CN112458110A

CN112458110A - 植物抗病基因AtIQD1的应用

Info

Publication number: CN112458110A
Application number: CN202011381230.9A
Authority: CN
Inventors: 邵志勇; 汪俏梅; 陶晗
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN112458110B

Abstract

本发明公开了AtIQD1基因的用途，提高植株对病原菌的抗性；病原菌为尖孢镰刀菌、灰霉菌和核盘菌中的至少一种。本发明构建了AtIQD1过表达拟南芥和芥蓝植株，并进行功能研究；通过尖孢镰刀菌、灰霉菌和核盘菌的接种实验，发现AtIQD1能够提高拟南芥对尖孢镰刀菌，以及拟南芥和芥蓝对灰霉菌和核盘菌的抗性。

Description

植物抗病基因AtIQD1的应用

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，涉及一个植物抗病调控基因(AtIQD1)及其应用。

背景技术：

植物在生长发育过程中，常常受到多种病原物的侵害，其中真菌性病害的种类最多，约占植物病害的70％～80％以上，对农业生产造成不可估量的损失。例如，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schl.)是一种世界性分布的土传病害病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、十字花科等植物枯萎病的发生。灰霉菌(Botrytis cinerea)和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)均是一种广寄主性的病原真菌，前者能侵染植物的茎、叶、花和果实等部位发生灰霉病，且传播速度，后者能引起的菌核病和腐烂病，是油料作物、蔬菜等作物生产过程中分布最广、危害最为严重的病害之一。目前，采用化学防控和农业防治的手段，均无法有效控制病害的发生，且成本高，对环境污染大。因此，深入挖掘抗病基因，特别是对病原菌具有广谱抗性的基因资源，从而改良植物抗病性，对于作物育种和农业生产具有重要意义。

拟南芥AtIQD1(At3g09710)编码一种以Ca²⁺依赖型方式与钙调蛋白结合的核蛋白，分子量为50kDa。目前现有的研究表明，AtIQD1能够提高拟南芥对粉纹夜蛾和蚜虫的抗性，但是关于其在抗病过程中的作用没有任何报道。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供AtIQD1基因的用途：提高植株对病原菌的抗性。该基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

作为本发明的AtIQD1基因的用途的改进：病原菌为尖孢镰刀菌、灰霉菌和核盘菌中的至少一种。

作为本发明的AtIQD1基因的用途的进一步改进：提高拟南芥对尖孢镰刀菌、灰霉菌和核盘菌的抗性。

作为本发明的AtIQD1基因的用途的进一步改进：提高芥蓝对灰霉菌和核盘菌的抗性。

本发明涉及一种能够提高植物对病原菌广谱抗性的基因AtIQD1。

本发明基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明还同时提供了含有上述基因的质粒以及含有上述基因的植物表达载体。

本发明还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞。

本发明构建了AtIQD1过表达拟南芥和芥蓝植株，并进行功能研究。通过尖孢镰刀菌、灰霉菌和核盘菌的接种实验，发现AtIQD1能够提高拟南芥对尖孢镰刀菌，以及拟南芥和芥蓝对灰霉菌和核盘菌的抗性。

附图说明：

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明；

图1是AtIQD1过表达载体pCAMBIAL-YFP1300-AtIQD1图谱。

图2是AtIQD1过表达拟南芥对尖孢镰刀菌的抗性表型。

图3是AtIQD1过表达拟南芥和芥蓝对灰霉菌的抗性表型。

图4是AtIQD1过表达拟南芥和芥蓝对核盘菌的抗性表型。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

一、AtIQD1基因克隆及过表达载体构建

在拟南芥数据库(https://www.arabidopsis.org/)中获取AtIQD1基因的蛋白编码序列(Coding sequence,CDS)，用primer premiere 5.0软件设计扩增引物

