BR112019018983A2

BR112019018983A2 - métodos de uso de uma serina protease archaeal

Info

Publication number: BR112019018983A2
Application number: BR112019018983A
Authority: BR
Inventors: Van Brussel-Zwijnen Marco; Yu Shukun; Shipovskov Stepan; Gu Xiaogang; Zou Zhengzheng
Original assignee: Dupont Nutrition Biosci Aps
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2018-03-09
Publication date: 2020-04-14
Also published as: MX2019010807A; EP3596211B1; US20200063115A1; DK3596211T3; RU2019132448A; WO2018169780A1; CN110603323A; EP3596211A1; RU2019132448A3

Abstract

a presente invenção refere-se a métodos de uso de sequências de serina proteases archaeal.

Description

Relatório Descrivito da Patente de Invenção para MÉTODOS DE USO DE UMA SERINA PROTEASE ARCHAEAL.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO [0001] O presente pedido reivindica prioridade ao pedido PCT/CN2017/076770, depositado em 15 de março de 2017, que está incorporado aqui a titulo de referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [0002] A listagem de sequência fornecida no arquivo nomeado NB41217WOPCT_SequenceListing_ST25 com um tamanho de 29KB que foi criado em sexta-feira, 2 de março de 2018 e que é depositado com o presente pedido, é incorporada a título de referência no presente documento em sua totalidade.

Campo [0003] O campo refere-se a uma serina protease archaeal termoestável e, em particular, à identificação e caracterização da proteína, denominada no presente documento TnaProl, como uma enzima protease termofílica adequada para uso em aplicações de ração ou grão.

Antecedentes [0004] Proteases (também denominadas peptidases ou proteinases) são enzimas que têm capacidade para clivar ligações peptídicas. Proteases evoluíram múltiplas vezes e diferentes classes de proteases podem realizar a mesma reação por mecanismos catalíticos compietamente diferentes. As proteases podem ser encontradas em animais, plantas, fungos, bactérias, archaea e vírus.

[0005] Proteólise pode ser obtida através de enzimas atualmente classificadas em seis grupos amplos: aspartil proteases, cisteína proteases, serina proteases, treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases.

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2/131 [0006] As serina proteases são um subgrupo de carbonil hydrolases que compreende uma classe diversa de enzimas que têm uma ampla gama de especificidades e funções biológicas. Apesar dessa diversidade funcional, o maquinário catalítico de serina proteases foi abordado por pelo menos duas famílias geneticamente distintas de enzimas: 1) as subtilisinas; e 2) serina proteases relacionadas a quimotripsina (por exemplo, tripsina).

[0007] Essas duas famílias de serina proteases têm mecanismos catalísticos muito similares. A estrutura terciária dessas duas famílias de enzima une uma tríade catalítica conservada de aminoácidos consistindo em serina, histidina e aspartato.

[0008] Muita pesquisa foi conduzida sobre as serina proteases, devido grandemente a seu uso em aplicações industriais. Trabalho adicional tem sido focado em condições ambientais que podem impactar de maneira negativa a função dessas enzimas em uma variedade de aplicações (por exemplo, exposição a agentes oxidantes, agentes quelantes, extremos de temperatura e/ou pH).

[0009] Na indústria, enzimas protease são, por exemplo, de uso particular em produtos alimentícios. Tais produtos podem ser para seres humanos, porém, normalmente são mais para animais domésticos, tais como animais de criação ou animais de estimação. A adição de proteases em produtos alimentícios ou o uso de proteases na produção de produtos alimentícios resulta em degradação parcial de proteínas nos produtos alimentícios, o que resulta em digestibilidade melhorada dos produtos alimentícios. O valor nutricional de tais produtos alimentícios para os animais que consomem os mesmos pode, assim, ser melhorado.

[0010] Enzimas protease também são normalmente usadas em processos industriais para degradar materiais contendo proteína durante, por exemplo, fabricação, preparação e processamento de mate

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3/131 riais vegetais. Por exemplo, durante a extração de óleo de sementes de óleo ou outros produtos vegetais, proteases podem ser usadas na degradação de material celular. Proteases podem ser usados de maneira similar no processamento de grão durante, por exemplo, preparação.

[0011] Em tais processos, usos ou produtos industriais, proteases podem estar expostas a condições ambientais conforme abordado acima (por exemplo, extremos de temperatura e/ou pH), que podem ser prejudiciais à estabilidade ou atividade de enzima. O uso de proteases em tais processos e produtos é conhecido da técnica anterior, por exemplo, o documento n° U.S. 2010/0081168, que revela o uso de uma protease estável em ácido em ração para animais, e o documento n° U.S. 8772011, que revela variantes de protease natural com perfis de atividade de temperatura alterados, que podem ser usados na ração para animais e detergentes. No entanto, há uma necessidade contínua em desenvolver aplicações em que as proteases possam ser usadas sob condições adversas e reter ou ter atividade melhorada SUMÁRIO [0012] Em uma primeira modalidade, é descrito um construto recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo termoestável que tem atividade de serina protease, sendo que a dita sequência de nucleotídeos codificadora é operacionalmente ligada a pelo menos uma sequência reguladora funcional em um hospedeiro de produção, e a sequência de nucleotídeos codifica um polipeptideo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou um polipeptideo com pelo menos 92% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma;

e sendo que a dita sequência reguladora é heteróloga à sequência de nucleotídeos codificadora ou a dita sequência reguladora e a dita sequência codificadora não estão dispostas como encontradas juntas na

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4/131 natureza, [0013] Em uma segunda modalidade, a sequência de nucleotídeos codificadora do construto recombinante é uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, ou um polipeptideo com pelo menos 89% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma, [0014] Em uma terceira modalidade, a sequência de nucleotídeos codificadora do construto recombinante descrita no presente documento selecionada dentre o grupo que consiste em:

i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, ou um polipeptídeo com pelo menos 86% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma; ou ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:5 ou 14, ou um polipeptideo com pelo menos 84% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma.

[0015] Em uma quarta modalidade, a sequência reguladora de construto recombinante compreende um promotor.

[0016] Em uma quinta modalidade, é descrito um vetor que compreende um construto recombinante conforme descrito no presente documento.

[0017] Em uma sexta modalidade, é descrito um hospedeiro de produção ou célula hospedeira que compreende o construto recombinante descrito no presente documento.

[0018] Em uma sétima modalidade, o hospedeiro de produção ou célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 6, é uma célula que pode ser selecionada dentre o grupo que consiste em uma célula bacteriana, uma célula archaeal, uma célula fúngica ou uma célula algal.

[0019] Em uma oitava modalidade, é descrito um método para

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5/131 produzir uma serina protease termoestável, sendo que o dito método compreende:

i) transformar uma célula hospedeira com qualquer um dos construtos recombinantes descritos no presente documento; e ii) cultivar a célula hospedeira transformada da etapa (i) sob condições através das quais a serina protease termoestável é produzida pelo método descrito no presente documento é recuperada.

[0020] Em uma nona modalidade, se recupera a serina protease termoestável da célula hospedeira.

[0021] Em uma décima modalidade, a célula hospedeira pode ser selecionada dentre o grupo que consiste em célula bacteriana, uma célula archaeal, uma célula fúngica ou uma célula algal.

[0022] Em uma décima primeira modalidade, é descrito um sobrenadante de cultura que compreende uma serina protease termoestável obtida através de qualquer um dos métodos descritos no presente documento.

[0023] Em uma décima segunda modalidade, é descrito um método para hidrolisar um material derivado de milho, sendo que o dito método compreende:

(a) colocar o material obtido a partir do milho em contato com um líquido para formar um mosto; e (b) hidrolisar pelo menos uma proteína no mosto para formar um hidrolisado, colocando-se o hidrolisado em contato com um coquetel de enzimas compreendendo uma serina protease termoestável que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 e (c) opcionalmente, recuperar o hidrolisado obtido na etapa (b).

[0024] Em uma décima terceira modalidade, é descrita uma ração

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6/131 para animais, gêneros alimentícios, composição aditiva para ração ou pré-mist ura que compreende pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease e é termoestável, sendo que o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 92% de identidade de sequência com a mesma, e sendo que a dita ração para animais, gêneros alimentícios, composição aditiva para ração ou prémistura opcionalmente compreende, ainda, (a) pelo menos um microorganismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima.

[0025] Em uma décima quarta modalidade, a composição aditiva para ração descrita no presente documento compreende adicionalmente pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propileno glicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formiato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formiato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formiato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfeto de sódio, metil parabeno e propil parabeno.

[0026] Em uma décima quinta modalidade, qualquer uma das composições aditivas para ração descritas no presente documento pode ser granulada e compreende partículas produzidas por um processo selecionado a partir do grupo que consiste em granulação de alto cisalhamento, granulação em cilindro, extrusâo, esferonização, aglomeração em leito fluidizado, revestimento por aspersão em leito fluidizado, secagem por aspersão, liofilização, compressão, arrefecimento por aspersão, atomizaçâo em disco giratório, coacervação, produção

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7/131 de tabletes ou qualquer combinação dos processos acima.

[0027] Em uma décima sexta modalidade, o diâmetro médio dessas partículas está entre 50 e 2.000 microns.

[0028] Em uma décima sétima modalidade, qualquer uma das composições aditivas para ração descritas no presente documento está sob a forma de um líquido, um pó seco, ou um grânulo ou um revestimento, ou está em uma forma revestida ou encapsuiada.

[0029] Em uma décima oitava modalidade, qualquer uma das composições aditivas para ração descritas no presente documento pode estar sob a forma de um líquido que é adequado para secagem por aspersâo sobre um pélete de ração.

[0030] Em uma décima nona modalidade, em que o pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease está presente em uma quantidade de 1 a 20 g/tonelada de qualquer uma das rações para animais descritas no presente documento.

[0031] Em uma vigésima modalidade, é descrito um método para produzir produtos de fermentação a partir de material contendo amido que compreende:

(a) liquefazer o material contendo amido com um coquetel de enzimas compreendendo uma serina protease que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3;

(b) sacarificar o produto da etapa (a);

(c) fermentar com um organismo adequado; e (d) opcionalmente, recuperar o produto produzido na etapa (c).

[0032] Em uma vigésima primeira modalidade, as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente.

[0033] Em uma vigésima segunda modalidade, a adição de uma

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8/131 fonte de nitrogênio é eliminada ou reduzida em pelo menos 50% no método descrito no presente documento com o uso de 1 a 20 g de senna protease/MT de material contendo amido, sendo que a serina protease compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3.

[0034] Em uma vigésima terceira modalidade, a fonte de nitrogênio é ureia.

[0035] Em uma vigésima quarta modalidade, quando o produto de liquefação é etanol, e nenhuma enzima proteolítica ácida é necessária ao utilizar 1 a 20 g de serina protease termoestável/MT de material contendo amido, sendo que a serina protease compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E SEQUÊNCIAS [0036] A Figura 1 mostra o plasmídeo construído para expressão de AprE-TnaPro1, a saber plasmídeo pGX706, que tem a cadeia principal de vetor do plasmídeo p2JM103BBI. O gene aprE-TnaPro1 é um único quadro de leitura aberto que compreende a sequência de peptídeos sinal aprE, um ligante de 9 nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos Ala-Gly-Lys (AGK) e a sequência de proenzima TnaProl, nessa ordem, conforme mostrado. O gene aprE-TnaProl está sob o controle do promotor aprE (PaprE). CAT representa cloranfenicoi acetil transferase, que confere resistência a cloranfenicoi em bactérias que carregam o plasmídeo. Bla representa β-lactamase.

[0037] A Figura 2 é uma curva de resposta à dose que mostra a atividade proteolítica ao aumentar concentrações de TnaProl no substrato cromogênico AAPF-pNA. Atividade proteolítica é representada por A410 líquido da solução. Os experimentos foram realizados em pH 8.

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9/131 [0038] A Figura 3 é um perfil de pH de TnaProl purificado, que mostra sua atividade proteolítica em AAPF-pNA em vários pHs de pH 3 a pH 10. A atividade reiativa é dada como um valor de porcentagem relativo à atividade máxima vista, que foi observada em pH 9. Barras de erro representam um desvio padrão de ambos os lados da média.

[0039] A Figura 4 é um perfil de temperatura de TnaProl purificado, que mostra sua atividade proteolítica em AAPF-pNA em várias temperaturas de 30°C a 95°C. A atividade relativa é dada como um valor de porcentagem relativo à atividade máxima vista, que foi observada em 70°C. Barras de erro representam um desvio padrão de ambos os lados da média.

[0040] A Figura 5 apresenta os resultados de um ensaio de hidrólise de farelo de soja de milho com o uso de TnaProl purificado em pH

3. Hidróiise foi quantificada com o uso do ensaio OPA e relatada como ο A340 líquido. Barras de erro representam um desvio padrão de ambos os lados da média.

[0041] A Figura 6 apresenta os resultados de um ensaio de hldrólise de farelo de soja de milho com o uso de TnaProl purificado em pH

3. Hidróiise foi quantificada com o uso do ensaio BCA e relatada como ο A562 líquido. Barras de erro representam um desvio padrão de ambos os lados da média.

[0042] A Figura 7 apresenta os resultados de um ensaio de hidrólise de farelo de soja de milho equivalente àquele apresentado na Figura 5, com a exceção de que o ensaio foi realizado em pH 6.

[0043] A Figura 8 apresenta os resultados de um ensaio de hidrólise de farelo de soja de milho equivalente àquele apresentado na Figura 6, com a exceção de que o ensaio foi realizado em pH 6.

[0044] A Figura 9 apresenta os resultados de um ensaio de estabilidade de pepslna realizado em proteases TnaProl e ProAct, que mostram sua atividade após incubação com pepslna a 37°C por 30 minu

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10/131 tos. A atividade residual após a incubação demonstra estabilidade da enzima quando exposta à pepsina. A atividade residual de protease é apresentada como uma porcentagem da atividade original, que foi determinada como a atividade de TnaProl e ProAct depois de incubação a 37°C por 30 minutos com pepsina inativada por calor.

[0045] As seguintes sequências cumprem com o Título 37, Seções 1.821 a 1.825 do C.F.R. (Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules) e são consistentes com o Padrão ST.25 da Organização Mundial de Propriedade Intelectual (WIPO) (2009) e as solicitações de listagem de sequência das Regras da Convenção Européia de Patente (EPC) e do Tratado de Cooperação em Matéria de Patente (PCT) 5.2 e 49.5(a-bis), e Seção 208 e Anexo C das Instruções Administrativas. Os símbolos e formato usados para dados de sequência de nucleotídeos e aminoácidos cumprem com as regras apresentadas no Título 37, seção 1.822 do C.F.R.

[0046] SEQ ID NO: 1 apresenta a sequência de nucleotídeos de TnaProl (NCBI Sequência de Referenda: NZ_CP007264.1 de 1327825 a 1329105, complementar).

[0047] SEQ ID NO: 2 apresenta a sequência de aminoácidos da pré-proenzima TnaProl codificada por SEQ ID NO: 1 (número de registro GenBank: AHL23118.1).

[0048] SEQ ID NO: 3 apresenta a sequência de aminoácidos da enzima madura completamente processada TnaProl (isto é, a sequência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 6).

[0049] SEQ ID NO: 4 apresenta a sequência de nucleotídeos de um gene sintético que codifica uma proteína AprE-(AGK)-TnaPro1 (isto é, uma sequência de nucleotídeos com três códons derivados de vetor adicionais (que codificam AGK) situados entre a extremidade 3' de uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência sinal de

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AprE de Bacillus subtiiis e a extremidade 5' da sequência de nucleotideos que codifica a proenzima TnaProl).

[0050] SEQ ID NO: 5 apresenta a sequência de aminoácidos da proteína AprE-(AGK)-TnaPro1 (isto é, a sequência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 4).

[0051] SEQ ID NO: 6 apresenta a sequência de nucleotideos da enzima madura completamente processada TnaProl.

[0052] SEQ ID NO: 7 apresenta a sequência de nucleotideos da proenzima TnaProl.

[0053] SEQ ID NO: 8 apresenta a sequência de aminoácidos da proenzima TnaProl (isto é, a sequência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 7).

[0054] SEQ ID NO: 9 apresenta a sequência de nucleotideos da sequência sinal TnaProl.

[0055] SEQ ID NO: 10 apresenta a sequência de aminoácidos da sequência sinal TnaProl (isto é, a sequência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 9).

[0056] SEQ ID NO: 11 apresenta a sequência de nucleotideos do fragmento de propeptídeo TnaProl (o pró-domínio de TnaProl).

[0057] SEQ ID NO: 12 apresenta a sequência de aminoácidos do fragmento de propeptídeo/pró-domínio TnaProl (isto é, a sequência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 11).

[0058] SEQ ID NO: 13 apresenta a sequência de nucleotideos da proteína AprE-TnaPro1 (isto é, a proenzima TnaProl com a sequência sinal AprE).

[0059] SEQ ID NO: 14 apresenta a sequência de aminoácidos da proteína AprE-TnaPro1 (isto é, a sequência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 13).

[0060] SEQ ID NO: 15 apresenta a sequência de nucleotideos da sequência sinal AprE.

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12/131 [0061] SEQ ID NO: 16 apresenta a sequência de aminoácidos da sequência sinal AprE (isto é, a sequência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 15).

[0062] SEQ ID NO: 17 apresenta a sequência de aminoácidos presente no substrato de protease cromogênica AAPF-pNA.

Descrição Detalhada [0063] Todos os documentos de patente, pedidos de patente e publicações citados estão incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0064] Nessa descrição, diversos termos e abreviações são usados. As seguintes definições se aplicam a menos que seja especificamente afirmado de outra forma:

[0065] Os artigos um, uma, o e a que antecedem um elemento ou componente devem ser não restritivos com relação ao número de casos (isto é, ocorrências) do elemento ou componente. Portanto um, uma, o e a devem ser lidos incluindo um ou pelo menos um, e a forma de palavra singular do elemento ou componente também inclui o plural a menos que o número deva significar obviamente o singular.

[0066] O termo que compreende significa a presença dos recursos, números inteiros, etapas ou componentes afirmados conforme citado nas reivindicações, porém, esse não exclui a presença ou adição de um ou mais outros recursos, números inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos. O termo que compreende se destina a incluir modalidades englobadas pelos termos que consiste essencialmente em e que consiste em. Similarmente, o termo que consiste essencialmente em se destina a incluir modalidades englobadas pelo termo que consiste em.

[0067] Quando presentes, todas as faixas são Inclusivas e combináveis. Por exemplo, quando uma faixa de 1 a 5 é citada, a faixa ciPetição 870190101278, de 09/10/2019, pág. 30/157

13/131 tada deve ser interpretada incluindo faixas de 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, 1 a 2 e 4 a 5, 1 a 3 e 5, e semelhantes.

[0068] Como usado aqui em conexão com um valor numérico, o termo cerca de se refere a uma gama de +/- 0,5 do valor numérico, a não ser que o termo seja de outro modo especificamente definido no contexto. Por exemplo, a frase um valor de pH de cerca de 6 se refere a valores de pH de cerca de 5,5 a 6,5, a não ser que o valor de pH seja especificamente definido de outro modo.

[0069] Pretende-se que cada limitação numérica máxima dada ao longo deste Relatório Descritivo inclua cada limitação numérica inferior, como se tais limitações numéricas inferiores fossem expressamente escritas no presente documento. Cada limitação numérica mínima dada ao longo deste Relatório Descritivo incluirá cada limitação numérica superior, como se tais limitações numéricas superiores fossem expressamente escritas no presente documento. Cada faixa numérica dada ao longo deste Relatório Descritivo incluirá todas as faixas numéricas mais estreitas que estejam abrangidas dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se tais faixas numéricas mais estreitas fossem, todas, expressamente escritas no presente documento.

[0070] Conforme usados no presente documento, os termos proteína e polipeptideo são intercambiáveis e se referem a um polímero de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Uma proteína ou um polipeptideo compreende uma sequência polimérica de resíduos de aminoácido. O código de uma única letra e de 3 letras para aminoácidos definido em conformidade com IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) é usado ao longo desta descrição. A única letra X se refere a qualquer um dos vinte aminoácidos. Também se compreende que um polipeptideo pode ser codificado por mais de uma sequência de nucleotídeos devido à degeneração do código genético.

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14/131 [0071 ] O termo protease significa uma proteína ou polipeptídeo, ou um domínio de uma proteína ou polipeptídeo, que tem a capacidade para catalisar a divagem de ligações peptídicas em uma ou mais posições de uma cadeia principal de proteína. Uma protease pode ser obtida a partir de um organismo, tal como um micro-organ ismo (por exemplo, um fungo, bactéria ou arqueobactéria) ou um organismo superior, tal como uma planta ou animal. Os termos protease, peptidase e proteinase podem ser usados de forma intercambiável. Proteases podem ser encontradas em todos os domínios da vida: eucariontes (que incluem animais, plantas, fungos, etc.), bactérias e arqueobactérias. Proteases também são codificadas por vírus.

[0072] Proteases podem ser divididas nos dois grupos exopeptidases, que clivam a última ou penúltima ligação peptídica de uma cadeia polipeptídica (e, assim, liberam um único aminoácido ou um di~ peptídeo de uma cadeia polipeptídica de substrato), e endopeptidases, que clivam apenas ligações peptídicas não terminais em uma cadeia polipeptídica. Exopeptidases têm, assim, capacidade para clivar polipeptídeos em seus aminoácidos constituintes individuais; endopeptidases não têm tal capacidade.

[0073] Proteólise (isto é, hidrólise de proteína) pode ser obtida através de enzimas atualmente classificadas em seis grupos amplos: aspartil proteases, cisteína proteases, serina proteases, treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases. A presente descrição é direcionada aos usos de uma serina protease. Serina proteases usam uma tríade catalítica que compreende um resíduo de histidina, um resíduo de serina e um resíduo de aspartato para catalisar hidrólise de peptídeo.

[0074] Atividade de serina protease pode ser identificada por diversos métodos. Métodos de bioinformática são normalmente usados para identificar sequências de serina protease. Ensaios funcionais

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15/131 também podem ser usados. De acordo com a presente descrição, uma proteína com atividade de serina protease pode ser identificada por sua capacidade em clivar o substrato cromogênico N-Suc-Ala-Ala-ProPhe- p-nitroanilida (AAPF-pNA). A sequência de aminoácidos presente em AAPF-pNA é apresentada na SEQ ID NO: 17. AAPF-pNA é um substrato clivado pela maior parte de serina proteases, que incluem catepsina G, subtilisinas, quimiotripsina e quimase. Nem todas as senna proteases têm capacidade para clivar AAPF-pNA, por exemplo, neutrofil elastase não tem capacidade para tal. As serina proteases descritas no presente documento estão inseridas na família de proteases semelhantes a subtilisina, e dessa forma têm capacidade para clivar AAPF-pNA.

[0075] Um polipeptideo com atividade de serina protease, conforme definido no presente documento, pode, assim, ser identificado por sua capacidade para clivar AAPF-pNA. Uma reação de divagem pode ser realizada, por exemplo, como a seguir: a protease pode ser fornecida em uma solução de 50 mM de HEPES, pH 8. AAPF-pNA pode ser fornecida em DIVISO a uma concentração de 10 mM. A solução de AAPF-pNA pode, então, ser diluída em 50 mM de tampão de HEPES a uma razão de 17 partes de tampão para 1 parte de solução de AAPFpNA, e a mistura incubada a 40°C por 5 minutos. Uma quantidade apropriada de enzima pode, então, ser adicionada à solução, que pode, então, ser incubada a 40°C por 10 minutos. Uma quantidade apropriada de enzima pode ser uma concentração resultante na mistura de reação de, por exemplo, 0,1 ppm.

[0076] A atividade enzimática pode, então, ser medida de acordo com a absorvância da mistura de reação em 410 nm (isto é, seu valor de A410). Uma reação de controle negativo pode ser realizada, em que 0 tampão ou a água sem enzima é adicionada à solução diluída de AAPF-pNA no lugar de enzima. Uma serina protease, conforme descri

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16/131 ta no presente documento, pode ser identificada por um aumento estatisticamente significativo em A410 da mistura de reação em comparação com 0 controle negativo. Os detalhes do ensaio apresentado acima, em termos de tampões, temperaturas, tempos, etc., são meramente exemplificativos e podem ser variados pela pessoa habilidosa conforme apropriado. Uma pessoa habilidosa tem bastante capacidade para ensaiar a atividade de proteóllse de uma protease putativa sem instrução particular e, assim, embora um ensaio possa ser usado conforme descrito acima, 0 protocolo pode ser variado conforme apropriado. Aiternativamente, um ensaio diferente pode ser usado, em conformidade com 0 conhecimento e habilidades da pessoa habilidosa.

[0077] Ensaios alternativos incluem aqueles com base na liberação de peptídeos solúveis em ácido de caseína ou hemoglobina, medida como absorvância a 280 nm ou calorimetricamente com 0 uso do método Folin, e hidrólise da azocaseína marcada por molde, medida como absorvância a 440 a 450 nm. Ouros ensaios exemplificativos envolvem a solubilização de substratos cromogênicos (Consultar, por exemplo, Ward, Proteinases, em Fogarty (ed.), Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science, Londres, [1983], páginas 251 a 317). Um método de ensaio de detecção de protease que usa caseína de isotiocianato de fluoresceína altamente marcada (FITC) como 0 substrato, uma versão modificada do procedimento descrito por Twining [Twining, S.S., (1984) Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes” Anal. Biochem. 143:30 a 34] também pode ser usado.

[0078] Outros ensaios exemplificativos incluem, mas sem limitação: divagem de caseína em peptídeos solúveis em ácido tricloroacético que contêm resíduos de tirosina e triptofano, seguidos pela reação com reagente Folin-Ciocalteu e detecção colorimétrica de produtos a 660 nm, divagem de substratos de peptideo de FRET (Transferência

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17/131 de Energia de Ressonância de Fluorescência) bruscamente arrefecidos internamente seguidos pela detecção de produto com o uso de um fluorômetro. A Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência (FRET) é a transferência não radioativa de energia de um fluoróforo (ou doador) excitado para uma molécula (ou aceitante) bruscamente arrefecido adequado. FRET é usada em uma variedade de aplicações que incluem a medição de atividade de protease com substratos, em que o fluoróforo é separado do extintor por uma sequência de peptídeos curta que contém o local de divagem de enzima. Proteólise do peptídeo resulta na fluorescência quando o fluoróforo e extintor são separados. Referências adicionais numerosas conhecidas por aqueles indivíduos versados na técnica fornecem métodos adequados (Consultar, por exemplo, Wells et al., Nucleic Acids Res. 11:7.911 a 7.925 [1983]; Christianson et al., Anal. Biochem. 223:119 a 129 [1994]; e Hsia et al., Anal Biochem. 242:221 a 227 [1999]).

[0079] Preferencialmente, no entanto, o ensaio descrito acima com o uso de AAPF-pNA é usado.

[0080] O termo serina protease termoestável significa uma serina protease que é estável ao calor. Os termos termoestável e estável termicamente, conforme usados no presente documento, são intercambiáveis. Ademais, os termos serina protease termoestável e polipeptídeo termoestável com atividade de serina protease também são intercambiáveis. De acordo com a presente invenção, um polipeptídeo pode ser definido como termoestável se o mesmo não for desnaturado e manter sua atividade, em temperaturas nas quais a maior parte dos polipeptídeos seria desnaturado e perdería sua função. Em particular, um polipeptídeo pode ser definido como termoestável se o mesmo manter sua atividade em temperaturas de pelo menos 50°C ou pelo menos 60°C. Preferencialmente, um polipeptídeo é considerado termoestável apenas se o mesmo manter sua atividade em uma tempera

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18/131 turn de pelo menos 65°C, 70°C ou 80°C ou superior. Tipicamente, termoestabilidade pode ser determinada pela incubação da enzima em uma temperatura elevada (por exemplo, de pelo menos 50°C, 60°C, 70°C ou superior) durante um dado tempo (por exemplo, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas ou 3 horas ou mais). A esse ponto, espera-se que enzimas não termoestáveis sejam desnaturadas, assim, um polipeptídeo que mantém sua atividade depois dessa incubação pode ser considerado termoestável. Para ser considerado termoestável, conforme definido no presente documento, um polipeptídeo deve manter sua atividade depois de incubação em uma temperatura de pelo menos 50°C ou pelo menos 60°C, preferencialmente pelo menos 70°C, 75°C ou 80°C, durante um período de tempo de pelo menos 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos ou 30 minutos, preferencialmente de pelo menos 1 hora. Não é necessário que o polipeptídeo mantenha sua atividade depois da incubação em uma temperatura de pelo menos 100°C ou 110°C.

