CN115725541A - 一种紫花苜蓿果胶乙酰酯酶MsPAE12及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿果胶乙酰酯酶MsPAE12及其编码基因和应用，所述果胶乙酰酯酶MsPAE12氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码基因序列如SEQ IDNO：1所示，此外，本发明还提供了果胶乙酰酯酶MsPAE12蛋白及其编码基因在增加紫花苜蓿分枝数目中的应用以及其核苷酸序列、氨基酸序列、克隆载体、表达载体或宿主细胞在基因工程中的应用。本发明利用基因工程技术实现了MsPAE12转基因植株的培育，显著增加了植株的分枝数目，为紫花苜蓿新品种的培育和育种工作提供了重要的理论依据，具有很大的应用价值。

Description

一种紫花苜蓿果胶乙酰酯酶MsPAE12及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种紫花苜蓿果胶乙酰酯酶MsPAE12及其编码基因在促进植物分枝中的应用。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是豆科苜蓿属多年生草本植物，具有产草量高、品质优良、适应性强、适口性好等特点，同时具有保持水土、改良沙滩地等保护功能，在畜牧业生产和保护生态环境中发挥着重要作用。

果胶乙酰酯酶(Pectin acetylesterase,PAE)是一种碳水化合物酯酶，作用于半乳糖醛酸的C-2或C-3羧基基团，切割乙酰酯键释放乙酸，使果胶乙酰化。果胶乙酰化改变果胶组分的理化性质，影响果胶的溶解度，对细胞的粘连和细胞壁的结构具有决定性作用。植物PAE参与植物生长发育和防御胁迫的许多过程，包括果实硬度、花粉管和花粉粒的形成、植物对疫霉菌、蚜虫的抗性等等。尽管已获得多个植物PAE基因(如拟南芥、大豆、苹果等)，但对该类酶的功能研究仅限于少数植物中。目前，鲜有与紫花苜蓿PAE编码基因序列相关报道。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种新的能够有效改变植株株型、尤其是增加分枝数目的果胶乙酰酯酶，并实现对植物产量的提高、尤其是促进植物分枝的育种工作的提高。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提供一种果胶乙酰酯酶，具调节植物生长素含量，促进分枝的功能特性。

为实现上述目的，本发明提供了一种紫花苜蓿果胶乙酰酯酶MsPAE12，所述MsPAE12蛋白为A1或A2或A3或A4：

A1、氨基酸序列如序列SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

A2、将A1经过1～22个氨基酸的缺失、插入和/或取代得到的蛋白质；

A3、在A1所述蛋白质的C端和/或N端添加1～20个氨基酸得到的蛋白质；

A4、与A1具有94.9％以上同源性的蛋白质。

本发明的第二个方面是提供所述的紫花苜蓿果胶乙酰酯酶MsPAE12的蛋白在改变植物分枝数目的应用。

本发明的第三个方面是提供所述的紫花苜蓿果胶乙酰酯酶MsPAE12的编码基因，所述编码基因包括如核苷酸序列SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述核苷酸序列为B1或B2或B3或B4：

B1、具有如SEQ ID NO.1第1～1278位所示的序列；

B2、与B1有95.5％以上同源性的序列；

B3、能与A1进行杂交的序列；

B4、将B1中1～58个核苷酸的进行缺失、插入和/或取代得到的序列。

优选地，所述核苷酸序列通过紫花苜蓿克隆和/或人工合成方法获得。

本发明的第三个方面是提供所述的编码基因在改变植物分枝数目的应用。

进一步地，所述应用包括：构建含有所述果胶乙酰酯酶MsPAE12的所述编码基因的表达载体；转化植物宿体；培育筛选得到转基因植株。

优选地，所述植物宿体为植物组织或植物细胞。

本发明的四个方面是提供一种培育MsPAE12过表达转基因植株的方法，包括：构建含有如权利要求3或4所述果胶乙酰酯酶MsPAE12编码基因的表达载体；将构建的所述表达载体转化到植物植物组织或植物细胞中；培育筛选得到MsPAE12过表达转基因植株。

