CN104878027A

CN104878027A - 漾濞大泡核桃核糖核酸酶基因JsRNase及应用

Info

Publication number: CN104878027A
Application number: CN201510244601.1A
Authority: CN
Inventors: 刘迪秋; 韩青; 陈朝银; 陈瑞; 葛锋
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2015-05-14
Filing date: 2015-05-14
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2035-05-14
Also published as: CN104878027B

Abstract

本发明公开了漾濞大泡核桃核糖核酸酶基因JsRNase及应用，JsRNase基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码核糖核酸酶，本发明通过功能基因组学相关技术研究证实JsRNase基因具有提高植物抗真菌侵染的功能，将本发明抗真菌JsRNase基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性；JsRNase超表达的转基因烟草对胶孢炭疽菌、核盘菌、尖孢镰刀菌以及串珠状赤霉菌的生长具有明显的抑制作用。

Description

漾濞大泡核桃核糖核酸酶基因JsRNase及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是具有抗真菌活性的漾濞大泡核桃核糖核酸酶基因JsRNase及应用。

背景技术

植物病害在农业生产中是一个非常棘手的问题，人类与植物病害的斗争贯穿于农业的发展与进步之中。兴起于20世纪初期的经典遗传学使人们能够通过杂交育种成功地培育出新的抗病品种，大幅度地提高粮食产量。近年来，随着分子生物学理论和技术的不断发展完善，人们能够通过基因工程这一现代生物技术直接、快速和高效地培育抗病新品种和新材料，是提高植物抗病性的一种新方法。

核糖核酸酶(Ribonucleases, RNase)可以分解RNA，普遍存在于各种生物体内，包括病毒、细菌、真菌、原生动物、动物和植物。根据序列同源性以及最适pH，RNase被分为碱性核糖核酸酶(Alkaline RNase)Ⅰ和酸性核糖核酸酶(Acid RNase)Ⅱ两类。第Ⅰ类的RNase的最适pH为7.0~8.0，根据来源、分子量以及作用位点特异性，第Ⅰ类又分为A (RNase T1家族)和B亚类(RNase A家族。亚类A的成员主要是来源于微生物，分子量为11~12 kDa，作用底物有鸟苷酸特异性；亚类B成员主要来源于脊椎动物，分子量约为14 kDa，作用底物具有嘧啶特异性。第Ⅱ类只包含T2类RNase，即RNase T2家族，最适pH为4.0~5.0，分子量大于20 kDa，一般为24~36 kDa，此类RNase的分布较广，且没有发现其作用底物的特异性(Deshpande RA, Shankar V. Ribonucleases from T2 family. Critical reviews in microbiology. 2002, 28: 79–122.)。

植物RNase T2家族分为两个不同的亚类：S-RNases和S-like RNases。雌蕊等植物组织是病原菌营养的丰富来源，产生于雌蕊的RNases与蛋白酶抑制剂和其他植物防御蛋白结合起来抵御病原菌侵染植物(Green PJ. The ribonucleases of higher plants. Annual review of plant biology. 1994, 45: 421–445.)。在植物种子中发现的S-like RNases，如来自苦瓜(Momordica charantia)的RNase MC1，来自丝瓜(Luffa cylindrica)的RNase LC1和LC2等，作者认为它们可以保护种子免遭病原菌的侵害(Irie M. Structure-function relationships of acid ribonucleases: lysosomal, vacuolar, and periplasmic enzymes. Pharmacology & therapeutics. 1999, 81: 77–89.)。

Galiana等人发现烟草(Nicotiana tabacum)叶片接种病原真菌Phytophthora parasitica var. nicotianae后，烟草胞外编码S-like RNase NE的基因快速表达，且该蛋白的活性可以抑制真菌的侵入(Galiana E, Bonnet P, Conrod S, et al. RNase activity prevents the growth of a fungal pathogen in tobacco leaves and increases upon induction of systemic acquired resistance with elicitin. Plant Physiology. 1997, 115: 1557–1567.)。黑胫病菌(P. parasitica)的侵染可以诱导烟草核糖核酸酶RNase NE基因的表达，纯化的RNase NE蛋白能在体外抑制黑胫病菌和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)游动孢子的菌丝生长，外源施加RNase NE蛋白也能抑制烟草叶片上真菌菌丝的生长(Hugot K, Ponchet M, Marais A, et al. A tobacco S-like RNase inhibits hyphal elongation of plant pathogens. Molecular plant-microbe interactions. 2002, 15: 243–250.)。

