 2,4 M, 480 ml de H_{2}O, 16,8 ml de Na_{2}HPO_{4} 0,5 M, 3,2 ml de NaH_{2}PO_{4}, pH 5,8-5,9) a una concentración de 5 ml/g de micelios. Posteriormente, se añadieron 5 mg de Novozym 234^{R} y 6 mg de BSA por g de micelios. Se permitió la formación de protoplastos durante 1-2 horas a 30ºC en un agitador a 80-100 rpm. La formación de protoplastos se comprobó usando un microscopio de luz. Los protoplastos se filtraron con la ayuda de Miracloth^{R} estéril y la mezcla se dividió en alícuotas de 30 ml en tubos falcon. Se añadió STC (Sorbitol 1,2 M, Tris/HCl 10 mM pH 7,5, CaCl_{2}.2H_{2}O 50 mM) para llevar el volumen hasta 50 ml y los protoplastos se recogieron por centrifugación a 2000 rpm durante 10 min a 4ºC. Los protoplastos se lavaron de nuevo en 50 ml de STC y se resuspendieron en STC a una concentración de aproximadamente 10^{8} protoplastos/ml. Con objeto de comparar la frecuencia de transformación usando A. tumefaciens o una transformación con PEG, se llevaron a cabo también transformaciones con PEG. Se añadieron cinco \mug de pAN7.1 a una alícuota de 100 \mul de protoplastos (10^{7}), se mezclaron y se incubó durante 25 minutos en hielo. El PEG se añadió en dos alícuotas de 200 \mul y una alícuota de 850 \mul, y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Finalmente, la mezcla se lavó con 10 ml de STC, se recogió por centrifugación a 2000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y la muestra se plaqueó en una placa de MM con 100 \mug/ml de higromicina para seleccionar los transformantes.

Para la transformación de A. tumefaciens, se mezcló una alícuota de 100 \mul que contenía 3 x 10^{6} a 10^{7} protoplastos con 100 \mul de A. tumefaciens crecidos tal como se ha descrito en Materiales y Procedimientos. A partir de esta muestra se realizaron diluciones 1/10, 1/100 y 1/1000 en IM. Posteriormente, las mezclas se plaquearon sobre filtros de nitrocelulosa situados sobre placas de IM con glucosa 5 mM y se incubaron a temperatura ambiente o 29ºC durante 2 días. A continuación, los filtros se transfirieron a placas de MM de Aspergillus con cefotaxima 200 \muM para matar las células de Agrobacterium e higromicina 100 \mug/ml para seleccionar los transformantes.

Se llevaron a cabo tres experimentos por separado con A. tumefaciens con el vector binario pUR5750 en su interior. En cada experimento las transformaciones se llevaron a cabo por duplicado y se incluyó un control negativo sin AS. Los resultados están representados en la Tabla 3 más abajo. Las células transformadas resistentes a higromicina sólo se obtuvieron en medio que contenía AS. Los controles negativos no dieron nunca lugar a células transformadas. Estos resultados demuestran inequívocamente que la inducción de los genes vir es esencial para la transferencia del ADN-T a las células del moho y, por lo tanto, que A. tumefaciens es capaz de transformar el moho Aspergillus awamori. La frecuencia de transformación varió desde aproximadamente 300 hasta 7200 transformantes por 10^{7} protoplastos, lo cual es mucho mayor que los valores de la transformación con PEG obtenidos en experimentos anteriores no publicados. Para las transformaciones con PEG y con pAN7.1 (que contiene el mismo cassette de expresión con el gen de la higromicina como marcador de selección, que también está presente en pUR5750, véase Materiales y Procedimientos) se obtuvieron hasta 18 transformantes por \mug por 10^{7} protoplastos. Esto está en concordancia con el valor de aproximadamente 12 transformantes / \mug de ADN vector publicado por Ward y col (véase más arriba).

Estos datos demuestran que usando una transformación mediada por A. tumefaciens para mohos se pueden generar hasta 400 veces más transformantes que con una transformación con PEG (por \mug por 10^{7} protoplastos).

Además, en el experimento 3 (véase la Tabla 3 más abajo) se realizó una comparación directa entre ambos procedimientos de transformación empleando el mismo lote de protoplastos. En dos transformaciones con PEG, empleando 5 \mug de pAN7.1 por cada transformación de 10^{7} protoplastos, se obtuvieron 6 y 16 transformantes, respectivamente. Esto supone una media de 2,2 transformantes por \mug por 10^{7} protoplastos. Empleando la transformación mediada por A. tumefaciens se obtuvieron 300 y 480 transformantes por 10^{7} células receptoras, así de media 390 transformantes por 10^{7} células receptoras.

De este modo, aplicando el procedimiento de acuerdo con la invención empleando la transformación mediada por A. tumefaciens se obtuvieron aproximadamente 180 veces más transformantes.

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(Tabla pasa a página siguiente)

2

3

4

En los experimentos 1 y 2 la eficacia del plaqueo (% de células que sobreviven relacionado con el número inicial de células) se determinó plaqueando diluciones 1/1000 y 1/10 000 en placas de MM sin higromicina. En el experimento 1 la eficacia del plaqueo fue del 5% y en el experimento 2 fue de 2,6%.

El fenotipo resistente a Hyg de los transformantes se confirmó en 78 transformantes que se picaron aleatoriamente y los conidios se sembraron por estrías en placas de MM con cefotaxima 200 \muM e higromicina 100 \mug/ml. En ocho de estos transformantes, los conidios procedentes de colonias individuales se volvieron a sembrar por estrías en placas de MM con higromicina 100 \mug/ml. Esto se repitió dos veces. Posteriormente los conidios se aislaron y se crecieron en cultivo para obtener micelios para el aislamiento de ADN genómico. El aislamiento de ADN y la transferencia Southern están descritos en Materiales y Procedimientos. El ADN genómico se digirió con BglII o HindIII. BglII no corta en el ADN-T, de este modo esta digestión generará un fragmento que abarca el ADN-T en su totalidad y las secuencias cromosómicas que flanquean tanto el extremo derecho como el izquierdo del ADN-T. Este fragmento será de al menos 7,5 kb. HindIII corta solamente una vez en el ADN-T y la sonda pAN7.1 detecta solamente el fragmento de ADN-T portador del cassette de expresión de la higromicina y las secuencias cromosómicas que flanquean el extremo izquierdo del ADN-T. Este fragmento será de al menos 5 kb. Se incluyó ADN sin digerir con objeto de confirmar la presencia de ADN-T en el ADN cromosómico de elevado peso molecular. Las autoradiografías de las transferencias Southern están representadas en la Figura 3. En los ocho transformantes el ADN-T estaba integrado en un único locus cromosómico. Siete de ocho contenían también una única integración de ADN-T. En un caso, el ADN-T se integró en forma de repetición en tándem. Con las muestras de ADN sin digerir, la señal de hibridación coincide con el ADN de elevado peso molecular, lo que confirma la integración de ADN-T en el cromosoma.