本发明的五个方面是提供一种植物过表达载体，所述载体包括所述果胶乙酰酯酶MsPAE12编码基因。

本发明取的有益效果为：

1)提供的果胶乙酰酯酶MsPAE12及其编码基因，在改变植物分枝数目中具有显著的表现，可为培育多分枝、高产量等优良特性的转基因植株提供依据；

2)本发明成功构建了含MsPAE12基因的表达载体、并培育出了能够过表达MsPAE12基因的紫花苜蓿转基因植物体，且其中的生长素含量明显降低、改变了原植株的株型，为培育高产量紫花苜蓿及其育种工作的提高提供了重要的基础，具有很大的应用价值。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是MsPAE12氨基酸序列及保守域分析图；

图2是MsPAE12氨基酸序列跨膜域和信号肽预测结果示意图；

图3是MsPAE12进化树分析结果示意图；

图4是MsPAE12基因在不同组织中的表达量分析结果示意图；

图5是MsPAE12亚细胞定位示意图，A为p35S-YFP与pm-rk共转烟草定位，B为p35S-MsPAE12-YFP与pm-rk共转烟草的定位，C为p35S-MsPAE12-YFP与pm-rk共转烟草质壁分离后的定位；

图6是MsPAE12促进植物分枝的表型分析图，A为潮霉素基因PCR结果，B为MsPAE12基因相对表达量，C为分枝表型照片，D为分枝数统计；

图7是MsPAE12过表达转基因株系顶芽和茎中生长素含量分析图；

图8是MsPAE12过表达转基因株系顶芽中生长素合成相关基因的表达量分析图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例1、紫花苜蓿MsPAE12基因的克隆与序列分析

1.RNA的提取及cDNA的合成

取紫花苜蓿WL525的叶片组织，用“TransZol Up植物总RNA提取试剂盒”抽提总RNA，凝胶电泳鉴定RNA的完整性，分光光度计(Thermo Scientific Nanodrop 1000)测定RNA的纯度及浓度；用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix(购自全式金)进行反转录，合成cDNA。

2.基因的全长克隆

根据蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中与MsPAE12基因片段高度同源的核酸序列设计如下引物，ORF-F(5'-ATGGCTAAACTTTTCTGGGTTT-3')，ORF-R(5'-TCAACTGAAAACCAAATGGTGA-3')，以紫花苜蓿WL525的cDNA为模板进行PCR，扩增得到1278bp紫花苜蓿WL525 MsPAE12蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.1)。测序结果在NCBI网站进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对数据库(GenBank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的蒺藜苜蓿PAE基因的同源性很高，初步认为它是一个PAE基因。

3.紫花苜蓿WL525 MsPAE12基因的序列信息与同源性分析

本发明的紫花苜蓿MsPAE12全长开放读码框序列为1278bp，详细序列见SEQ IDNO.1所示序列。根据开放阅读框序列推导出紫花苜蓿MsPAE12蛋白的氨基酸序列，共425个氨基酸残基，详细序列见SEQ ID NO.2所示序列。

紫花苜蓿MsPAE12在氨基酸水平上与蒺藜苜蓿(登录号：AES82343.1)和两个拟南芥(登录号：AT5G26670和AT3G05910)PAE基因有非常高的相似性，并且具有植物PAE基因典型的9个保守域，CLDG，PXYH，GGGWC，GS，NWN，RYCDG，GCSAG，NXAYDXWQ以及HCQ，红星标识，如图1所示。利用Signal IP 6.0和TMHMM 2.0在线软件分别预测了MsPAE12的信号肽和跨膜域，结果表明，MsPAE12蛋白的N端含有一个跨膜域，一个由21个氨基酸组成的信号肽，如图2所示。