[0081] Para um polipeptídeo manter sua atividade, conforme definido no presente documento, o mesmo deve manter pelo menos 50% de sua atividade, preferencialmente pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de sua atividade depois da incubação descrita acima. A atividade do polipeptídeo depois de sua incubação é medida contra um nível de linha de base da atividade para calcular a proporção da atividade mantida. Essa atividade de linha de base pode corresponder ao nível de atividade do polipeptídeo em uma temperatura identificada como ideal para sua atividade (isto é, uma temperatura na qual a atividade do polipeptídeo é a maior). Tal temperatura ideal pode ser, por exemplo, 50°C, 60°^c, 65°C, 70°C, 75°C ou 80°C ou mais, e pode ser identificada pela pessoa habilidosa. A pessoa habilidosa terá capacidade para identificar condições adequadas para entender a leitura de linha de base sem esforço indevido.

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19/131 [0082] No presente documento, a atividade relevante do polipeptídeo é a atividade de serina protease. Atividade de serina protease de um polipeptídeo, conforme definido no presente documento, pode ser medida, conforme detalhado acima, com o uso de um ensaio de proteóiise com AAPF-pNA como um substrato, ou com o uso de qualquer outro ensaio apropriado conhecido na técnica.

[0083] Os termos animal e indivíduo são usados de modo intercambiável no presente documento. O termo animal incluí animais humanos e não humanos. Um animal, conforme citado no presente documento, pode ser um animal não ruminante (tal como um ser humano) ou um animal ruminante (tal como uma vaca, ovelha ou cabra). Em uma modalidade particular, o animal é um animal não ruminante, tal como um animai monogástrico ou um cavalo. Exemplos de animais monogástricos incluem, porém sem limitação, porcos e suínos, tais como leitões, porcos em crescimento e porcas; aves, tais como perus, patos, galinhas, frangos e aves de postura (isto é, pássaros criados para pôr ovos); peixe, tal como salmão, truta, tilápia, bagre e carpas; e crustáceos, tais como camarões. Exemplos de animais ruminantes, de acordo com a invenção, incluem, porém sem limitação, gado, jovens bezerros, cabras, ovelhas, girafas, bisão, alce, cervos, iaque, búfalo de água, veado, camelos, alpacas, lhamas, antílopes, antilocapras e nilgó.

[0084] O termo patógeno, conforme usado no presente documento, significa qualquer agente causador de doença. Tais agentes causadores podem incluir, porém sem limitação, agentes causadores bacterianos, virais, fúngicos e similares.

[0085] Uma ração e um alimento, conforme usados no presente documento, significam qualquer dieta natural ou artificial, refeição ou semelhantes, ou componentes de tais refeições destinados ou adequados para serem comidos, consumidos, ingeridos ou digeridos por

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20/131 um animal não humano ou um ser humano, respectivamente. O termo ração pode ser usado com referência a produtos com os quais animais na criação de pecuária são alimentados. Os termos ração e ração para animais são usados de modo intercambiável.

[0086] O termo produto alimentício também cobre qualquer componente ou ingrediente de um alimento ou ração, qualquer pré-mistura ou semelhantes que um alimento ou ração é baseado, e qualquer suplemento, aditivo ou semelhantes que é adicionado em um alimento ou ração antes de seu consumo por um animal. Assim, um produto alimentício pode ser entendido por cobrir qualquer produto que é comido ou consumido por um animal, ambos produtos comidos ou consumidos como um alimento ou ração isolada e produtos comidos ou consumidos como uma parte de um alimento ou ração mais complexa.

[0087] Os termos liquefazer, liquefação, liquefeito e variações dos mesmos referem-se ao processo ou produto da conversão de amido em substratos dextrinizados solúveis (por exemplo, polissacarídeos menores).

[0088] Liquefeito pode ser referido como massa ou pode também ser chamado de um substrato de amido solúvel ou um substrato liquefeito. Em alguns casos, o mesmo pode ser uma pasta fluida de grãos triturados contendo uma alfa amilase termoestável que foi submetida à liquefação de alta temperatura resultando em um substrato solúvel para sacarificação e fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Alta temperatura é uma temperatura mais alta do que a temperatura de gelatinização dos polissacarídeos de grãos.

[0089] O termo moído é usado no presente documento para se referir a um material vegetal que foi reduzido em tamanho, tal como por tríturação, esmagamento, fracionamento ou qualquer outro meio de redução de tamanho de partícula A moagem inclui moagem a úmido ou a seco. Moagem a seco refere-se à moagem do grão seco in

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21/131 teiro. Moagem a úmido refere-se a um processo através do qual ο grão é primeiro embebido (macerado) em água para amolecer o grão. [0090] O termo hidrólise refere-se a uma reação ou processo químico em que um composto químico é quebrado pela reação com água. Enzimas digestivas de amido hidrolisam amido em unidades menores, isto é, polissacarídeos menores.

[0091] O termo lignocelulósico refere-se a uma composição que compreende tanto lignina quanto celulose. O mesmo pode também conter hemicelulose.

O termo biomassa lignocelulósica se refere a qualquer material lignocelulósico e inclui materiais que compreendem celulose, hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. Biomassa também pode compreender componentes adicionais, tais como proteína e/ou lipídeo. Biomassa pode ser derivada de uma única fonte ou biomassa pode compreender uma mistura derivada de mais de uma fonte;

por exemplo, biomassa podería compreender uma mistura de espigas de milho e palha de milho, ou uma mistura de gramínea e folhas. Biomassa lignocelulósica inclui, porém, sem limitação a culturas de bioenergia, resíduos agrícolas, refugo sólido público, refugo sólido industrial, resíduo de fabricação de papel, resíduos de quintal, resíduo de madeira e florestal.

Exemplos de biomassa incluem, porém sem limitação, espigas de milho, resíduos de cultura, tal como cascas de milho, palha de milho, gramíneas (que incluem Miscanthus), palha de trigo, palha de cevada, feno, palha de arroz, grama, papel usado, bagaço de cana-de-açúcar, material de sorgo, material vegetal de soja, componentes obtidos a partir de moagem de grãos ou do uso de grãos nos processos de produção (tal como DDGS:

grãos destiladores secos com solúveis), árvores, galhos,

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22/131 raízes, folhas, lascas de madeira, serragem, arbustos e moitas, legumes, frutas, flores, cacho de fruta de palmeira vazio e cana de energia. O termo cana de energia se refere à cana-de-açúcar que é cultivada para uso em produção de energia. A mesma é selecionada para uma porcentagem mais alta de fibras do que o açúcar.

[0092] O termo biomassa lignocelulósica pré-tratada se refere à biomassa que foi submetida a um tratamento físico, térmico e/ou químico antes de sacarificação. O termo biomassa lignocelulósica prétratada com amônia se refere à biomassa que foi submetida pelo menos a um processo de pré-tratamento que emprega amônia. Em uma modalidade, o pré-tratamento com amônia é um pré-tratamento com baixo teor de amônia, em que a biomassa é colocada em contato com uma solução aquosa que compreende amônia para formar uma mistura de amônia e biomassa aquosa onde a concentração de amônia é suficiente para manter o pH alcalino da mistura de amônia e biomassa aquosa, porém, é menor que cerca de 12 por cento em peso com relação ao peso seco de biomassa, e em que o peso seco de biomassa é pelo menos cerca de 15 por cento em peso de sólidos com relação ao peso da mistura de amônia e biomassa aquosa, conforme revelado no documento de Patente n° U.S. 7.932.063, que está incorporado no presente documento a título de referência.

[0093] O termo hidrolisado de biomassa lignocelulósica se refere ao produto que resulta a sacarificação de biomassa lignocelulósica. A biomassa pode também ser pré-tratada ou pré-processada antes da sacarificação. Os termos sacarificação e sacarificar referem-se ao processo de converter polissacarídeos em monômeros de dextrose com o uso de enzimas. Sacarificação pode se referir à conversão de polissacarídeos em um liquefeito. Os produtos de sacarificação são, por exemplo, glicose e outros oligossacarídeos pequenos (baixo peso molecular), tais como dissacarídeos e trissacarídeos.

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23/131 [0094] O termo SSF refere-se à sacarificação e fermentação simultâneas.

[0095] O termo “coquetel de enzimas refere-se a uma mistura ou combinação de pelo menos duas enzimas diferentes, que tornam mais eficiente e eficaz qualquer reação catalítica.

[0096] Os termos fermentação ou fermentar referem-se ao processo de transformar açúcares de material vegetal reduzido em produtos hortifrutícolas como produto de fermentação.

[0097] O termo produto de fermentação significa um produto produzido por um processo incluindo uma etapa de fermentação com o uso de um organismo de fermentação.

[0098] O termo subproduto” refere-se a um produto secundário derivado de um processo de fabricação ou reação química. O mesmo não é o produto ou serviço primário sendo produzido.

[0099] O termo Isolado significa uma substância em uma forma ou ambiente que nâo ocorre na natureza. Exemplos sem limitação de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância que inclui, porém sem limitação, qualquer célula hospedeira, enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que seja pelo menos parcialmente removido de um ou mais ou todos os constituintes de ocorrência natural com o qual está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem com relação àquela substância encontrada na natureza: ou (4) qualquer substância modificada aumentando-se a quantidade da substância com relação a outros componentes com os quais está naturalmente associada. Os termos molécula de ácido nucleico isolado, polinucleotídeo isolado e fragmento de ácido nucleico isolado serão usados de modo intercambiável e se referem a um polímero de RNA ou DNA que é de fita única ou dupla que contém, opcionalmente, bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Uma molé

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24/131 cuia de ácido nucleico isolada na forma de um polímero de DNA pode ser compreendida por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.

[00100] O termo purificado conforme aplicado a ácidos nucleicos ou polipeptídeos denota, de modo geral, um ácido nucleico ou polipeptídeo que é essencialmente isento de outros componentes, conforme determinado por técnicas analíticas bem conhecidas na técnica (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo purificado forma uma banda discreta em um gel eietroforético, eluato cromatográfico e/ou um meio submetido a centrifugação de gradiente de densidade). Por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo que origina essencialmente uma banda em um gel eietroforético é purificado. Um ácido nucleico ou polipeptídeo purificado é pelo menos cerca de 50% puro, normalmente pelo menos cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 99,5%, cerca de 99,6%, cerca de 99,7%, cerca de 99,8% ou mais puro (por exemplo, porcentagem em peso em uma base molar). Em um sentido relacionado, uma composição é enriquecida para uma molécula quando há um aumento substancial na concentração da molécula após aplicação de uma técnica de purificação ou enriquecimento. O termo enriquecido se refere a um composto, polipeptídeo, célula, ácido nucleico, aminoácido ou outro material ou componente especificado que está presente em uma composição em uma concentração relativa ou absoluta que é superior a uma composição de partida.

[00101] O termo micro-organismo de alimentação direta (DFM) conforme usado no presente documento é fonte de micro-organismos de ocorrência natural vivos (viáveis). Em particular, um DFM pode ser adicionado a um alimento ou ração como uma fonte de micro

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25/131 organismos vivos de ocorrência natural para o animal para o qual o alimento ou ração é destinada. Um DFM pode compreender um ou mais dos tais micro-organismos vivos de ocorrência natural, em particular cepas bacterianas ou fúngicas. Categorias de DFMs incluem bactérias do gênero Bacillus, bactérias e leveduras de ácido lático. Assim, o termo DFM engloba uma ou mais dentre as seguintes: bactérias de alimentação direta, levedura de alimentação direta e combinações das mesmas.

[00102] DFMs podem compreender, em particular, bacilli na forma de esporos. Bacilli formam esporos sob determinadas condições ambientais, normalmente estresse causado, por exemplo, pela falta de nutrientes. Tais esporos estão metabolicamente inativos e têm capacidade para suportar condições ambientais extremas, tais como calor intenso e pHs altos e baixos. Quando ingeridos por um animal, tais esporos germinam em células vegetativas ativas. Esporos de Bacillus podem ser usados em produtos de refeição e alimentícios peletizados. Tais esporos devem, obviamente, ser de espécie não patogênica e cepas de Bacillus.

[00103] As bactérias de ácido lático são bactérias gram positivas de diversas cepas e gêneros que produzem ácido lático como um produto final maior do metabolismo de carboidrato. Acredita-se que a presença de bactérias de ácido lático em produtos alimentícios seja antagonístíca ao crescimento de espécies bacterianas patogênicas. Bactérias de ácido lático têm capacidade para crescer em pH baixo, porém, tendem a ser sensíveis ao calor, o que significa que podem ser inadequados para inclusão em produtos alimentícios granulados. Tipos de bactérias de ácido lático incluem espécies dos gêneros Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus e Streptococcus.

[00104] O termo pré-biótico significa um não ingrediente de alimento digestivo que afeta de maneira benéfica o hospedeiro estimu

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26/131 lando-se seletivamente o crescimento e/ou a atividade de uma ou um número limitado de bactérias benéficas em um animal que consome ο pré-biótico. Em particular, um pré-biótico pode estimular seletivamente o crescimento e/ou atividade de espécie benéfica de bactérias na microflora intestinal de um animal que consome o pré-biótico. O termo bactérias benéficas significa espécies de bactérias, o crescimento dessas em um animal, particularmente na microflora intestinal de um animal, é benéfico para esse animal. Em particular, tais bactérias podem ser benéficas para a função e/ou saúde do sistema digestivo do animal (por exemplo, evitar disbiose ou colonização do intestino com espécie patogênica), para o metabolismo animal (por exemplo, podem promover crescimento saudável do animal) e/ou para a função do sistema imunológico do animal. Em particular, pré-bióticos podem aumentar o número de atividade de Bifidobacteria e bactérias de ácido lático no intestino de um animal que consome um pré-biótico.

[00105] O termo cultura probiótica conforme usado no presente documento se refere a uma cultura de micro-organismos vivos (que incluem bactérias ou leveduras, por exemplo) que, quando, por exemplo, ingeridos ou aplicados de maneira local em quantidades suficientes, afeta de maneira benéfica o organismo-recipiente, por exemplo, conferindo-se um ou mais benefícios para a saúde demonstráveis no organismo hospedeiro. Probiótlcos podem melhorar o saldo microbiano em uma ou mais superfícies da mucosa. Por exemplo, a superfície da mucosa pode ser o intestino, o trato urinário, o trato respiratório ou a pele. O termo probiótico conforme usado no presente documento também engloba micro-organismos vivos que podem estimular as ramificações benéficas do sistema imunológico e ao mesmo tempo diminuir as reações inflamatórias em uma superfície da mucosa, por exemplo, o intestino. Enquanto não há nenhum limite inferior ou superior para ingestão probiótica, sugere-se que pelo menos 10⁶ a 10¹²,

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27/131 preferencialmente pelo menos 10⁶ a 1O¹⁰, preferencialmente 10⁸ a 10⁹de unidades formadoras de colônia (ufc) como uma dose diária seja eficaz para obter os efeitos benéficos de saúde em um indivíduo. Probióticos podem compreender, particularmente, bactérias do gênero Bifidobacterium e bactérias de ácido lático, tais como aquelas do gênero Lactobacillus. Leveduras do gênero Saccharomyces também podem ter efeitos benéficos quando consumidas por um animal e, assim, estar compreendidas em um probiótico.

[00106] O termo unidade formadora de colônia” (CFU) é uma medida de número variável, em que uma colônia representa um agregado de células derivadas de uma única célula progenitora.

[00107] Uma proproteína (pró-proteína) ou proenzima (pró-enzima) é uma forma imatura de uma proteína ou enzima. Uma pró-proteína não compreende um peptídeo sinal (seja codificado sem um peptídeo sinal ou seja a sequência de polipeptídeos que permanece depois da divagem de um peptídeo sinal). Uma pró-proteína ou pró-enzima compreende uma sequência de aminoácidos em uma ou outra terminação (isto é, sua terminação N ou terminação C) que é necessária para o enovelamento apropriado e/ou secreção da proteína ou é usada para manter uma proteína ou enzima em forma inativa ou semelhantes. Essa sequência de aminoácidos é denominada no presente documento uma proenzima. Uma pró-proteína ou pró-enzima é convertida em sua forma madura por divagem que separa a sequência de proteínas madura e ativa de seu fragmento de pró-peptídeo (pró-domínio). Proteases são expressas, frequentemente, como pró-enzimas, que são ativadas apenas quando convertidas em sua forma madura por divagem para remover o pró-peptídeo.

[00108] Os termos sequência sinal e peptídeo sinal se referem a uma sequência de resíduos de aminoácido que pode participar na secreção ou transporte direto da forma madura ou precursora de uma

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28/131 proteína, isto é, uma sequência de resíduos de aminoácido que marca um polipeptideo para secreção. A sequência de sinalização está tipicamente localizada no terminal N da sequência de proteínas precursora ou madura. A sequência sinal pode ser endógena (uma sequência sinal nativamente codificada pelo gene para a proteína precursora) ou exógena (uma sequência sinal nativamente codificada como parte de uma diferente sequência genética, ou uma sequência sinal artificial). Uma sequência sinal está normalmente ausente da proteína madura. Uma sequência sinal é tipicamente clivada da proteína por uma peptidase sinal após a proteína ser transportada. Uma pré-proenzima ou polipeptideo precursor é um produto de tradução que consiste em uma sequência sinal, pró-peptídeo e sequências maduras.

[00109] Uma proteína com uma sequência sinal é conhecida como uma pré-proproteína ou pré-proenzima. Em alguns casos, divagem da sequência sinal pode produzir a forma madura da proteína. Uma proteína sintetizada na forma de uma pró-proteína com uma sequência sinal é conhecida como uma pré-proproteína (ou no caso de uma enzima, uma pré-proenzima). Clivagem da sequência sinal de uma préproproteína deixa uma pró-proteína, que pode, então, ser subsequentemente processado adicionalmente para render a proteína madura.

[00110] A forma madura de uma proteína ou polipeptideo, conforme usado no presente documento, é a forma funcional de uma proteína, polipeptideo ou enzima a partir da qual uma sequência sinal e/ou fragmento de pró-peptídeo foi clivado. Uma proteína madura não contém uma sequência sinal ou fragmento de pró-peptídeo. Préproteínas e pré-pró-proteínas (isto é, qualquer polipeptideo que compreende uma sequência sinal ou um fragmento de pró-peptídeo) podem ser denominadas proteínas precursoras.

[00111] No caso dos polipeptídeos da presente invenção, a sequência de aminoácidos da enzima TnaProl madura (isto é, a forma

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29/131 ativa da enzima sem a (pré) sequência sinal, e sem a (pro) sequência de pró-domínio) é apresentada na SEQ ID NO: 3; a sequência de aminoácidos da pró-proteína (isto é, sem a sequência sinal, porém, com a pró sequência) é apresentada na SEQ ID NO: 8, a sequência de aminoácidos da proteína de precursor TnaProl de complemento completo expressa nessa avaliação é apresentada na SEQ ID NO: 5, enquanto a sequência de aminoácidos da proteína de precursor TnaProl de comprimento completo identificada em bactérias Thermococeus nautili é apresentada na SEQ ID NO: 2.

[00112] O termo tipo selvagem em referência a uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos indica que a sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos é uma sequência nativa ou de ocorrência natural. Conforme usado no presente documento, o termo de ocorrência natural se refere a qualquer elemento (por exemplo, sequências de proteínas, aminoácidos ou ácidos nucleicos) que seja encontrado na natureza. Por outro lado, o termo de ocorrência não natural (ou não nativo) se refere a qualquer elemento que não seja encontrado na natureza (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos e proteínas recombinantes produzidas em laboratório ou modificação da sequência de tipo selvagem).

[00113] Os termos derivado de e obtido a partir de se referem não só a uma proteína produzida ou produzível por uma cepa do organismo em questão, mas também a uma proteína codificada por uma sequência de DNA isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro que contém tal sequência de DNA. Adicionalmente, o termo refere-se a uma proteína que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou de cDNA e que tem as características identificadoras da proteína em questão.

[00114] Deve ser reconhecido, por uma pessoa de habilidade comum na técnica, que modificações de sequências de aminoácidos re

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30/131 veladas no presente documento podem ser feitas enquanto se mantém a função associada às sequências de aminoácidos reveladas. Por exemplo, são bem conhecidas na técnica que as alterações em um gene que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalente em um dado sítio, porém, não afetam as propriedades funcionais da proteína codificada são comuns. Por exemplo, qualquer aminoácido particular em uma sequência de aminoácidos revelada no presente documento pode ser substituído por outro aminoácido funcionalmente equivalente. Para os fins desta descrição, aminoácidos funcionalmente equivalentes se referem a aminoácidos que pertencem ao mesmo dentre os seguintes cinco grupos:

1. Resíduos ligeiramente polares ou não polares, alifáticos pequenos: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

2. Resíduos negativamente carregados, polares e amidas dos mesmos: Asp, Asn, Glu, Gin;

3. Resíduos positivamente carregados, polares: His, Arg, Lys;

4. Resíduos não polares, alifáticos grandes: Met, Leu, lie, Vai, Cys; e

5. Resíduos aromáticos grandes: Phe, Tyr e Trp.

[00115] Em muitos casos, também não se espera que alterações de nucleotídeo que resultam em alteração das porções N-terminal e Cterminal da molécula de proteína alterem a atividade da proteína.

[00116] O termo códon otimizado se refere a genes ou regiões codificadoras de moléculas de ácido nucleico para transformação de vários hospedeiros, em que os códons presentes no gene ou região codificadora da molécula de ácido nucleico são alterados para refletir o uso de códon típico do organismo hospedeiro sem alterar a sequência do polipeptídeo para o qual o DNA se codifica. Conforme será reconhecido por uma pessoa de habilidade comum na técnica, tais altera

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31/131 ções de códon são possíveis devido à natureza degenerada do código de ácido nucleico. Tal modificação de uma sequência de ácidos nucleicos pode ser facilmente alcançada com o uso de técnicas comuns na técnica.

[00117] O termo gene se refere a uma molécula de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, que inclui sequências reguladoras anteriores (sequências não codificadoras de 5’) e seguintes (sequências não codificadoras de 3') à sequência codificadora. Gene nativo se refere a um gene conforme encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. Geme quimérico se refere a qualquer gene que não seja um gene nativo, que compreende sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Gene endógeno refere-se a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. Um gene externo se refere a um gene não encontrado normalmente no organismo hospedeiro, porém, introduzido no organismo hospedeiro por transferência genética. Os genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. Um transgene é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação.

[00118] A partir dessa definição será verificado que o construto recombinante, conforme descrito no presente documento pode compreender, ou representar, um gene quimérico. Em particular, o gene quimérico, (que também pode ser definido como uma sequência de nucleotídeos quimérica) compreende uma sequência de nucleotídeos codificadora que codifica a serina protease termoestável ligada (mais

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32/131 particularmente, ligada operacionalmente) a uma sequência reguladora com a qual, ou de uma maneira que, não ocorre na natureza.

[00119] O termo sequência codificadora se refere a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos específica. Sequências reguladoras adequadas se referem a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências não codificadoras de 5'), dentro ou a jusante (sequências não codificadoras de 3') de uma sequência codificadora, e que influenciam a transcrição, processamento de RNA ou estabilidade, ou tradução da sequência codificadora associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, sítio de processamento de RNA, sítios de ligação efetoras e estruturas de alça em formiato de grampo.

[00120] O termo operacionalmente ligado se refere à associação de sequências de ácidos nucleicos em uma única molécula de ácido nucleico de modo que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência codificadora quando tem capacidade para afetar a expressão daquela sequência codificadora, isto é, a sequência codificadora está sob o controle transcricional do promotor. Sequências codificadoras podem ser operacionalmente ligadas às sequências reguladoras na orientação de sentido ou antissenso.

[00121] Os termos sequência reguladora ou sequência de controle são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a um segmento de uma sequência de nucleotídeos que tem capacidade para aumentar ou diminuir a expressão de genes específicos dentro de um organismo. Exemplos de sequências reguladoras incluem, porém sem limitação, promotores, sequências sinal, operadores e semelhantes. Conforme observado acima, as sequências reguladoras podem ser operacionalmente ligadas na orientação de sentido ou antissenso na sequência codificadora de interesse.

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33/131 [00122] Promotor ou sequências promotoras se referem a sequências de DNA que definem onde a transcrição de um gene por RNA polimerase começa. Sequências promotoras estão tipicamente localizadas diretamente a montante ou na extremidade 5' do sítio de iniciação de transcrição. Os promotores podem ser derivados na sua totalidade de uma sequência nativa ou de ocorrência natural ou podem ser compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza ou ainda compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de célula ou em diferentes estágios de desenvolvimento ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas (promotores induzíveis).

[00123] As sequências não codificadoras de 3’ se referem a sequências de DNA localizadas a jusante de uma sequência codificadora e incluem sequências que codificam sinais reguladores que têm capacidade para afetar o processamento de mRNA ou expressão genética, tal como terminação de transcrição.

[00124] O termo transformação, conforme usado no presente documento, se refere à transferência ou introdução de uma molécula de ácido nucleico em um organismo hospedeiro. A molécula de ácido nucleic© pode ser introduzida como uma forma linear ou circular de DNA. A molécula de ácido nucleico pode ser um plasmídeo que se replica autonomamente, ou pode se integrar ao genoma de um hospedeiro de produção. Os hospedeiros de produção que contêm o ácido nucleico transformado são denominados organismos transformados ou re~ combinantes ou transgênicos ou transformantes.

[00125] O termo recombinante conforme usado no presente documento se refere a uma combinação artificial de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos de outra forma separadas. As duas ou

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34/131 mais sequências de ácidos nucleicos podem ser montadas juntas, por exemplo, através de síntese química ou da manipulação de ácidos nucleicos ou segmentos isolados de ácidos nucleicos com o uso de técnicas de modificação genética. As duas ou mais sequências de ácidos nucleicos podem ser sequências nativas, sequências artificiais ou uma combinação das duas. DNA que foi artificialmente manipulado, por exemplo, para reordenar sequências de dentro de uma molécula, para alterar a sequência de uma molécula, para combinar sequências de duas ou mais moléculas diferentes, para combinar as sequências de duas ou mais moléculas diferentes, para remover uma ou mais sequências de uma molécula ou qualquer outra manipulação de sequência, ou qualquer combinação do supracitado, é uma moiécula de DNA recombinante. Assim, uma sequência de DNA recombinante, que inclui o construto recombinante da invenção, tem uma sequência não encontrada na natureza. Um organismo no qual uma molécula de DNA recombinante (ou construto recombinante) foi introduzida é um organismo recombinante. Os termos recombinante, transgênico, transformado, projetado ou modificado para expressão de gene exógeno” são usados de modo intercambiável no presente documento com relação a organismos.

[00126] Os termos construto recombinante”, construto de expressão, construto de expressão recombinante e cassete de expressão são usados de modo intercambiável no presente documento. Um construto recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, por exemplo, sequências reguladoras e codificadoras que não se encontram todas juntas na natureza. Por exemplo, um construto pode compreender sequências reguladoras e sequências codificantes que são derivadas de diferentes fontes, ou sequências reguladoras e sequências codificantes derivadas da mesma fonte, porém, dispostas de uma maneira diferente daquela encon

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35/131 trada na natureza. Tal construto pode ser usado por si só ou pode ser usado em conjunto com um vetor. Se um vetor é usado, então, a escolha de vetor é dependente do método que será usado para transformar células hospedeiras, conforme bem conhecido por aqueles versados na técnica e com o propósito dessa transformação. Por exemplo, um vetor de plasmídeo pode ser usado. O indivíduo versado na técnica está ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor a fim de transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras. O especialista habilidoso também reconhecerá que diferentes eventos de transformação independentes podem resultar em diferentes níveis e modelos de expressão (Jones et al., (1985) EMBO J 4:2.411 a 2.418; De Almeida et at., (1989) Mol Gen Genetics 218:78 a 86) e, assim, que diversos eventos são tipicamente examinados de modo a obter linhas que exibem o nívei e modelo de expressão desejáveis. Tal exame pode ser realizado com o uso de ensaios biológicos moleculares padrão, bioquímicos e outros ensaios que incluem análise Southern de DNA, análise Northern de expressão de mRNA, PCR, PCR quantitativo em tempo real (qPCR), transcrição reversa de PCR (RT-PCR), análise immunoblotting de expressão de proteína, ensaios de enzima ou atividade, e/ou análise fenotípica.