Las transformaciones con A. tumefaciens no se realizaron solamente con el vector binario pUR5750, sino también con el vector binario pUR5751 (véase la Figura 2). Este vector contiene el replicador del plásmido AMA1 de Aspergillus nidulans. Los plásmidos portadores del replicón AMA1 son capaces de mantenerse de forma autónoma en Aspergillus nidulans. Por lo tanto, este ADN-T debería ser capaz de producir una célula transformada en la que el ADN-T está presente en forma de elemento extracromosómico. Los resultados de dos experimentos están representados en la Tabla 3 más arriba. La frecuencia de transformación varió desde aproximadamente 300 hasta 950 transformantes por 10^{7} protoplastos. El fenotipo resistente a Hyg de los transformantes se confirmó en 20 transformantes que se picaron de forma aleatoria y las esporas se sembraron por estrías en placas de MM con 100 \mug/ml de higromicina.

Ejemplo 2 Transformación de conidios de Aspergillus awamori

Para la transformación de conidios de Aspergillus awamori mediada por A. tumefaciens, se mezcló una alícuota de 100 \mul que contenía 10^{7} conidios con 100 \mul de A. tumefaciens crecidos tal como está descrito en Materiales y Procedimientos. De esta muestra se hicieron diluciones 1/10 y 1/100 en IM. Posteriormente, las mezclas se plaquearon sobre filtros de nitrocelulosa situados sobre placas de IM que contenían glucosa 5 mM y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 días. A continuación, los filtros se transfirieron a placas de MM de Aspergillus con cefotaxima 100 \muM para matar las células de Agrobacterium e higromicina 100 \mug/ml para seleccionar los transformantes. Los resultados de dos experimentos están representados en la Tabla 3 más arriba. También en este caso la transformación fue dependiente de la inducción de los genes vir por AS. La frecuencia de transformación varió desde aproximadamente 1000 hasta 2000 transformantes por 10^{7} conidios, lo cual se encuentra dentro del mismo intervalo que la frecuencia tras la transformación de protoplastos. El fenotipo resistente a Hyg de los transformantes se confirmó en 15 transformantes que se picaron de forma aleatoria y se sembraron los conidios por estrías en placas de MM que contenían cefotaxima 200 \muM e higromicina 100 \mug/ml.

Ejemplo 3 Transformación de conidios de Aspergillus nidulans

Para la transformación de conidios de Aspergillus nidulans mediada por A. tumefaciens, se mezcló una alícuota de 100 \mul que contenía 10^{7} conidios con 100 \mul de A. tumefaciens crecidos tal como está descrito en Materiales y Procedimientos. Las mezclas se plaquearon sobre filtros de nitrocelulosa situados sobre placas de IM que contenían glucosa 5 mM y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 días. A continuación, los filtros se transfirieron a placas de medio mínimo para Aspergillus que contenían cefotaxima 100 \muM para matar las células de Agrobacterium e higromicina 1000 \mug/ml para seleccionar los transformantes. El filtro se revistió con agar MM que contenía cefotaxima e higromicina en las mismas concentraciones.

Con Aspergillus nidulans la selección demostró ser incómoda. Aparentemente, los conidios germinaron durante el co-cultivo y se dejaron crecer demasiado como para permitir una selección restrictiva. Esta observación concuerda con los resultados obtenidos por Cullen y col. (Gene 57 (1989) 21-26). Éstos determinaron que el tiempo de incubación antes de comenzar la selección es muy importante para la obtención de un buen resultado. Se aplicó un periodo de incubación de 16 horas antes de la selección dando como resultado un crecimiento de fondo significativo, mientras que tras un periodo de incubación de solamente 8 horas no se observaron colonias. Las Figuras que se aportan se obtuvieron tras un periodo de incubación de 12 horas. También observaron una sustancial variabilidad entre cepas en cuanto a su sensibilidad a la higromicina. A la vista de los resultados de Cullen y col. la frecuencia de transformación de este Ejemplo se puede mejorar optimizando el periodo de incubación antes de aplicar la selección.

El resultado está representado en la Tabla 3 más arriba. Se obtuvieron, en total, 15 colonias supuestamente transformadas. Además, el control negativo produjo tres colonias en crecimiento formadoras de esporas. Con objeto de confirmar el fenotipo transformado, los conidios se sembraron por estrías en placas de MM que contenían cefotaxima 200 \muM e higromicina 1000 \mug/ml. Los controles negativos no crecieron y solamente crecieron 2 de los 15 supuestos transformantes. Por lo tanto, también en este caso la transformación fue dependiente de la inducción de los genes vir por AS.

Los datos bibliográficos sobre las transformaciones con PEG empleando el gen de resistencia a la higromicina muestran frecuencias de transformación de 5-20 transformantes por \mug de ADN vector (Cullen y col.; Gene 57 (1989) 21-26; Punt y col.; Gene 56 (1987) 117-124).

Usando otro marcador de selección, el gen argB, Fungaro y col. (FEMS Microbiology Letters 125, (1995) 293-298) obtuvieron hasta 81 transformantes por \mug de ADN vector, mientras que se obtuvieron 20-300 transformantes por \mug de ADN vector con el gen trpC como marcador (Yelton y col.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 1470-1474). Estos datos bibliográficos sugieren que el número de transformantes que se pueden obtener empleando una transformación mediada por Agrobacterium se puede mejorar empleando otro gen como marcador de selección.

Ejemplo 4 Transformación de conidios de Aspergillus niger

Para la transformación de conidios de Aspergillus niger mediada por A. tumefaciens, se mezcló una alícuota de 100 \mul que contenía 10^{5}, 10^{6} ó 10^{7} conidios con 100 \mul de A. tumefaciens crecidos tal como está descrito en Materiales y Procedimientos. Las mezclas se plaquearon sobre filtros de nitrocelulosa situados sobre placas de IM que contenían glucosa 5 mM y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 días. A continuación, los filtros se transfirieron a placas de medio mínimo para Aspergillus que contenían cefotaxima 200 \muM para matar las células de Agrobacterium e higromicina 200 \mug/ml para seleccionar los transformantes. En general, la selección demostró ser incómoda. Aparentemente, los conidios germinaron durante el co-cultivo y se dejaron crecer demasiado como para permitir una selección restrictiva. Esto se podría mejorar en cierto grado empleando un revestimiento sobre el filtro que consistiría en agar MM con cefotaxima 200 \muM e higromicina 200 \mug/ml.