下划线部分为XbaI酶切位点，斜体为保护碱基)和

下划线部分为SpeI酶切位点，斜体为保护碱基)。采用TRIZOL法提取拟南芥叶片总RNA，反转录成cDNA，用上述引物PCR扩增AtIQD1的CDS片段(不包含终止子)。PCR反应体系参照TOYOBO公司高保真酶KOD FX的说明书，反应程序如下：94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸1min 30s，35个循环；最后68℃终延伸5min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收纯化。

AtIQD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，其所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所述。

用XbaI和SpeI双酶切PCR片段，以及植物表达载体pCAMBIAL1300-YFP，将片段和载体连接后，热激转化大肠杆菌DH5α，用含有抗生素Kan的LB固体培养基进行筛选。挑取培养基上的单菌落，通过菌落PCR鉴定阳性克隆，过夜摇菌，提取质粒，最后送公司测序。将正确的重组质粒命名为pCAMBIAL-YFP1300-AtIQD1(见图1)。

二、拟南芥和芥蓝转基因植株创制

将构建完成的过表达载体转入农杆菌感受态LBA4404中，具体方法参照LBA4404Chemically Component Cell(上海唯地)产品说明书。

拟南芥遗传转化以野生型Col-0为野生型，转化方法参照Clough和Bent(1998)的方法。

Clough,S.J.and Bent,A.F.(1998)Floral dip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16,735–743.(Clough,S.J.and Bent,A.F.(1998)浸花法：一种农杆菌介导的拟南芥转化的简易方法。植物杂志，16，735–743)。

芥蓝的遗传转化以商业品种芥蓝-27(JL-27)为野生型，转化方法如下：

(1)无菌外植体的获得

挑取颗粒饱满的芥蓝种子，用75％的酒精消毒2min，用无菌水快速冲洗3次；再用40％的漂白水(例如为花王漂白水)浸泡10min，用无菌水冲洗7次，之后用无菌滤纸吸干水分，均匀播在播种培养基(1/2MS+1％蔗糖+0.8％琼脂)中。播种后先放置在生化培养箱中暗催芽2d，露白后转至25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养。约5d即可获得外植体。

(2)预培养

切取带1～2mm叶柄的子叶，插入预培养基(MS+0.02mg/L NAA+2mg/L 6-BA+1％蔗糖+0.8％琼脂)，放回原培养环境培养2d。

(3)制备侵染液

挑取含目的基因的农杆菌单菌落，接种于5mL含有抗生素(25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)的YEB液体培养基中，28℃，200rpm小摇过夜；以1:100比例扩大培养，相同条件下摇菌至OD₆₀₀＝0.6～0.8；收集菌液，3,000rpm离心10min，获得菌体沉淀；倒掉上清液，加等量MS液体培养基重悬菌体，即可用来侵染。

(4)侵染共培养

将侵染液倒入无菌培养皿中，将预培养基中的外植体浸没在侵染液中10min，之后用无菌滤纸吸干多余菌液，插入原培养基中，暗培养2～3d。

(5)筛选抗性芽

将共培养的外植体转入筛选培养基(MS+0.02mg/L NAA+2mg/L 6-BA+5mg/L潮霉素+200mg/L特美汀+1％蔗糖+0.8％琼脂)，置于25℃，16h光照/8h黑暗条件下诱导愈伤组织和抗性芽。

(6)诱导生根

待抗性芽长出后，切下，放入生根培养基(MS+0.1mg/L NAA+5mg/L Hyg+200mg/LTim+1％蔗糖+0.8％琼脂)诱导生根。

(7)转基因植株鉴定以及纯合株系的获取

待抗性芽长出根系后，将无菌苗开盖炼苗，最后移栽到培养基中正常培养，获取T₀代种子，同时，利用PCR和RT-qPCR检测抗性苗中AtIQD1基因的存在和表达情况。将T₀代种子进行表面消毒，播在含有5mg/L Hyg的1/2MS培养基上，选择抗性：非抗性接近于3:1(说明是单拷贝)的株系的抗性苗，继续进行单株留种，获得T₁代种子。将T₁代种子继续播在同样的抗性培养基上，选择抗性不分离的种子，即可作为试验材料。通过以上步骤，获得AtIQD1单基因插入、过量表达且稳定遗传的转基因芥蓝株系，记为AtIQD1-OX。