[00127] O termo vetor se refere a uma molécula de DNA usada como um veículo para introduzir material genético externo em uma célula. Um vetor pode, por exemplo, ser um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. Vetores incluem plasmídeos, sequências autonomamente replicantes, elementos transponíveis, fagomídeos, cosmídeos, cromossomos artificiais, tais como um cromossomo artificial de levedura (YAC), um cromossomo artificial bacteriano (BAC), ou um cromossomo artificial derivado de PI (PAG), bacteriófagos, tais como lambda fago ou Ml 3 fago, e vírus animal. Um vetor pode ser uma sequência de integração de genoma ou pode ser mantida de maneira

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36/131 extracromossômica em uma célula. Pode ser linear ou circular, e compreender ou consistir em DNA ou RNA de fita única ou dupla.

[00128] Um cassete de transformação se refere a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionais ao gene que facilitam transformação de uma célula hospedeira particular. Os termos cassete de expressão e vetor de expressão são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionais ao gene que permitem expressão daquele gene em um hospedeiro.

[00129] Um vetor de expressão pode ser um dentre vários vetores ou cassetes úteis para a transformação de hospedeiros de produção adequados conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou o cassete incluirão sequências que direcionam a transcrição e a tradução do gene relevante, um marcador seiecionável e sequências que permitem replicação autônoma ou integração cromossômica. Vetores adequados incluem geralmente uma região 5' do gene que abriga controles de iniciação transcricional e uma região 3' do fragmento de DNA que controla terminação transcricional. Ambas regiões de controle podem ser derivadas de genes homólogos àqueles da célula hospedeira de produção transformada e/ou genes nativos ao hospedeiro de produção, embora tais regiões de controle não precisem ser derivadas.

[00130] Regiões de controle de iniciação possíveis ou promotores que podem ser incluídos no vetor de expressão são numerosos e familiares para aqueles indivíduos versados na técnica. Virtualmente, qualquer promotor que tem capacidade para conduzir expressão genética é adequado, incluindo, porém sem limitação, CYC1, H1S3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPi (úteis para a expressão em Saccharomyces'y, A0X1 (útil para a expressão em Píchia); e /ac, arafí, tet, trp, IPl, IPr, T7, tac e trc (úteis para a expressão em Escherichia coli) assim como os promoto

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37/131 res amy, apr, npr e vários promotores de fago úteis para a expressão em Bacillus. O promotor deve ser adequado para conduzir expressão do gene relevante no hospedeiro de produção a ser usado. O promotor pode ser um promotor constitutivo ou induzível. Um promotor constitutivo é um promotor que é ativo sob a maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor induzível ou reprimível é um promotor que é ativo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento. Em algumas modalidades, promotores são induzíveis ou reprimíveis devido a mudanças em fatores ambientais incluindo, porém sem limitação, a disponibilidade de carbono, nitrogênio ou outro nutriente, temperatura, pH, osmolaridade, a presença de metal (ou metais) pesado, a concentração de inibidor (ou inibidores), tensão ou uma combinação dos anteriores, conforme conhecido na técnica. Em algumas modalidades, os promotores induzíveis ou reprimíveis são induzíveis ou reprimíveis por fatores metabólicos, tais como o nível de determinadas fontes de carbono, o nível de determinadas fontes de energia, o nível de determinados catabólitos ou uma combinação dos anteriores conforme conhecido na técnica. Em uma modalidade, o promotor é um que é nativo à célula hospedeira. Por exemplo, quando T. reesei é o hospedeiro, o promotor é um promotor T. reesei nativo, tal como o promotor de cbh1 que é depositado no GenBank com o Número de Acesso D86235.

[00131] Os exemplos não limitantes adequados de promotores incluem cbh1, cbh2, egl1, eg!2, eg!3, egi4, eglô, xyn1 e xyn2, promotor de gene de fosfatase de ácido reprimível (phoA) de P. chrysogenus (consultar, por exemplo, Graessle et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol., 63 :753 a 756), promotor de PCK1 reprimível de glicose (consultar, por exemplo, Leuker et al., (1997), Gene, 192:235 a 240), promotor de MET3 reprimível por glicose, induzível por maltose (consultar Liu et al., (2006), Eukary. Cell, 5:638 a 649), promotor de pKi e promotor de

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38/131 cpd. Outros exemplos de promotores úteis incluem promotores de genes de glicoamilase de A. awamori e A. niger (consultar, por exemplo, Nunberg et ak, (1984) Mo/. Ce// 8/0/. 15 4:2.306 a 2.315 e Boel et aL, (1984) EMBO J. 3:1.581 a 1.585). Ademais, os promotores do gene xln1 de T. reesei podem ser úteis (consultar, por exemplo, 0 documento EPA 137280AI).

[00132] Os fragmentos de DNA que controlar a terminação transcricional podem ser também derivados de vários genes nativos a uma célula hospedeiro de produção preferencial. Em certas modalidades, a inclusão de uma região de controle de terminação é opcional. Em certas modalidades, 0 vetor de expressão inclui uma região de controle de terminação derivada da célula hospedeira preferencial.

[00133] Os termos hospedeiro de produção, hospedeiro e célula hospedeira são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a qualquer organismo, ou célula do mesmo, seja humana ou não humana, que inclui células procariontes, tais como células bacterianas, em que um construto recombinante pode ser introduzido ou transformado de maneira estável ou transiente de modo a expressar um gene. A célula hospedeira pode, assim, ser qualquer célula hospedeira eucarionte ou procarionte adequada, porém, será tipicamente uma célula hospedeira microbiana, por exemplo, uma célula hospedeira procarionte ou uma célula fúngica (por exemplo, levedura) ou uma célula de mamífero ou linha celular. Quando 0 hospedeiro de produção é um organismo (em vez de ser uma célula hospedeira isolada ou cultivada ou uma linha celular), então, em modalidades particulares, 0 organismo é um organismo não humano ou um organismo não mamífero, e com máxima particularidade, 0 organismo é um micro-organismo. Os termos hospedeiro de produção, hospedeiro e célula hospedeira englobam qualquer progenitura de uma célula parente que não é idêntica à célula parente devido a mutações que ocor

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39/131 rem durante a propagação.

[00134] Transformação estável se refere à transferência de um fragmento de ácido nucleico para um genoma de um organismo hospedeiro, que inclui ambos genomas nuclear e organelar, que resulta em herança geneticamente estável. Por outro lado, transformação transiente se refere à transferência de um fragmento em um organismo hospedeiro, que inclui no núcleo ou em uma organela que contém DNA, de um organismo hospedeiro que resulta em expressão genética sem integração ou herança estável. Organismos hospedeiros que contém ácidos nucleicos transformados podem ser denominados organismos transgênicos.

[00135] O vetor de expressão pode ser introduzido na célula hospedeira, particularmente nas células de hospedeiros microbianos. As células hospedeiras podem ser hospedeiros microbianos encontrados dentro das famílias fúngicas ou bacterianas e que crescem sobre uma ampla faixa de temperatura, valores de pH e tolerâncias de solvente. Por exemplo, é contemplado que qualquer uma das bactérias, algas e fungos, tais como fungos filamentosos e levedura podem hospedar de maneira adequada o vetor de expressão.

[00136] Depois da introdução do vetor de expressão na célula hospedeira, o polipeptideo pode ser expresso de modo que o mesmo resida de modo intracelular, extracelular ou uma combinação de ambos dentro e fora da célula. Se a proteína for uma proteína transmembranar, a mesma pode residir na membrana da célula. Expressão extracelular gera recuperação da proteína desejada de uma cultura do hospedeiro de produção mais superficial que métodos para recuperação de proteína produzida através de expressão intracelular. Proteína que é expressa de modo que a mesma resida na membrana da célula é difícil de recuperar.

[00137] O termo expressão, conforme usado no presente docu

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40/131 mento, se refere à produção de um produto final de um gene (por exemplo, uma molécula de RNA funcional ou uma proteína) na forma precursora ou madura. Assim, a expressão de um gene codificador de proteína se refere à transcrição do gene e tradução do mRNA resultante para render uma proteína.

[00138] Os termos percentual de (%) identidade e percentual (%) de identidade de sequência se referem a uma relação entre duas ou mais sequências de polípeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado pela comparação das sequências. Na técnica, identidade também significa o grau de relação de sequência entre as sequências de polípeptídeos ou polinucleotídeos, conforme possa ser o caso, conforme determinado pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos correlacionados entre as cadeias de tais sequências. Identidade e similaridade podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos, Incluindo, porém sem limitação, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993): Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador publlcamente disponíveis.

[00139] Conforme usado no presente documento, % de identidade de sequência ou percentual de identidade de sequência se referem à identidade de sequência de proteínas ou ácidos nucleicos. A porcentagem de identidade pode ser determinada com o uso de técnicas padrão conhecidas na técnica. Algoritmos úteis incluem os algoritmos

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BLAST (Consultar, Altschul et al., J Mol Biol, 215:403 a 410, 1990; e Karlin e Altschul, Proc Natl Acad Sci, E.U.A., 90:5.873 a 5.787, 1993). O programa BLAST usa diversos parâmetros de pesquisa, a maioria dos quais é definida para os valores padrão. O algoritmo BLAST de NCBI encontra as sequências mais relevantes em termos de similaridade biológica, porém, não é recomendado para sequências de busca de menos de 20 resíduos (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3.389 a 3.402, 1997; e Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2.994 a 3.005, 2001). Os parâmetros BLAST padrão exemplificativos para uma pesquisa de sequência de ácidos nucleicos incluem: Limite de palavras vizinhas = 11; Corte den valor E = 10; Matriz de Pontuação = NUC.3.1 (correspondência = 1, não correspondência = lj3); Abertura de Intervalo = 5; e Extensão de Intervalo = 2. Os parâmetros BLAST padrão exemplificativos para as pesquisas de sequência de aminoácidos incluem: Tamanho de palavra = 3; Corte de valor E = 10; Matriz de Pontuação = BLOSUM62; Abertura de lacuna= 11; e Extensão de lacuna =

1. Um valor de percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos é determinado pelo número de resíduos idênticos correspondentes dividido pelo número total de resíduos da sequência de referência que inclui quaisquer lacunas criadas pelo programa para alinhamento ideal/máximo. Algoritmos BLAST se referem à sequência de referência como a sequência de busca.

[00140] Conforme usado no presente documento, o termo proteínas homólogas” ou proteases homólogas se refere a proteínas que têm similaridade distinta na estrutura primária, secundária e/ou terciária. A homologia da proteína pode se referir à similaridade na sequência de aminoácidos linear quando as proteínas estão alinhadas. A pesquisa homóloga de sequências de proteínas pode ser feita com o uso de BLASTP e PSI-BLAST de NCBI BLAST com limiar (corte de valor E) a 0,001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang

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Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 1 de setembro de 1997; 25(17): 3.389 a 3.402). Com o uso dessas informações, as sequências de proteínas podem ser agrupadas. Uma árvore filogenética pode ser construída com o uso das sequências de aminoácidos.

[00141] Alinhamentos de sequência e cálculos de percentual de identidade podem ser realizados com o uso do programa Megalign da suíte de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl), do programa AlignX de Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc., Bethesda, MD), ou da suíte de software aberto EMBOSS (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276 a 277 (2000)). O alinhamento múltiplo das sequências pode ser realizado com o uso do método CLUSTAL (tal como CLUSTALW; por exemplo, versão 1.83) de alinhamento (Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151 a 153 (1989); Higgins et a!., Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680 (1994); e Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 (13):3.497 a 3.500 (2003)), disponíveis junto ao European Molecular Biology Laboratory por meio do European Bioinformatics Institute) com os parâmetros-padrão. Parâmetros adequados para alinhamentos de proteína CLUSTALW incluem penalidade por existência de lacuna 15, Extensão de lacuna ™ 0,2, matriz = Gonnet (por exemplo, Gonnet250), ENDGAP de proteína = -1, GAPDIST de proteína ··· 4 e KTUPLE ™ 1. Em uma modalidade, um alinhamento rápido ou lento é usado com os ajustes-padrão quando há um alinhamento lento. Alternativamente, os parâmetros que usam o método CLUSTALW (por exemplo, versão 1.83) podem ser modificados para usar também KTUPLE = 1, penalidade por lacuna = 10, extensão de lacuna ™ 1, matriz = BLOSUM (por exemplo, BLOSUM64), janela = 5, e diagonais superiores salvas = 5.

[00142] Várias sequências de aminoácidos de polipeptídeo e se

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43/131 quências de polinucleotídeos são reveladas no presente documento como características de certos aspectos. As variantes dessas sequências que são pelo menos cerca de 70 a 85%, 85 a 90% ou 90% a 95% idênticas às sequências reveladas no presente documento podem ser usadas em certas modalidades. Alternativamente, uma sequência de polipeptídeos ou sequência de polinucleotídeos variante em determinadas modalidades pode ter pelo menos 60%, 61%, 62%,63%,64%, 65%, 66%, 67%, 68%,69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência revelada no presente documento. A sequência de aminoácidos ou sequência de polinucleotídeos variante tem a mesma função da sequência revelada, ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da função da sequência revelada.

[00143] O termo variante, em relação a um polipeptídeo, refere-se a um polipeptídeo que se diferencia de um polipeptídeo de tipo selvagem, original ou de referência especificado em que o mesmo inclui uma ou mais substituições, inserções ou deleções de um aminoácido de ocorrência natural ou feitas pelo homem. Similarmente, o termo variante, em relação a um polinucleotídeo, refere-se a um polinucleotídeo que difere em sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo do tipo selvagem, original ou de referência especificado. A identidade do polipeptídeo ou polinucleotídeo do tipo selvagem, original ou de referência será evidente a partir do contexto.

[00144] Usos industriais de uma serina protease da arqueobactéria Thermococcus nautili foram identificados. A protease recebeu o nome TnaProl. O gene de TnaProl tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1, que corresponde à sequência de comprimento completo da enzima de

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TnaProl, é apresentada na SEQ ID NO: 2. A sequência de DNA da SEQ ID NO: 1 corresponde à NCBI Sequência de Referência: NZ_CP007264.1, bases 1327825-1329105, complementar. A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 é aquela do número de registro GenBank: AHL23118.1.

[00145] A sequência de TnaProl de comprimento completo apresentada na SEQ ID NO: 2 corresponde a uma pré-pró-enzima, isto é, compreende tanto uma sequência sinal quanto um fragmento de próenzima. Os 26 aminoácidos N terminal de TnaProl de comprimento completo (isto é, aminoácidos 1 a 26 da SEQ ID NO: 2) constituem um peptídeo sinal previsto. A sequência de aminoácidos do peptídeo sinal TnaProl previsto é apresentada na SEQ ID NO: 10; a sequência de DNA que codifica nativamente o peptídeo sinal TnaProl é apresentada na SEQ ID NO: 9. A pré-enzima TnaProl, isto é, a proteína de TnaProl depois de divagem do peptídeo sinal, tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, que corresponda aos aminoácidos 27 a 426 da SEQ ID NO: 2. A sequência de DNA que codifica nativamente a pró-enzima TnaProl é apresentada na SEQ ID NO: 7.

[00146] A sequência de DNA que codifica nativamente o fragmento de pró-enzima TnaProl é apresentada na SEQ ID NO: 11.0 fragmento de pró-enzima é clivado da pró-enzima de TnaProl para render a forma ativa e madura da enzima. A forma madura da enzima tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, que corresponde aos aminoácidos 102 a 426 da SEQ ID NO: 2. A sequência de DNA que codifica nativamente a forma madura de TnaProl é apresentada na SEQ ID NO: 6.

[00147] Assim, a parte mínima de TnaProl necessária para fornecer uma serina protease ativa pode ser a forma madura com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3 sozinha ou com a adição de cerca de 3 aminoácidos à terminação N e/ou à terminação C e/ou a

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45/131 deleção de cerca de 3 aminoácidos na terminação N e/ou na terminação C [00148] Consequentemente, em uma primeira modalidade, é descrito um construto recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo termoestável que tem atividade de serina protease, sendo que a dita sequência de nucleotídeos codificadora é operacionalmente ligada a pelo menos uma sequência reguladora funcional em um hospedeiro de produção, e a sequência de nucleotídeos codifica um polipeptideo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou um polipeptideo com pelo menos 92% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma;

[00149] e sendo que a dita sequência reguladora é heteróloga à sequência de nucleotídeos codificadora ou a dita sequência reguladora e a dita sequência codificadora não estão dispostas como encontradas juntas na natureza.

[00150] Em uma segunda modalidade, o nucleotídeo codificador de qualquer um dos construtos recombinantes descritos aqui é uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, ou um polipeptideo com pelo menos 89% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma.

[00151] Em um terceiro aspecto, a sequência de nucleotídeos codificadora é selecionada dentre o grupo que consiste em:

i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, ou um polipeptideo com pelo menos 86% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma; ou il) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:5

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46/131 ou 14, ou um polipeptideo com pelo menos 84% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma.

[00152] Ademais, a pelo menos uma sequência reguladora compreende um promotor.

[00153] A frase dita sequência reguladora é heteróloga com a sequência de nucleotídeos codificadora significa que a sequência reguladora não ocorre com a sequência codificadora na natureza. Em outras palavras, não é uma sequência reguladora nativa que ocorre no gene de TnaProl como está presente em uma célula de Thermococcus nautili nativa, ou, alternativamente expressa, não é a sequência reguladora que ocorre com a sequência codificadora no gene endógeno nativo. Ainda expresso de maneira diferente, não é a sequência reguladora endógena nativa do gene de TnaProl. Em uma modalidade particular, a sequência reguladora é obtida a partir de uma espécie diferente para a espécies da qual a sequência de nucleotídeos codificadora é obtida. A sequência de nucleotídeos codificadora é o gene de TnaProl ou uma variante do mesmo. Conforme mencionado acima, TnaProl é nativamente codificado por Thermococcus nautili. Assim, uma sequência reguladora heteróloga ao nucleotídeo codificador pode ser uma sequência reguladora que é obtida a partir de uma espécie diferente de T nautili, ou uma sequência reguladora artificial.

[00154] Para que a sequência reguladora e a sequência codificadora não estejam dispostas conforme encontradas na natureza, significa meramente que as sequências reguladoras e codificantes no construto recombinante não estão dispostas de maneira idêntica na disposição do gene de TnaProl em T. nautili. Assim, se a sequência codificadora para a serina protease é operacionalmente ligada a uma sequência reguladora de uma espécie que não seja T. nautili, essa exigência será inevitavelmente correspondida. No entanto, não é uma exigência que a sequência reguladora seja de uma espécie diferente de T. nautili. A

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47/131 mesma pode ser uma sequência reguladora de T. nautili que regula nativamente a expressão de um gene diferente (isto é, um gene que não seja TnaProl), por exemplo, um gene de manutenção, tal como RNA polimerase ou semelhantes. Alternativamente, no construto recombinante da invenção, a sequência codificadora de serina protease pode ser operacionalmente ligada a uma sequência reguladora que é nativa ao gene TnaProl, por exemplo, o promotor de TnaProl, de modo que a disposição das sequências reguladoras e codificadoras seja diferente daquela encontrada na natureza. A disposição pode diferir na sequência da sequência reguladora, por exemplo, o promotor de TnaProl nativo pode ser alterado para alterar, por exemplo, aprimorar, sua atividade. Alternativamente, o afastamento entre as sequências reguladoras e codificadoras pode ser diferente daquele encontrado na natureza.

[00155] A sequência reguladora pode ser qualquer sequência que seja necessária ou vantajosa para a expressão do polipeptídeo de serina protease, isto é, pode ser qualquer sequência de controle de expressão. Tais sequências reguladoras incluem, porém sem limitação, uma sequência líder, uma sequência poliadenilação, uma sequência de fragmento de propeptídeos, uma sequência promotora, uma sequência sinal e um terminador de transcrição.

[00156] Em uma modalidade preferencial da invenção, a pelo menos uma sequência reguladora operacionalmente ligada à sequência codificadora que codifica a serina protease compreende um promotor. O promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor induzível, conforme definido no presente documento. Tal promotor pode ser particularmente uma sequência promotora reconhecida por uma célula hospedeira bacteriana, ou uma célula hospedeira bacteriana particular ou específica ou grupo de células hospedeiras. Em uma modalidade particular, o promotor pode ser derivado de ou reconhecido por uma

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48/131 célula hospedeira de Bacillus. A região promotora pode compreender um único promotor ou uma combinação de promotores. Quando a região promotora compreende uma combinação de promotores, os promotores estão preferencialmente em tandem. Um promotor da região promotora é preferencialmente um promotor que possa iniciar transcrição de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade biológica em uma célula hospedeira Bacillus de interesse. Tal promotor pode, particularmente, ser obtido de genes de Bacillus nativos, particularmente genes de B. subtilis nativos, que direcionam expressão de polipeptídeos que têm atividade biológica. A sequência reguladora também pode compreender, ou compreende altemativamente, um terminador, uma sequência operadora ou qualquer outra sequência reguladora, conforme definido no presente documento.

[00157] Assim, em determinadas modalidades, a pelo menos uma sequência reguladora operacionalmente ligada à sequência codificadora que codifica a serina protease compreende um promotor obtido de uma fonte bacteriana. Fontes bacterianas possíveis incluem bactérias gram positivas e gram negativas. Bactérias gram positivas incluem, porém sem limitação, aquelas dos gêneros Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus e Oceanobacillus. Bactérias gram negativas incluem, porém sem limitação, E. coli e aquelas dos gêneros Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, llyobacter, Neisseria e Ureaplasma. A região promotora pode compreender um promotor obtido a partir de uma espécie ou cepa de Bacillus (por exemplo, Bacillus agaradherens, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megateríum, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus

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49/131 thuringiensis) ou de uma cepa de Streptomyces (por exemplo, Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus).

[00158] Exemplos de promotores adequados para direcionar transcrição de um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo que tem atividade biológica nos métodos da presente descrição são os promotores obtidos a partir do operão /ac de E. coll, gene agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), gene de protease alcalina de Bacillus lentus ou Bacillus clausii (aprH), gene de protease alcalina de Bacillus licheniformis (gene Carlsberg de subtilisina), gene levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), gene alfa-amilase de Bacillus subtilis (amyE), gene alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene tenebfionis CrylllA de subespécie de Bacillus thuringiensis (crylllA) ou porções dos mesmos, gene beta-lactamase procariótico (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences E.U.A. 75:3.727 a 3.731), e gene xylA de Bacillus megaterium (Rygus e Hillen, 1992, J. Bacterio!. 174: 3.049 a 3.055; Kim et al., 1996, Gene 181: 71 a 76). Outros exemplos são o promotor do promotor de fago bacteriano spo1 e o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21 a 25). Promotores adicionais são descritos em Useful proteins from recombinant bacteria em Scientific American, 1980, 242:74 a 94; e em Sambrook, Fritsch e Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^a edição, Cold Spring Harbor, N.Y. Um promotor preferencial é o promotor aprE de B. subtilis de tipo selvagem, um promotor aprE mutante ou um promotor aprE de consenso, conforme apresentado na Publicação Internacional PCT n° WO 2001/51643. Outros incluem o promotor spoVG de B. subtilis, um promotor spoVG mutante ou um promotor spoVG de consenso (Frisby

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50/131 e Zuber, 1991).

[00159] O promotor pode ser um promotor ribossômico, tal como um promotor de RNA ribossômico ou um promotor de proteína ribossômica. O promotor de RNA ribossômico pode ser um promotor rrn derivado de B. subtilis, mais particularmente, o promotor rrn pode ser um promotor ribossômico rrnB, rrn! ou rrnE de B. subtilis. Em determinadas modalidades, o promotor de RNA ribossômico é um promotor rrnl P2 de B. subtilis conforme apresentado na Publicação Internacional PCT n° WO2013/086219.

[00160] A região promotora pode compreender um promotor que é um promotor consenso que tem a sequência TTGACA para a região -35 e TATAAT para a região -10. O promotor consenso pode ser obtido a partir de qualquer promotor que possa funcionar em uma célula hospedeira de Bacillus. A construção de um promotor de consenso pode ser realizada por mutagênese de sítio direcionado com o uso de métodos bem conhecidos na técnica para criar um promotor que se conforma mais perfeitamente nas sequências de consenso estabelecidas para as regiões -10 e -35 dos promotores do tipo sigma A vegetativos para Bacillus subtilis (Voskuil et ah, 1995, Molecular Microbiology 17: 271 a 279).

[00161] A pelo menos uma sequência reguladora operacionalmente ligada à sequência codificadora que codifica a serina protease também pode compreender, ou compreende alternativamente, uma sequência terminadora de transcrição adequada, tal como uma sequência reconhecida por uma célula hospedeira bacteriana (por exemplo, uma célula hospedeira de Bacillus) para terminar a transcrição. Uma sequência terminadora é operacionalmente ligada à terminação 3' da sequência de nucleotídeos que codifica uma serina protease termoestável. Preferencialmente, um terminador que é funcional em uma célula hospedeira de Bacillus ou uma célula hospedeira E. coli pode ser usada.

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51/131 [00162] A sequência reguladora (que também pode ser denominada uma sequência de controle, ou sequência de controle de expressão) também pode ser, ou incluir, uma sequência líder adequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução por uma célula hospedeira, em particular uma célula hospedeira bacteriana, tal como uma célula hospedeira de Backus ou uma célula hospedeira E. coli. A sequência líder é ligada de maneira funcional à terminação 5' da sequência de nucleotídeos que direcionada a síntese do polipeptídeo que tem atividade biológica. Qualquer sequência líder que é funcional em uma célula hospedeira de escolha (por exemplo, uma célula hospedeira microbiana, bacteriana ou de Bacillus) pode ser usada na presente invenção.

[00163] A pelo menos uma sequência reguladora também pode compreender, ou compreende alternativamente, uma sequência estabilizadora de mRNA. O termo sequência estabilizadora de mRNA é definido no presente documento como uma sequência localizada a jusante de uma região promotora e a montante de uma sequência codificadora de um polinucleotídeo que codifica uma serina protease termoestável à qual a região promotora é operacionaimente ligada, de modo que todos os mRNAs sintetizados da região promotora possam ser processados para gerar transcrições de mRNA com uma sequência estabilizadora na extremidade 5' das transcrições. Por exemplo, a presença de tal sequência estabilizadora na extremidade 5’ das transcrições de mRNA aumenta sua meia-vida (Agaisse e Lereclus, 1994, supra, Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3.465 a 3.471). Ο processamento/sequência estabilizadora de mRNA é complementar à extremidade 3' de RNA ribossômico 16S bacteriano. Em determinadas modalidades, o processamento/sequência estabilizadora de mRNA gera essencialmente transcrições de tamanho único com uma sequência estabilizadora na extremidade 5' das transcrições. O processamen

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52/131 to/sequência estabilizadora de mRNA é preferencialmente uma que é complementar à extremidade 3' de um RNA ribossômíco 16S bacteriano. Consultar os documentos de Patente n° U.S. 6.255.076 e U.S. 5.955.310.

[00164] Sequências reguladoras podem ser fornecidas com ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação ou as sequências reguladoras com a região de codificação da sequência de nucleotídeos que codifica uma serina protease termoestável. No construto recombinante da invenção, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo termoestável que tem atividade de serina protease pode ser operacionalmente ligada a uma ou mais sequências reguladoras que têm capacidade para direcionar a expressão da sequência codificadora em uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula hospedeira de Bacillus, particularmente uma célula de B. subtilis, sob condições compatíveis com as sequências reguladoras.