Los resultados de un experimento típico están representados en la Tabla 3 más arriba. Los experimentos produjeron 6 colonias en crecimiento en el control negativo y 6 colonias supuestamente transformadas en las placas de transformación que contenían AS. Con objeto de confirmar el fenotipo resistente a Hyg de estas colonias, los conidios de las 12 colonias se sembraron por estrías en placas de MM que contenían cefotaxima 200 \muM e higromicina 200 \mug/ml. Solamente cinco de los 6 supuestos transformantes crecieron en las nuevas placas de selección. El supuesto transformante restante y las colonias del control negativo no crecieron. Por lo tanto, también en este caso la transformación fue dependiente de la inducción de los genes vir por AS. Dos transformantes se sometieron a transferencia Southern. El ADN genómico se digirió con BglII o HindIII. BglII no corta en el ADN-T, por lo tanto esta digestión generará un fragmento que abarca el ADN-T en su totalidad y las secuencias cromosómicas que flanquean tanto el extremo derecho como el izquierdo del ADN-T. Este fragmento será de al menos 7,5 kb. HindIII corta solamente una vez en el ADN-T y la sonda para le gen hph de pAN7.1 detecta solamente el fragmento de ADN-T portador del cassette de expresión de la higromicina y las secuencias cromosómicas que flanquean el extremo izquierdo del ADN-T. Este fragmento será de al menos 5 kb. La transferencia Southern (véase la Figura 4) demostró que en ambos transformantes el ADN-T estaba integrado en un único locus cromosómico, lo que confirmó el fenotipo transformado a nivel molecular.

Los datos bibliográficos sobre las transformaciones de protoplastos mediadas por PEG empleando el gen de resistencia a la higromicina muestran frecuencias de transformación de 5-20 transformantes por \mug (Punt y col.; Gene 56 (1987) 117-124) y de hasta 17 000 transformantes por \mug (Mohr and Esser; Appl Microbiol Biotechnol 34 (1990) 63-70). Sin embargo, estos últimos autores mencionan que su publicación:

"Tras la purificación de colonias de aislados primarios sobre medio completo, solamente unas pocas cepas (aproximadamente el 10%) crecieron en medio con higromicina"

Aparentemente, tuvieron problemas con su procedimiento de selección.

Para la transformación de conidios germinantes intactos por electroporación empleando el gen argB, está descrita una frecuencia de transformación de 0,5-4 transformantes por \mug (Ozeki y col.; Biosci. Biotech. Biochem. 58 (1994) 2224-2227).

Ejemplo 5 Transformación de conidios de Colletotrichum gloeosporioides

Para la transformación de conidios de Colletotrichum gloeosporioides mediada por A. tumefaciens, se mezcló una alícuota de 100 \mul que contenía 10^{5} ó 10^{6} conidios con 100 \mul de A. tumefaciens crecidos tal como está descrito en Materiales y Procedimientos. Las mezclas se plaquearon sobre filtros de nitrocelulosa situados sobre placas de IM que contenían glucosa 5 mM y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 días. A continuación, los filtros se transfirieron a placas de medio mínimo para Aspergillus que contenían cefotaxima 200 \muM para matar las células de Agrobacterium e higromicina 100 \mug/ml para seleccionar los transformantes. Tras cinco días de incubación a temperatura ambiente aparecieron colonias en las placas de la transformación. La transformación con 10^{5} conidios dio 7 transformantes mientras que la transformación con 10^{6} conidios dio 175 transformantes. No se obtuvieron colonias en la placa del control negativo. Un día más tarde empezaron a aparecer pequeñas colonias en la placa del control negativo. Aparentemente, la selección no fue lo suficientemente restrictiva como para inhibir completamente el crecimiento de las células no transformadas. Con objeto de confirmar el fenotipo resistente a Hyg, los micelios de 11 colonias supuestamente transformadas y tres colonias del control negativo se transfirieron a placas de MM que contenían cefotaxima 200 \muM e higromicina 100 \mug/ml. Ocho de los once supuestos transformantes crecieron en las nuevas placas de selección. Los tres supuestos transformantes restantes y las tres colonias del control negativo no crecieron. Por lo tanto, también en este caso la transformación fue dependiente de la inducción de los genes vir por AS. Los resultados que se representan en la Tabla 3 más arriba están corregidos para los falsos positivos que se obtuvieron. La transformación produjo de 500 a 1300 transformantes por 10^{7} conidios. Se sometió un transformante a transferencia Southern tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. Esto demostró que el ADN-T estaba integrado en un único locus cromosómico, lo que confirmó el fenotipo transformado a nivel molecular.

Stephenson y col. (Aust. Soc. Biochem. Mol. Biol. 26 (1994) Pos-1-31) informaron de una frecuencia de transformación de menos de 100 transformantes por 100 \mug. Anteriormente, Armstrong y Harris (Phytopathology 83 (1993) 328-332) habían informado de una frecuencia de transformación de 2-50 transformantes por 10^{8} protoplastos empleando la resistencia al fungicida benomil para la selección.

Ejemplo 6 Transformación de conidios de Fusarium solani pisi

Para la transformación de conidios de Fusarium solani pisi mediada por A. tumefaciens, se mezcló una alícuota de 100 \mul que contenía 10^{5} ó 10^{7} conidios con 100 \mul de A. tumefaciens crecidos tal como está descrito en Materiales y Procedimientos. Las mezclas se plaquearon sobre filtros de nitrocelulosa situados sobre placas de IM que contenían glucosa 5 mM y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 días. A continuación, los filtros se transfirieron a placas de medio mínimo para Aspergillus que contenían cefotaxima 200 \muM para matar las células de Agrobacterium e higromicina 100 \mug/ml para seleccionar los transformantes. Los resultados están representados en la Tabla 3 más arriba. La transformación de 10^{7} conidios dio lugar a 1 transformante. No se obtuvieron colonias en la placa del control negativo. El fenotipo resistente a Hyg del transformante se confirmó creciendo el transformante en placas de MM que contenían cefotaxima 200 \muM e higromicina 100 \mug/ml. También en este caso la transformación fue dependiente de la inducción de los genes vir por AS.