本发明中核糖核酸酶基因JsRNase来自漾濞大泡核桃(Juglans sigillata Dode)。漾濞大泡核桃是目前云南主要的核桃栽培品种，具有果大、壳薄、仁白、味香、出油率高、营养丰富等优点，并对病原真菌胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)具有较强的抗性。

发明内容

本发明的目的是提供一种从漾濞大泡核桃中克隆获得具有抗真菌活性的核糖核酸酶的全长基因JsRNase，JsRNase的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因全长为943 bp，包含一个684 bp的开放阅读框、76 bp的5′非翻译区(untranslated regions，UTR)及183 bp的3′UTR，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明所述核糖核酸酶基因JsRNase的编码区是序列表SEQ ID NO：1中第77-760位所示的核苷酸序列。

本发明分离克隆漾濞大泡核桃的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中过量表达，并通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为JsRNase。

植物S-like RNase为核糖核酸酶T2家族成员，参与植物磷酸回收、植物衰老和抗逆等生理过程。RNase在生物和非生物胁迫下诱导表达，在防卫反应中起重要作用，能抵抗病毒、真菌等病原物的侵染，是植物防御系统中重要的组成成分，超表达RNase基因能提高转基因植物的抗病性。

本发明涉及分离包含JsRNase的DNA片段并鉴定其功能，具有该基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌入侵的表型。其中所述DNA片段如序列表所示，对该基因进行分析，表明JsRNase全长cDNA为943 bp，包含一个684 bp的开放阅读框、76 bp的5′UTR及183 bp的3′UTR，其中ORF编码一个具有227个氨基酸的蛋白质。JsRNase编码蛋白具有RNase T2家族的保守结构域，与来自白梨(pyrus bretschneideri)、川桑(Morus notabilis)和苹果(Malus domestica)以及其他植物的RNase蛋白具有较高相似性，这表明其属于漾濞大泡核桃中的核糖核酸酶基因。超表达序列表SEQ ID NO ：1所示序列可以增强烟草对胶孢炭疽菌、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)以及串珠状赤霉菌(Gibberella moniliformis)的抗性。

上述JsRNase基因可以应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下：

(1)采用扩增JsRNase的特异引物，从接种胶孢炭疽菌后的漾濞大泡核桃叶中提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增出JsRNase的全长编码区，然后将其连接到pMD-18T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆。

(2)用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切pMD18-T-JsRNase载体和植物表达载体pCAMBIA2300S，通过胶回收得到目的基因片段和载体大片段，再将所获得JsRNase基因片段与pCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达。

(3)以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到阳性转基因植株，分析转基因植株对于病原真菌的抗性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明中来自漾濞大泡核桃的JsRNase基因能增强植物对几种病原真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产作物、花卉等提供方便，减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减少环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中部分JsRNase转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果，其中Marker：DL2000 DNA Marker (大连宝生物)，由2,000 bp、1,000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及100 bp六条DNA片段组成；正对照：质粒pMD18-T-JsRNase为模板的PCR反应；WT：非转基因烟草(野生型)总DNA为模板进行的PCR；

图2是本发明中部分阳性JsRNase转基因烟草中JsRNase转录水平的表达分析结果，其中Marker：DL2000 DNA Marker(大连宝生物)；WT：非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；正对照：质粒pMD18-T-JsRNase为模板的PCR产物；

图3是本发明中JsRNase转基因烟草体外抗真菌活性的抑菌效果图；其中a、b、c、d图示中的真菌分别是核盘菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌以及尖孢镰刀菌；WT为野生型烟草的总蛋白；CK为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：JsRNase全长cDNA克隆以及序列分析