以PAE基因的氨基酸全序列，利用MEGA7.0软件对26个来自拟南芥和蒺藜苜蓿的PAE氨基酸序列进行比对。26个PAE氨基酸序列来自于NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。选用邻接法(neighbor joinhg,NJ)构建进化树。主要参数设置为:距离模型，Poisson moder；基因树稳健性检测，bootstrap法，1000次重复；空位缺失数据的处理，两两间删除。如图3所示，PAE基因进化树分为3个分枝，紫花苜蓿WL525MsPAE12基因归为第一个分枝。

实施例2、紫花苜蓿MsPAE12基因在不同组织中的表达差异性

1.紫花苜蓿WL525植株的培养与处理：将种子去除包衣后洗净均匀分布在垫有滤纸的托盘中，保持湿润，7天后，选取长势良好且一致的幼苗移栽在1/2Hoagland营养液中进行水培。Hoagland培养液配方如下：Ca(NO3)2·4H2O 0.62g/L、KNO3 0.34g/L、KH2PO40.06g/L、NH4NO3 0.053g/L、MgSO4 0.24g/L、MgCl2 0.67mg/L、H3BO3 0.38mg/L、MnSO40.2mg/L、ZnSO4·7H2O 0.29mg/L、CuSO4 0.01mg/L、FeSO4·7H2O 0.02785g/L、EDTA-Na20.0373g/L，PH 5.7-5.8)，28℃，16h光照/8h黑暗条件培养，2周后取紫花苜蓿根尖(0-1cm)，根基部，顶芽，节，幼叶，成熟叶，老叶，茎，叶柄以及托叶，用锡箔纸包好，液氮冷冻后保存在-80℃超低温冰箱中。

2.RNA的提取、RNA的完整性、纯度、浓度的测定及cDNA的获得参照实施例1；

3.根据已经获得的紫花苜蓿WL525MsPAE12基因序列，设计定量分析的特异性引物，引物qPAE12-F(5’-ACGGCGTGGATCATCATTATACATGG-3’)，引物qPG1-R(5’-TCGCTGTCCTCTGAATTGCAGTTC-3’)，内参基因为延伸因子EF-α基因，引物为EF-F(5’-GCACCAGTGCTCGATTGC-3’)，EF-R(5’-TCGCCTGTCAATCTTGGTAACAA-3’)；

4.利用Bio-rad实时定量PCR仪，以上述所取样品的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR。反应体系含2×SYBR qPCR SuperMix(购自全式金)10μL、Primer F/R各0.4μL、cDNA 2μL、补水至总体积20μL。反应程序为94℃30s；95℃5s,57℃15s,72℃15s,40个循环。每个处理3次生物学重复，3次技术重复。采用2-ΔΔCT法分析数据，SAS 9.0进行统计分析，sigmplot10.0进行作图。表达模式如图4所示。

实施例3、紫花苜蓿MsPAE12烟草叶片亚细胞定位分析

1.构建植物表达载体

分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物并引入酶切位点：PAE12-F(5’-CGGGATCCATGGCTAAACTTTTCTGGGTTT-3’)、PAE12-R(5’-GGACTAGTACTGAAAACCAAATGGTGACAT-3')，回收PCR产物并连接到pMD18-T载体上，挑取单克隆菌斑进行PCR验证并测序。提取阳性克隆菌液质粒。将目的片段质粒与PHB双元转化载体进行BamH I和Spe I双酶切，回收酶切后的PHB载体与MsPAE12片段，用T₄连接酶在16℃过夜连接，转化大肠杆菌，提取阳性克隆质粒并转化农杆菌GV3101。

2.烟草叶片瞬时表达

(1)农杆菌准备：将含有pHB-MsPAE12-YFP、pm-rk(质膜marker)和含有空载的甘油农杆菌菌株划线活化，挑单克隆至5ml含50mg/L Kan、25mg/L Rif的LB液体培养基中，28℃，200rpm摇菌24h；再以1:100扩培至含相同抗性LB培养基中，28℃，200rpm，培养至OD₆₀₀为1.2左右，18℃，6000rpm，15min集菌。