Con el uso del gen de resistencia a higromicina para la transformación de protoplastos mediante PEG, se han informado frecuencias de transformación de 10 000 transformantes por \mug por 10^{7} protoplatos para Fusarium solani f.sp. cucurbitae race 2 (Crowhurst y col. Current Genetics 21 (1992) 463-469). La transformación de Fusarium solani f.sp. phaseoli mediante PEG y acetato de litio, tal como informaron Marek y col (Curr. Genet. 15 (1989) 421-428), produjo de 0,2 a 3,3 transformantes por \mug.

Ejemplo 7 Transformación de conidios de Fusarium graminearum y de material de la ATCC seco y congelado rehidratado

Para la transformación de conidios de Fusarium graminearum mediada por A. tumefaciens, se mezcló una alícuota que contenía 4 x 10^{5} conidios con 100 \mul de A. tumefaciens crecidos tal como está descrito en Materiales y Procedimientos. También se empleó para la transformación un cultivo seco y congelado rehidratado de la American
Type Culture Collection. El material seco y congelado, presente en un vial doble, se rehidrató añadiéndole 0,4 ml de agua estéril y se incubó durante 30 minutos a RT. El material que se empleó para la transformación había sido almacenado a 4ºC durante aproximadamente dos semanas. Se mezcló una alícuota de 100 \mul del material de la ATCC con 200 \mul de A. tumefaciens. Las mezclas se plaquearon sobre filtros de nitrocelulosa situados sobre placas de IM que contenían glucosa 5 mM y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 días. La mitad del material de la ATCC se co-cultivó en placas de IM durante cinco días. A continuación, los filtros se transfirieron a placas de PDA que contenían cefotaxima 200 \muM para matar las células de Agrobacterium e higromicina 150 \mug/ml para seleccionar los transformantes.

Los resultados están representados en la Tabla 3 más arriba. La transformación de 4 x 10^{5} conidios dio 1 transformante, lo cual supone 25 transformantes por 10^{7} conidios. Con el material de la ATCC, se obtuvieron cinco transformantes cuando había sido co-cultivado durante 5 días. No se obtuvieron colonias en el control negativo. El fenotipo resistente a Hyg del transformante se confirmó creciendo los transformantes en placas de PDA que contenían cefotaxima 200 \muM e higromicina 150 \mug/ml. También en este caso la transformación fue dependiente de la inducción de los genes vir por AS. Dos transformantes obtenidos tras la transformación del material de la ATCC se sometieron a transferencia Southern tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. Esto demostró que el ADN-T estaba integrado en un único locus cromosómico, lo que confirmó el fenotipo transformado a nivel molecular.

La transformación de 5 x 10^{6} hasta 2 x 10^{7} protoplastos de Fusarium graminearum con el gen de la acetamidasa de A. nidulans empleando un procedimiento de transformación con PEG, dio como resultado frecuencias de transformación de 5 transformantes por \mug (Royer y col., Bio/technology 13 (1995), p. 1479-1483).

Ejemplo 8 Transformación de conidios de Neurospora crassa

Para la transformación de conidios de Neurospora crassa mediada por A. tumefaciens, se mezcló una alícuota de 100 \mul que contenía 10^{5} conidios con 100 \mul de A. tumefaciens crecidos tal como está descrito en Materiales y Procedimientos. Las mezclas se plaquearon sobre filtros de nitrocelulosa situados sobre placas de IM que contenían glucosa 5 mM y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 días. A continuación, los filtros se transfirieron a placas de medio mínimo para Aspergillus que contenían cefotaxima 200 \muM para matar las células de Agrobacterium e higromicina 200 \mug/ml para seleccionar los transformantes. Los resultados están representados en la Tabla 3 más arriba. En el primer experimento, la transformación de 10^{5} conidios dio aproximadamente 50 transformantes, mientras que la dilución 1/10 dio 5 transformantes. En el segundo experimento, la transformación de 10^{5} conidios también dio aproximadamente 50 transformantes. Esto significa que la transformación da hasta 5000 transformantes por 10^{7} conidios. El fenotipo resistente a Hyg de 20 transformantes se confirmó creciendo los transformantes en placas de medio mínimo para Aspergillus que contenían cefotaxima 200 \muM e higromicina 200 \mug/ml. También en este caso la transformación fue dependiente de la inducción de los genes vir por AS. Dos transformantes se sometieron a transferencia Southern tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. Esto demostró que el ADN-T estaba integrado en un único locus cromosómico, lo que confirmó el fenotipo transformado a nivel molecular.

Neurospora crassa se ha transformado empleando varios procedimientos. Los conidios germinantes se han transformado por electroporación empleando el gen de resistencia a la higromicina, obteniéndose frecuencias de transformación de 3000 hasta 6000 transformantes por \mug por 10^{7} conidios (Chakraborty y col.; Can. J. Microbiol. 37 (1991) 858-863. Las transformaciones de conidios germinantes con acetato de litio dieron como resultado frecuencias de transformación de 2 a 10 transformantes por \mug por 10^{7} conidios (Dhawale y col.; Curr. Gen. 8 (1984) 77-79). La transformación de protoplastos con PEG dio como resultado frecuencias de transformación de 400 hasta 15 000 transformantes por \mug (Vollmer and Yanofsky; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 4867-4873).

Ejemplo 9 Transformación de conidios de Trichoderma reesei

Para la transformación de conidios de Trichoderma reesei mediada por A. tumefaciens, se mezcló una alícuota de 100 \mul que contenía 10^{5} ó 10^{7} conidios con 100 \mul de A. tumefaciens crecidos tal como está descrito en Materiales y Procedimientos. Las mezclas se plaquearon sobre filtros de nitrocelulosa situados sobre placas de IM que contenían glucosa 5 mM y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 días. A continuación, los filtros se transfirieron a placas de medio mínimo para Aspergillus que contenían cefotaxima 200 \muM para matar las células de Agrobacterium e higromicina 100 \mug/ml para seleccionar los transformantes.