用胶孢炭疽菌接种漾濞大泡核桃，用接种后4 h的叶提取总RNA，用液氮将处理过的漾濞大泡核桃的叶研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA。采用逆转录酶M-MLV (promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5 μg总RNA，依次加入50 ng oligo (dT)，2 μL dNTP Mix (2.5mM each)，用DEPC水将反应体积补齐至14.5μL；混匀后，70℃加热变性5 min后迅速在冰上冷却5 min，然后依次加入4μL 5×First-stand buffer、0.5μL RNasin (200U)、1 μL M-MLV (200U)，混匀并简短离心，42℃温浴1.5 h，取出后70℃加热10 min，终止反应。cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因JsRNase，所用上下游引物序列分别为5￠-ACCCACATTACAGCAAAAGATAGAC-3￠及5￠-ATTACAGTGGTTACTTGAATTGATGA-3￠。采用Advantage^TM 2 PCR Enzyme (Clontech)扩增出目的基因。PCR反应条件：95℃ 1 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 50 s，32个循环；72℃ 5 min。反应体系(20 μL)为1 μL cDNA、2 μL 10×Advantage 2 PCR Buffer、1.8 μL dNTP Mix(10 mM each)、0.2 μL正向引物(10 μM)、0.2 μL反向引物(10 μM)、0.2 μL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、14.6 μL PCR-Grade water；PCR结束后，取8 μL进行琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小。

所得到PCR产物只有一条DNA带，故直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pMD18-T vector kit (大连宝生物)，反应体系和操作过程为：取1.5 μL PCR产物，依次加入1 μL pMD18-T vector (50 ng/μL)和2.5 μL 2×Ligation solution I，混匀后置于16℃过夜反应。通过热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态中。用含有氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增JsRNase的特异引物检测多克隆位点插入JsRNase的克隆。将得到的阳性克隆进行测序，最终获得的JsRNase全长cDNA为943 bp，通过NCBI ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析发现其包含一个684 bp的开放读码框(见序列表)。JsRNase编码一个含227个氨基酸的蛋白质JsRNase，其分子量约为25.27 KDa，等电点为5.12。借助生物信息学软件SignalP4.1分析JsRNase编码的蛋白序列，检测其是否具有N端信号肽。结果显示在JsRNase的N端存在信号肽，因此推测该蛋白是分泌蛋白。

实施例2：植物超表达载体构建

采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取插入JsRNase的大肠杆菌质粒pMD18-T-JsRNase以及植物表达载体pCAMBIA2300S质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低。用限制性内切酶EcoRI (TaKaRa)和BamHI (TaKaRa)分别对质粒pMD18-T-JsRNase和pCAMBIA2300S进行双酶切(100 μL体系)，反应体系和操作过程为：分别取20 μL pMD18-T-JsRNase和pCAMBIA2300S质粒、依次加入10 μL 10×K buffer、5 μL EcoRI、5 μL BamHI、60 μL ddH₂O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应。将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒 (上海生工)对JsRNase片段和pCAMBIA2300s载体大片段分别进行胶回收，取1 μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，其余回收产物置于-20℃保存备用。

利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，将回收的JsRNaseDNA片段和pCAMBIA2300S载体片段连接起来，反应体系(20 μL)和操作过程为：取10 μL JsRNaseDNA片段依次加入2 μL pCAMBIA2300S载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μL ddH₂O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50 mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增JsRNase的特异引物进行PCR，挑选出JsRNase与pCAMBIA2300S成功连接的克隆，向检测获得的阳性菌株中加入甘油并置于-80℃保存备用。