[00165] A sequência codificadora de serina protease termoestável no construto recombinante codifica um polipeptideo com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou um polipeptideo com pelo menos 92% de identidade de sequência com a mesma. Em modalidades particulares, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptideo termoestável com atividade de serina protease é de códon otimizado para expressão da sequência de nucleotídeos em uma célula hospedeira não nativa. Em particular, a sequência de nucleotídeos pode ser de códon otimizado para expressão em um procarionte, tal como Escherichia coll ou Baciiius subtilis. Técnicas para modificar sequências de ácido nucleico que usam métodos de clonagem são bem conhecidas na técnica.

[00166] Em modalidades particulares, o polipeptideo termoestável que tem atividade de serina protease codificada pela sequência codifi

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53/131 cadora do construto recombinante da invenção é codificado na forma de uma pró-enzima. O fragmento de pró-enzima da pró-enzima pode ser codificado em sua terminação N ou em sua terminação C. Preferencialmente, o fragmento de pró-enzima está localizado na terminação N da pró-enzima.

[00167] Em uma modalidade particular da invenção, a sequência de nucleotídeos codificadora do construto recombinante é uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, ou um polipeptídeo com pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma.

[00168] Nessa modalidade particular, a pró-enzima é a pró-enzima de TnaProl nativa ou uma variante da mesma. É necessário em qualquer variante da pró-enzima de TnaProl que o fragmento de próenzima seja clivável a partir da sequência de enzima madura. Assim, é preferencial que em qualquer variante da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma variante da SEQ ID NO: 8, a sequência que codifica o sítio de divagem de pró-enzima esteja inalterado, ou pelo menos que a sequência que a mesma codifica esteja inalterado, de modo que o sítio de divagem na pró-enzima expressa a partir do construto esteja inalterado e reconhecido para divagem, de modo que a pró-enzima possa ser processada corretamente em sua forma ativa e madura.

[00169] O polipeptídeo termoestável que tem atividade de serina protease codificado pela sequência codificadora do construto recombinante descrito no presente documento pode ser codificado de modo que compreenda um peptídeo sinal, isto é, codificado como uma préenzima ou uma pré-pró-enzima. Preferencialmente, o polipeptídeo termoestável que tem atividade de serina protease é codificado como

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54/131 uma pré-pró-enzima, que compreende da terminação N à terminação C um peptídeo sinal, um fragmento de pró-enzima e a sequência de enzima madura. Preferencialmente, a sequência de pró-enzima é conforme definida acima. Em um aspecto dessa modalidade, a sequência sinal é aquela da proteína de TnaProl nativa, isto é, tem a sequência de polipeptídeos apresentada na SEQ ID NO: 10. Assim, em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos codificadora no construto recombinante da invenção é uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, ou um polipeptídeo com pelo menos 70 % 75 %, 80 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%,90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma.

[00170] A sequência sinal pode ser alternativamente, no entanto, uma sequência sinal de qualquer outro gene ou organismo, ou uma sequência sinal artificial. Em particular, a sequência sinal pode ser uma sequência sinal nativa para a célula hospedeira na qual o polipeptídeo termoestável que tem atividade de serina protease deve ser expresso. Por exemplo, a sequência sinal pode ser uma sequência sinal de E. coli ou B. subtilis. Tais sequências sinal são bem conhecidas e facilmente disponíveis para aqueles na técnica. Em uma modalidade particular da invenção, o polipeptídeo termoestável que tem atividade de serina protease é codificado como uma pré-pró-enzima, em que a sequência de pró-enzima é ou é uma variante da sequência de próenzima de TnaProl (isto é, a sequência de nucleotídeos codificadora do construto recombinante é uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, ou um polipeptídeo com pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência de aminoácidos com

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55/131 a mesma), e em que a sequência sinal é a sequência sinal AprE de B. subtilis. AprE é a serina protease Subtilisin E., nativa para B. subtilis. A sequência sinal AprE tem a sequência de polipeptídeos apresentada na SEQ ID NO: 16, e é nativamente codificada pela sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 15. Uma pré-pró-enzima TnaPro1 com a sequência sinal AprE e a sequência de pró-enzima de TnaProl nativa tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14, que é nativamente codificada pela sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 13 (nesse exemplo particular, nativamente codificado indica que o gene consiste na sequência codificadora nativa da sequência sinal AprE e na sequência codificadora nativa da pró-enzima de TnaProl).

[00171] Os Exemplos abaixo descrevem a expressão de uma proteína em que a sequência sinal AprE é separada da sequência de próenzima de TnaProl nativa por um espaçador de 3 aminoácidos (AGK), introduzido como um resultado da ligação da sequência codificadora no vetor de expressão p2JM103BBI. A sequência de aminoácidos dessa proteína é mostrada na SEQ ID NO: 5 e sua sequência de nucleotídeos codificadora é mostrada na SEQ ID NO.4.

[00172] Assim, em uma modalidade particular, a sequência de nucleotídeos codificadora no construto recombinante descrito no presente documento é uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 ou 14, ou um polipeptideo com pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 8'%, 82%, 83%, 84%, 85 %,86%, 87%, 88%, 89% 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma.

[00173] Em outras modalidades, a sequência sinal pode ser qualquer sequência sinal eficaz em uma célula hospedeira desejada, por exemplo, uma célula hospedeira de Bacillus. Exemplos das mesmas

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56/131 incluem a região codificadora de peptídeo sinal obtida a partir do gene amilase maltogênico de Bacillus NCIB 11837, o gene alfa-amilase de B. stearothermophilus, o gene subtilisina de B. licheniformis, o gene beta-lactamase de B. licheniformis, os genes de protease neutra de B. stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), e o gene prsA de B. subtilis.

[00174] Assim, em certas modalidades, a sequência codificadora pode codificar uma enzima madura de serina protease sem uma sequência sinal (isto é, sem uma pré sequência) e, de preferência, também sem uma pró sequência. Em tal modalidade, a sequência de nucleotideos codificadora pode consistir (i) na sequência de nucleotideos apresentada na SEQ ID NO: 6 ou uma sequência de nucleotideos com pelo menos 92% de identidade de sequência com a mesma ou (ii) uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptideo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou um polipeptideo com pelo menos 92% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma. Altemativamente, a sequência codificadora ou, mais particularmente, o vetor recombinante, pode compreender uma sequência de nucleotideos de (i) ou (ii), mas não compreenderá qualquer sequência de nucleotideos adicional da SEQ ID NO: 1 que flanqueie ou encontre-se imediatamente adjacente à sequência da SEQ ID NO: 6, ou qualquer sequência de nucleotideos adicional que codifique qualquer sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 que flanqueia ou encontra-se imediatamente adjacente à sequência da SEQ ID NO: 3. Em outras palavras, o construto recombinante pode compreender apenas uma sequência codificadora que codifica o polipeptideo maduro e não inclui qualquer sequência de nucleotideos que codifique uma pré, pró ou pré-pró sequência da SEQ ID NO: 2, ou pré, pró ou pré-pró sequência que tenha pelo menos 86% de identidade de sequência com a pré, pró ou pré-pró sequência da SEQ ID NO: 2.

[00175] No caso em que a sequência de nucleotideos codificadora

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57/131 é uma variante da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4, ou codifica uma variante da SEQ ID NO: 2, 5 ou 14, ou codifica uma variante de uma pré-pró-enzima na qual a sequência sinal não é a sequência sinal de TnaProl ou B. subtiüs aprE (por exemplo, a sequência sinal é uma daquelas listadas acima ou uma sequência sinai não nativa alternativa), é preferencial que não só a sequência que codifica a divagem de próenzima permaneça inalterada, ou pelo menos a sequência a qual codifica fique inalterada, de modo que o sítio de divagem na pró-enzima expressa a partir do construto fique inalterado e seja reconhecido para divagem, mas também que a sequência que codifica o sítio de divagem da sequência sinal (isto é, o sítio clivado por uma peptidase sinal para remover a sequência sinal da pré-proteína) fique inalterado, ou pelo menos a sequência a qual codifica fique inalterada, de modo que seja reconhecida pela peptidase sinal para permitir o processamento adequado da pré-proteína.

[00176] A serina protease codificada no construto descrito no presente documento pode, de preferência, ser codificada com uma identificação de afinidade para uma maior facilidade de purificação. Tal identificação está, de preferência, localizada na terminação da protease. Se a protease for codificada como uma pró-enzima ou uma prépró-enzima, com uma sequência sinal e/ou fragmento de pró-enzima em sua terminação N, a protease é, de preferência, codificada com uma identificação de afinidade em sua terminação C. Identificações adequadas são bem conhecidas na técnica e incluem uma identificação poli-histidina, uma identificação strep, uma identificação FLAG, uma identificação HA ou semelhantes.

[00177] Em uma outra modalidade, também é rebelado um vetor que compreende o construto recombinante descrito no presente documento. O vetor pode ser qualquer vetor, conforme definido no presente documento, incluindo aquele que pode ser um vetor de clona

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58/131 gem ou um vetor de expressão. O vetor pode ser qualquer vetor que possa ser introduzido, por exemplo, transformado) e replicado em uma célula hospedeira. De preferência, o vetor é um plasmídeo. O vetor da invenção é, de preferência, adequado para uso em bactérias, particularmente para uso em E. coli ou B. subtilis. Vetores adequados para uso nessas espécies e outras espécies específicas são bem conhecidos na técnica.

[00178] Um vetor adequado pode compreender sequências reguladoras, conforme descrito acima, por exemplo, uma ou mais sequências promotoras, terminadoras ou líder, etc. Um vetor adequado pode compreender, ainda, uma sequência de ácidos nucleicos que possibilita que o vetor se replique em uma célula hospedeira. Exemplos de tais sequências habilitadoras incluem as origens de replicação de plasmídeos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, p!J702 e similares. [00179] Um vetor adequado também pode compreender um marcador selecionável, por exemplo, um gene cujo produto complementa um defeito na célula hospedeira isolada, tal como os genes dal de B. subtílis ou B. lícheniformis' ou um gene que confere resistência antibiótica, tal como, por exemplo, resistência à ampicilina, resistência à canamicina, resistência à cloranfenicol, resistência à tetraciclina e semelhantes.

[00180] Um vetor de clonagem adequado, assim, inclui tipicamente um elemento que permite a replicação do vetor no organismo hospedeiro selecionado e um ou mais marcadores fenotipicamente detectáveis para propósitos de seleção. Exemplos de vetores de clonagem de propósito geral adequados para uso em bactérias, particularmente E. coli, incluem vetores pUC19, pBR322, pBluescript (Stratagene Inc.) e pCRTOPO®da Invitrogen Inc., por exemplo, pCR2.1-TOPO.

[00181] Um vetor de expressão adequado inclui tipicamente um elemento que permite a replicação autônoma do vetor no hospedeiro

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59/131 de produção ou organismo hospedeiro selecionado e um ou mais marcadores fenotipicamente detectáveis para propósitos de seleção, da mesma maneira que o vetor de clonagem. Vetores de expressão também compreendem tipicamente sequências de nucleotídeos de controle, tais como, por exemplo, um promotor, um operador, um sítio de ligação ribossômico, um sinal de iniciação de tradução e, opcionalmente, um gene repressor, uma ou mais sequências de genes ativadores ou semelhantes.

[00182] Um vetor de expressão também pode compreender uma sequência para uma identificação de afinidade a ser fundida na estrutura à sequência do gene de interesse, de modo que a proteína codificada seja produzida com tal identificação em uma ou outra terminação. Exemplos de identificações de afinidade que podem ser usadas na invenção são fornecidos acima. Exemplos de vetores de expressão adequados para uso em bactérias incluem aqueles derivados de, inter alia, vetores da família pET, tais como pET3a, pET3l, pET3c, pET3d, pET12a, pET14l, pET15l, pET16l, pET28a e pET28c; vetores da família pBAD família, tais como pBAD/HisA, pBAD/HisB e pBAD/HisC; e vetores da família pGEX, tais como pGEX-3X, pGEX-4T-1, pGEX-4T2, pGEX-4T-3, pGEX-5X-1, pGEX-5X-2 e pGEX-5X-3. Um vetor de expressão bacteriano representativo adicionai é p2JM103BBI. Vetores de expressão adequados para uso em levedura incluem aqueles derivados de, inter alia, vetores da família pAG, tais como vetores do tipo pAG423, vetores do tipo pAG424, vetores do tipo pAG425, vetores do tipo pAG426 e vetores do tipo pAG303; vetores da família pRG, tais como pRG206, pRG221, pRG227 e pRG236; e vetores da família pYC, tais como pYC48, pYC50, pYC55 e pYC64. Se o versado na técnica desejar construir um vetor de clonagem ou expressão da invenção, o mesmo terá capacidade para escolher uma cadeia principal de vetor adequada com base nas considerações abordadas acima. Os

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60/131 protocolos usados para ligar o construto de DNA que codifica uma proteína de Interesse, promotores, terminadores e/ou outros elementos e para inseri-lo em vetores adequados que contêm as informações necessárias para replicação são bem conhecidos pelos indivíduos de habilidade comum na técnica.

[00183] É adicionalmente fornecido um hospedeiro de produção ou uma célula hospedeira que compreende um construto ou vetor recombinante, conforme definido no presente documento. A célula hospedeira é, de preferência, uma célula hospedeira não nativa, isto é, uma célula hospedeira que não pertence à espécie da qual a TnaProl é derivada, isto é, de preferência, não é uma célula de T. nautili. A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. De preferência, é uma célula de um micro-organismo. A célula hospedeira pode ser uma célula bacteriana (pela qual se entende eubacteriana), uma célula archaeal, uma célula fúngica, uma célula algal, uma célula de mamíferos ou qualquer outro tipo de célula. A célula não está localizada em um animal. Quando a célula hospedeira é uma célula bacteriana, a mesma pode ser de uma espécie gram-positiva ou gramnegativa. De preferência, a célula bacteriana é uma célula de E. coli célula ou de B. subtiiis. A célula hospedeira pode ser de um procariota termofílico, tal como uma bactéria termofílica ou uma archaebactérla termofílica. Se a célula hospedeira for uma célula fúngica, a mesma pode ser a célula de um fungo filamentoso ou uma célula de levedura, particularmente uma célula da espécie Pichia pastoris.

[00184] Métodos para introduzir ase sequências de nucleotídeos, tais como construtos e vetores, em células são descritos acima e são bem conhecidos na técnica, assim como são os métodos para identificar células nas quais tais construtos foram introduzidos. Uma célula hospedeira da invenção pode ser obtida com o uso de qualquer método adequado, por exemplo, transformação seguida por seleção positi

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61/131 va com o uso de um marcador, tal como resistência a antibióticos. Os métodos de transformação e expressão para bactérias são revelados em Brigidi et a/. (1990). Um protocolo de transformação e expressão geral para cepas de Bacillus deletadas de protease é descrito em Ferrari et al. (Patente n² U.S. 5.264.366). Outros métodos para introduzir DNA em células incluem eletroporação, microinjeção nuclear, transdução, transfecção (por exemplo, transfecção mediada por lipofecção e medida por DEAE-Dextrina), incubação com precipitado de DNA em fosfato de cálcio, bombardeamento de alta velocidade com microprojéteis revestidos com DNA, transformação biolística ou por disparo de genes e fusão de protoplastos e semelhantes. Os textos básicos que revelam métodos gerais que podem ser usados incluem Sambrook et a/., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2^a edição, 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)).

[00185] Métodos para transformar ácidos nucleicos em fungos filamentosos, tais como Aspergillus spp., por exemplo, Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger, Hylarana grísea, Humicola insolens e Trichoderma reesei, são bem conhecidos na técnica. Um procedimento adequado para transformação de células hospedeiras de Aspergillus é descrito, por exemplo, no documento η² EP 238023. Um procedimento adequado para transformação de células hospedeiras de Trichoderma é descrito, por exemplo, em Steiger et al 2011, Appl. Environ. Microbiol. 77:114 a 121.

[00186] Muitos métodos padrão de transfecção podem ser usados para produzir linhagens celulares de fungos filamentosos e bactérias (por exemplo, Aspergillus ou Trichoderma) que expressam grandes quantidades da protease. Alguns dos métodos publicados para a introdução de construtos de DNA nas cepas de produção de celulase de Trichoderma incluem Lorito, Hayes, DiPietro e Harman, (1993) Curr.

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Genet. 24: 349 a 356; Goldman, VanMontagu e Herrera-Estrella, (1990) Curr. Genet. 17:169 a 174; e Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen e Knowles, (1987) Gene 6: 155 a 164, consultar também o documento n^Q USP 6.022.725; o documento n^QUSP 6.268.328 e Nevalainen et al., The Molecular Biology of Trichoderrna and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes em Molecular Industrial Mycology, Edições, Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) páginas 129 a 148; para Aspergillus incluem Yelton, Hamer e Timberlake, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 81: 1.470 a 1.474, para Fusarium incluem Bajar, Podila e Kolattukudy, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8.202 a 8.212, para Streptomyces incluem Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, UK e FernandezAbalos et al., Microbiol 149:1.623 a 1.632 (2003) e para Bacillus incluem Brigidi, DeRossi, Bertarini, Riccardi e Matteuzzi, (1990) FEMS Microbiol. Lett. 55: 135 a 138).

[00187] No entanto, qualquer procedimento bem conhecido para introduzir sequências de nucleotídeos externas em células hospedeiras pode ser usado. Esses incluem o uso de transfecção com fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, biolística, lipossomos, microinjeção, vetores plasmáticos, vetores virais e quaisquer dos outros métodos bem conhecidos de introdução de DNA genômico, cDNA, DNA sintético clonados ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira (consultar, por exemplo, Sambrook et ai., supra). Também é usado o método de transfecção mediado por Agrobactéria descrito na Patente n- U.S. 6.255.115. Também é necessário que o procedimento de manipulação genética particular usado tenha capacidade para introduzir de modo bem-sucedido o pelo menos um gene na célula hospedeira com capacidade para expressar o gene. [00188] O construto ou vetor da invenção compreendido na célula

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63/131 hospedeira descrita no presente documento pode ser integrado estavelmente ao cromossomo da célula hospedeira, possibilitando a transferência livre de seleção do material genético do construto ou vetor ao longo das gerações do hospedeiro, A integração de um construto ou vetor de DNA em um cromossomo hospedeiro pode ser realizada aplicando~se métodos convencionais, por exemplo, através de recombinação homóloga ou heteróloga. Por exemplo, a publicação internacional PCT n-WO 2002/14490 descreve métodos de transformação de Bacillus, transformantes do mesmo e bibliotecas do mesmo.

[00189] Alternativamente, o construto ou vetor pode ser mantido extracromossomicamente na célula hospedeira, de modo que não fique integrado ao cromossomo. É provável que a manutenção extracromossômica de um construto ou vetor seja menos estável que a integração do construto ou vetor ao cromossomo de um organismo, exigindo seleção constante para garantir que o construto ou vetor não seja perdido durante a reprodução da célula hospedeira. A integração estável ou a manutenção extracromossômica do plasmídeo pode, cada uma, ser benéfica para determinados propósitos, conforme é bem compreendido pelo versado na técnica.

[00190] A invenção fornece um método para produzir uma serina protease termoestável, sendo que o dito método compreende:

i) introduzir, em uma célula hospedeira, um construto ou vetor da invenção; e ii) cultivar a célula hospedeira produzida na etapa (i) sob condições através das quais a serina protease termoestável é produzida.

[00191] A célula hospedeira pode ser qualquer célula hospedeira, conforme definido acima. De preferência, a mesma é uma célula bacteriana, uma célula archaeal, uma célula fúngica ou uma célula algal. Em modalidades específicas, a célula hospedeira é uma célula de E.

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64/131 co// ou uma célula de B. subtfâs.

[00192] O construto ou vetor pode ser introduzido na célula hospedeira com o uso de qualquer método para introduzir sequências de nucleotídeos, por exemplo, DNA, em células hospedeiras, conforme descrito acima. De preferência, o construto ou vetor é introduzido na célula hospedeira por transformação.

[00193] Por cultura entende-se que a célula hospedeira é desenvolvida, de modo que seja replicada. Métodos para a cultura de células são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula hospedeira pode ser desenvolvida em um meio rico (isto é, um meio rico em nutrientes) a uma temperatura fisiológica (aproximadamente 37°C) ou a uma temperatura ideal para desenvolvimento e divisão celular. Dependendo do tipo de célula usado como hospedeiro, o meio pode ser agitado durante a cultura para garantir a aeração do meio, por exemplo, uma incubadora de agitação pode ser usada. Meios e componentes de meios adequados estão disponíveis junto a fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as receitas publicadas (por exemplo, conforme descrito nos catálogos da Coleção de Cultura do Tipo Americano).

[00194] Por condições através das quais a serina protease termoestável é produzida entende-se condições sob as quais a expressão da serina protease termoestável pode ser detectada. A detecção pode ser detecção direta da proteína, por exemplo, Western blotting. Aiternativamente, o mRNA da protease pode ser diretamente detectado, por exemplo, por RT-PCR, mas a detecção direta da proteína é preferencial. Uma detecção pode, alternativamente, ocorrer em sua função. Ensaios para determinar ou identificar a atividade de serina protease são descritos acima. Se, estatisticamente, a atividade proteoiítica da cultura de células hospedeiras que compreendem o construto ou vetor descrito no presente documento for significativamente mais

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65/131 alta que a atividade proteolítica de uma cultura de células de controle, pode-se dizer que a serina protease pode é expressada. Células de controle adequadas incluem células do tipo selvagem da cepa da célula hospedeira de produção, nas quais nenhum construto ou vetor foi introduzido, ou células da cepa da célula hospedeira de produção nas quais um vetor vazio foi introduzido. Por vetor vazio entende-se a cadeia principal de um vetor da invenção, na qual nenhum construto da invenção foi clonado. Assim, um vetor vazio pode conter todas as sequências reguladoras ou de controle e marcadores de um vetor descritas no presente documento, mas não codifica um polipeptídeo com atividade de protease, particularmente atividade de serina protease.

[00195] Se a serina protease codificada pelo construto ou vetor, conforme revelado no presente documento, for codificada com um peptídeo sinal, de modo que seja secretada das células hospedeiras, sua atividade pode ser detectada no sobrenadante de cultura. Se a serina protease for codificada sem um peptídeo sinal e, portanto, não for secretada das células hospedeiras, será necessário colher e lisar as células hospedeiras, e tentar detectar a atividade de serina protease em seus lisados. De preferência, a serina protease é codificada com um peptídeo sinal e secretada das células.

[00196] A expressão da serina protease pode ser constitutiva ou induzível, dependendo do promotor usado. Se o promotor for constitutivo, a protease é continuamente expressa sob essencialmente todas as condições de desenvolvimento. Se o promotor for induzível, um estímulo é necessário para induzir a expressão. No caso de expressão induzível, a produção de proteína pode ser iniciada quando necessário, por exemplo, através da adição de uma substância indutora ao meio de cultura, por exemplo, dexametasona, arabinose, IPTG ou soforose, dependendo do sistema de expressão usado.

[00197] Dependendo da célula hospedeira usada, modificações

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66/131 pós-transcricionais e/ou pós-translacionais podem ser realizadas durante a expressão do gene. Um exemplo não limitante de uma modificação pós-transcricional e/ou pós-translacional é clipagem ou truncação de um polipeptídeo. Por exemplo, isso pode resultar em levar uma serina protease termoestável de um estado inativo ou substancialmente inativo para um estado ativo como no caso de um propeptídeo que passa por processamento pós-translacional para um peptídeo maduro que tem a atividade enzimátlca. Em outro caso, esse recorte pode resultar em tomar um polipeptídeo de serina protease termoestável madura e remover adicionalmente os aminoácidos de terminal N ou C para gerar formas truncadas da serina protease termoestável que retêm atividade enzimática.

[00198] Outros exemplos de modificações pós-transcricionais ou pós-translacionais incluem, porém sem limitação, miristoilação, glicosilação, truncação, lipidação e fosforilação de tirosina, serina ou treonina. A pessoa versada perceberá que o tipo de modificações póstranscricionais ou pós-traducionais que uma proteína pode sofrer pode depender do organismo hospedeiro em que a proteína é expressa.

[00199] Em algumas modalidades, a preparação de um caldo de fermentação gasto completo de um micro-organismo recombinante pode ser alcançada com o uso de qualquer método de cultivo conhecido na técnica que resulta na expressão de uma serina protease termoestável.

[00200] A fermentação pode, portanto, ser entendida por compreender cultivo em frasco de agitação, fermentação em pequena ou grande escala (que inclui fermentações contínua, em batelada, em batelada alimentado ou de estado sólido) em fermentadoras de laboratório ou industriais realizada em um meio adequado e sob condições que permitem que a serina protease seja expressa ou isolada. O termo caldo de fermentação de gasto completo é definido no presente do

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67/131 cumento como teor não fracionado de material de fermentação que inclui meio de cultura, proteínas extracelulares (por exemplo, enzimas) e biomassa celular. Entende-se que o termo caldo de fermentação de gasto completo também engloba biomassa celular que foi lisada ou permeabilizada com o uso de métodos bem conhecidos na técnica.

[00201] Qualquer um dos métodos de fermentação bem conhecidos na técnica pode adequadamente ser usado para fermentar a célula hospedeira na qual o construto ou vetor foi introduzido. Em algumas modalidades, as células hospedeiras, por exemplo, células fúngicas ou células bacterianas, são desenvolvidas sob condições de fermentação em batelada ou contínua.

[00202] Uma fermentação em batelada clássica é um sistema fechado, em que a composição do meio é estabelecida no início da fermentação, e a composição não é alterada durante a fermentação. No início da fermentação, o meio é inoculado com o organismo (ou organismos) desejado. Em outras palavras, o processo de fermentação inteiro ocorre sem a adição de quaisquer componentes ao sistema de fermentação inteiro.

[00203] Alternativamente, uma fermentação em batelada se qualifica como uma batelada em relação à adição da fonte de carbono. Além disso, são feitas frequentemente tentativas de controlar fatores, tais como pH e concentração de oxigênio, por todo o processo de fermentação. Tipicamente, o metabólito e as composições de biomassa do sistema de batelada mudam constantemente até ao momento em que a fermentação é interrompida. Dentro das culturas em batelada, as células progridem através de uma fase de latência estática para uma fase de latência de alto crescimento e finalmente para uma fase estacionária, onde a taxa de crescimento é diminuída ou interrompida. Deixadas não tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morreríam. Em geral, as células na fase logarítmica são responsáveis

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68/131 pelo volume de produção de produto. Uma variação adequada no sistema de batelada padrão é o sistema de fermentação em batelada alimentada. Nessa variação de um sistema de batelada típico, o substrato é adicionado em incrementos conforme a fermentação progride. Os sistemas de batelada alimentada são úteis quando se sabe que a repressão de catabólito inibiría o metabolismo das células, e/ou em que é desejável ter quantidades limitadas de substratos no meio de fermentação. A medição da concentração de substrato atual em sistemas de batelada alimentada é difícil e, portanto, estimada com base nas mudanças de fatores mensuráveis, tais como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases residuais, tal como CO2. As fermentações em batelada e batelada alimentada são bem conhecidas na técnica.

[00204] Fermentação contínua é outro método conhecido de fermentação. A mesma é um sistema aberto em que um meio de fermentação definido é adicionado a um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para o processamento. A fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma densidade constante, em que as células são mantidas principalmente em crescimento de fase logarítmica. A fermentação contínua permite a modulação de um ou mais fatores que afetam o crescimento celular e/ou concentração de produto. Por exemplo, um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou fonte de nitrogênio, por ser mantido em uma taxa fixa, e a todos os outros parâmetros é permitida moderação. Em outros sistemas, diversos fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente enquanto a concentração celular, medida por turbidez de meio, é mantida constante. Os sistemas contínuos se esforçam para manter condições de crescimento de estado estável. Portanto, a perda celular devido ao meio que é extraído deve ser equilibrada em relação à taxa de crescimento celular na fermentação. Mé

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69/131 todos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, assim como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto, são bem conhecidos na técnica de microbiologia industrial.