Los resultados están representados en la Tabla 3 más arriba. La transformación de 10^{7} conidios dio aproximadamente 240 transformantes, mientras que la transformación de 10^{5} conidios dio 12 transformantes. Esto significa que la frecuencia de transformación varía entre 240 y 1200 transformantes por 10^{7} conidios. El fenotipo resistente a Hyg de 9 transformantes se confirmó creciendo los transformantes en placas de medio mínimo para Aspergillus que contenían cefotaxima 200 \muM e higromicina 100 \mug/ml. También en este caso la transformación fue dependiente de la inducción de los genes vir por AS. Dos transformantes se sometieron a transferencia Southern tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. Esto demostró que el ADN-T estaba integrado en un único locus cromosómico, lo que confirmó el fenotipo transformado a nivel molecular.

Cuando se emplea el mismo gen de la higromicina como marcador de selección (pAN7.1) para la transformación de protoplastos con PEG, se obtienen aproximadamente 100 transformantes por \mug por 10^{7} protoplastos (Mach y col.; Current Genetics 25 (1994) 567-570). Cuando el gen de la higromicina se flanqueó con señales de expresión homólogas, derivadas del propio Trichoderma reesei, Mach y col informaron de frecuencias de transformación aumentadas, de 1800 a 2500 transformantes por \mug por 10^{7} protoplastos. Gruber informó de resultados similares (Curr. Genet. 18 (1990) 447-451). Obtuvieron aproximadamente 800 a 1500 transformantes por \mug empleando vectores heterólogos. Un vector que contenía el gen pyrG homólogo produjo hasta 12 000 transformantes por \mug.

Ejemplo 10 Transformación de conidios de Pleurotus ostreatus

Existen pocas publicaciones conocidas acerca de la transformación de hongos comestibles. Peng y col. (Curr. Genet. 22 (1992) 53-59) tuvieron éxito en la transformación de Pleurotus ostreatus, pero las cepas transformadas eran inestables. Sin embargo, recientemente Yanai y col. (Biosci. Biotech. Biochem. 60 (1996) 472-475) obtuvieron transformantes estables de Pleurotus ostreatus.

Para la transformación de conidios de Pleurotus ostreatus mediada por A. tumefaciens se emplearon dos procedimientos. En el experimento 1 se mezcló una alícuota de 1,25 x 10^{7} conidios con 150 \mul de A. tumefaciens crecidos tal como se ha descrito en Materiales y Procedimientos. La mezcla se plaqueó sobre un filtro de nitrocelulosa situado sobre una placa de IM que contenía glucosa 5 mM. En el experimento dos, se plaquearon 2,5 x 10^{7} conidios sobre un filtro de nitrocelulosa situado sobre una placa de PDA y se preincubaron durante 4 días a temperatura ambiente. Posteriormente, los filtros se transfirieron a una placa petri, se sumergieron en 25 ml de cultivo de Agrobacterium en IM (crecido durante 6 horas tal como está descrito en Materiales y Procedimientos) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, el filtro se situó sobre una placa de IM que contenía glucosa 5 mM. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 3 ó 6 días. A continuación, los filtros se transfirieron a placas de PDA que contenían cefotaxima 200 \muM para matar las células de Agrobacterium e higromicina 75 \mug/ml para seleccionar los transformantes.

Los resultados tras 6 días de co-cultivo están representados en la Tabla 3 más arriba. La transformación de 10^{7} conidios dio como resultado aproximadamente 48 transformantes.

Cuando los conidios se usaron directamente para la transformación, sólo se obtuvieron transformantes tras 6 días de co-cultivo (experimento 1). Sin embargo, cuando los conidios habían sido preincubados durante 4 días antes de la transformación (experimento 2), se obtuvieron transformantes después de 3 y 6 días de co-cultivo, aunque después de 3 días el número de transformantes era menor que después de 6 días: 10 en lugar de 48. También en este caso la transformación fue dependiente de la inducción de los genes vir por AS.

Cuando se emplea el mismo gen de la higromicina como marcador de selección (pAN7.1) para la transformación de protoplastos con PEG, se obtienen aproximadamente 5-46 transformantes por \mug por 10^{7} protoplastos viables (Peng y col.; Current Genetics 22 (1992) 53-59). Empleando bialafos como marcador de selección dominante, Yanai y col. (Biosci. Biotech. Biochem. 60 (1996) 472-475) obtuvieron aproximadamente 2 transformantes por \mug.

Ejemplo 11 Transformación de conidios de Agaricus bisporus

Para la transformación de Agaricus bisporus mediada por A. tumefaciens se usaron conidios de la cepa comercial Horst U1 (adquirida en "Proefstation voor de Champignoncultuur", P.O. Box 6042, 5960 AA Horst, Holanda). Se usaron los siguientes medios para germinar los conidios. Un agar extracto de malta (Mox; 50 gr/l que incluye extracto de malta, peptona y agar) adquirida en Oxoid o un agar extracto de malta tal como lo especifica la "Proefstation voor de Champignoncultuur" (MPrf; extracto de malta 2%, MOPS 10 mM, agar 1,5%, pH 7,0 con KOH). Se plaquearon aproximadamente 1,2 x 10^{7} conidios sobre un filtro de nitrocelulosa situado sobre medio Mox o MPrf. Un granulado de cultivo para Agaricus bisporus (adquirido también en "Proefstation voor de Champignoncultuur") se situó sobre el agar que rodea al filtro con objeto de facilitar la germinación de los conidios. Las placas petri se sellaron con parafilm. Las placas se preincubaron durante 5 ó 7 días a temperatura ambiente. Posteriormente, los filtros se transfirieron a una placa petri y se sumergieron en 25 ml de cultivo de Agrobacterium tumefaciens en IM (crecido durante 6 horas tal como está descrito en Materiales y Procedimientos). Para la transformación se empleó la cepa LBA1126 de A. tumefaciens (Bundock & Hooykaas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 15272-75), en la que se introdujo el vector binario pUR5750. Esta cepa LBA1126 se obtuvo con restricciones acerca de su uso procedentes de la State University Leiden en la que están empleados Bundock y col. Los filtros se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, los filtros se situaron sobre placas de IM que contenían glucosa 5 mM y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 5 días. A continuación, los filtros se transfirieron a placas de Mox o MPrf que contenían cefotaxima 200 \muM para matar las células de Agrobacterium e higromicina 25 \mug/ml (Van Rhee y col., Mol Gen Genet 250 (1996) 252-258) para seleccionar los transformantes. Las colonias resistentes a higromicina aparecieron después de aproximadamente 5 semanas de incubación. En cinco transformaciones, se obtuvieron 10 colonias transformadas (véase la Tabla 3 más arriba). Los transformantes se obtuvieron con ambos medios y después de 5 y 7 días de preincubación antes de la transformación. También en este caso la transformación fue dependiente de la inducción de los genes vir por AS. Siete transformantes se cultivaron posteriormente en placas de MPrf que contenían cefotaxima 200 \muM con o sin higromicina 25 \mug/ml. Cuatro transformantes se sometieron a transferencia Southern tal como está descrito en el Ejemplo 4. La transferencia Southern (véase la Figura 5) demostró que en todos los transformantes el ADN-T estaba integrado en el ADN cromosómico, lo que confirmó el fenotipo transformado a nivel molecular.