采用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒(上海生工)提取并纯化上述大肠杆菌DH5α中的pCAMBIA2300S-JsRNase质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300S-JsRNase转入所制备的根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取2μg pCAMBIA2300S-JsRNase质粒加入含有200 μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5 min，随后转入液氮中冷冻1 min，然后迅速置于37℃水浴5 min，再冰浴2 min，之后加入500 μL LB液体培养基于28℃振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃倒置培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增JsRNase的特异性引物进行PCR反应，检测pCAMBIA2300S-JsRNase是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草(N. tabacum L.)。将烟草种子用75%的酒精浸泡30 s，无菌水洗涤后用0.1%的HgCl₂浸泡8 min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28℃暗培养5-8 d，发芽后转至光照培养箱(25℃，16 h/d光照)，以后每月用MS培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-JsRNase质粒的农杆菌LBA4404菌种，取20 μL接种于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1 mL浑浊的菌液至含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃培养48 h。随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃振荡培养5-8 h以活化农杆菌。

取烟草无菌烟草幼嫩叶片切成约1 cm²的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，25℃浸染15 min。用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，将叶盘置于共培养基上，22℃无光条件下共培养2天。烟草转化的共培养基为MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂+50 mg/L Km+200 mg/L 头孢霉素(cefotaxime sodium salt，Cef)；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养(25℃，16 h/d光照，8 h/d黑暗)。待烟草长出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/L Cef的MS培养基继代培养。因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选。将烟草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗做进一步的检测。

采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，取1 μL所得基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度。以转基因植株的基因组DNA为模板用JsRNase的特异引物进行PCR反应。PCR结束后，取8 μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株。部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，JsRNase转基因烟草共筛选到27株阳性转基因植株。

实施例4：转基因烟草中JsRNase的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

分别取阳性转基因植株以及非转基因烟草(野生型)的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDNA第一链，并以此为模板用扩增JsRNase的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基因植株中JsRNase转录水平的表达量。总RNA提取以及RT-PCR的方法与实施例1中相同。PCR结束之后，取8 μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到17个转基因单株中JsRNase在转录水平大量表达，这些单株的编号为1～17。

将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基(200 g/L马铃薯，15 g/L琼脂，20 g/L葡萄糖)上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3 cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。供试真菌共有8种：胶孢炭疽菌、核盘菌、葡萄座腔菌(Botrosphaeria dothidea)、串珠状赤霉菌、尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌(F. solani)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、轮枝镰刀菌(F. verticillioides)。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作。首先取1 g转基因烟草单株(编号分别为1、6、8、10)及野生型叶片放入研钵中，加入1 mL蛋白提取液(1 M NaCl，0.1 M 乙酸钠，1% PVP，pH 6)，充分研磨。转入1.5 mL离心管中，混匀后4℃静置过夜。4℃离心30 min (12,000 g)，取上清于新的1.5 mL离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2 μg/μL，然后分别取20 μL滴于各真菌培养基的无菌滤纸上。在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照(蛋白提取液)。28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价JsRNase转基因烟草的体外抗真菌活性。结果如图3所示，JsRNase转基因烟草蛋白对胶孢炭疽菌、核盘菌、尖孢镰刀菌以及串珠状赤霉菌的生长具有明显的抑制作用。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 漾濞大泡核桃核糖核酸酶基因JsRNase及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 943

<212> DNA

<213> JuglanssigillataDode

<220>

<221> mRNA

<222> (1)..(943)

<220>

<221> 5'UTR

<222> (1)..(76)

<220>

<221> CDS

<222> (77)..(760)

<220>

<221> 3'UTR

<222> (761)..(943)