[00205] De preferência, o método para produzir uma serina protease termoestável compreende, ainda, uma etapa de recuperar a protease termoestável após sua produção. A recuperação da protease termoestável pode assumir a forma do seu isolamento, por exemplo, purificação, e/ou uma concentração da protease. Assim, após a produção ter ocorrido, a protease pode ser isolada ou separada, por exemplo, das células hospedeiras ou da cultura. Em uma primeira etapa, as células e o meio podem ser separados, por exemplo, por centrifugação ou filtração. Se a protease estiver na fração celular, as células podem, então, ser Usadas, e o sobrenadante descartado. Métodos de lise são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, sonicação, prensa francesa e lise química com o uso de um reagente de extração de proteína (por exemplo, BugBuster®, EMD Milllpore (EUA)). Se a protease for secretada pelas células hospedeiras, de modo que esteja na fração sobrenadante, a fração celular pode, então, ser descartada. A protease pode, então, ser purificada, por exemplo, por cromatografia. As técnicas de purificação são bem conhecidas na área. Por exemplo, se a protease for expressa com uma identificação de afinidade, conforme descrito acima, a protease pode ser purificada por cromatografia de afinidade. Cromatografia de exclusão por tamanho e/ou cromatografia de troca iônica também podem ou, alternativamente, ser usadas juntamente com qualquer outra técnica conhecida na área, por exemplo, procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparatória), solubllidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), microfiltração por extração ou separação em duas fases. Para orientação geral em técnicas de purificação adequadas,

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70/131 consultar Scopes, Protein Purification (1982). O grau de purificação necessário variará dependendo do uso da proteína de interesse. Em alguns casos, nenhuma purificação será necessária.

[00206] A solução contendo enzima pode ser concentrada com o uso de técnicas de concentração convencionais até o nível de enzima desejado ser obtido. A concentração da solução contendo enzima pode ser alcançada por qualquer técnica conhecida na área. Exemplos de métodos de enriquecimento/concentração incluem, porém sem limitação, filtração e/ou ultrafiltração a vácuo rotatória. A concentração pode, alternativamente, ser realizada com o uso, por exemplo, de um agente de precipitação, tal como um agente de precipitação de haleto de metal. Agentes de precipitação de haleto de metal incluem, porém sem limitação, cloretos de metal alcalino, brometos de metal alcalino e mesclas de dois ou mais desses haletos de metal.

[00207] Haletos metálicos exemplificativos incluem cloreto de sódio, cloreto de potássio, brometo de sódio, brometo de potássio e mesclas de dois ou mais desses haletos metálicos. O agente de precipitação de haleto de metal, cloreto de sódio, pode ser também usado como um conservante. Para a recuperação de escala de produção, os polipeptídeos de serina protease termoestável podem ser enriquecidos ou parcialmente purificados conforme descrito de modo geral acima com a remoção de células através de floculação com polímeros. Alternativamente, a enzima pode ser enriquecida ou purificada por microfiltração seguida por concentração por ultrafiltração com o uso de membranas e equipamentos disponíveis. Contudo, para algumas aplicações, a enzima não precisa ser enriquecida ou purificada e toda a cultura de caldo pode ser lisada e usada sem tratamento adicional. A enzima pode então ser processada, por exemplo, em grânulos.

[00208] Em um outro aspecto, é descrito um sobrenadante de cultura que compreende um polipeptídeo termoestável com atividade de

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71/131 serina protease obtido por meio do método acima para produzir uma serina protease termoestável. O polipeptídeo termoestável com atividade de serina protease compreendido no sobrenadante de cultura da invenção tem ou compreende, de preferência, a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácldos com pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a mesma. Em certas modalidades, o polipeptídeo termoestável com atividade de serina protease compreendido no sobrenadante de cultura descrito no presente documento tem ou compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a mesma. Tal sobrenadante é obtenível quando a serina protease é codificada, expressa e produzida com um peptídeo sinal, que direciona a protease para a secreção a partir da célula hospedeira. A serina protease é, assim, secretada no meio de cultura. O peptídeo sinal é clivado da serina protease mediante sua secreção da célula hospedeira e, assim, a serina protease termoestável presente no sobrenadante de cultura não compreende uma sequência sinal. Um sobrenadante de cultura pode ser obtido separandose as células do meio. Métodos para realizar essa etapa são bem conhecidos na técnica e são descritos acima, por exemplo, centrifugação e filtração.

[00209] As serina proteases termoestáveis podem ser Isoladas ou purificadas em uma variedade de formas conhecidas por aqueles indivíduos versados na técnica dependendo de quais outros componentes estão presentes na amostra. Métodos de purificação padrão incluem, porém sem limitação, cromatografia (por exemplo, troca tônica, afinidade, hidrofóbica, de cromatofoco, imunológica e exclusão por tama

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72/131 nho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparatória), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônia), microfiltração por extração, separação em duas fases. Por exemplo, a proteína de interesse pode ser purificada com o uso de uma antiproteína padrão de coluna de anticorpo de interesse. As técnicas de ultrafiltração e diafiltração, em combinação com a concentração de proteína, também são úteis. Para orientação geral em técnicas de purificação adequadas, consultar Scopes, Protein Purification (1982). O grau de purificação necessário variará dependendo do uso da proteína de interesse. Em alguns casos, nenhuma purificação será necessária.

[00210] Ensaios para detectar e medir a atividade enzimática de uma enzima, tal como um polipeptídeo de serina protease termoestável, são bem conhecidos. Vários ensaios para detectar e medir a atividade de proteases (por exemplo, polipeptídeos de serina protease termoestáveis), também são conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Em particular, estão disponíveis ensaios para medir atividade de protease que se baseiam na liberação de peptídeos solúveis em ácido de caseína ou hemoglobina, medida como absorvância a 280 nm ou colorimetricamente com o uso do método Folin, e hidrólise da azocaseína marcada por molde, medida como absorvância a 440 a 450 nm.

[00211] Outros ensaios exemplificativos envolvem a solubilização de substratos cromogênicos (Consultar, por exemplo, Ward, Proteinases, em Fogarty (edição), Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science, Londres, [1983], páginas 251 a 317). Um método de ensaio de detecção de protease que usa caseína de isotiocianato de fluoresceína altamente marcada (FITC) como o substrato, uma versão modificada do procedimento descrito por Twining [Twining, S.S., (1984) Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteo

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73/131 lytic Enzymes Anal. Biochem. 143:30 a 34] também pode ser usado.

[00212] Outros ensaios exemplificativos incluem, mas sem limitação: divagem de caseína em peptídeos solúveis em ácido tricloroacético que contêm resíduos de tirosina e triptofano, seguidos pela reação com reagente Folin-Ciocalteu e detecção colorimétrica de produtos a 660 nm, divagem de substratos de peptideo de FRET (Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência) bruscamente arrefecidos internamente seguidos pela detecção de produto com o uso de um fluorômetro. A Transferênda de Energia de Ressonância de Fluorescência (FRET) é a transferência não radioativa de energia de um fluoróforo (ou doador) excitado para uma molécula (ou aceitante) bruscamente arrefecido adequado. FRET é usada em uma variedade de aplicações que incluem a medição de atividade de protease com substratos, em que o fluoróforo é separado do extintor por uma sequência de peptídeos curta que contém o local de divagem de enzima. Proteólise do peptideo resulta na fluorescência quando o fluoróforo e extintor são separados. Referências adicionais numerosas conhecidas por aqueles indivíduos versados na técnica fornecem métodos adequados (Consultar, por exemplo, Wells et al., Nucleic Acids Res. 11:7.911 a 7.925 [1983]; Christianson et al., Anal. Biochem. 223:119 a 129 [1994]; e Hsia et al., Anal Biochem. 242:221 a 227 [1999]).

[00213] Também é fornecido no presente documento um produto de ração para animais que compreende um polipeptideo que tem atividade de serina protease e é termoestável, em que o dito polipeptideo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91%, 92%, 93,%, 94% 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a mesma, e em que, opcionalmente, o dito produto alimentício compreende, ainda, (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta (DFM) de (b), pelo menos uma

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74/131 outra enzima ou (c) tanto um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima. Em certas modalidades, o produto de ração para animais pode compreender uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID NO: 8 ou um polipeptídeo com pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma.

[00214] A pelo menos uma outra enzima pode ser selecionada dentre, porém sem limitação, enzimas, tais como alfa-amilase, amiloglicosidase, fitase, pululanase, beta-glucanase, celulase, xilanase, etc.

[00215] Quaisquer dessas enzimas podem ser usadas em uma quantidade que varia de 0,5 a 500 microgramas/g de ração ou matériaprima.

[00216] Alfa-amilases (alfa-1,4~glucano~4~glucano~hidrolase, EC 3.2.1.1.) hidrolisam ligações de alfa-1,4-glícosídicas internas em amido, amplamente e aleatoriamente para produzir dextranos de peso molecular menor. Esses polipeptídeos são usados, inter alia, em processamento de amilasese em produção de álcool. Quaisquer alfaamilases podem ser usadas, por exemplo, aquelas descritas na Patente número U.S. 8.927.250 e 7.354.752.

[00217] Amiloglucosidase catalisa a hidrólise de resíduos de alfa-Dglicose terminalmente 1,4-ligados sucessivamente a partir das extremidades de não redução de malto-oligo- e polissacarídeos com a liberação de beta-D-glicose. Qualquer amiloglicosidase pode ser usada.

[00218] Fitase se refere a uma proteína ou polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a hidrólise de fitato para (1) mio-inositol e/ou (2) mono-, di-, tri-, tetra- e/ou pentafosfatos do mesmo e (3) fosfato inorgânico. Por exemplo, enzimas que têm atividade catalítica conforme definido na Comissão de Enzima EC número 3.1.3.8 ou EC número 3.1.3.26. Qualquer fitase pode ser usada, tal como descrito nas Pa

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75/131 tentes número U.S. 8.144.046, 8.673.609 e 8.053.221.

[00219] Pululanase (EC 3.2.1.41) é um tipo específico de glucanase, uma exoenzima amilolítica que degrada pululano (um polímero de polissacarídeo que consiste em unidades de maltotriose, também conhecidas como alfa-1,4-; alfa-1,6-glucano. Portanto, é um exemplo de uma enzima desramificação. Pululanase também conhecido como pululan-6-glucano-hidrolase. Pululanases são geralmente secretadas por uma espécie de Bacillus. Por exemplo, Bacillus deramificans (patente n² U.S. 5.817.498; 1998), Bacillus acidopullulyticus (patente européia n² 0 063 909) e Bacillus naganoensis (patente n² U.S. 5.055.403). Enzimas que têm atividade de pululanase usadas comercialmente são produzidas, por exemplo, a partir de espécies de Bacillus (nome comercial OPITMAX® 1-100 de DuPont-Genencor e Promozyme® D2 de Novozymes). Outros exemplos de enzimas desramificadoras incluem, porém sem limitação, iso-amilase de Sulfolobus solfatarícus, Pseudomonas sp. e pululanase termoestável de Fervidobacterium nodosum (por exemplo, documento n²WO2010/76113). A isoamilase a partir de Pseudomonas sp. está disponível como enzima purificada de Megazyme International. Qualquer pululanase pode ser usada.

[00220] Glucanases são enzimas que quebram um glucano, um polissacarídeo produzido a partir de diversas subunldades de glicose. Na medida em que realizam hidrólise da ligação glicosídica, as mesmas são hidrolases.

[00221] Enzimas beta-glucanase (EC 3.2.1.4) digerem fibra. Isso ajuda na quebra de paredes de planta (celulose).

[00222] Celulases são quaisquer das diversas enzimas produzidas por fungos, bactérias e protozoários que catalisam celulólise, a decomposição de celulose e de alguns polissacarídeos relacionados. O nome também é usado para qualquer mistura de ocorrência natural ou

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76/131 complexo de várias de tais enzimas que atuam em série ou sinergicamente para decompor material celulósico. Quaisquer celulases podem ser usadas.

[00223] Xilanase (EC 3.2.1.8) é o nome dado a uma classe de enzimas que degradam o polissacarídeo linear beta-1,4-xilano em xilose, aquelas que quebram hemicelulose, um dos principais componentes de paredes celulares de planta. Quaisquer xilanases podem ser usadas.

[00224] Conforme definido no presente documento, ração para animais ou produto de ração para animais abrange uma ração, ou um gênero alimentício, composição aditiva para ração, pré-mistura, para um animal, incluindo seres humanos.

[00225] Os termos composição de ração para animais, ração, gênero alimentício e forragem são usados de modo intercambiável no presente documento. Uma ração é definida acima, sendo que a definição se aplica igualmente aos termos intercambiáveis composição de ração para animais, gênero alimentício e forragem.

[00226] Uma ração pode compreender um ou mais materiais de ração selecionados dentre o grupo que compreende a) cereais, tais como grãos pequenos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveia e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes, tais como mais ou sorgo: b) subprodutos de cereais, tais como farinha de glúten de milho, grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS) (particularmente grãos secos de destilaria com solúveis à base de milho (cDDGS), farelo de trigo, sêmeas de trigo, polvilho de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, caroço de palma e polpa cítrica; c) proteína obtida a partir de fontes, tais como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, feijões-fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína plasmática seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidas a partir de fontes vegetais e animais; e/ou

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e) minerais e vitaminas.

[00227] Compreende-se que uma ração pode ser qualquer produto alimentício que seja fornecido a um animal (em vez de o animal ter que se alimentar por si mesmo). Ração abrange plantas que foram cortadas. Além disso, a ração inclui silagem, alimentos prensados e peletizados, óleos e rações mistas e também grãos e legumes germinados.

[00228] A ração pode ser obtida a partir de uma ou mais plantas selecionadas dentre: milho (mais), alfafa (luzerna), cevada, trevocorniculado, brassica, Chau moellier, couve, colza (canola), rutabaga (sueca), nabo, trevo, trevo híbrido, trevo-violeta, trevo-subterrâneo, trevo-banco, festuca, bromo, painço, aveia, sorgo, soja, árvores (brotos de árvore em talhadia para feno), trigo e legumes. A ração pode estar na forma de uma solução ou como um sólido ou como um semissólido, dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

[00229] A ração pode ser uma ração composta. O termo ração composta significa uma ração comercial na forma de uma farinha, um pélete, frutos secos, bagaço, uma migalha ou semelhantes. Rações compostas podem ser mescladas a partir de várias matérias-primas e aditivos. Estas combinações são formuladas de acordo com os requisitos específicos do animal-alvo.

[00230] As rações compostas podem ser rações completas que fornecem todos os nutrientes diariamente necessários, concentrados que fornecem uma parte da ração (proteína, energia) ou suplementos que fornecem apenas micronutrientes adicionais, tais como minerais e vitaminas.

[00231] Os ingredientes principais usados na ração composta são os grãos de ração, que incluem milho, trigo, farinha de canola, farinha de colza, tremoço, soja, sorgo, aveia e cevada.

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78/131 [00232] Em uma modalidade, o gênero alimentício compreende ou consiste em milho, DDGS (tal como cDDGS), trigo, farelo de trigo ou qualquer combinação dos mesmos.

[00233] Em uma modalidade, o componente de ração pode ser milho, DDGS (por exemplo, cDDGS), trigo, farelo de trigo ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o gênero alimentício compreende ou consiste em milho, DDGS (tal como cDDGS) ou uma combinação dos mesmos.

[00234] Um gênero alimentício descrito no presente documento pode conter pelo menos 30%, pelo menos 40 %, pelo menos 50% ou pelo menos 60% em peso de farinha de milho e soja ou milho e soja com gordura total, ou farinha de trigo ou farinha de girassol.

[00235] Por exemplo, um gênero alimentício pode conter entre cerca de 5% e cerca de 40% de DDGS à base de milho. Para aves, o gênero alimentício em média pode conter entre cerca de 7% e 15% de DDGS à base de milho. Para suínos (porcos), o gênero alimentício pode conter em média 5% a 40% de DDGS à base de milho. A mesma também pode conter milho como um único grão, caso em que o gênero alimentício pode compreender entre cerca de 35% e cerca de 80% de milho.

[00236] Em gêneros alimentícios que compreendem grãos mistos, por exemplo, que compreendem milho e trigo, por exemplo, o gênero alimentício pode compreender pelo menos 10% de milho.

[00237] Adicional ou altemativamente, um gênero alimentício também pode compreender pelo menos um material de ração com alto teor de fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração com alto teor de fibras para fornecer um gênero alimentício com alto teor de fibras. Exemplos de materiais de ração com alto teor de fibras incluem: trigo, cevada, centeio, aveia, subprodutos de cereais, tais como farinha de glúten de milho, ração de glúten de mi

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Iho, bagaço úmido, grãos secos de destilaria (DDG), grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS), farelo de trigo, sêmeas de trigo, polvilho de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, caroço de palma e polpa cítrica. Algumas fontes de proteína também podem ser consideradas como material de ração com alto teor de fibras: proteína obtida a partir de fontes, tais como girassol, tremoço, feijões-fava e algodão. Em um aspecto, o gênero alimentício, conforme descrito no presente documento, compreende pelo menos um material com alto teor de fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração com alto teor de fibras selecionado dentre o grupo que consiste em: grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS), particularmente, cDDGS; bagaço úmido: grãos secos de destilaria (DDG), particularmente, cDDG; farelo de trigo; e trigo, por exemplo. Em uma modalidade, o gênero alimentício da presente invenção compreende pelo menos um material de ração com alto teor de fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração com alto teor de fibras selecionado dentre o grupo que consiste em: grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS), particularmente, cDDGS; farelo de trigo; e trigo.

[00238] A ração pode ser uma ou mais dentre as seguintes: uma ração e pré-mistura compostas, incluindo péletes, frutos secos ou bagaço (para gado); uma plantio ou resíduo de plantio: milho, soja, sorgo, aveia, cevada, copra, palha, palhiço, refugo de beterraba sacarina; farinha de peixe; farinha de carne e ossos; melaço; bagaço de óleo e bagaço prensado; oligossacarídeos; plantas forrageiras conservadas: silagem; alga marinha; sementes e grãos, inteiros ou preparados por trituração, moagem, etc.; grãos e legumes germinados; extrato de levedura.

[00239] Adequadamente, uma pré-mistura, conforme mencionado no presente documento, pode ser uma composição composta por mi

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80/131 croingredientes, tais como vitaminas, minerais, conservantes químicos, antibióticos, produtos de fermentação e outros ingredientes essenciais. As pré-misturas são usualmente composições adequadas para combinação em rações comerciais. A ração ou composição aditiva para ração pode ser combinada com pelo menos um mineral e/ou pelo menos uma vitamina para formar uma pré-mistura, conforme definido no presente documento.

[00240] O termo ração, conforme usado no presente documento, abrange, em algumas modalidades, alimentos para animais de estimação. Um alimento para animais de estimação é material vegetal ou animal destinado ao consumo por animais de estimação, tal como alimento para cães ou alimento para gatos. Alimentos para animais de estimação, tais como alimentos para cães e gatos, podem estar sob uma forma seca, tal como flocos para cães, ou sob forma úmida enlatada. Alimentos para gatos podem conter o aminoácido taurina.

[00241] A ração para animais também abrange, em algumas modalidades, um alimento para peixes. Um alimento para peixes normalmente contém macronutrientes, oligoelementos e vitaminas necessárias para manter os peixes de cativeiro em boa saúde. O alimento para peixes pode estar na forma de um floco, pélete ou comprimido. As formas peletizadas, algumas das quais afundam rapidamente, são frequentemente usadas para peixes maiores ou espécies que se alimentam em profundidade. Alguns alimentos para peixes também contêm aditivos, tais como beta-caroteno ou hormônios sexuais, para intensificar artíficialmente a cor dos peixes ornamentais.

[00242] Em ainda um outro aspecto, a ração para animais abrange alimentos para pássaros. Alimentos para pássaros incluem o alimento que é usado tanto em alímentadores de pássaros quanto para alimentar pássaros de estimação. Tipicamente, alimentos para pássaros compreendem uma variedade de sementes, mas também pode abran

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81/131 ger sebo (came bovina ou gordura de carneiro).

[00243] Rações para animais podem incluir material vegetal, tal como milho, trigo, sorgo, soja, canola, girassol ou misturas de qualquer um desses materiais vegetais ou fontes de proteína vegetal para aves, porcos, ruminantes, aquacultura e animais de estimação. Contemplase que parâmetros de desempenho animal, tais como crescimento, ingestão de ração e eficácia de ração, sejam melhorados e, além disso, melhora de uniformidade será exibida e terá como resultado, uma concentração reduzida de amônia no alojamento para animais, com a consequência de uma melhor situação de bem-estar e saúde dos animais. Mais especificamente, conforme usado no presente documento, desempenho animal pode ser determinado pela eficácia da ração e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão da ração e/ou pela digestibilidade de um nutriente em uma ração (por exemplo, dlgestibilidade de aminoácidos) e/ou energia digerível ou energia metabolizável em uma ração e/ou por retenção de nitrogênio e/ou pela capacidade dos animais para evitar os efeitos negativos de entente necrótica e/ou pela resposta imunológica do indivíduo.

[00244] Preferencialmente desempenho animal é determinado por eficiência de ração e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão de ração.

[00245] Por desempenho animal melhorado entende-se que há um aumento da eficácia da ração, e/ou aumento de ganho de peso e/ou redução da razão de conversão da ração e/ou melhora da digestibilidade de nutrientes ou energia em uma ração e/ou por melhor retenção de nitrogênio e/ou por melhor capacidade para evitar os efeitos negativos da entente necrótica e/ou por uma melhora na resposta imunológica do indivíduo resultante do uso da composição aditiva para ração da presente invenção na ração em comparação com a ração que não compreende a dita composição aditiva para ração.

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82/131 [00246] De preferência, por desempenho animal melhorado entende-se que há aumento da eficácia da ração e/ou aumento de ganho de peso e/ou redução da razão de conversão da ração. Conforme usado no presente documento, o termo eficácia da ração refere-se à quantidade de ganho de peso em um animal que ocorre quando o animal é alimentado ad-libitum ou com uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo.

[00247] Por aumento da eficácia da ração entende-se que o uso de uma composição aditiva para ração de acordo com a presente invenção na ração resulta em um aumento de ganho de peso por unidade de ingestão de ração em comparação com um animal alimentado com a mesma ração, mas sem a dita composição aditiva para ração estar presente.

[00248] Um aumento de ganho de peso refere-se a um animal que tem um aumento de peso corporal ao ser alimentado com a ração que compreende uma composição aditiva para ração em comparação com um animal que é alimentado com uma ração sem a dita composição aditiva para ração estar presente.

[00249] Conforme usado no presente documento, o termo razão de conversão da ração refere-se à quantidade de ração com a qual um animal foi alimentado para aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada.

[00250] Uma melhor razão de conversão da ração significa uma menor razão de conversão da ração, isto é, um animal deve ser alimentado com menos ração a fim de ganhar uma certa quantidade de peso.

[00251] Por menor razão de conversão da ração ou melhor razão de conversão da ração entende-se que o uso de uma composição aditiva para ração na ração resulta em uma menor quantidade de ração necessária para alimentar um animal de modo a aumentar o peso

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83/131 do animal em uma quantidade especificada em comparação com a quantidade de ração necessária para aumentar o peso do animal na mesma quantidade quando a ração não compreende a dita composição aditiva para ração.

[00252] Digestibilidade de nutriente, conforme usado no presente documento, significa a fração de um nutriente que desaparece (por exemplo, é absorvida na corrente sanguínea, degrada, etc.) do trato gastrointestinal ou de um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o intestino delgado. A digestibilidade de nutrientes pode ser medida como a diferença entre o que é administrado ao sujeito e o que sai nas fezes do sujeito, ou entre o que é administrado ao sujeito e o que permanece na regurgitação em um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o íleo.

[00253] A digestibilidade de nutriente, conforme usado no presente documento, pode ser medida pela diferença entre a ingestão de um nutriente e o nutriente excretado por meio da coleta total de excremento durante um período de tempo; ou com o uso de um marcador inerte que não é absorvido pelo animal, e permite que o pesquisador calcule a quantidade de nutriente que desapareceu em todo o trato gastrointestinal ou em um segmento do trato gastrointestinal. Um tal marcador inerte pode ser dióxido de titânio, óxido crômico ou cinza insolúvel em ácido. A digestibilidade pode ser expressa como uma porcentagem do nutriente na ração ou como unidades de massa de nutriente digerível por unidades de massa de nutriente na ração.

[00254] A digestibilidade de nutrientes, conforme usado no presente documento, abrange a digestibilidade de amido, digestibilidade de gordura, digestibilidade de proteína e digestibilidade de aminoácidos.

[00255] Energia digerível, conforme usado no presente documento, significa a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta nas fezes ou a energia bruta da ração consumida menos a energia

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84/131 bruta na regurgitação restante em um segmento especificado do trato gastrointestinal do animal, por exemplo, o íleo. Energia metabolizável, conforme usado no presente documento, refere-se à energia metabolizável aparente e significa a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta contida nas fezes, urina e produtos gasosos da digestão. A energia digerível e a energia metabolizável podem ser medidas como a diferença entre a ingestão de energia bruta e a energia bruta excretada nas fezes ou na regurgitação presente no segmento especificado do trato gastrointestinal com o uso dos mesmos métodos para medir a digestibilidade de nutrientes, com correções adequadas para excreção de nitrogênio para calcular a energia metabolizável de uma ração.

[00256] Em algumas modalidades, as rações e/ou as composições aditivas para ração descritas no presente documento podem melhorar a digestibilidade ou a utilização de hemicelulose ou fibra dietária em um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um porco.

[00257] Retenção de nitrogênio, conforme usado no presente documento, significa uma capacidade do indivíduo para reter nitrogênio da dieta como massa corporal. Um saldo negativo de nitrogênio ocorre quando a excreção de nitrogênio excede a ingestão diária e é frequentemente observado quando há perda muscular. Um saldo positivo de nitrogênio está frequentemente associado ao crescimento muscular, particularmente em animais em crescimento.

[00258] A retenção de nitrogênio pode ser medida como a diferença entre a ingestão de nitrogênio e o nitrogênio excretado por meio da coleta total de excremento e urina durante um período de tempo. Compreende-se que o nitrogênio excretado inclui proteína não digerida da ração, secreções proteicas endógenas, proteína microbiana e nitrogênio urinário.

[00259] Uma ração da invenção pode conter minerais adicionais,

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85/131 tais como, por exemplo, cálcio, e/ou vitaminas adicionais. Em algumas modalidades, a ração é uma mistura de farinha de milho e soja.

[00260] A ração é tipicamente produzida em moinhos de ração nos quais matérias-primas são, primeiramente, trituradas até um tamanho de partícula adequado e, então, misturadas com aditivos adequados. A ração pode, então, ser produzida como um mosto ou péletes; o último tipicamente envolve um método no qual a temperatura é elevada até um nível-aivo e, então, a ração é passada através de um molde para produzir péletes de um tamanho específico. Permite-se que os péletes resfriem. Subsequentemente, aditivos líquidos, tais como soluções de gordura e enzima, podem ser adicionados. A produção de ração também pode envolver uma etapa adicional que inclui a extrusão ou expansão antes da peletização, em particular, por meio de técnicas adequadas que podem incluir pelo menos o uso de vapor.

[00261] As rações, conforme revelado no presente documento, podem ser para qualquer animal, conforme definido no presente documento.

[00262] Assim, em uma outra modalidade, é revelada uma ração para animais, gênero alimentício, composição aditiva para ração ou pré-mistura que compreende pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease e é termoestável, em que o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 92 % de identidade de sequência com a mesma, e sendo que a dita ração para animais, gêneros alimentícios, composição aditiva para ração ou prémistura opcionalmente compreende, ainda, (a) pelo menos um microorganismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima.

[00263] O termo composição aditiva para ração refere-se a uma

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86/131 composição enzimática para uso no alimento. Essa composição enzimática também pode compreender (a) pelo menos um microorganismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima, isto é, mais de uma enzima, ou c) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima.

[00264] Uma composição aditiva para ração pode ser misturada por adição com um componente de ração para formar um gênero alimentício. O termo componente de ração, conforme usado no presente documento, significa a totalidade ou parte do gênero alimentício. Parte do gênero alimentício pode significar um constituinte do gênero alimentício ou mais de um constituinte do gênero alimentício, por exemplo, 2 ou 3 ou 4 ou mais. Em uma modalidade, o termo componente de ração abrange uma pré-mistura ou os constituintes da pré-mistura. A ração pode ser uma ração composta ou uma pré-mistura da mesma. Uma composição aditiva para ração pode ser misturada por adição com uma ração composta, um componente de ração composta ou uma pré-mistura de uma ração composta, ou uma ração, um componente de ração ou uma pré-mistura de uma ração.