El hongo Agaricus bisporus cultivado ha sido recientemente transformado por Van Rhee y col. (Mol Gen Genet 250 (1996) 252-258). Sin embargo, mientras que fueron capaces de transformar una única cepa homocariótica ATCC 24663 no fueron capaces de transformar directamente la cepa heterocariótica comercial Horst U1, dicha cepa siendo de uso generalizado para la producción de hongos comestibles. Para esta cepa, primero tuvieron que seleccionar una cepa derivada que se pareciese al fenotipo de ATCC 24663 antes de ser capaces de obtener transformantes. Por lo tanto, la aplicación de biotecnología en esta especie, la cual es un importante cultivo con una producción mundial de 1,5 millones de toneladas en 1990 (Van Rhee y col., Mol Gen Genet 250 (1996) 252-258), aún estaba dificultada por la falta de un sistema de transformación aplicable de forma generalizada. La aplicación de técnicas de la biotecnología al cultivo de hongos puede mejorar de forma importante la calidad y el rendimiento de los cultivos.

Ejemplo 12 Integración dirigida de múltiples copias de un gen en Aspergillus awamori Sistema experimental

El diseño experimental de un procedimiento para la integración dirigida de múltiples copias de un gen en el moho A. awamori se muestra en la Figura 6. El sistema se basa en dos componentes, (1) una cepa micótica que contiene el gen pyrG con una deleción en 3', y (2) una cepa de Agrobacterium que contiene un vector binario adecuado para la restauración del gen pyrG por recombinación. Este vector binario contiene entre los extremos del ADN-T una construcción de reparación portadora del gen pyrG con una deleción en 5', de forma que ambos genes pyrG truncados tienen parte del gen pyrG en común la cual funciona como uno de los sitios de recombinación. El otro sitio de recombinación debe encontrarse corriente abajo del gen pyrG de forma que, por recombinación, el gen pyrG sea restaurado.

Con objeto de introducir al menos otro gen más, el vector binario debería contener múltiples copias de al menos un gen que codifique una proteína deseada entre los dos sitios de recombinación, preferiblemente corriente abajo del gen pyrG truncado.

Como alternativa, se puede prever que la recombinación con la introducción de al menos un gen se puede producir también cuando el locus diana contiene una deleción en 5' y la construcción de reparación contiene el(los) gen(es) a introducir corriente arriba de un gen pyrG delecionado en 3' con un segundo sitio de recombinación corriente arriba del(de los) gen(es) a introducir. Sin embargo, en esta situación se debe tener cuidado de que el promotor del gen pyrG no se vea afectado.

Con objeto de detectar específicamente la integración por recombinación homóloga el gen pyrG endógeno se usó como marcador genético de selección (Gouka y col., Current Genetics 27 (1995) 536-540).

Construcción del sitio diana

El plásmido pUR5710 (véase la Figura 7) se construyó clonando un fragmento BamHI/SalI de 2,0 kb que contenía un extremo 5' del gen pyrG, el cual está presente en el plásmido pAW4.1 (Gouka y col.; véase más arriba), en un vector general de clonación pIC20R (Marsh y col.; Gene 32 (1984) 481-485) digerido con BamHI y SalI. Posteriormente, se clonó un ADN espaciador sintético que contenía el sitio de reconocimiento de 18 pb para la endonucleasa I-SceI
(5' -TAGGGATAACAGGGTAAT- 3' = SEQ. ID. NO. 1) flanqueado por sitios SalI y HindIII en el plásmido pUR5710 digerido con SalI y HindIII. Esto dio como resultado el plásmido pUR5711 (véase la Figura 7). El plásmido pUR5712 (véase la Figura 7) se construyó clonando un fragmento HindIII de 2,0 kb que contenía secuencias corriente abajo de la región codificante de pyrG, que está presente en el plásmido pAW4.4 (Gouka y col.; véase más arriba), en el plásmido pUR5711 digerido con HindIII. La orientación de este fragmento HindIII en relación con la región codificante del gen pyrG es idéntica a la situación salvaje. El plásmido pUR5712 se empleó para construir la cepa mutante pyrG^{-} AWCSCE de A. awamori.

Construcción de la cepa mutante pyrG^{-} AWCSCE de A. awamori

La transformación de la cepa salvaje de A. Awamori se realizó con un fragmento EcoRI purificado (Qiaex gel extraction kit; Qiagen número de catálogo 20021) obtenido a partir del plásmido pUR5712 que contenía en gen pyrG mutante con el sitio de restricción I-SceI en el sitio de la deleción (véanse las Figuras 6 y 7). En cada transformación se transformaron 2 x 10^{6} protoplastos con 10 \mug de ADN. Ya que las cepas pyrG^{-} son resistentes a 5-FOA (ácido 5-fluoro-orótico; Boeke y col.; Mol Gen Genet 197 (1984) 345-346), los transformantes pyrG^{-} se pueden seleccionar directamente a partir de cepas salvajes. Los transformantes se seleccionaron en placas de MM (AspA se sustituye por AspA-N; 50 x Asp-N = KCl 0,35 M, KH_{2}PO_{4}, pH 6,5 con KOH) suplementado con uridina 10 mM y 0,75 mg/ml de 5-FOA, con prolina 10 mM como fuente de N. El fenotipo mutante de los transformantes que se obtuvieron se comprobó creciendo estas colonias en placas de MM sin uridina. Dos transformantes que no eran capaces de crecer sin uridina se analizaron además por transferencia Southern. El patrón de ADN observado concordaba con el patrón esperado para la cepa AWCSCE.