三、AtIQD1过表达植株抗病性分析

以上述步骤二所得的AtIQD1-OX作为AtIQD1过表达植株，以野生型Col-0/JL-27作为对照植株。

1、AtIQD1过表达植株对尖孢镰刀菌的抗性分析

将分离的尖孢镰刀菌接种于PDA培养基上，倒置于25℃生化培养箱培养约7d。用刀片刮取分生孢子，用灭菌水重悬，用四层纱布过滤除去菌丝，之后用血球计数板调整孢子浓度至10⁶个/mL，即获得侵染液。对于拟南芥，取5周大小的植株，将其轻轻连根拔起，并浸在侵染液中15s，之后重新定植。侵染植株置于12h光照/12h黑暗，27℃条件下培养，接种后4-5d观察其发病情况。如图2所示，在尖孢镰刀菌接菌第5d，对照植株表现出叶片脱落、黄化、萎蔫的症状，发病严重的植株已死亡，而AtIQD1过表达植株的叶片仅出现部分黄化，且生长良好，此结果说明，AtIQD1过表达提高了拟南芥对尖孢镰刀菌的抗性。

2、AtIQD1过表达植株对灰霉菌的抗性分析

将分离的灰霉菌(Botrytis cinerea)接种于V8固体培养基(36％(v/v)V8果汁+0.2％(m/v)CaCO₃+2％(m/v)琼脂)，在25℃和黑暗下倒置培养10d左右至产生大量孢子。用刀片刮取灰霉菌的孢子和菌丝，转移到孢子悬浮液(4％麦芽糖(m/v)和1％(m/v)蛋白胨)中，用4层纱布过滤，并用血球计数板调整孢子浓度至10⁵个/mL，即获得侵染液。对于拟南芥，取5周大小的植株，将侵染液均匀喷施在莲座叶上，之后将植株保湿，放置在22℃，10h光照/14h黑暗的条件下培养，接种后4-5d观察发病情况。如图3A所示，在灰霉菌侵染后第5d，对照植株叶片黄化甚至死亡，而AtIQD1过表达植株生长良好，叶片仅部分失绿，由此可见，AtIQD1过表达提高了拟南芥对灰霉菌的抗性。

对于芥蓝，取5周大小的芥蓝植株相同位置的叶片，用移液枪在叶片的相同位置滴上10μL灰霉菌侵染液，置于高湿，25℃，16h光照/8h黑暗的条件下培养，接种后4-5d观察叶片发病情况。如图3B所示，在灰霉菌侵染第5d，对照植株叶片变黄并出现较大面积的发病区域，而AtIQD1异源过表达的芥蓝叶片保持绿色，且仅在接菌部位出现小面积病斑。由此可见，AtIQD1异源过表达提高了芥蓝对灰霉菌的抗性。

3、AtIQD1过表达植株对核盘菌的抗性分析

将生长强势的核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)接种在PDA培养基上，置于25℃和黑暗条件下培养4d。用孔径为3mm的打孔器在长有核盘菌的培养基上打孔，菌丝面朝下贴在5周大小的拟南芥莲座叶上或芥蓝植株叶片上，置于22℃，10h光照/14h黑暗，相对湿度95％条件下培养，24h后湿度降为85％，接菌后4-5d观察发病情况。如图4A所示，在核盘菌接菌第5d，对于对照植株而言，接菌叶片(箭头所指)已彻底腐烂，腐烂叶片薄而透明，被菌丝覆盖，并且菌丝已蔓延到相邻的未接种的叶片。而对于AtIQD1过表达植株，仅接种叶片被病斑覆盖，且发病症状明显较对照轻。由此可知，AtIQD1过表达提高了拟南芥对核盘菌的抗性。