[00265] Em aigumas aplicações, as composições aditivas para ração podem ser misturadas ou administradas na água potável.

[00266] O pelo menos um DFM pode compreender pelo menos um micro-organismo viávei, tal como, uma cepa bacteriana viável ou um fungo viável, tal como uma levedura viável. De preferência, o DFM compreende pelo menos uma bactéria viável.

[00267] É possível que o DFM possa compreender uma cepa bacteriana formadora de esporos e, portanto, o DFM pode compreender esporos, por exemplo, esporos bacterianos. Assim, o termo microorganismo viável, conforme usado no presente documento, inclui esporos microbianos, tais como endósporos ou conídios. Alternativamente, o DFM na composição aditiva para ração descrita no presente do

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87/131 cumento pode não compreender esporos microbianos. Assim, o microorganismo viável pode ser um micro-organismo metabolicamente ativo (por exemplo, uma célula bacteriana vegetative) ou um microorganismo metabolicamente inativo (por exemplo, um endósporo). Por viável entende-se, assim, um micro-organismo que tem capacidade para se desenvolver e reproduzir. Um esporo pode ser considerado viável se tiver capacidade para germinação.

[00268] O micro-organismo pode ser um micro-organismo de ocorrência natural, ou pode ser um micro-organismo transformado ou mutado, tal como uma micro-organismo geneticamente modificado.

[00269] Um DFM, conforme descrito no presente documento, pode compreender micro-organismo de um ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera e combinações dos mesmos.

[00270] De preferência, o DFM compreende uma ou mais cepas bacterianas selecionadas dentre as seguintes Bacillus spp: B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis, B. pumills e B. amyloliquefaciens.

[00271] O gênero Bacillus”, conforme usado no presente documento, inclui todas as espécies do gênero Bacillus”, conforme conhecido por aqueles de habilidade comum na técnica, incluindo, porém sem limitação, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. gibsonii, B. pumilis e B. thuringiensis. Reconhece-se que o gênero Bacillus continua a sofrer reorganização taxonômica. Assim, pretende-se que o gênero inclua espécies que tenham sido reclassificadas, incluindo, porém sem limitação, tais organismos como Bacillus stearothermophilus, que é agora denominado Geobacillus stearothermophilus”, ou Bacillus polimyxa, que agora denomina-se Paenibacillus poiimyxa”. A produção

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88/131 de endósporos resistentes sob condições ambientais estressantes é considerada a característica definidora do gênero Bacillus, embora essa característica também se aplique aos recentemente denominados Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurínlbacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobaciilus, Ureibacillus, e Virgibacillus.

[00272] Em um outro aspecto, o DFM pode compreender, ainda, um ou ambos dentre os seguintes Lactococcus spp: Lactococcus cremoris e Lactococcus lactis.

[00273] O DFM pode compreender, ainda, um ou mais dos seguintes Lactobacillus spp: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus. Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarlus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sake!, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii e Lactobacillus jensenii e combinações de qualquer um dos mesmos.

[00274] Em ainda um outro aspecto, o DFM pode compreender, ainda, um ou mais dos seguintes Bifidobacteria spp: Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium Infantis, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium adolescentis, e Bifidobacterium angulatum e combinações de qualquer um dos mesmos.

[00275] O DFM pode particularmente compreender uma ou mais dentre as seguintes espécies: Baciilus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilis, Enterococcus , Entero

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89/131 coccus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Megasphaera elsdenii, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. Saltvarius, Propionibacteria spp. e combinações das mesmas.

[00276] Um micro-organismo de alimentação direta, conforme descrito no presente documento, pode compreender uma ou mais cepas bacterianas. O DFM pode compreender um tipo de cepa bacteriana, ou um tipo de espécie bacteriana ou um tipo de gênero bacterlano. Esse tipo de espécie bacteriana pode consistir em apenas uma única cepa ou pode compreender mais de uma cepa. Esse tipo de gênero bacteriano pode consistir em uma única espécie, que pode compreender uma ou mais cepas, ou o gênero pode compreender mais de uma espécie bacteriana, sendo que cada uma pode compreender uma ou mais cepas. Alternativamente, o DFM pode compreender uma mistura de gêneros, sendo que cada um pode compreender uma ou mais espécies e cepas.

[00277] O DFM pode compreender um ou mais dentre os produtos ou os micro-organismos contidos naqueles produtos revelados no documento n²WO2012110778 resumidos da seguinte forma:

[00278] cepa de 2084 Bacillus subtilis, n² de registro NRRI B-50013, cepa LSSAO1 de Bacillus subtilis, n² de registro NRRL B-50104 e cepa 15A-P4 ATCC de Bacillus subtilis, n² de registro PTA-6507 (disponíveis junto à Enviva Pro®, anteriormente conhecida como Avicorr®); cepa C3102 de Bacillus subtilis (disponível junto à Calsporin®); cepa PB6 de Bacillus subtilis (disponível junto à Clostat®); Bacillus pumilis (8G-134); NCIMB 10415 de Enterococcus (SF68) (disponível junto à Cylactin®); cepa C3102 de Bacillus subtilis (disponível junto à Galli

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90/131 pro® & GalliproMax®); Bacillus licheniformis (disponível junto à Gallipro®Tect®); Enterococcus e Pediococcus (disponível junto à Poultry star®); Lactobacillus, Bifidobacterium e/ou Enterococcus (disponível junto à Protexin®); cepa QST 713 de Bacillus subtilis (disponível junto à Proflora®); CECT-5940 de Bacillus amyloliquefaciens (disponível junto à Ecobiol® & Ecobiol® Plus); SF68 de Enterococcus faecium (disponível junto à Fortiflora®); Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis (disponível junto à BioPlus2B®); bactérias de ácido lático 7 Enterococcus faecium (disponível junto à Lactiferm®); cepa de Bacillus (disponível junto à CSI®); Saccharomyces cerevisiae (disponível junto à YeaSacc®); Enterococcus (disponível junto à Biomin IMB52®); Pediococcus acidilactici, Enterococcus, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius (disponível junto à Biomin C5®); Lactobacillus farciminis (disponível junto à Biacton®); Enterococcus (disponível junto à Oralin E1707®); Enterococcus (2 cepas), DSM 1103 de Lactococcus lactis (disponível junto à Probios-pioneer PDFM®); Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus farciminis (disponível junto à Sorbiflore®); Bacillus subtilis (disponível junto à Animavit®); Enterococcus (disponível junto à Bonvital®); Saccharomyces cerevisiae (disponível junto à Levucell SB 20®); Saccharomyces cerevisiae (disponível junto à Levucell SC 0 & SC10® ME); Pediococcus acidilacti (disponível junto à Bactocell); Saccharomyces cerevisiae (disponível junto à ActiSaf® (anteriormente BioSaf®)); NCYC Sc47 de Saccharomyces cerevisiae (disponível junto à Actisaf® SC47); Clostridium butyricum (disponível junto à Miya-Gold®); Enterococcus (disponível junto à Fecinor e Fecinor Plus®); NCYC R-625 de Saccharomyces cerevisiae (disponível junto à InteSwine®); Saccharomyces cerevisia (disponível junto à BioSprint®); Enterococcus e Lactobacillus rhamnosus (disponível junto à Provita®); Bacillus subtilis e Aspergillus oryzae (disponível junto à PepSoyGen-C®); Bacillus ce

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91/131 reus (disponível junto à Toyocerin®); NCIMB 40112/CNCM 1-1012 de Bacillus cereus var. toyoi (disponível junto à TOYOCERIN®) ou outros DFMs, como Bacillus licheniformis e Bacillus subtilis (disponível junto à BioPlus® YC) e Bacillus subtilis (disponível junto à GalliPro®).

[00279] O DFM pode compreender Enviva® PRO que está comercialmente disponível junto à Danisco A/S. Enviva Pro® é uma combinação da cepa 2084 de Bacillus, n^a de registro NRRI B-50013, cepa LSSAO1 de Bacillus, n^a de registro NRRL B-50104 e cepa 15A-P4 ATCC de Bacillus n^a de registro PTA-6507 (conforme apresentado no documento n^a U.S. 7.754.469 B - incorporado ao presente documento a título de referência).

[00280] O DFM descrito no presente documento pode compreender, ainda, uma levedura do gênero: Saccharomyces.

[00281] De preferência, o DFM descrito no presente documento compreende micro-organismos que são geralmente reconhecidos como seguros (GRAS) e, de preferência, são aprovados por GRAS. Assim, os micro-organismos são, de preferência, não patogênicos.

[00282] Um indivíduo de habilidade comum na técnica estará prontamente ciente de espécies e/ou cepas específicas de microorganismos dos gêneros descritos no presente documento, os quais são usados nas indústrias alimentícias e/ou agrícolas e que são geralmente considerados adequados para o consumo animal.

[00283] Em algumas modalidades, é importante que o DFM seja tolerante ao calor, isto é, seja termotolerante. Esse é particularmente o caso quando a ração é peletizada. Portanto, em uma outra modalidade, o DFM pode compreender um ou mais micro-organismos termotolerantes, tais como bactérias termotolerantes, incluindo, por exemplo, Bacillus spp. Por bactérias termotolerantes entendem-se espécies bacterianas com capacidade para sobreviver a uma temperatura acima da temperatura fisiológica (37°C). De preferência, isso se refere a es

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92/131 pécies com capacidade para sobreviver a uma temperatura de pelo menos 50°C, 60°C, 70°C, 80°C ou 90°C. Por capacidade para sobreviver entende-se espécies com capacidade para sobreviver na forma vegetativa em tais temperaturas, por exemplo, micro-organismos termofílicos, e espécies que não têm capacidade para sobreviver na vegetativa em tais temperaturas, mas que têm capacidade para esporular de modo a produzir esporos com capacidade para sobreviver em tais temperaturas. Tais espécies incluem Bacillus spp., o qual produz endósporos com capacidade para sobreviver em tais temperaturas.

[00284] Pode ser desejável que o DFM compreenda bactérias produtoras de esporos, tais como Bacillus spp. Bacilli têm capacidade para formar endósporos estáveis, quando as condições para o crescimento são desfavoráveis, e são muito resistentes ao calor, ao pH, à umidificação e a desinfetantes.

[00285] O DFM descrito no presente documento pode diminuir ou impedir o estabelecimento intestinal de micro-organismos patogênicos (tais como Clostridium perfringens e/ou E. coll e/ou Salmonella spp e/ou Campylobacter spp.). Em outras palavras, o DFM pode ser antipatogênico. O termo antipatogênico, conforme usado no presente documento, significa que o DFM neutraliza um efeito (efeito negativo) de um patógeno.

[00286] Conforme descrito acima, o DFM pode ser qualquer DFM adequado. Por exemplo, o ensaio DFM pode ser usado para determinar a adequação de um micro-organismo a um DFM. O ensaio DFM, conforme usado no presente documento, é explicado com mais detalhes no documento n² US2009/0280090. Para evitar dúvidas, o DFM selecionado como uma cepa inibidora (ou um DFM antipatogênico) de acordo com o ensaio DFM apresentado no presente documento é um DFM adequado para uso de acordo com a presente descrição, isto é, no produto alimentício de acordo com a presente descrição.

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93/131 [00287] Tubos foram semeados, cada um com um patógeno representativo (por exemplo, bactérias) proveniente de um grupamento representativo.

[00288] O sobrenadante de um DFM potencial, desenvolvido de maneira aeróbica ou anaeróbica, é adicionado aos tubos semeados (exceto para o controle ao qual nenhum sobrenadante é adicionado) e incubados. Após a incubação, a densidade óptica (OD) do controle e tubos tratados com sobrenadante foi medida para cada patógeno.

[00289] As colônias de cepas (DFM potencial) que produziram uma OD reduzida em comparação com o controle (que não continha qualquer sobrenadante) podem, então, ser classificadas como uma cepa inibidora (ou um DFM antipatogênico). Assim, o ensaio DFM, conforme usado no presente documento, é explicado com mais detalhes no documento n²US2009/0280090.

[00290] De preferência, um patógeno representativo usado nesse ensaio de DFM pode ser um (ou mais) dentre os seguintes: Clostrídio, tal como Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile, E. coli Salmonella spp e/ou Campylobacter spp. Em uma modalidade preferencial, o ensaio é conduzido com um ou mais dentre Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile e/ou E. coli, de preferência, Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile, com mais preferência, Clostridium perfringens.

[00291] Os DFMs antipatogênicos incluem uma ou mais dentre as seguintes bactérias e são descritos no documento n^QWO2013029013: cepa 3BP5 de Bacillus subtilis, n² de registro NRRL B-50510, cepa 918 ATCC de Bacillus amyloliquefaciens, n²de registro NRRL B~ 50508 e cepa 1013 ATCC de Bacillus subtilis, n² de registro NRRL B-50509.

[00292] DFMs podem ser preparados como cultura (ou culturas) e carreador (carreadores) (quando usados) e podem ser adicionados a

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94/131 um misturador helicoidal ou de pás e misturados por cerca de 15 minutos, embora a temporização possa ser aumentada ou diminuída. Os componentes são mesclados de modo que resulte uma mistura uniforme das culturas e carreadores. O produto final é, de preferência, um pó seco fluidificável. O DFM (ou DFMs) que compreende uma ou mais cepas bacterianas pode, então, ser adicionado à ração para animais ou a uma pré-mistura de ração, adicionado a uma água do animai ou administrado de outras formas conhecidas na técnica (de preferência, simultaneamente com as enzimas descritas no presente documento.

[00293] A inclusão das cepas individuais na mistura de DFM pode ocorrer em proporções que variam de 1 % a 99% e, de preferência, de 25% a 75% [00294] As dosagens adequadas do DFM na ração para animais podem se situar na faixa de cerca de 1x10³ CFU/g de ração a cerca de 1x1O¹⁰ CFU/g de ração, adequadamente entre cerca de 1x10⁴ CFU/g de ração e cerca de 1x10⁸ CFU/g de ração, adequadamente entre cerca de 7,5x10⁴ CFU/g de ração e cerca de 1x10⁷ CFU/g de ração.

[00295] Em um outro aspecto, o DFM pode ser dosado no gênero alimentício em mais que cerca de 1x10³ CFU/g de ração, adequadamente, mais que cerca de 1x10⁴ CFU/g de ração, adequadamente, mais que cerca de 5x10⁴ CFU/g de ração ou, adequadamente, mais que cerca de 1x10⁵ CFU/g de ração.

[00296] O DFM pode ser dosado em uma composição aditiva para ração de cerca de 1x10³ CFU/g de composição a cerca de 1x10¹³CFU/g de composição, de preferência, 1x10⁵ CFU/g de composição a cerca de 1x10¹³ CFU/g de composição, com mais preferência, entre cerca de 1x10⁶ CFU/g de composição e cerca de 1x10¹² CFU/g de composição e, com máxima preferência, entre cerca de 3,75x10⁷CFU/g de composição e cerca de 1x10¹¹ CFU/g de composição. Em um outro aspecto, o DFM pode ser dosado em uma composição aditi

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95/131 va para alimento em mais que cerca de 1x10⁵ CFU/g de composição, de preferência, mais que cerca de 1x10⁶ CFU/g de composição e, com máxima preferência, mais que cerca de 3,75x10⁷ CFU/g de composição. Em uma modalidade, o DFM é dosado na composição aditiva para ração em mais que cerca de 2x10⁵ CFU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 2x10⁶ CFU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 3,75x10⁷ CFU/g de composição.

[00297] Uma composição aditiva para ração, conforme descrito no presente documento, que compreende uma serina protease termoestável, conforme definido no presente documento, pode ser usada como, em ou na preparação de um produto alimentício, tal como uma ração.

[00298] Uma composição aditiva para ração, conforme descrito no presente documento, também pode compreender (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima, isto é, mais de uma enzima, ou c) pelo menos um microorganismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima.

[00299] A composição aditiva para ração pode compreender, ainda, um ou mais dentre: um carreador nutricionalmente aceitável, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável e um ingrediente nutricionalmente ativo. Por exemplo, uma composição aditiva para ração descrita no presente documento pode compreender pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propilenoglicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formiato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formiato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formiato de

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96/131 magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfito de sódio, metil parabeno e propil parabeno. Por um peptídeo entende-se um composto que compreende um pequeno número de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Por exemplo, um peptídeo pode conter 30 ou menos, 25 ou menos, 20 ou menos, 15 ou menos, 10 ou menos ou 5 ou menos aminoácidos.

[00300] Essa composição aditiva para ração pode ser granulada. Por granulada entende-se que o produto alimentício é fornecido em uma forma particulada, isto é, o produto alimentício está sob a forma de partículas, por exemplo, sob a forma de um pó. O produto alimentício granulado pode ser obtido por meio do processamento de um volume maior do produto (isto é, processamento de um produto alimentício nâo granular) com o uso de um processo, tal como granulação de alto cisalhamento, granulação em cilindro, extrusão, esferonização, aglomeração em leito fluidizado, revestimento por aspersão em leito fluidizado, secagem por aspersão, liofilização, compressão, arrefecimento por aspersão, atomização em disco giratório, coacervação ou produção de tabletes ou qualquer combinação dos processos acima. Esses processos são bem conhecidos pelos indivíduos versados na técnica e são normalmente realizados na técnica da produção de produto alimentício, particularmente, produção de ração para animais.

[00301] A composição aditiva para ração descrita no presente documento pode ser formulada em grânulos conforme descrito no documento n² W02007/044968 (denominados grânulos TPT) incorporado ao presente documento a título de referência.

[00302] Em certas modalidades, as partículas do produto alimentício granulado (por exemplo, composição aditiva para ração) têm um diâmetro médio de 50 microns (pm) a 2.000 microns, por exemplo, 100 microns a 1.800 microns, 250 microns a 1.500 microns, 500 microns a 1.500 microns, 800 microns a 1.200 microns ou cerca de 1.000 mi

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97/131 crons.

[00303] Quando a composição aditiva para alimento descrita no presente documento é granulada, o produto alimentício pode consistir em grânulos que compreendem um sal de barreira hidratado revestido sobre um núcleo da proteína. A vantagem de tal revestimento de sal é a melhoria da termotolerância, melhoria da estabilidade no armazenamento e proteção contra outros aditivos para ração que, de outra forma, têm um efeito adverso na serina protease termoestável e/ou no DFM opcional que compreende uma ou mais cepas bacterianas. De preferência, o sal usado para o revestimento de sal tem uma atividade em água superior a 0,25 ou umidade constante superior a 60% a 20°C. De preferência, o revestimento de sal compreende um NazSO^.

[00304] Em uma modalidade, a composição aditiva para ração descrita no presente documento é formulada em um grânulo de modo a fornecer composições de ração que compreendem: um núcleo; um agente ativo; e pelo menos um revestimento, sendo que o agente ativo do grânulo retém pelo menos 50%, 60%, 70% ou 80% de atividade após experimentar condições selecionadas dentre um ou mais dentre: a) um processo de peletização de ração, b) um processo de prétratamento de ração aquecido por vapor, c) armazenamento, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura não peletizada e e) armazenamento como um ingrediente em uma mistura-base de ração ou uma pré-mistura de ração que compreende pelo menos um composto selecionado dentre oligoelementos minerais, ácidos orgânicos, açúcares redutores, vitaminas, cloreto de colina e compostos que resultam em uma mistura-base de ração ou pré-mistura de ração ácida ou básica.

[00305] Em relação ao grânulo, o pelo menos um revestimento pode compreender um material de hidratação por umidificação que constitui pelo menos 55% em p/p do grânulo; e/ou o pelo menos um reves

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98/131 timento pode compreender dois revestimentos. Os dois revestimentos podem ser um revestimento de hidratação por umidificação e um revestimento de barreira contra umidificação. Em algumas modalidades, o revestimento de hidratação por umidificação pode constituir entre 25% e 60% em p/p do grânulo, e o revestimento de barreira contra umidificação pode constituir entre 2% e 15% em p/p do grânulo. O revestimento de hidratação por umidificação pode ser selecionado dentre sais inorgânicos, sacarose, amido e maltodextrina, e o revestimento de barreira contra umidificação pode ser selecionado dentre polímeros, gomas, soro e amido.

[00306] O grânulo pode ser produzido com o uso de um processo de peletização de ração que pode ser conduzido entre 70°C e 95°C, tal como entre 85°C e 95°C, por até diversos minutos.

[00307] A composição aditiva para ração pode ser formulada em um grânulo para ração para animais que compreende: um núcleo; um agente ativo, sendo que o agente ativo retém pelo menos 80% de atividade após o armazenamento e após um processo de peletização aquecido por vapor, em que o grânulo é um ingrediente; um revestimento de barreira contra umidificação; e um revestimento de hldratação por umidificação que constitui pelo menos 25% em p/p do grânulo, sendo que o grânulo tem uma atividade em água inferior a 0,5 antes do processo de peletização aquecido por vapor.

[00308] O grânulo pode ter um revestimento de barreira contra umidificação selecionado dentre polímeros e gomas, e o material de hidratação por umidificação pode ser um sal inorgânico. O revestimento de hidratação por umidificação pode constituir entre 25% e 45% em p/p do grânulo, e o revestimento de barreira contra umidificação pode constituir entre 2% e 10% em p/p do grânulo.

[00309] O grânulo pode ser produzido com o uso de um processo de peletização aquecido por vapor que pode ser conduzido entre 85°C

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99/131 e 95°C por até diversos minutos, [00310] O produto alimentício da invenção, por exemplo, uma composição aditiva para ração ou uma ração que compreende uma composição aditiva para ração, pode ser usado em qualquer forma adequada. Tal produto alimentício (por exemplo, uma composição aditiva para ração) pode ser usado sob a forma de preparações sólidas ou líquidas ou alternativas das mesmas. Exemplos de preparações sólidas incluem pós (incluindo pós secos), pastas, bolus, cápsulas, péletes, tabletes, poeiras e grânulos que podem ser molháveis, secos por aspersão ou liofilizados. Exemplos de preparações líquidas incluem, porém sem limitação, soluções, suspensões e emulsões aquosas, orgânicas ou aquosas e orgânicas. Tais produtos alimentícios podem ser revestidos, por exemplo, encapsulados, por exemplo, para proteger as enzimas do produto alimentício contra o calor. Um revestimento pode, assim, ser considerado um termoprotetor.

[00311] Pó seco ou grânulos podem ser preparados por quaisquer meios conhecidos pelos versados na técnica, tais como granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, aspersão de leito fluidizado.

[00312] Uma composição aditiva para ração pode ser em pó, conforme descrito acima. O pó pode, adicionalmente, ser peletizado. No processo de peletização, o pó pode ser misturado com outros componentes conhecidos na técnica, forçados através de um molde, e os filamentos resultantes podem ser cortados em péletes adequados de comprimento variado.

[00313] Opcionalmente, a etapa de peletização pode incluir um tratamento a vapor, ou estágio de condicionamento, antes da formação dos péletes. A mistura que compreende o pó pode ser colocada em um condicionador, por exemplo, um misturador com injeção de vapor. A mistura é aquecida no condicionador até uma temperatura especifi

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100/131 cada, tal como de 60 a 100°C, temperaturas típicas seriam 70°C, 80°C, 85°C, 90°C ou 95°C. O tempo de permanência pode variar de segundos a minutos e até horas, por exemplo, 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos ou 1 hora. Será compreendido que as serina proteases termoestáveis (ou composição que compreende as serina proteases termoestáveis) descritas no presente documento são adequadas para adição a qualquer material de ração apropriado.

[00314] Alternativamente, uma composição aditiva para ração pode ser formada aplicando-se, por exemplo, aspergindo-se a serina protease termoestável em um substrato carreador, tal como trigo triturado, por exemplo.

[00315] Quando a composição aditiva para ração está sob a forma de um líquido, de preferência, a forma líquida é adequada para secagem por aspersão em um pélete de ração.

[00316] Quando a composição aditiva para ração está sob a forma de um líquido, a mesma pode estar em uma formulação adequada para consumo, por exemplo, contendo um ou mais dentre os seguintes: um tampão, sal, sorbitol e/ou glicerol.

[00317] Em uma modalidade, a serina protease termoestável e, opcionalmente, um DFM são formulados com pelo menos um carreador fisiologicamente aceitável selecionado a partir de pelo menos um dentre maltodextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um componente do trigo, sacarose, amido, NazSCri, talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbato, glicerol, sacarose, propilenoglicol, 1,3propanodiol, glicose, parabenes, cloreto de sódio, citrato, acetato, fosfato, cálcio, metabissulfito, formato e misturas dos mesmos.

[00318] Em algumas modalidades, a serina protease termoestável, conforme definido no presente documento, pode estar presente em um produto de ração para animais da invenção (por exemplo, uma ração)

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101/131 a uma concentração na faixa de 1 ppb (parte por bilhão) a 10 % (p/p), com base na proteína enzimática pura. Em algumas modalidades, a protease está presente no gênero alimentício na faixa de 1 a 100 ppm (partes por milhão). Uma dose preferenciai pode ser 1 a 20 g de serina protease termoestável por tonelada (pela qual se entende uma tonelada métrica de 1.000 kg) de produto de ração ou composição de ração, por exemplo, 1 a 18 g/tonelada, 2 a 18 g/tonelada, 5 a 15 g/tonelada, 1 a 10 g/tonelada, 10 a 20 g/tonelada ou 8 a 12 g/tonelada, ou uma dose final de 1 a 20 ppm de serina protease termoestável no produto final, por exemplo, 1 a 18 ppm, 2 a 18 ppm, 5 a 15 ppm, 1 a 10 ppm, 10 a 20 ppm ou 8 a 12 ppm.

[00319] De preferência, a serina protease termoestável está presente na ração com uma atividade de pelo menos cerca de 200 PU/kg, 300 PU/kg, 400 PU/kg, 500 PU/kg, 600 PU/kg, 700 PU/kg, 800 PU/kg, 900 PU/kg, 1.000 PU/kg, 1.500 PU/kg, 2.000 PU/kg, 2.500 PU/kg, 3.000 PU/kg, 3.500 PU/kg, 4.000 PU/kg, 4.500 PU/kg ou 5.000 PU/kg ração.

[00320] Em um outro aspecto, a serina protease termoestável pode estar presente no gênero alimentício em menos que cerca de 60.000 PU/kg, 70.000 PU/kg, 80.000 PU/kg, 90.000 PU/kg, 100.000 PU/kg, 200.000 PU/kg, 300.000 PU/kg, 400.000 PU/kg, 500.000 PU/kg, 600.000 PU/kg ou 700.000 PU/kg de ração.

[00321] As faixas podem incluir, porém sem limitação, qualquer combinação das faixas inferior e superior discutidas acima.

[00322] Será compreendido que uma unidade de protease (PU) é a quantidade de enzima que libera 2,3 microgramas de composto fenólico (expresso como equivalentes de tirosina) de um substrato de caseína por minuto em pH 10,0 a 50°C. Isso pode ser mencionado como o ensaio para determinar 1 PU. O versado na técnica é bastante capacitado para realizar tal ensaio e para determinar o número PU presente

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102/131 em uma amostra.

[00323] Em um outro aspecto, é revelado um método para hidrolisar um material derivado de milho, sendo que o dito método compreende:

[00324] Amido ou amilum é um carboidrato polimérico que consiste em um grande número de unidades de unidades de glicose por ligações giicosídicas O amido pode ser hidrolisado em carboidratos mais simples por ácidos, várias enzimas ou uma combinação dos dois.

[00325] Na indústria, o amido é convertido em açúcares, por exemplo, por maltagem, e fermentado para produzir etanol na fabricação de cerveja, uísque e biocombustível.

[00326] Qualquer material que contém amido adequado pode ser usado. O material de partida é geraimente selecionado com base no produto de fermentação desejado. Os exemplos de materiais que contêm amido incluem, porém sem limitação, grãos inteiros, milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijões ou misturas dos mesmos ou amidos derivados dos mesmos ou cereais. O material de partida pode ser um sólido seco, tal como, porém sem limitação, um sólido seco de uma ração ou alimento para animais conforme descrito no presente documento. São também contemplados tipos cerosos e não cerosos ou milho e cevada. Os materiais que contêm amido usados para produção de etanol são milho ou

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103/131 trigo. O amido é inicialmente coletado de grãos de planta com o uso de uma moagem a úmido, uma moagem a seco ou um processo de trituração a seco.