Construcción de un vector con múltiples copias

Para la construcción del plásmido pUR5713 (véase la Figura 8A) el plásmido pAW4.4 (véase Gouka y col.; véase más arriba) se digirió con HindIII, el sitio HindIII se rellenó con la polimerasa Klenow y el fragmento se digirió posteriormente con BamHI. El fragmento de 1,6 kb resultante, que contenía secuencias corriente abajo de la región codificante de pyrG, se aisló. Además, el plásmido pAW4.20 (Gouka y col.; véase más arriba) se digirió con BamHI y HindIII y el fragmento de 0,4 kb, que contenía secuencias presentes inmediatamente corriente arriba del fragmento de 1,6 kb descrito más arriba, se aisló. Los fragmentos HindIII/BamHI de 0,4 kb y BamHI/rellenado en HindIII de 1,6 kb se clonaron de forma simultánea en el vector general de clonación pBluescript^{R} SK (Stratagene) digerido con HindIII y SmaI. Esto dio como resultado el plásmido pUR5713.

El plásmido pUR5714 (véase la Figura 8B) se construyó clonando un fragmento BglII/HindIII de 1,0 kb que contenía un extremo 3' del gen pyrG, que está presente en el vector pAW4.1, en el vector general de clonación pBluescript^{R} SK digerido con BamHI y HindIII. El cósmido pUR5716 (véase la Figura 9) deriva del vector cósmido pJB8 (Ish-Horowicz, D. and Burje, J.F.; Nucleic Acids Res 9 (1981) 2989) por sustitución del fragmento poliligador EcoRI/HindIII por un espaciador sintético, que contiene un sitio de restricción EcoRI y NotI, con la siguiente secuencia (véase SEQ. ID. NO. 2):

(5' -AATTC AT GCGGCCGC T- 3'

3' -G TA CGCCGGCG ATCGA- 5')

En esta etapa de clonación, se pierde el sitio HindIII. El cósmido pUR5718 (véase la Figura 9) se construyó clonando simultáneamente el fragmentos NotI/HindIII de 1,0 kb procedente del plásmido pUR5714 y el fragmento HindIII/NotI de 2,0kb procedente del plásmido pUR5713 en el plásmido pUR5716 digerido con NotI. De este modo, este vector es portador de una secuencia homóloga a ambos extremos del sitio I-SceI del locus diana pyrG en la cepa mutante pyrG^{-} AWCSCE de A. awamori.

El plásmido pUR5729 (véase la Figura 10) se construyó clonando el fragmento PstI/SacI de aproximadamente 1,5 kb que contiene el marco abierto de lectura (ORF) del gen de la cutinasa de Fusarium solani pisi (copia sintética del ADNc; Van Gemeren y col.; Journal of Biotechnology 40 (1995) 155-162) bajo el control del promotor y la secuencia de terminación del gen ex1A de Aspergillus awamori (Gouka y col.; Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996) 28-35), del plásmido pUR7385 (Van Gemeren y col.; Applied Microbiology and Biotechnology 45 (1996) 755-763), en el vector general de clonación pIC19H (Marsh y col.; véase más arriba) digerido con PstI y SacI.

Basándose en el cósmido pUR5718 se construyó un nuevo cósmido (pUR5725) que contenía múltiples copias del gen de la cutinasa bajo el control de las señales de expresión de ex1A (tal como se ha descrito más arriba). Una única copia de este cassette de expresión se aisló como un fragmento HindIII de 1,5 kb del plásmido pUR5729 y se ligó en el cósmido pUR5718 digerido con HindIII. Tras el empaquetamiento de la mezcla de ligación usando el \lambda-ADN in vitro packaging module (Amersham; código RPN1717), la mezcla de empaquetamiento se transformó en la cepa 1046 de E. coli (ambos de acuerdo con el protocolo proporcionado con el módulo). De esta transformación se obtuvo el cósmido pUR5725 (véase la Figura 11) que contenía un conjunto en tándem de nueve copias del cassette de expresión.

Con objeto de producir un vector Agrobacterium tumefaciens que se pueda usar para transformar un moho, se construyó el plásmido pUR5752. Es un vector binario con un único sitio NotI entre las repeticiones flanqueantes izquierdas y derechas del ADN-T y deriva de pSDM14 (R. Offringa; PhD. Thesis "Gene targeting in plants using the Agrobacterium vector system"; Leiden University, Leiden 1992) por digestión con KpnI y BamHI y ligación con los siguientes oligonucleótidos alineados:

MGANotI: 5' -CAATGCGGCCGCTAAG- 3' (= SEQ. ID. NO. 3)

MGANotII: 5' -CATGGTTACGCCGGCGATTCCTAG- 3' (= SEQ. ID. NO. 4).

El plásmido pUR5752 se usó para introducir en el sitio NotI múltiples copias del fragmento de aproximadamente 1,5 kb con el gen de la cutinasa de Fusarium solani pisi controlado por el promotor de la endoxilanasa y una secuencia de terminación de la transcripción de A. awamori. Por lo tanto, un fragmento NotI de 17 kb procedente de pUR5725 (véase más arriba) que contenía 9 copias del cassette de expresión de la cutinasa se ligó en el sitio NotI de pUR5752. Con este procedimiento de ligación se obtuvieron los plásmidos pUR5756 (véase la Figura 12) que contiene 9 copias del cassette de expresión y pUR5755, que contiene solamente 4 copias del cassette de expresión (probablemente debido a la pérdida de copias durante la ligación por recombinación intramolecular).

Se construyó como plásmido control el plásmido pUR5753 (sin ningún gen de la cutinasa) clonando un fragmento NotI de 3,0 kb procedente de pUR5718 (véase más arriba) que contenía el gen pyrG con una deleción en 5' y secuencias corriente abajo en el sitio NotI de pUR5752. El plásmido pUR5753 es el mismo que el plásmido pUR5756 excepto que las 9 copias del gen entre los sitios HindIII están ausentes dando como resultado un plásmido que contiene los siguientes elementos: flanqueante izquierdo, sitio NotI, gen pyrG con una deleción en 5', sitio HindIII, secuencias 3' corriente abajo del gen pyrG, sitio NotI, flanqueante derecho.

Tanto el plásmido pUR5752 como el plásmido pUR5753 se pueden adaptar para introducir en el sitio NotI o en el sitio HindIII cualquier gen homólogo o heterólogo.

Transformación y análisis de los transformantes

Para la transformación de la cepa AWCSCE de A. awamori se usó la cepa LBA1126 de A. tumefaciens (Bundock & Hooykaas, PNAS 93 (1996) 15272-75; para las restricciones de uso véase más arriba) que contenía los vectores binarios pUR5753, pUR5755 y pUR5756. La transformación se llevó a cabo tal como se ha descrito más arriba en Materiales y Procedimientos para las conidiosporas, salvo que la placa con medio IM contenía además uridina 1 mM.