(2)瞬时转化烟草叶片：用MS液体培养基悬浮菌体至OD₆₀₀为0.6，将pm-rk分别与pHB-MsPAE12-YFP、空载以1:1的体积混匀，并加入AS(终浓度为0.2mM)与MES(终浓度10mM)，室温暗处放置3h；注射烟草叶片，暗处放置48h；将农杆菌侵染的烟草叶片置于激光共聚焦显微镜下进行镜检观察。用0.3g/mL蔗糖处理10min进行质壁分离。MsPAE12定位于细胞膜，观察结果如图5所示。

实施例4、过表达MsPAE12转基因紫花苜蓿表型分析

1.过表达MsPAE12转基因紫花苜蓿的获得与鉴定

1)外植体准备：将紫花苜蓿品种“甘农3号”种子清洗干净后置于60℃烘箱中72h，依次用次氯酸钠、无水乙醇消毒，接种于MS固体培养基上萌发生长，20天后即可用于农杆菌侵染。

2)农杆菌准备：将在-80℃冰箱中保存的pHB-MsPAE12-Flag农杆菌菌株在含有抗生素为Kan50和Rif100的LB固体培养基上划线活化，28℃培养48h后，挑取单克隆至含有相同抗生素的LB液体培养基中，置于28℃摇床上200rpm培养至OD600＝0.8，4500rpm室温离心15min，在无菌培养瓶中用重悬液调OD600＝0.4，即可用于侵染。

3)农杆菌侵染：将无菌幼苗叶片轻轻夹伤，放置于(2)中准备好的菌液，盖好瓶盖，抽真空10min，超声清洗仪中40kHz 20℃超声2min,取出后再抽真空10min。用镊子夹出叶片平铺在多层无菌纸中间覆盖25min后，转移至共培养培养基中，暗培养5天。

4)愈伤组织诱导及分化：将侵染后的叶片放入筛选培养基上置于光下诱导愈伤组织4周，期间继代一次。待愈伤组织形成，将其转移至再生培养基上，6-8周后，将有分化出芽点的愈伤组织转移至茎伸长培养基上。2-4周后分化出叶片并转移至生根培养基。2-4周后根系形成，将其移栽到基质中培养，4周后扦插扩繁。

5)转基因株系鉴定：取大约0.2g的野生型紫花苜蓿和转基因株系的叶片，在液氮中充分研磨，用Plant genomic DNA提取试剂盒(购买自全式金)提取gDNA进行潮霉素验证。潮霉素上游引物序列和下游引物序列：hyg-F：5′-GGATATGTCCTGCGGGTAAA-3′；hyg-R：5′-ATTTGTGTACGCCCGACAGT-3′，PCR反应体系同实施例1，延伸时间为1min。凝胶电泳结果如图6A所示。鉴定为阳性株系后，通过qRT-PCR检测野生型和转基因株系中MsPAE12的相对表达量，qRT-PCR反应体系同实施案例2，相对表达量检测结果如图6B所示。

该遗传转化方法培养基配方参考文献：Chunxiang Fu,Timothy Hernandez,Chuanen Zhou et al.Agrobacterium Protocols,Springer New York,2015.

2.过表达MsPAE12转基因紫花苜蓿表型分析

挑选生长状态良好且一致的野生型和MsPAE12过表达转基因株系，将茎剪成4-5cm的小段，在茎节和节间处形成上下两个斜切口，茎节处包含一个叶片和一个腋芽，节间处切口蘸少量生根粉，扦插在1:2(草炭：蛭石)的基质中进行培养。培养5天、35天、40天和45天后，观察其生长表型，统计分枝数，结果如图6C和6D所示。过表达MsPAE12明显增加了紫花苜蓿的分枝数。