<400> 1

ggggatcatt aatataccaa cccacattac agcaaaagat agactgtgag agtgtgagag 60

agagagagag agagagatgg ggcacaagta ctgttcaatc ttgttcaagc ttttaatact 120

acaatgtctg tcgcttctat gtgtttccca ggacttcgat ttcttctact ttgtccagca 180

gtggccagca tcgtactgtg acacaaagca gagttgttgc tacccaacga gcgggaagcc 240

tgcagcagac ttcagcattc acgggctttg gcctaattac aaggatggct cctacccttc 300

aaactgcgat gccgatagcc ctttcaatca agctgagtta tcagacctcg caagcaatat 360

gcaaaaaaat tggccatcac tggcatgccc aagcagcaat agcgtagggt tctggacaca 420

cgagtgggtg aaacatggca catgctcaga gtctgtcctc gaccaacatg gatacttcgc 480

atcagctctc aacctcaaac agagatcaag cctcctccaa tctcttaaca gagcaggaat 540

agaggcagat gggaaatctt acagcctaca aaacatcaag gaagccttaa aagaagcaat 600

tgggtatact ccatggatag agtgcaatac ggatgcttcg ggtaacagcc agctttacca 660

gatctacctg tgcgtggata cttctggatc agacttcatc gaatgtcctg tgtttcccaa 720

gggaaaatgc agttcagcga ttgagttccc ttcattttaa gattgtgaac gatccatgtt 780

atctgtttaa tttctttgat catccactga tcatcaattc aagtaaccac tgtaatgatc 840

gtcaatttat gtatacccgc ccgcaggctg cagcttgttg gatggaaata agttttcata 900

tatgaaaatc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 943

<210> 2

<211> 227

<212> PRT

<213> JuglanssigillataDode

<400> 2

Met Gly His Lys Tyr Cys Ser Ile Leu Phe Lys Leu Leu Ile Leu Gln

1 5 10 15

Cys Leu Ser Leu Leu Cys Val Ser Gln Asp Phe Asp Phe Phe Tyr Phe

20 25 30

Val Gln Gln Trp Pro Ala Ser Tyr Cys Asp Thr Lys Gln Ser Cys Cys

35 40 45

Tyr Pro Thr Ser Gly Lys Pro Ala Ala Asp Phe Ser Ile His Gly Leu

50 55 60

Trp Pro Asn Tyr Lys Asp Gly Ser Tyr Pro Ser Asn Cys Asp Ala Asp

65 70 75 80

Ser Pro Phe Asn Gln Ala Glu Leu Ser Asp Leu Ala Ser Asn Met Gln

85 90 95

Lys Asn Trp Pro Ser Leu Ala Cys Pro Ser Ser Asn Ser Val Gly Phe

100 105 110

Trp Thr His Glu Trp Val Lys His Gly Thr Cys Ser Glu Ser Val Leu

115 120 125

Asp Gln His Gly Tyr Phe Ala Ser Ala Leu Asn Leu Lys Gln Arg Ser

130 135 140

Ser Leu Leu Gln Ser Leu Asn Arg Ala Gly Ile Glu Ala Asp Gly Lys

145 150 155 160

Ser Tyr Ser Leu Gln Asn Ile Lys Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Gly

165 170 175

Tyr Thr Pro Trp Ile Glu Cys Asn Thr Asp Ala Ser Gly Asn Ser Gln

180 185 190

Leu Tyr Gln Ile Tyr Leu Cys Val Asp Thr Ser Gly Ser Asp Phe Ile

195 200 205

Glu Cys Pro Val Phe Pro Lys Gly Lys Cys Ser Ser Ala Ile Glu Phe

210 215 220

Pro Ser Phe

225

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acccacatta cagcaaaaga tagac 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attacagtgg ttacttgaat tgatga 26

Claims

1.一种漾濞大泡核桃核糖核酸酶基因JsRNase，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO ：1所示。

2.权利要求1所述的漾濞大泡核桃核糖核酸酶基因JsRNase在提高烟草对胶孢炭疽菌、核盘菌、尖孢镰刀菌、串珠状赤霉菌抗性中的应用。

3.根据权利要求2所述的漾濞大泡核桃核糖核酸酶基因JsRNase的应用，其特征在于提高烟草的真菌抗性的具体操作如下：

（1）将漾濞大泡核桃核糖核酸酶基因JsRNase与植物超表达载体pCAMBIA2300S连接，构建植物超表达载体；

（2）将上述构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中；

（3）以重组载体T-DNA上具有的卡那霉素抗性基因来筛选转化子，并通过聚合酶链式反应筛选获得阳性转基因植株，接种特定病原真菌，分析转基因烟草蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。