[00327] Um substrato que compreende material vegetal é reduzido ou moído por métodos conhecidos na técnica. O materiai vegetal pode ser obtido a partir de: trigo, milho, centeio, sorgo (milo), arroz, painço, cevada, triticale, mandioca (tapioca), batata, batata-doce, beterrabas, cana-de-açúcar e legumes, tais como soja e ervilhas. O material vegetal preferencial inclui milho, cevada, trigo, arroz, milo e combinações dos mesmos. O material vegetal pode incluir variedades híbridas e variedades geneticamente modificadas (por exemplo, milho transgênico, cevada ou sojas que compreendem genes heterólogos).

[00328] Qualquer parte da planta contendo amido pode ser usada para produzir o liquefeito, incluindo, porém sem limitação, partes de planta, tais como folhas, caules, cascos, cascas, tubérculos, espigas, grãos e similares. Os grãos inteiros preferenciais incluem milho, trigo, centeio, cevada, sorgo e combinações dos mesmos. Em outras modalidades, o amido pode ser obtido a partir de grãos de cereal fracionados incluindo fibra, endosperma e/ou componentes germinativos. Os métodos para fracionar material vegetal, tal como milho e trigo, são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o material vegetal obtido a partir de diferentes fontes pode ser misturado em conjunto (por exemplo, milho e milo ou milho e cevada). Os métodos de moagem são bem conhecidos na técnica e referência é feita a The Alcohol Textbook: A Reference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, 3^a edição K.A. Jacques et al., Eds, (1999) Nottingham University Press. Consultar os Capítulos 2 e 4.

[00329] Em algumas modalidades, o material vegetal, reduzido por moagem ou outros meios, será combinado com uma solução resultando em uma pasta fluida que compreende substrato de amido. Em al

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104/131 gumas modalidades, a pasta fluida pode incluir uma corrente lateral do processamento de amido, tal como recuo. Em algumas modalidades, a pasta fluida compreenderá 15 a 55% ds (por exemplo, 20 a 50%, 25 a 45%, 25 a 40% e 20 a 35%). Em algumas modalidades, a pasta fluida pode compreender 10% a 60% de recuo. A pasta fluida que compreende o material vegetal reduzido pode ser submetida a um processo de liquefaçâo em que uma alfa amilase pode ser adicionada durante a etapa de liquefaçâo. Isso resulta em um liquefeito. Para produzir o liquefeito, uma única dose ou dose dividida de uma alfa amilase pode ser adicionada à pasta fluida. Uma pessoa versada na técnica pode determinar prontamente a dosagem eficaz da alfa amilase a ser usada nos processos de liquefaçâo.

[00330] A quantidade de alfa amilase usada para liquefaçâo é uma quantidade eficaz para causar a liquefaçâo de uma maioria do amido. Em outras modalidades, a quantidade é eficaz para permitir a liquefaça© de mais do que 40% do amido, incluindo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100%. Em algumas modalidades, a faixa será 0,05 a 50 AAU/g de ds (unidades de alfa-amilase por grama de sólidos secos (por exemplo, ração ou alimento para animais, tal como milho), também 0,1 a 20 AAU/gDS e também 1,0 a 10 AAU/gDS. Em modalidades adicionais, a dosagem de alfa amilase estará na faixa de 0,01 a 10,0 kg/tonelada métrica (MT) de ds; também 0,05 a 5,0 kg/MT de ds; e também 0,1 a 4,0 kg/MT de ds.

[00331] Uma alfa amilase pode ser adicionada a uma temperatura de 0 a 30°C abaixo da temperatura de geiatinização de amido do amido granular do material vegetal reduzido. Essa temperatura pode ser 0 a 25°C, 0 a 20°C, 0 a 15°C e 0 a 10°C abaixo da temperatura de gelatinização de amido. Esse valor específico variará e dependerá do tipo de grão que compreende a pasta fluida. Por exemplo, a temperatura de geiatinização de amido do milho é geralmente mais alta do que a

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105/131 temperatura de gelatinização de amido do centeio ou trigo. Em algumas modalidades, a temperatura estará entre 45 a 80°C, também entre 50 a 75°C, também entre 50 a 72°C e, em algumas modalidades, a temperatura estará abaixo de 68°C; abaixo de 65°C, abaixo de 62°C, abaixo de 60°C e também abaixo de 55°C. Em outras modalidades, a temperatura estará acima de 40°C, acima de 45°C, acima de 50°C e acima de 55°C. Em algumas modalidades preferenciais, a temperatura da incubação estará entre 58 a 72°C e também entre 60 a 68°C.

[00332] Em algumas modalidades, a pasta fluida será mantida a uma faixa de pH de cerca de 3,0 a menos do que 6,5, também a uma faixa de pH de 4,0 a menos do que 6,2, também a uma faixa de pH de cerca de 4,5 a menos do que 6,0 e, preferencialmente, a uma faixa de pH de cerca de 5,0 a 6,0 (por exemplo, cerca de 5,4 a 5,8), e o grão moído na pasta fluida entrará em contato com a composição de enzima por um período de tempo de 2 minutos a 8 horas (por exemplo, 5 min a 3 h; 15 min a 2,5 h e 30 min a 2 h). Em uma etapa adicional, o substrato incubado será liquefeito expondo-se o substrato incubado a um aumento na temperatura, tal como 0 a 55°C acima da temperatura de gelatinização de amido. (Por exemplo, 65°C a 120°C, 70°C a 110°C, 70°C a 90°C) por um período de tempo de 2 minutos a 8 horas (por exemplo, 2 minutos a 6 h, 5 minutos a 4 horas e, preferencialmente, 1 h a 2 h) a um pH de cerca de 4,0 a 6,5. Em algumas modalidades, a temperatura pode ser elevada a uma temperatura a entre cerca de 85 a 90°C e uma única dose de alfa amilase pode ser usada. Se a temperatura for elevada acima de 90 a 105°C, uma segunda dose de alfa amilase pode ser adicionada após a temperatura retomar ao normal. Em uma modalidade adicional, a temperatura pode ser elevada para entre cerca de 105 e 140°C e uma dose dividida de alfa amilase pode ser usada, sendo que uma parte é adicionada antes da elevação da temperatura e a outra parte é adicionada após a temperatura ter

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106/131 sido reduzida para pelo menos abaixo de 105°C, incluindo abaixo de 104, 103, 102, 101, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, e 91 °C, mas, de preferência, abaixo de 90°C. Em algumas modalidades, o liquefeito resultante é resfriado antes da sacarificação.

[00333] O liquefeito obtido acima pode ser colocado em contato com uma glicoamilase, uma alfa amilase estável ao ácido e uma protease fúngica ácida (tal como FERMGEN™, DuPont ou AP1 junto à CTE Global) em uma dose única ou uma dose dividida contanto que uma razão desejada de enzimas seja mantida. Assim, uma dose dividida significa que a dose total na razão desejada é adicionada em mais do que uma porção, incluindo duas porções ou três porções. Em uma modalidade, uma porção da dose total é adicionada no começo e uma segunda porção é adicionada a um tempo especificado no processo. Em uma modalidade, pelo menos uma porção da dose é adicionada no começo da sacarificação (ou SSF) para começar o processo de sacarificação. Em uma modalidade, cada enzima na composição enzimática pode ser adicionada ao liquefeito separadamente, mas simultaneamente ou próximo o suficiente no tempo de modo que a razão de atividade seja mantida. Alternativamente, a composição de mescla de enzimas que compreende uma glicoamilase, uma alfa amilase estável ao ácido e uma protease fúngica ácida pode ser adicionada durante uma ou ambas dentre a sacarificação e a fermentação. A razão entre a glicoamilase, uma alfa amilase estável ao ácido e uma protease fúngica ácida é, preferencialmente, cerca de 1:1,5:0,1 a cerca de 1:8:1 e, mais preferencialmente, cerca de 1:2:0,2 a 1:5: 0,6, conforme medido por GAU:SSU:SAPU.

[00334] A sacarificação ou processo SSF compreende tipicamente a adição de ureia ou amônia usada como uma fonte de nitrogênio para o organismo hospedeiro (tal como, porém sem limitação, levedura). Em plantas de etanol comerciais, a adição da fonte de nitrogênio (tal

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107/131 como ureia) durante a sacarificação ou SSF está tipicamente na faixa entre 200 a 1.000 ppm, tal como pelo menos 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 até 1.000 ppm de ureia. Outra fonte de nitrogênio rica em uma planta de etanol são as proteínas de milho presentes no miolo do milho. Essa fonte de nitrogênio é disponibilizada para o organismo de fermentação quando é hidrolisado em fragmentos menores como pequenos peptídeos e aminoácidos.

[00335] Constatou-se, surpreendente e inesperadamente, que quando uma serina protease termoestável, conforme descrito no presente documento, está presente durante a etapa de liquefação de um método para produzir produtos de fermentação a partir de materiais contendo amido, a necessidade de adicionar uma fonte de nitrogênio, tal como ureia, durante o processo de sacarificação ou SSF é reduzida em pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou completamente eliminada (100% de redução). Isso indica que uma serina protease termoestável, conforme descrito no presente documento, pode hidrolisar proteínas de milho até o ponto que possibilite que o organismo de fermentação use proteínas de milho como uma fonte de nitrogênio. Consequentemente, menos ureia ou nenhuma ureia pode ser adicionada à SSF. A forte redução ou eliminação de uma fonte de nitrogênio permite que a planta funcione a um custo mais baixo.

[00336] O que é descrito é um método para produzir produtos de fermentação a partir de material contendo amido que compreende:

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108/131 (b) sacarificar o produto da etapa (a);

[00337] Assim, conforme abordado acima, as etapas (b) e (c) podem ser realizadas simultaneamente.

[00338] Além disso, a adição de uma fonte de nitrogênio, tal como ureia, é eliminada ou reduzida em pelo menos 50% com o uso de 1 a 20 g de serina protease/MT de material contendo amido, em que a serina protease compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3.

[00339] Além disso, quando o the produto de liquefação for etanol, então nenhuma enzima proteolítica ácida é necessária ao usar 1 a 20 g de serina protease termoestável/MT de material contendo amido, em que a serina protease compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3.

[00340] Em outras palavras, isso parece indicar que a presença de uma protease diferente da serina protease termoestável descrita no presente documento no processo de fermentação poda não ser necessária.

[00341] O processo de sacarlficação pode durar 12 a 120 horas. Entretanto, é comum realizar uma sacarlficação por 30 minutos a 2 horas e, então, concluir a sacarificação durante a fermentação. Algumas vezes isso é denominado sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A sacarificação é comumente executada a temperaturas de 30 a 65°C e, tipicamente, a pH de 3,0 a 5,0, incluindo 4,0 a 5,0. A sacarificação pode resultar na produção de açúcares fermentáveis.

[00342] Em algumas modalidades, os açúcares fermentáveis são submetidos à fermentação com micro-organismos de fermentação. A

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109/131 etapa de contato e a etapa de fermentação podem ser realizadas simultaneamente no mesmo vaso de reação ou sequencialmente. Em geral, os processos de fermentação são descritos em The Alcohol Textbook 3^a edição, A Reference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, Eds Jacques et aL, (1999) Nottingham University Press, Reino Unido.

[00343] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente usar açúcares fermentáveis (dextrina, por exemplo, glicose) como um alimento para animais de fermentação em fermentações microbianas sob condições de fermentação adequadas para obter produtos finais, tais como álcool (por exemplo, etanol), ácidos orgânicos (por exemplo, ácido succínico, ácido lático), álcoois de açúcar (por exemplo, gliceroi), intermediários de ácido ascórbico (por exemplo, giuconato, DKG, KLG) aminoácidos (por exemplo, lisina), proteínas (por exemplo, anticorpos e fragmento dos mesmos).

[00344] Os açúcares fermentáveis podem ser fermentados com uma levedura a temperaturas na faixa de 15 a 40°C, 20 a 38°C e também 25 a 35°C; a uma faixa de pH de pH 3,0 a 6,5; também pH 3,0 a 6,0; pH 3,0 a 5,5, pH 3,5 a 5,0 e também pH 3,5 a 4,5 por um período de tempo de 5 horas a 120 horas, preferencialmente, 12 a 120 e mais preferencialmente de 24 a 90 horas para produzir um produto de álcool, preferencialmente, etanol.

[00345] As células de levedura são geralmente fornecidas em quantidades de 10⁴ a 10¹² e, preferencialmente, de 10⁷a 10¹⁰ contagens de levedura viável por ml de caldo de fermentação. A fermentação incluirá adicionalmente a um micro-organismo de fermentação (por exemplo, levedura) nutrientes, opcionalmente, ácido e enzimas adicionais. Em algumas modalidades, adicionalmente ás matérias-primas descritas acima, o meio de fermentação conterá suplementos incluindo, porém sem limitação, vitaminas (por exemplo, biotina, ácido fólico, ácido nico

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110/131 tinico, riboflavins), cofatores e macro e micronutrientes e sais (por exemplo, (NH4)₂SO₄; K2HPO4; NaCI; MgSO₄; H3BO3; ZnCI₂; e CaCb).

[00346] Em algumas modalidades preferenciais, 0 material vegetal moído inclui cevada, milo, milho e combinações dos mesmos, e as etapas de contato e fermentação são conduzidas simultaneamente a uma faixa de pH de 3,5 a 5,5, uma faixa de temperatura de 30 a 45°C e por um período de tempo de 48 a 90 h, em que pelo menos 50% do amido é solubilizado.

[00347] Um produto final de um processo de fermentação pode ser um produto de álcool, por exemplo, etanol. Outros produtos finais podem ser os coprodutos de fermentação, tais como grãos secos de destilaria (DDG) e grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS), que podem ser usados como uma ração para animais.

[00348] Com 0 uso de um micro-organismo de fermentação adequado, conforme conhecido na técnica, os produtos finais de fermentação podem incluir, sem limitação, glicerol, 1,3-propanodiol, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato, ácido 2-ceto-Lgulônico, ácido succínico, ácido láctico, aminoácidos e derivados dos mesmos.

[00349] Os exemplos de organismos de fermentação são microorganismos etanologênicos ou micro-organismos que produzem etanol, tais como bactérias etanologênicas que expressam álcool desidrogenase e piruvato desidrogenase e que podem ser obtidas a partir de Zymomonas moblis (Consultar, por exemplo, os documentos nUSP 5.000.000; USP 5.028.539, USP 5.424.202; USP 5.514.583 e USP 5.554.520). Em modalidades adicionais, os micro-organismos etanologênicos expressam xilose redutase e xilitol desidrogenase, enzimas que convertem xilose em xilulose. Em modalidades adicionais, a xilose isomerase é usada para converter xilose em xilulose. Em modalidades particularmente preferenciais, um micro-organismo com a ca

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111/131 pacidade para fermentar tanto pentoses quanto hexoses em etanol é utilizado. Por exemplo, em algumas modalidades, o micro-organismo pode ser um micro-organismo natural ou não geneticamente modificado ou, em outras modalidades, o micro-organismo pode ser um microorganismo recombinante.

[00350] Os micro-organismos de fermentação incluem, porém sem limitação, cepas bacterianas de Bacillus, Lactobacillus, E. coll, Erwinia, Pantoea (por exemplo, P. citrea), Pseudomonas e Klebsiella (por exemplo K. oxytoca). (Consultar, por exemplo, os documentos n² USP 5.028.539, USP 5.424.202 e WO 95/13362). Bacillus é um microorganismo de fermentação preferencial. O micro-organismo de fermentação usado na etapa de fermentação dependerá do produto final a ser produzido.

[00351] O micro-organismo que produz etanol pode ser um microorganismo fúngico, tal como Tríchoderma, uma levedura e, especificamente, Saccharomyces, tais como cepas de S. cerevisiae (USP 4.316.956). Uma variedade de S. cerevisiae está comercialmente disponível e inclui, porém sem limitação, FALI (Levedura de Fleischmann), SUPERSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialties), (Ethanol Red, Fermentis, França), (SYNERXIA® Thrive, Dupont), RED STAR (Lesaffre) e levedura de álcool Angel (Angel Yeast Company, China).

[00352] Por exemplo, quando o ácido láctico é o produto final desejado, um Lactobacillus sp. (L. casei) pode ser usado; quando glicerol ou 1,3-propanodiol são produtos finais desejados, E. coli pode ser usada; e quando 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato e ácido 2ceto~L~gulônico são os produtos finais desejados, Pantoea citrea pode ser usada como o micro-organismo de fermentação. A lista enumerada acima é apenas exemplificativa e um versado na técnica estará ciente de vários micro-organismos de fermentação que podem ser adequadamente usados para obter um produto final desejado.

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112/131 [00353] O produto final pode ser separado e/ou purificado a partir do meio de fermentação. Os métodos para separação e purificação são conhecidos, por exemplo, submetendo-se a mídia a extração, destilação e cromatografia de coluna. Em algumas modalidades, o produto final é identificado diretamente submetendo-se o meio à análise por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).

[00354] Exemplos não limitantes de composições e método revelados no presente documento incluem:

1. Um construto recombinante que compreende uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptideo termoestável que tem atividade de serina protease, sendo que a dita sequência de nucleotideos codificadora é operacionalmente ligada a pelo menos uma sequência reguladora funcional em um hospedeiro de produção, e a sequência de nucleotideos codifica um polipeptideo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou um polipeptideo com pelo menos 92% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma;

e sendo que a dita sequência reguladora é heteróloga à sequência de nucleotideos codificadora ou a dita sequência reguladora e a dita sequência codificadora não estão dispostas como encontradas juntas na natureza.

2. O construto recombinante, de acordo com a modalidade 1, em que a dita sequência de nucleotideos codificadora é uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptideo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, ou um polipeptideo com pelo menos 89% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma.

3. O construto recombinante, de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que a dita sequência de nucleotideos codificadora é selecionada dentre o grupo que consiste em:

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i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, ou um polipeptídeo com pelo menos 86% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma; ou ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:5 ou 14, ou um polipeptídeo com pelo menos 84% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma.

4. O construto recombinante, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que a dita pelo menos uma sequência reguladora compreende um promotor.

5. Um vetor que compreende um construto recombinante, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4.

6. Um hospedeiro de produção ou célula hospedeira que compreende o construto recombinante, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4.

7. O hospedeiro de produção ou célula hospedeira, de acordo com a modalidade 6, em que a dita célula é uma célula bacteriana, uma célula archaeal, uma célula fúngica ou uma célula algal.

8. Um método para produzir uma serina protease termoestável, sendo que o dito método compreende:

i) transformar uma célula hospedeira com um construto, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4; e ii) cultivar a célula hospedeira transformada da etapa (i) sob condições através das quais a serina protease termoestável é produzida.

9. O método, de acordo com a modalidade 8, que compreende, ainda, recuperar a serina protease termoestável a partir da célula hospedeira.

10. O método, de acordo com a modalidade 8 ou 9, sendo

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114/131 que a dita célula hospedeira é uma célula bacteriana, uma célula archaeal, uma célula fúngica ou uma célula algal.

11. Um sobrenadante de cultura que compreende uma serina protease termoestável obtida por meio do método, de acordo com qualquer uma das modalidades 8 a 10.

12. Um método para hidrolisar um material derivado de milho, sendo que o dito método compreende:

13. Uma ração para animais, gêneros alimentícios, composição aditiva para ração ou pré-mistura que compreende pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease e é termoestável, sendo que o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 92% de identidade de sequência com a mesma, e sendo que a dita ração para animais, gêneros alimentícios, composição aditiva para ração ou pré-mistura opcionalmente compreende, ainda, (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) pelo menos um microorganismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima.

14. A composição aditiva para ração, de acordo com a modalidade 13, sendo que a dita composição aditiva para ração compre

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115/131 ende adicionalmente pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, uma sacarose, uma lactose, um sorbitol, um glicerol, um propilenoglicol, um cloreto de sódio, um sulfato de sódio, um acetato de sódio, um citrato de sódio, um formiato de sódio, um sorbato de sódio, um cloreto de potássio, sulfato de potássio, um acetato de potássio, um citrato de potássio, um formiato de potássio, um acetato de potássio, um sorbato de potássio, um cloreto de magnésio, um sulfato de magnésio, um acetato de magnésio, um citrato de magnésio, um formiato de magnésio, um sorbato de magnésio, um metabissulfito de sódio, metii parabeno e propil parabeno.

15. A composição aditiva para ração, de acordo com a modalidade 13 ou 14, sendo que a dita composição aditiva para ração é granulada e compreende partículas produzidas por um processo selecionado a partir do grupo que consiste em granulação de alto cisalhamento, granulação em cilindro, extrusão, esferonlzação, aglomeração em leito fluidizado, revestimento por aspersão em leito fluidizado, secagem por aspersão, liofilização, compressão, arrefecimento por aspersão, atomização em disco giratório, coacervação, produção de tabletes ou qualquer combinação dos processos acima.

16. A ração para animais, de acordo com a modalidade 15, em que o diâmetro médio das partículas está entre 50 e 2.000 microns.

17. A composição aditiva para ração, de acordo com a modalidade 15 ou 16, sendo que a dita composição aditiva para ração está sob a forma de um líquido, um pó seco, ou um grânulo ou um revestimento, ou está em uma forma revestida ou encapsulada.

18. A composição aditiva para ração, de acordo com a modalidade 17, em que a dita composição aditiva para ração está sob a forma de um líquido que é adequado para secagem por aspersão em um péiete de ração.

19. A ração para animais, de acordo com a modalidade 13,

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116/131 em que o pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease está presente em uma quantidade de 1 a 20 g/tonelada.

20. Um método para produzir produtos de fermentação a partir de material contendo amido que compreende:

(b) sacarificar o produto da etapa (a);

21. O método, de acordo com a modalidade 20, em que as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente.

22. O método, de acordo com a modalidade 20 ou 21, sendo que a adição de uma fonte de nitrogênio é eliminada ou reduzida em pelo menos 50% com o uso de 1 a 20 g de serina protease/MT de material contendo amido, sendo que a serina protease compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3.

23. O método, de acordo com a modalidade 22, sendo que a fonte de nitrogênio é ureia.

24. O método, de acordo com a modalidade 22 ou 23, sendo que o produto de liquefação é etanol, e nenhuma enzima proteolítica ácida é necessária ao utilizar 1 a 20 g de serina protease termoestável/MT de material contendo amido, sendo que a serina protease compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de

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117/131 identidade de sequência com a SEQ ID NO:3.

EXEMPLOS [00355] A menos que definido de outra forma no presente documento, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente compreendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta descrição pertence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2^a edição, John Wiley e Sons, Nova York (1994), e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionam a uma pessoa versada na técnica um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta descrição.

[00356] A descrição é adicionalmente definida nos Exemplos a seguir. Deve-se compreender que os Exemplos, embora indicando certas modalidades, são dados a título de ilustração apenas. A partir da discussão acima e dos Exemplos, uma pessoa versada na técnica pode determinar características essenciais desta descrição e, sem se afastar do espírito e do escopo da mesma, pode fazer várias mudanças e modificações para adaptar a mesma para vários usos e condições. EXEMPLO 1

Análise da Sequência TnaProl [00357] A sequência de nucleotídeos do gene TnaProl de comprimento completo, conforme identificado no banco de dados NCBI (Thermococcus nautili, NCBI Sequência de Referência: NZ_CPQ07264.1 de 1327825-1329105, complementar), é fornecida na SEQ ID NO: 1. A sequência de proteínas de comprimento completo correspondente codificada pelo gene TnaProl é mostrada na SEQ ID NO: 2 (número de registro GenBank: AHL23118.1).

[00358] O propeptídeo e as regiões maduras da proteína TnaProl foram previstos com base em um alinhamento de sequência de proteí

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118/131 nas com uma enzima homóloga, a proteína TK-subtiiisina de Thermococcus kodakaraensis KOD1 (Pulido et a/. (2006) Applied and Environmental Microbiology, 72(6): 4.154 a 4.162). Com o uso do software SignalP v4.0 (Nordahl Petersen et at. (2011) Nature Methods 8:785 a 786), o peptídeo sinal de TnaProl foi previsto como tendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 10, e a pró-enzima foi prevista como tendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8. Com base no alinhamento com T. kodakaraensis KOD1, a terminação N de propeptídeo de TnaProl foi prevista.

[00359] O gene TnaProl que codifica o peptídeo sinal é apresentado na SEQ ID NO: 9, e a seção que codifica a pró-enzima é apresentada na SEQ ID NO: 7. A seção do gene TnaProl que codifica o fragmento de propeptídeo é apresentada na SEQ ID NO: 11, e a seção que codifica a TnaProl madura é apresentada na SEQ ID NO: 6. EXEMPLO 2

Clonagem de TnaProl [00360] A sequência de DNA que codifica a pró-enzima TnaProl foi sintetizada e inserida no vetor de expressão de Bacillus subtilis p2JM103BBI (Vogtentanz, Protein Expr Purif, 55: 40 a 52, 2007) produzindo um plasmídeo nomeado pGX706 (aprE-TnaPro1) (Figura 1).

[00361] A ligação do gene que codifica a proteína TnaProl no vetor digerido resultou na adição de três códons (que codificam Ala-Gly-Lys) entre a extremidade 3' da sequência sinal AprE de Bacillus subtilis e a extremidade 5' do propeptídeo nativo de TnaProl previsto. O gene tem um códon inicial alternativo (GTG). Conforme mostrado na Figura 1, pGX706 (aprE-TnaPro1) contém um promotor AprE, uma sequência sinal AprE usada para direcionar a secreção de proteína alvo em B. subtilis, e a sequência de nucleotídeos sintética que codifica a próenzima TnaProl prevista. A sequência de genes do construto aprE~ TnaProl, incluindo os três códons adicionais introduzidos durante a

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119/131 ligação das sequências fundidas, é apresentada na SEQ ID NO: 4. A sequência de aminoácidos da proteína de fusão AprE-TnaPro1, incluindo os três aminoácidos adicionais codificados pelos três códons adicionais, é apresentada na SEQ ID NO: 5.

EXEMPLO 3

Expressão e Purificação de TnaProl [00362] O plasmídeo pGX706 foi transformado em uma cepa de B. subtfâs adequada, e as células transformadas espalhadas em placas de ágar Luria suplementadas com 5 ppm de cloranfenicoi. As colônias foram selecionadas e submetidas à fermentação em um frasco de agitação de 250 ml com um meio definido à base de MOPS.

[00363] O sobrenadante de cultura foi obtido pela centrifugação das culturas de frasco de agitação, concentrado e subsequentemente incubado a 85°C por 30 min. Para purificação, a solução resultante foi suplementada com sulfato de amônio a uma concentração finai de 1 M e, então, carregada em uma coluna HiPrep™ Phenyl FF préequilibrada com Tris 20 mM (pH 8,0) suplementada com mais sulfato de amônio 1 Μ. A proteína-alvo foi eluída a partir da coluna com sulfato de amônio 0,5 M. As frações de proteína ativa resultantes foram, então, agrupadas e concentradas com o uso dos dispositivos 10K Amicon Ultra e armazenadas em glicerol 40% a -20°C até o uso.

[00364] Uma amostra da proteína TnaProl purificada foi submetida à espectrometria de massa LC, e os resultados confirmam a proteína TnaProl madura como a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3 e a sequência propeptídeo conforme apresentado na SEQ ID NO: 12. EXEMPLO 4

Atividade Proteolítica da TnaProl Purificada [00365] A atividade proteolítica da TnaProl purificada foi medida em tampão de HEPES 50 mM (pH 8), com o uso de Suc-Ala-Ala-ProPhe-pNA (AAPF-pNA, n?- Cat L-1400.0250, BACHEM) como um subs

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120/131 trato. Antes da reação, a amostra de enzima foi diluída em série em água a 0,01 a 1,25 ppm. O AAPF-pNA foi dissolvido em suifóxido de dimetila (DMSO, n² Cat STBD2470V, Sigma) até uma concentração final de 10 mM. Para iniciar a reação, primeiramente, 5 μί de AAPFpNA foram misturados com 85 μ! de tampão de HEPES em uma placa de microtitulação de 96 poços sem ligação (96-MTP) (n² Cat 3641, Corning Life Sciences) e incubados a 40°C por 5 min a 600 rpm em um termomisturador (Eppendorf), então, 10 μΙ da enzima diluída (ou água isoladamente como o controle branco) foram adicionados. Após 10 min de incubação em um termomisturador a 40°C e 600 rpm, a placa de reação foi lida diretamente em 410 nm com o uso de um SpectraMax 190. A parte líquida A410 foi calculada subtraindo-se ο A410 do controle branco daquele dos poços contendo enzima e, então, plotada contra concentrações diferentes de proteína (de 0,001 ppm a 0,125 ppm). Os resultados são mostrados na Figura 2. Cada valor foi a média de ensaios triplicados. A atividade proteolítica é mostrada como índice A410. O ensaio proteolítico com AAPF-pNA como 0 substrato indica que TnaProl é uma protease ativa.