实施例5、过表达MsPAE12紫花苜蓿植株生长素含量分析

1.植物材料培养过程同实施例4，培养40天时，分别取野生型和转基因株系的顶芽和茎各0.5g，用锡箔纸包好，液氮冷冻后放置在-80℃保存备用。

2.生长素含量测定

由于MsPAE12在顶芽中表达量最高，调控分枝的关键激素-生长素主要在顶芽合成，因此利用植物生长素酶联免疫分析试剂盒(江莱生物公司)测定生长素含量，操作步骤按照试剂盒说明书进行。生长素含量如图7所示，和野生型相比，过表达MsPAE12明显降低了顶芽、茎中的生长素含量。

实施例6、过表达MsPAE12紫花苜蓿植株顶芽中生长素合成基因的表达量分析

植物材料培养过程同实施例4，培养40天时取野生型和MsPAE12过表达转基因株系顶芽，总RNA提取同实施例1，qRT-PCR反应体系同实施案例2，各基因引物序列如下：

TAA1q-F:GGGTGGTGATGCTGCTGTGTATG,

TAA1q-R:CACGAAGGGTTCCATCAGGGTTG；

TAR2q-F:CGAACAGGTGGAAGCAGCTAAGAG,

TAR2q-R:TCCACATTTCCCTCACACTTCAACC；

YUC4q-F:AGCAATGTGCCTAGTTGGCTCAAG,

YUC4q-R:AGACCTCTTCTTGTGAAACCCACTG；

YUC1q-F:AGGAATAAGTGGCCTACTTGCTTGC,

YUC1q-R:GCCTCCATAATCCTCCAACACCATC；

YUC2q-F:GTTGTGCCTCAAATTGAAGGGATGG,

YUC2q-R:TTTCCACACCCCACCACCAAAAC；

YUC6q-F:TTCAGTACACGTCCTACCACGAGAG,

YUC6q-R:AGCCATGACACTATGAGCAAGAACC。

相对表达量检测结果如图8所示。和野生型相比，MsPAE12过表达转基因植株中，MsTAA1，MsTAR2以及MsYUCC4表达量明显下调(图8A-C)，MsYUCC1，MsYUCC2和MsYUCC6表达量上调(图8D-F)。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种紫花苜蓿果胶乙酰酯酶MsPAE12，其特征在于，MsPAE12蛋白为A1或A2或A3或A4：

A1、氨基酸序列如序列SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

A2、将A1经过1～22个氨基酸的缺失、插入和/或取代得到的蛋白质；

A3、在A1所述蛋白质的C端和/或N端添加1～20个氨基酸得到的蛋白质；

A4、与A1具有94.9％以上同源性的蛋白质。

2.一种如权利要求1所述的紫花苜蓿果胶乙酰酯酶MsPAE12的蛋白在改变植物分枝数目的应用。

3.如权利要求1所述的紫花苜蓿果胶乙酰酯酶MsPAE12的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括如核苷酸序列SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述核苷酸序列为B1或B2或B3或B4：

B1、具有如SEQ ID NO.1第1～1278位所示的序列；

B2、与B1有95.5％以上同源性的序列；

B3、能与A1进行杂交的序列；

B4、将B1中1～58个核苷酸的进行缺失、插入和/或取代得到的序列。

5.如权利要求3或4所述的编码基因，其特征在于，所述核苷酸序列通过紫花苜蓿克隆和/或人工合成方法获得。

6.如权利要求3～5所述的任一项编码基因在改变植物分枝数目的应用。

7.如权利要求2或6所述的应用，其特征在于，所述应用包括：构建含有所述果胶乙酰酯酶MsPAE12的所述编码基因的表达载体；转化植物宿体；培育筛选得到转基因植株。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物宿体为植物组织或植物细胞。

9.一种培育MsPAE12过表达转基因植株的方法，其特征在于，所述方法包括：构建含有如权利要求3或4所述果胶乙酰酯酶MsPAE12编码基因的表达载体；将构建的所述表达载体转化到植物植物组织或植物细胞中；培育筛选得到MsPAE12过表达转基因植株。

10.一种植物过表达载体，其特征在于，所述载体包括如权利要求3或4所述果胶乙酰酯酶MsPAE12编码基因。

Images