Se obtuvieron transformantes después de aproximadamente 7 días de incubación. La frecuencia de transformación media con 10^{6} conidiosporas fue de 17 y 30 transformantes para pUR5753 y pUR5755, respectivamente, pero de solamente 0,5 transformantes para pUR5756. Este último resultado significa que por 10^{7} conidiosporas, se pueden obtener 5 transformantes con múltiples copias del cassette de expresión de la cutinasa. Este número es notablemente elevado, ya que con la transformación tradicional de protoplastos solamente ha sido posible integrar una única copia de un gen en un locus específico, y esto con una frecuencia de aproximadamente sólo 1 - 2 transformantes por la transformación de 10^{7} protoplastos (Gouka y col.; (1995) véase más arriba).

Se purificaron dos veces una serie de transformantes en medio mínimo para Aspergillus y las conidiosporas se aislaron a partir de placas de PDA. Los transformantes se sometieron a transferencia Southern para verificar: a) el número de copias del cassette de expresión, b) el sitio de integración del cassette de expresión, y c) si se había integrado ADN fuera de las repeticiones flanqueantes del ADN-T.

El ADN genómico se digirió con BglII o SalI, los fragmentos se separaron por tamaño en un gel de agarosa al 0,7% y se transfirieron a una membrana Hybon-N. La hibridación se llevó a cabo tal como se ha descrito anteriormente usando como sonda un fragmento AflII/SacI de 0,5 kb que contiene la secuencia de terminación ex1A de A. awamori, que está presente en los cassettes de expresión de la cutinasa.

Cuando el ADN se digirió con SalI, todos los fragmentos contenían un fragmento de hibridación de aproximadamente 5 kb que se corresponde con el fragmento SalI ex1A endógeno.

Se vio que los transformantes obtenidos con pUR5755 y pUR5756 contenían un segundo fragmento de hibridación que abarca todos los cassettes de expresión Pex1A-cutinasa-Tex1A. El tamaño es indicativo del número de copias del gen presentes en el fragmento. Se vio que en las cepas ensayadas se había integrado un número variable de cassettes de expresión. Por ejemplo, 2 copias estaban presentes en las cepas nº 8, nº 9 y nº 10 transformadas con Agrobacterium que contenía ADN derivado del plásmido pUR5755 (que contenía en origen 4 copias), mientras que 4 copias estaban presentes en las cepas nº 13, nº 14, nº 15 y nº 17, 7 u 8 copias en la cepa nº 12, y 9 copias en la cepa nº 16, todas transformadas con Agrobacterium que contenía ADN derivado del plásmido pUR5756 (que contenía en origen 9 copias).

Estos resultados se confirmaron por digestión del ADN con BglII. Esta última corta una vez en el cassette de expresión, y por lo tanto todos los cassettes de expresión están representados como un solo fragmento de hibridación de 1,5 kb. La intensidad de este fragmento de hibridación es indicativa del número de copias y concordaba con los números de copias dados más arriba para los fragmentos de restricción SalI.

Además, todos los transformantes que contenían el cassette de expresión de la cutinasa contenían además un fragmento de hibridación de 1,8 kb, que es el fragmento flanqueante 5' que está hibridando con la sonda. Los patrones de integración fueron todos compatibles con una integración en el locus pyrG. Esto se confirmó también por hibridación de una membrana de ADN similar con un fragmento BamHI/HindIII de 2,4 kb que contenía el gen pyrG de A. awamori. Además, un fragmento de hibridación de 5 kb que se correspondía con el gen ex1A endógeno estaba presente en todos los transformantes. Por último, se usó un fragmento HindIII/EcoRI de 11,9 kb procedente de pUR5750 que contenía secuencias de ADN fuera de las repeticiones flanqueantes del ADN-T de A. tumefaciens para analizar la presencia probable de secuencias de ADN bacteriano. Ninguno de los transformantes mostró una señal de hibridación lo que indica que todos están libres de ADN bacteriano.

En conclusión, se demostró que A. awamori se puede transformar con una cepa de Agrobacterium tumefaciens que contenga múltiples copias de un gen modelo con frecuencias mayores que con los procedimientos tradicionales de transformación. Usando este sistema, múltiples copias de genes pueden tener como objetivo el locus pyrG sin la integración de secuencias - bacterianas - no deseadas.

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Se da información acerca del depósito de un microorganismo a tenor del Tratado de Budapest en la página 19, líneas 26-29. De acuerdo con la regla 28 (4) EPC, o un acuerdo similar para un Estado que no es un Estado Contratante de la EPC, se solicita por la presente que una muestra de dicho depósito, cuando se solicite, se entregue solamente a un experto.

Claims (9)

1. Un procedimiento para producir un moho transformado, caracterizado porque

(1)

un fragmento de ADN que contiene al menos un gen de expresión que se va a introducir en un moho se clona primero en un vector de Agrobacterium tumefaciens entre el ADN-T flanqueante presente en ese vector, en el que el ADN-T flanqueante son repeticiones directas imperfectas de 24 pares de bases que flanquean el ADN-T.

(2)

el vector que contiene el fragmento de ADN entre el ADN-T flanqueante se introduce en una cepa de Agrobacterium tumefaciens que contiene una región vir en su ADN;

(3)

liberación del ADN-T que contiene dicho fragmento de ADN de dicho Agrobacterium tumefaciens añadiendo un compuesto inductor de vir, y la cepa de Agrobacterium tumefaciens se incuba con el moho que se va a transformar; y

(4)

el moho transformado se selecciona de entre los mohos no transformados dependiendo de las características del ADN introducido o de su producto de expresión, y eventualmente el moho transformado se cultiva.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el moho pertenece al grupo Eumycota.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el moho se selecciona dentro del grupo que consiste en las subdivisiones micóticas Ascomycotina, Basidiomycotina, Deuteromycotina, Mastigomycotina y Zygomycotina.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el fragmento de ADN contiene múltiples copias del gen deseado.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el fragmento de ADN se integra en un locus seleccionado del genoma del moho.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el fragmento de ADN se integra en el locus pyrG del genoma del moho (que es conocido como locus pyrA en A. niger y locus pyr4 en Neurospora crassa).

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el moho transformado está libre de una secuencia de ADN bacteriano que comprende un ADN-T flanqueante.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el fragmento de ADN se integra de forma aleatoria en el genoma del moho.

9. Un moho transformado que se puede obtener por transformación mediada por Agrobacterium según la reivindicación 8 y dicho moho comprende en su genoma una o más partes de secuencias de ADN-T flanqueante.