EXEMPLO 5

Perfil de pH da TnaProl Purificada [00366] Com AAPF-pNA como 0 substrato, 0 perfil de pH da TnaProl foi estudado em tampão de glicina/acetato de sódio/HEPES 25 mM com diferentes valores de pH (na faixa de pH 3,0 a 10,0). Antes do ensaio, 85 μΙ de tampão glicina/acetato de sódio/HEPES 25 mM com um valor pH específico foram primeiramente misturados com 5 μΙ de AAPF-pNA 10 mM (dissolvido em DMSO) em uma 96-MTP, e, então, 10 μΙ de enzima diluída (0,5 ppm em água ou água isoladamente como 0 controle branco) foram adicionados. A reação foi realizada e analisada conforme descrito acima. A atividade enzimática em cada pH foi relatada como a atividade relativa, em que a atividade no pH ideal foi

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121/131 definida como 100%. Os valores de pH testados foram 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10. Cada valor foi a média de ensaios triplicados. Conforme mostrado na Figura 3, sob as condições desse teste, o pH ideal da TnaPro1 é 9.0, com mais do que 70% da atividade máxima retida entre pH 8 e 10.

EXEMPLO 6

Perfil de Temperatura da TnaProl Purificada [00367] O perfil de temperatura da TnaProl purificada foi analisado em tampão de HEPES 50 mM (pH 8) com o uso do ensaio AAPF-pNA. Antes da reação, 85 μΙ de tampão de HEPES 50 mM pH 8,0 e 5 μΙ de AAPF-pNA 10 mM foram adicionados aos tubos PCR 200 μΙ, que foram subsequentemente incubados em Cicladores Térmicos Peltier (BioRad) a temperaturas desejadas (isto é, 30~95°C) por 5 min. Após a incubação, 10 μΙ de enzima diluída (0,4 ppm em água, ou água isoladamente como o controle branco) foram adicionados ao substrato para iniciar a reação. Após 10 min de incubação nos termocicladores Peitier em diferentes temperaturas, 80 μΙ da mistura de reação foram transferidos para uma nova 96-MTP, e a absorbância foi lida em 410 nm. A atividade foi relatada como atividade relativa, em que a atividade na temperatura ideal foi definida como 100%. As temperaturas testadas foram 30,0°C, 39,4°C, 45,0°C, 49,8°C, 59,9°C, 70,0°C, 79,1°C, 84,4°C, 90,2°C e 95,0°C, e os resultados são apresentados na Figura 4. Cada valor foi a média de ensaios triplicados.

[00368] Os dados na Figura 4 mostram que 70°C foi a temperatura ideal de TnaProl, e que a mesma reteve mais do que 80% de sua atividade máxima entre 60°C e 95°C.

EXEMPLO 7

Termoestabilidade da TnaProl Purificada [00369] Análises de termoestabilidade da TnaProl purificada e das proteases RONOZYME® ProAct (RONOZYME® ProAct, DSM) comer

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122/131 cialmente disponíveis foram realizadas com o uso de tampão de Tris 20 mM (pH 8, com xNaCI 150 mM) e tampão de acetato de sódio 50 mM (pH 3) como tampões de incubação, respectivamente, e com AAPF-pNA como o substrato para medição da atividade restante. A TnaProl purificada foi diluída em tampão de incubação de 1 ml a uma concentração final de 24 ppm e subsequentemente incubada a 90°C ou 95°C por 0, 5, 15, 30 ou 60 min, enquanto a protease ProAct foi diluída a 500 ppm e incubada a 90°C por 30 segundos ou 60 segundos. No final de cada período de incubação, uma alíquota de 50 μί de cada mistura de enzima-tampão foi transferida para uma 96-MTP e colocada em gelo. Para iniciar a reação enzimática, 85 μΙ de tampão de HEPES 50 mM pH 8,0 foram misturados com 5 μΙ de AAPF-pNA 10 mM e 10 μΙ de cada solução de incubação diluída (40 vezes diluída em água para TnaProl e 250 vezes diluída em água para ProAct, respectivamente) em uma placa de microtitulação de 96 poços (MTP). Após uma incubação de 10 min em um termomisturador a 40°C e 600 rpm, a absorbância foi medida a 410 nm em um espectrofotômetro de 96 poços. A atividade enzimática de cada amostra foi relatada como a atividade residual percentual, em que a atividade em um tempo de incubação de 0 min foi definida como 100%. Os resultados de termoestabilidade para TnaProl são resumidos na Tabela 1. ProAct foi completamente desativada após 1 min de incubação a 90°C (dados não mostrados).

Tabela 1. A termoestabilidade da protease TnaProl a 90 e 95°C medida com o substrato AAPF-pNA
Atividade Residual (%)
90 °C	95 °C
5 min	15 min	30 min	60 min	5 min	15 min	30 min	60 min
89	83	80	78	71	53	40	21

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EXEMPLO 8

Análises de Hídrólise de Farelo de Soja e Milho da TnaProl Purificada [00370] A extensão da hídrólise de farelo de milho e soja (tendo 60% de farelo de milho e 40% de farelo de soja) por TnaProl purificada foi avaliada com o uso de OPA (o-ftalaldeído) ou dos ensaios de detecção de BCA (ácido blclnconínico) descritos abaixo, para medir a quantidade de grupos amina N terminal ou peptídeos solúveis recémproduzidos, respectivamente, liberados no sobrenadante após a hidrólise enzimática. Para conduzir os ensaios, 140 μί de substrato de farelo de milho e soja (10% em p/p em tampão de acetato de sódio 50 mM pH 3 ou tampão de MES pH 6) (Yu S, Cowieson A, Gilbert C, Plumstead P, Dalsgaard S., Interactions of phytate and myo-inositol phosphate esters (IP1-5) including IP5 isomers with dietary protein and iron and inhibition of pepsin. J. Anim. Sci. 2012, 90:1.824 a 1.832) foram misturados com 20 μΙ de uma amostra de enzima TnaProl diluída (4,0 mg/ml) em uma 96-MTP. Após a incubação por 2 h a 40°C em uma incubadora, as placas foram centrifugadas a 3.700 rpm por 15 min a 4°C. O sobrenadante resultante foi diluído 10 vezes em água para se preparar para a detecção de produto de reação subsequente com o uso dos ensaios com OPA e BCA. Uma amostra de protease ProAct (RONOZYME® ProAct, DSM) foi incluída para comparação. Água foi usada como o controle branco (sem enzima).

[00371] Detecção OPA: o reagente OPA foi preparado misturandose 30 ml de tampão de fosfato trissódico a 2% (pH 11), 800 μί de OPA a 4% (n^a Cat P1378, Sigma, dissolvido em etanol a 96%), 1 ml de Ditiotreitol 3,52 % (n^a Cat D0632, Sigma) e 8,2 ml de água. A reação foi iniciada adicionando-se 10 μί da reação de protease diluída 10X aos 175 μί de reagente OPA em uma 96-MTP (n^a Cat 3635, Corning Life Sciences). Após 2 min de incubação, a absorbância da solução resultante foi medida a 340 nm (A340) com 0 uso de um espectrofotômetro.

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Ο Α34ο líquido (Figuras 5 e 7) foi calculado com a subtração de A340 do controle branco (sem enzima) daquele de cada reação de protease para medir a extensão de hidrólise de farelo de soja e milho alcançada por cada amostra de protease.

[00372] Detecção BCA: A reação de cor BCA é proporcional ao número de ligações de peptídeo em polipeptídeos de pelo menos 3 resíduos de comprimento. A reação BCA foi conduzida com a mistura de 10 pl da reação de protease diluída 10X com 200 μΙ de reagente BCA. A mistura foi incubada em um misturador térmico a 37°C por 30 min. A absorbância foi subsequentemente medida a 562 nm (A562) com 0 uso de um espectrofotômetro. Ο A562 líquido (Figuras 6 e 8) foi calculado com a subtração de A562 do controle branco (sem enzima) daquele de cada reação de protease para determinar a extensão de hidrólise de farelo de soja e milho observada para cada amostra de protease.

[00373] Conforme mostrado nas Figuras 5, 6, 7 e 8, a TnaProl purificada pode hidrolisar efetivamente 0 substrato de farelo de milho e soja.

EXEMPLO 9

Hidrólise e Solubilização de Proteína de Milho e Soja com Protease TnaProl [00374] A uma MTP de 96 poços, foram adicionados 140 μΙ de pasta fluida de ração de milho e soja 10% (em p/p) preparada conforme descrito em (Yu S, Cowieson A, Gilbert C, Plumstead P, Dalsgaard S., interactions of phytate and myo-inositol phosphate esters (IP1-5) including IP5 Isomers with dietary protein and Iron and inhibition of pepsin. J. Anim. Sci. 2012, 90:1.824 a 1.832) com pH ajustado a pH 3,0, 20 pl da protease TnaProl preparados em acetato de Na 50 mM pH 3,0 para obter uma concentração final de 0, 500, 1.000 e 1.500 ppm e 10 μΙ de pepsina (Sigma P7000, dissolvidos em água a uma concentração final de 1,69 mg/ml).

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125/131 [00375] As enzimas pepsina e pancreatina foram adicionadas para controle apenas, para o Branco, pepsina e pancreatina foram omitidas. A protease de ração comercial, ProAct (RONOZYME® ProAct, DSM) foi usada como uma referência. A placa foi incubada a 40°C por 45 min em uma incubadora/agitador iEMS (Thermo Scientific) a 1.150 rpm. No final da incubação, 34 pl de solução de pancreatina porcina (Sigma P7545, 0,4636 mg/mi preparados em bicarbonato de sódio 1 M) foram adicionados, e as amostras foram adicionalmente incubadas a 40°C por 60 min em um IEMS definido a 1.150 rpm. Após a incubação, a placa foi centrifugada por 15 min a 5°C e 4.000 rpm. Uma alíquota de 10 μΙ do sobrenadante foi transferida para uma nova MTP de 96 poços contendo 90 μΙ de água (diluição de 10x). Esse sobrenadante diluído 10 vezes foi usado para determinar a hidrólise de proteína pelo método OPA.

[00376] A hidrólise de proteína, usando o reagente o-ftaldialdeído (OPA), foi feita basicamente conforme descrito anteriormente (P.M. Nielsen, D. Petersen e C. Dambmann, mproved method for determining food protein degree of hydrolysis, J. Food Sci. 66:642 a 646, 2001). O reagente OPA foi preparado novamente misturando-se 30 ml de fosfato trissódico (Na3PO4.12H2O, 2% em p/v em água com pH justado para pH 11), 0,8 ml de OPA (0,4 g de o-ftalaldeido a 97% em 10 ml de etanol a 96%, 1 ml de solução de DTT (0,352 g de DLditiotreitol a 99% em 10 ml de água) e água até um volume final de 40 ml) e guardado a -20°C. O reagente foi mantido no escuro e usado logo após a preparação. Uma alíquota de 20 μΙ do sobrenadante diluído 10x foi misturada com 175 μΙ do reagente OPA por 5 segundos, e a absorbância foi medida a 340 nm exatamente após 2 min.

[00377] A tabela 2 mostra a hidrólise de proteína na ração de milho e soja aumentado com as proteases TnaProl e ProAct em doses de 0 a 1.500 ppm na presença tanto de pepsina quanto de pancreatina.

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Tabela 2. Hidrólise de proteína de ração de milho e soja pelas proteases TnaProl e ProAct.
Concentração de protease (ppm)	Branco	Controle	Controle+ 500 ppm	Controle+ 1.000 ppm	Controle+ 1.500 ppm
Hidrólise de proteína (Valor OPA) por TnaProl	0,306	0,542	0,927	1,044	1,119
% do valor OPA com o controle como 100% por TnaProl	56	100	171	193	207
Hidrólise de proteína (valor OPA) por ProAct	0,306	0,542	0,838	0,898	0,949
% do valor OPA com o controle como 100% por ProAct	56	100	155	166	175

EXEMPLO 10

Estabilidade de Pepsina da TnaProl [00378] A estabilidade de pepsina das enzimas TnaProl e ProAct purificadas foi analisada incubando-se as enzimas com pepsina (Sigma, n² Cat P7000), desativada com calor e ativa, em tampão de acetato de sódio 50 mM (pH 3,0) e com o uso de AAPF-pNA para medir a atividade restante. Uma solução de estoque de 50 mg/ml de pepsina dissolvida em tampão de acetato de sódio 50 mM (pH 3,0) foi aquecida a 90°C por 15 min em uma máquina de PCR para desativar com calor. As amostras de enzimas TnaProl e ProAct foram misturadas com a pepsina desativada com calor ou pepsina ativa a uma razão de 1:500, em que a TnaProl e ProAct purificadas foram dosadas a 100 ppm. Após 30 min de incubação a 37°C, as amostras foram diluídas 160 vezes em água. Para medir a atividade restante, 5 μί de AAPF-pNA 10 mM foram misturados com 85 μΙ de tampão de HEPES (50 mM, pH 8,0) em poços de 96-MTP, então, 10 μΙ das misturas de incubação diluídas foram adicionados. O ensaio AAPF-pNA foi realizado, e os resultados analisados descrito acima. O tampão de acetato de sódio contendo 50 mg/ml de pepsina foi usado como o controle branco. A atividade de enzima restante foi relatada como a atividade residual, em que a atividade da amostra em pepsina desativada com calor foi defi

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127/131 nida como sendo 100%. Os resultados são mostrados na Figura 9 e indicam que a atividade de TnaProl não é afetada pela incubação com pepsina exógena enquanto que a atividade de ProAct foi afetada de alguma forma pela incubação com pepsina exógena EXEMPLO 11

Avaliação da Protease TnaProl na Liquefação de Amido [00379] O efeito da protease TnaProl foi testada em um protocolo de liquefação de milho em escala laboratorial conforme descrito abaixo. Caroços do milho (Arie Blok Animal Nutrition, NL-3440 AA Woerden, Artnr: 3777) foram moídos com o uso de uma máquina de trituração Retsch ZM200 com as configurações: tela de 3 mm, 10k rpm. A farinha de milho moída foi usada para gerar uma pasta fluida de 0,5 kg a 32,0% de sólidos secos adicionando-se uma mistura 1:1 de água de tomeira/água desmineralizada à farinha. O pH foi ajustado até 5,5 com H2SO4 e, posteriormente, Spezyme® RSL (produto comercial DuPont contendo uma alfa amilase bacteriana) foi dosado a uma dose comercial relevante. Subsequentemente, a TnaProl protease foi adicionada a uma concentração final de 4 ug/g de DS e a mistura de 0,5 kg foi incubada a 85°C por duas horas sob condições de agitação constante com 0 uso de um misturador suspenso.

[00380] Uma amostra de controle foi gerada adicionando-se nenhuma protease à liquefação. Após a incubação, a amostra de milho tratada (liquefeito) foi coletada e analisada por exclusão de tamanho por HPLC para determinar 0 grau de solubilização de proteína do milho durante a liquefação do milho.

[00381] As amostras de final de liquefação foram centrifugadas a 13.000 rpm por 5 minutos e 200 ul de sobrenadante foram filtrados através de um filtro de 0,22 um. Uma alíquota de 5 ul desse filtrado foi injetada em uma HPLC (Agilent Technologies série 1200), em um Waters BEH125Â, coluna de 1,7 um/300 mm; e execução a 0,3 ml/min.

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Tampão de operação: NaPO4 25 mM pH 6,8, NaCI 0,1 Μ. A área total entre o tempo de retenção 4,8 min a 23 min foi integrada, Detecção: OD 220 nm.

[00382] Os resultados da detecção por HPLC dos peptídeos nas amostras de liquefação são mostrados na Tabela 3, como a área sob a curva integrada com tempo de retenção entre 4,8 a 23 minutos para amostras tratadas com e sem TnaProl protease. O controle é definido a 100% de unidades de área. Os resultados de hidrólise de proteína mostrados na Tabela 3 indicam que, quando a protease TnaProl foi adicionada na liquefação, um aumento nos níveis de peptídeos solúveis foi observado.

Tabela 3. Detecção por HPLC de peptídeos em amostras de liquefação. Área integrada com tempo de retenção entre 4,8 a 23 minutos é relatada.
	Unidades de área integrada	Área sob a curva relativa
Spezyme RSL	89957	100%
Spezyme RSL + TnaProl	250815	279%

EXEMPLO 12

Avaliação da Protease TnaProl como uma Protease de Liquefação [00383] Estudos de liquefação-SSF foram realizados em que a protease, TnaProl, foi testada em liquefação e sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) de milho em escala laboratorial. Caroços do milho (Arie Blok Animal Nutrition, NL-3440 AA Woerden, Artnr: 3777) foram moídos com o uso de uma máquina de trituração Retsch ZM200 com as configurações: tela de 3 mm, 10k rpm. Uma pasta fluida de sólidos secos a 32% foi produzida adicionando-se uma mistura de 6:4 em p/p de água de torneira:recuo de uma planta de etanol comercial à farinha. O pH foi ajustado até 5,3 com H2SO4 e, posteriormente, SPEZYME® RSL (produto comercial DuPont contendo uma alfa amilase bacteriana) foi dosado a uma dose comercial relevante. Subsequentemente, a TnaProl protease foi adicionada a uma concentração

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129/131 final de 3,5 ug/g de DS e a mistura de 0,5 kg fol incubada a 85°C per duas horas sob condições de agitação constante com o uso de urn misturador suspenso. Uma amostra de controle foi gerada adicionando-se nenhuma protease à liquefação. Após a incubação, a amostra de milho tratada (liquefeito) foi coletada e usada em um experimento de SSF subsequente.

[00384] O pH das amostras de liquefeito (com e sem protease TnaProl adicionada à reação de liquefação) foi ajustado a 4,8 e Synerxia Thrive LC® (produto comercial DuPont contendo uma alfa amilase fúngica e uma glicoamilase fúngica) foi adicionado a uma dose relevante comercial a cada vaso SSF contendo 49 gramas do liquefeito. Posteriormente, 1 ml de uma cultura de levedura propagada (Synerxia® Thrive, Dupont) foi adicionado e, subsequentemente, ureia e FERMGEN™ 2,5x (produto comercial DuPont contendo uma protease fúngica ácida) foram adicionados a diferentes concentrações conforme indicado na Tabela 4. Os experimentos foram realizados em triplicata.

[00385] Os vasos de fermentação foram incubados a 32°C em uma incubadora de ar forçado a 150 rpm. As amostras foram coletadas em cinco pontos de tempo diferentes (17 h, 23 h, 41 h, 48 h e 65 horas). Essas amostras foram analisadas quanto à concentração de etanol com o uso de separação e quantificação de HPLC conforme descrito abaixo.

[00386] As amostras de fermentação foram centrifugadas por 10 minutos 15.000 g. 50 ul do sobrenadante foram adicionados a um frasco contendo 500 ul de H2SO4 0,01 N. Posteriormente, a amostra foi aquecida por 7 minutos a 95°C e filtrada através de um filtro de 0,2 gm antes da análise por HPLC. As condições de execução de HPLC (Agilent Technologies série 1200) foram da seguinte forma: coluna Phenomenex Rezex™ RFQ-Fast Acid H+ retida a 80°C, execução a fluxo isocrático de 1,0 ml/min de solvente de H2SO4 0,01 N, um volume de

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130/131 injeção de 10 μΙ e um tempo de execução de eluição de 5,3 min. A detecção de índice de refração foi usada para quantificação de etanol, e os resultados são mostrados na Tabela 4.

Tabela 4. Rendimentos de etanol de SSF (% em v/v) obtidos com várias quantidades de ureia e FERMGEN™ 2,5X, com e sem protease TnaProl durante a etapa de liquefação de milho.
Condição	horas	% em v/v de Etanol
600 ppm de ureia + 0,1 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X	17	8,5 (+/-0,08)
150 ppm de ureia	17	6,22 (+/-0,06)
300 ppm de ureia	17	6,97 (+/-0,1)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 150 ppm de Ureia	17	8,61 (+/-0,05)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 300 ppm de Ureia	17	8,57 (+/-0,19)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 600 ppm de Ureia + 0,1 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X	17	8,63 (+/-0,05)

600 ppm de ureia + 0,1 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X	23	9,88 (+/-0,08)
150 ppm de ureia	23	7,61 (+/-0,11)
300 ppm de ureia	23	8,39 (+/-0,2)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 150 ppm de Ureia	23	9,93 (+/-0,02)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 300 ppm de Ureia	23	9,84 (+/-0,18)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 600 ppm de Ureia + 0,1 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X	23	9,98 (+/-0,08)

600 ppm de ureia + 0,1 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X	41	14,11 (+/-0,28)
150 ppm de ureia	41	11,49 (+/-0,13)
300 ppm de ureia	41	12,73 (+/-0,03)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 150 ppm de Ureia	41	14,04 (+/-0,21)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 300 ppm de Ureia	41	13,69 (+/-0,15)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 600 ppm de Ureia + 0,1 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X	41	14,21 (+/-0,01)

600 ppm de ureia + 0,1 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X	47	15,01 (+/-0,22)
150 ppm de ureia	47	12,3 (+/-0,15)
300 ppm de ureia	47	13,58 (+/-0,09)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 150 ppm de Ureia	47	14,91 (+/-0,2)

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Tabela 4. Rendimentos de etanol de SSF (% em v/v) obtidos com várias quantidades de ureia e FERMGEN™ 2,5X, com e sem protease TnaProl durante a etapa de liquefaçâo de milho.
Condição	horas	% em v/v de Etanol
3,5 ug/gDS de TnaProl, 300 ppm de Ureia	47	14,84 (+/-0,19)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 600 ppm de Ureia + 0,1 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X	47	14,77 (+/-0,07)

600 ppm de ureia + 0,1 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X	65	15,56 (+/-0,34)
150 ppm de ureia	65	14,02 (+/-0,19)
300 ppm de ureia	65	14,88 (+/-0,04)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 150 ppm de Ureia	65	15,49 (+/-0,35)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 300 ppm de Ureia	65	15,93 (+/-0,05)
3,5 ug/gDS de TnaProl, 600 ppm de Ureia + 0,1 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X	65	15,57 (+/-0,12)

[00387] Os resultados mostram que, quando TnaProl foi adicionada à liquefaçâo, a dose de Ureia em SSF podería ser reduzida em 75% sem ter um efeito negativo sobre a formação de etanol.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Construto recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo termoestável que tem atividade de serina protease, em que a dita sequência de nucleotídeos codificadora é operacionalmente ligada a pelo menos uma sequência reguladora funcional em um hospedeiro de produção, e a sequência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo com pelo menos 92% de identidade de sequência de aminoácidos com a mesma;

e em que a dita sequência reguladora é heteróloga à sequência de nucleotídeos codificadora ou a dita sequência reguladora e a dita sequência codificadora não estão dispostas como encontradas juntas na natureza.
2. Construto recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de nucleotídeos codificadora é uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, ou um polipeptídeo com pelo menos 89% de identidade de sequência de aminoácidos da mesma.
3. Construto recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de nucleotídeos codificadora é selecionada a partir do grupo que consiste em:

i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, ou um polipeptídeo com pelo menos 86% de identidade de sequência de aminoácidos da mesma; ou ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5

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2/6 ou 14, ou um polipeptídeo com pelo menos 84% de identidade de sequência de aminoácidos da mesma.
4. Construto recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dita pelo menos uma sequência reguladora compreende um promotor.
5. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um construto recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. Hospedeiro de produção ou célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que compreende o construto recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
7. Hospedeiro de produção ou célula hospedeira, como definido na reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita célula é uma célula bacteriana, uma célula archaeal, uma célula fúngica ou uma célula algal.
8. Método para produzir uma serina protease termoestável, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende:

i) transformar uma célula hospedeira com um construto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e ii) cultivar a célula hospedeira transformada da etapa (i) sob condições através das quais a serina protease termoestável é produzida.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreende ainda recuperar a serina protease termoestável a partir da célula hospedeira.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a dita célula hospedeira é uma célula bacteriana, uma célula archaeal, uma célula fúngica ou uma célula algal.

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11. Sobrenadante de cultura, caracterizado pelo fato de que compreende uma serina protease termoestável obtida por meio do método, como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 10,
12. Método para hidrolisar um material derivado de milho, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende:

(a) colocar o material obtido a partir do milho em contato com um líquido para formar um mosto; e (b) hidrolisar pelo menos uma proteína no mosto para formar um hidrolisado, colocando-se o hidrolisado em contato com um coquetel de enzimas compreendendo uma serina protease termoestável que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 e (c) opcionalmente, recuperar o hidrolisado obtido na etapa (b).
13. Ração para animais, gêneros alimentícios, composição aditiva para ração ou pré-mistura, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease e é termoestável, em que o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 92% de identidade de sequência da mesma, e em que a dita ração para animais, gêneros alimentícios, composição aditiva para ração ou pré-mistura opcionalmente compreende, ainda, (a) pelo menos um aditivo microbiano de inclusão direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) pelo menos um aditivo microbiano de inclusão direta e pelo menos uma outra enzima.
14. Composição aditiva para ração, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a dita composição aditiva para ração compreende ainda pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, uma

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4/6 sacarose, uma lactose, um sorbitol, um glicerol, um propilenoglicol, um cloreto de sódio, um sulfato de sódio, um acetato de sódio, um citrato de sódio, um formiato de sódio, um sorbato de sódio, um cloreto de potássio, sulfato de potássio, um acetato de potássio, um citrato de potássio, um formiato de potássio, um acetato de potássio, um sorbato de potássio, um cloreto de magnésio, um sulfato de magnésio, um acetato de magnésio, um citrato de magnésio, um formiato de magnésio, um sorbato de magnésio, um metabissulfito de sódio, metil parabeno e propil parabene.
15. Composição aditiva para ração, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que a dita composição aditiva para ração é granulada e compreende partículas produzidas por um processo selecionado a partir do grupo que consiste em granulação de alto cisalhamento, granulação em cilindro, extrusão, esferonização, aglomeração em leito fluidizado, revestimento por aspersão em leito fluidizado, secagem por aspersão, liofilização, compressão, arrefecimento por aspersão, atomização em disco giratório, coacervação, produção de comprimidos ou qualquer combinação dos processos acima.
16. Ração para animais, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o diâmetro médio das partículas está entre 50 e 2.000 microns.
17. Composição aditiva para ração, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que a dita composição aditiva para ração está sob a forma de um líquido, um pó seco, ou um grânulo ou um revestimento, ou está em uma forma revestida ou encapsulada.
18. Composição aditiva para ração, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a dita composição aditiva

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5/6 para ração está sob a forma de um líquido que é adequado para secagem por aspersão sobre um pélete de ração.
19. Ração para animais, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polipeptideo que tem atividade de serina protease está presente em uma quantidade de 1 a 20 g/tonelada.
20. Método para produzir produtos de fermentação a partir de material contendo amido, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) liquefazer o material contendo amido com um coquetel de enzimas compreendendo uma serina protease que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3;

(b) sacarificar o produto da etapa (a);

(c) fermentar com um organismo adequado; e (d) opcionalmente, recuperar o produto produzido na etapa (c).
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente.
22. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a adição de uma fonte de nitrogênio é eliminada ou reduzida em pelo menos 50% com o uso de 1 a 20 g de serina protease/MT de material contendo amido, em que a serina protease compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3.

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23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a fonte de nitrogênio é ureia.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o produto de liquefação é etanol, e nenhuma enzima proteolítica ácida é necessária ao utilizar 1 a 20 g de serina protease termoestável/MT de material contendo amido, em que a serina protease compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3.