芥蓝叶片在核盘菌接种后，以接种位置为中心，逐渐出现圆形褐色病斑。可根据病斑的大小判断植株对核盘菌的抗性。如图4B所示，在接种后第5d，相较于对照，AtIQD1过表达芥蓝叶片上的病斑大小明显小于对照，表明AtIQD1异源过表达同样提高了芥蓝对核盘菌的抗性。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 植物抗病基因AtIQD1的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atggttaaaa aagcgaaatg gctgaaaaac gttaaaaagg cttttagccc agattcaaag 60

aagttgaaac acgaatctgt tgagtgtcaa gatagtgtaa tctcttaccc tgtcttgata 120

gccacatcca gaagttcttc tcctcagttt gaagttagag ttgatgaggt caactatgaa 180

cagaagaaga atctgtatcc tccttcttca gattctgtga ctgctactgt tgcacatgtt 240

cttgtagatt ctcctccatc ttctcctgaa tctgtccatc aagctatagt tgttaataga 300

tttgcaggca agtcaaagga agaagcagct gccatcttaa tccagtctac gtttaggggc 360

catttggcaa gaagagaatc gcaggtgatg agggggcagg aaagacttaa gttactgatg 420

gaaggatcgg ttgtacaacg gcaagctgca attactctta aatgtatgca gacgctctct 480

cgtgtacagt cacaaatccg atctaggaga atcaggatgt cagaagagaa tcaggctcga 540

cataagcaac ttcttcagaa gcatgccaaa gagctaggag gcttaaagct tttcatgcgg 600

ttgtttaaat ttatcgttgt ctcttctgat aatgggggta attggaacta cagcaatcag 660

tcaaaggaac aagttgaagc aggtatgttg cacaagtacg aggcaacaat gagaagggaa 720

agggcattgg cttatgcatt cacacatcag caaaacttga agagcttctc gaaaactgca 780

aatccgatgt tcatggatcc tagcaacccg acttggggtt ggagctggtt agagaggtgg 840

atggctggcc ggccatggga gagttcagag aaagaacaaa acaccaccaa caacgacaac 900

tcctcggtta agaactcgac taaccgtaat tcccaaggag gagaaacagc aaaatcttca 960

aaccgcaaca aactcaatag ctcgactaaa cccaataccc catcagcatc atccacagcc 1020

accagaaacc cgagaaagaa gcggcccatc ccatcgtcca taaaatccaa aagcagtgat 1080

gatgaggcca agagctcgga gaggaaccgt aggcccagca ttgctaggcc atcggttagt 1140

gatgacgaga ccctgagtag ctcaactgct aggcgtagta gcaatctgat tcctacaaca 1200

aaatcagcac gaggcaagcc caagtctcaa acctcatcac gagtagcggt gaccacatcc 1260

acaacagagg aaagcagtat attaccggag aaagcaccag caaagaaacg gctctccacc 1320

tcggcttcac ctgcacccaa acccagacga tcctccgccc cgccaaaggt ggaaaaaggc 1380

gttctcaagg cagagagaac gccgtga 1407

<210> 2

<211> 468

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Met Val Lys Lys Ala Lys Trp Leu Lys Asn Val Lys Lys Ala Phe Ser

1 5 10 15

Pro Asp Ser Lys Lys Leu Lys His Glu Ser Val Glu Cys Gln Asp Ser

20 25 30

Val Ile Ser Tyr Pro Val Leu Ile Ala Thr Ser Arg Ser Ser Ser Pro

35 40 45

Gln Phe Glu Val Arg Val Asp Glu Val Asn Tyr Glu Gln Lys Lys Asn

50 55 60

Leu Tyr Pro Pro Ser Ser Asp Ser Val Thr Ala Thr Val Ala His Val

65 70 75 80

Leu Val Asp Ser Pro Pro Ser Ser Pro Glu Ser Val His Gln Ala Ile

85 90 95

Val Val Asn Arg Phe Ala Gly Lys Ser Lys Glu Glu Ala Ala Ala Ile

100 105 110

Leu Ile Gln Ser Thr Phe Arg Gly His Leu Ala Arg Arg Glu Ser Gln

115 120 125

Val Met Arg Gly Gln Glu Arg Leu Lys Leu Leu Met Glu Gly Ser Val

130 135 140

Val Gln Arg Gln Ala Ala Ile Thr Leu Lys Cys Met Gln Thr Leu Ser

145 150 155 160

Arg Val Gln Ser Gln Ile Arg Ser Arg Arg Ile Arg Met Ser Glu Glu

165 170 175

Asn Gln Ala Arg His Lys Gln Leu Leu Gln Lys His Ala Lys Glu Leu

180 185 190

Gly Gly Leu Lys Leu Phe Met Arg Leu Phe Lys Phe Ile Val Val Ser

195 200 205

Ser Asp Asn Gly Gly Asn Trp Asn Tyr Ser Asn Gln Ser Lys Glu Gln

210 215 220

Val Glu Ala Gly Met Leu His Lys Tyr Glu Ala Thr Met Arg Arg Glu

225 230 235 240

Arg Ala Leu Ala Tyr Ala Phe Thr His Gln Gln Asn Leu Lys Ser Phe

245 250 255

Ser Lys Thr Ala Asn Pro Met Phe Met Asp Pro Ser Asn Pro Thr Trp

260 265 270

Gly Trp Ser Trp Leu Glu Arg Trp Met Ala Gly Arg Pro Trp Glu Ser

275 280 285

Ser Glu Lys Glu Gln Asn Thr Thr Asn Asn Asp Asn Ser Ser Val Lys

290 295 300

Asn Ser Thr Asn Arg Asn Ser Gln Gly Gly Glu Thr Ala Lys Ser Ser

305 310 315 320

Asn Arg Asn Lys Leu Asn Ser Ser Thr Lys Pro Asn Thr Pro Ser Ala

325 330 335

Ser Ser Thr Ala Thr Arg Asn Pro Arg Lys Lys Arg Pro Ile Pro Ser

340 345 350

Ser Ile Lys Ser Lys Ser Ser Asp Asp Glu Ala Lys Ser Ser Glu Arg

355 360 365

Asn Arg Arg Pro Ser Ile Ala Arg Pro Ser Val Ser Asp Asp Glu Thr

370 375 380

Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Arg Ser Ser Asn Leu Ile Pro Thr Thr

385 390 395 400

Lys Ser Ala Arg Gly Lys Pro Lys Ser Gln Thr Ser Ser Arg Val Ala

405 410 415

Val Thr Thr Ser Thr Thr Glu Glu Ser Ser Ile Leu Pro Glu Lys Ala

420 425 430

Pro Ala Lys Lys Arg Leu Ser Thr Ser Ala Ser Pro Ala Pro Lys Pro

435 440 445

Arg Arg Ser Ser Ala Pro Pro Lys Val Glu Lys Gly Val Leu Lys Ala

450 455 460

Glu Arg Thr Pro

465

Claims

1.AtIQD1基因的用途，其特征在于：提高植株对病原菌的抗性。

2.根据权利要求1所述的AtIQD1基因的用途，其特征在于：所述病原菌为尖孢镰刀菌、灰霉菌和核盘菌中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的AtIQD1基因的用途，其特征在于：提高拟南芥对尖孢镰刀菌、灰霉菌和核盘菌的抗性。

4.根据权利要求1或2所述的AtIQD1基因的用途，其特征在于：提高芥蓝对灰霉菌和核盘菌的抗性。